Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63541
Automatic Translation
1,2
1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כלים חדשים למבחני קשירת SPR כדי לבחון קשירת CV-N ל-HA, גליקופרוטאין S, גליקנים היברידיים קשורים ואוליגוסכרידים עתירי מנוז. SPR משמש לקביעתK D לקשירת CV-N דימרי או מונומרי לגליקנים אלה.

Abstract

תהודת פלסמון פני השטח (SPR) משמשת למדידת קשירת המגלוטינין (HA) לדמיר ציאנובירין-N (CV-N) שהוחלף בתחום ולניטור אינטראקציות בין פפטידים מנוזילטים לבין אתר הקשירה בעל הזיקה הגבוהה של CV-N. דווח כי קוצים במעטפת הנגיף gp120, ha וגליקופרוטאין אבולה (GP) 1,2 קושרים אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה ונמוכה ב-CVN2 דימרי. פפטיד HA דימנוזילי קשור גם בשני אתרי הקישור בעלי הזיקה הנמוכה למולקולה מהונדסת של CVN2, הנושאת אתר זיקה גבוהה עבור הליגנד המתאים ועוברת מוטציה כדי להחליף קשר דיסולפיד מייצב בכיס קשירת הפחמימות, ובכך לאשר קשירה רב-ערכית. קשירת HA מוצגת לאתר קשירה אחד בעל זיקה גבוהה של פסאודו-נוגדנים CVN2 בקבוע דיסוציאציה (KD) של 275 ננומטר המנטרל עוד יותר את נגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) באמצעות אוליגומריזציה. קורלציה בין מספר הגשרים הדיסולפידים ב-CVN2 שהוחלפו בתחום, אשר מופחתים מ-4 ל-2 על-ידי החלפת ציסטינים בזוגות שאריות קוטביות של חומצה גלוטמית וארגינין, מביאה לירידה בזיקה ל-HA. בין האינטראקציות החזקות ביותר, אבולה GP1,2 קשורה על ידי CVN2 עם שני אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה בתחום הננומולרי התחתון באמצעות גליקן המעטפת ללא תחום טרנסממברנה. במחקר הנוכחי, קשירת CV-N מונומרי רב-ספציפי לתסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) גליקופרוטאין (S) נמדדת ב- K D = 18.6 μM בהשוואה לננומולאר KD לאותם קוצים אחרים בנגיף, ובאמצעות תחום קשירת הקולטן שלו בטווח הטוחנות האמצעיות μ.

Introduction

פעילות אנטי-ויראלית הקשורה לטתרין מושרית על ידי אינטרפרון-α, והיא מורכבת מקשירה מבוססת חלבון, מה שמוביל לשמירה של וירוסים שנוצרו במלואם על משטחי תאים נגועים1. הצורך בגליקוזילציה של טטרין בעיכוב שחרור הנגיף עדיין אינו ודאי, מה שמרמז על החשיבות של דפוסי גליקוזילציה על גליקנים המבוטאים באופן רקומביננטי עבור מחקרים במבחנה 1,2, אשר תלוי בקונפורמציה של (במקרה של נגיף שפעת) השפעת המגלוטינין HA 3,4 . צוין כי שינוי של אוליגוסכריד הקשור לגליקוזילציה הקשורה ל-N מספיק להגבלה בתיווך תרין של שחרור HIV מסוג 12, בעוד שדמריזציה ממלאת תפקיד חיוני במניעת שחרור הנגיף, ובכך מערבת את תחום הטרנס-ממברנה או גליקוזיל-פוספטידיל-אינוזיטול (GPI)-עוגן לקשירת הוויריונים הניצנים5 . תכונות ייחודיות מתוארות עבור טתרין אנושי ומורין כדי לחסום וירוסים עטופים מרובים, רטרו-וירוסים, ופילו-וירוסים. BST-2/tetherin הוא חלבון אנטי-ויראלי הניתן לאינטרפרון של מערכת החיסון המולדת1,6, הפועל עם פעילות אנטי-ויראלית רחבת טווח ונוגד אנטגוניזם על ידי גליקופרוטאינים מעטפת5 כדי לבצע טרנסלוקציה של טטרין או לשבש את המבנה של ת'רין 6. לדוגמה, גליקופרוטאין HA של מעטפת המבוטא על פני השטח ונוירמינידאז על נגיף שפעת A ידועים באנטגוניזם של טטרין באופן ספציפי לזן7, מה שמקל על זיהוי אתרי קשירת קולטן מארח8. נוגדנים המכוונים לגליקן נחקרים בסטויכיומטריה של יחסי הגומלין שלהם עם מגני הגליקן המותאמים אישית במהירות ב-HA, וכתוצאה מכך נוצרת זיקה לתת-סוגים שפעת A H3N2 ו-H1N14.

כדי להבהיר את מנגנוני הקשירה בין חומרים אנטי-ויראליים לבין קוצים במעטפת הנגיף, כלומר ליגנדות פחמימות, ושיטות אימונולוגיות וספקטרוסקופיות משלימות, מסונתזים כימית מונו, די-די-מנוז ותלת-מנוז. הפפטידים המנוזילים נוצרים באמצעות אזידו גליקוזילציה של גליקוזיל {בטא}-פראצטטים לטרנספורמציה של 1,2-טרנס גליקוזיל אזידים9, המחקה את ה-N-אצטיל גלוקוזאמין ואוליגוסכרידים עתירי מנוז על פני השטח של וירוסים מסכני חיים. ביואיזוסטרים של טריאזול משמשים לחיקויים של קישורים היוצרים את השאריות המנוזיליות של פפטיד HA10 ומאפשרים אינטראקציות ספציפיות לאתר עם נגזרות CV-N אנטי-ויראליות סביב נקודת הגליקוזילציה השנייה הקשורה ל-N בתחום ראש ה-HA (HA למעלה עם 4 גליקנים מקושרים N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . אינטראקציות בין חומצה גלוטמית (Glu) וארגינין (Arg) לבין דיפול הסליל שנוצר ביטאו יציבות טובה של פפטידי המודל ושל חלבונים, אך הן מוצגות באמצעות SPR. אם משווים אותו לזיהוי אתר גליקוזילציה מסונתז כימית יחיד ב-HA10 על ידי עיכוב ישיר של קשירת קולטן על הגליקן, הוכחה זיקה גבוהה יותר של מבנה Fc בעל מוטציה של ארבעה אתרים לקולטן שלו כמעוררת פונקציות אפקטים in vivo, וחושפת את ההרכב הלא קשור של גליקנים מקושרים N המחוברים למוטציה של Fc כדי לקבוע באופן מכניסטי13.

CV-N מציג פעילות אנטי-ויראלית נגד HIV 14,15, שפעת16 ונגיף האבולה, המתווך על ידי קשירת ננומולר לשינויים אוליגוסכרידיים עתירי מנוז על חלבוני ספייק מעטפת12,17,18,19. קשירת שפעת HA לאתר קשירת פחמימות אחד בעל זיקה גבוהה (H) ב-CV-N או בשני Hs ב-CVN2 דימרי מקושר קוולנטית נקבעת כבעלת קבועי דיסוציאציה של שיווי משקל (K D) = 5.7 ננומטר (איור 1A) ו-KD = 2.7 ננומטר, בהתאמה. גם CV-N וגם CVN2 מכילים עוד אתר אחד או שניים של קשירת פחמימות בעלות זיקה נמוכה (L)s 12,17,20,21. אבולה GP1,2 נקשר ל-2H של CVN2 עם זיקות בתחום הננומולרי התחתון (KD = 26 ננומטר). CV-N WT מחייב לאבולה GP1,2 ו- HA מציג זיקות מ- K D = 34 nM ל- KD = 5.7 nM (A / New York / 55/04)12. לקטינים, כגון CV-N, המכוונים באופן ספציפי לגליקנים עתירי מנוז על מעטפות הנגיף, מעכבים עוד יותר את השכפול של נגיף הפטיטיס C, SARS-CoV, נגיף ההרפס, נגיף מרבורג ונגיף החצבת22.

מולקולת CV-N הקטנה נחקרה ביסודיות במשך יותר מ-20 שנה, שכן היא מתפקדת כדי לקשור מגוון רחב של נגיפים כדי לעכב את כניסת הנגיף16,18. ניתוחים מבניים ומבחני זיקה מקשרים מצביעים על קישור צולב של שני Ls בדימר CVN2 שהוחלף על ידי קשירה דו-ערכית בטווח המיקרומולרי כדי להגביר את ההתלהבות לגליקופרוטאינים של מעטפת נגיפית10,19. קשירה סלקטיבית של Manα1-2Manα על זרועות Man(8) D1D3 ו-Man(9) כוללת שני אתרי קשירה בעלי זיקות שונות הממוקמים על פרוטומרים של חלבונים מנוגדים20, ובכך מגיעים לזיקות קשירה ננומולריות (איור 1B). לפיכך, CVN2 נחשב לנוגדן פסאודו בנוגע ליישומו לקשירת אפיטופים על HIV gp120, בדומה לנוגדנים מנטרלי וירוסים17. כאן, המחבר מעוניין לחקור את הקשירה הפוטנציאלית של CVN2 לספייק SARS-CoV-2 באמצעות תחום קשירת הקולטן שלו (RBD). עקומות קשירה של אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי משותק (ACE)-2 עם SARS-CoV-2 RBD התוצאה KD = 4.7 nM עבור אינטראקציה מחייבת רלוונטית ביולוגית זו23.

לעומת זאת, מחלקות אימונוגלובולינים נבחרות מזהות תבניות חלבונים מבניות ספציפיות ועקביות, המקנים מצע להבשלת זיקה באזורי HA24 המעוגנים בממברנה. CV-N מראה פעילות חזקה מאוד כמעט בכל נגיפי שפעת A ו-B16, והוא חומר אנטי-ויראלי המנטרל באופן נרחב. הידע שלנו אינו שלם על מיקומם של אפיטופים ממוקדים על הגבעול של HA1 ו-HA2 שעשויים לערב מבנים אפיטופיים למיקוד גליקן על ידי נוגדנים מנטרלים מאוד ובהשוואה לקשירת לקטין25.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של בדיקת קשירת SPR עבור CV-N לקפיצות מעטפת הנגיף. (A) בדיקת SPR לקשירת CV-N לליגנד: חלבון HA באורך מלא (90 kDa). ערכת נתונים קינטית (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) המציגה כריכה כפולה בזמן אמת לשפעת HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 גרסה V2 נקשרת לליגנד DM משותק בטווח ריכוז של 500 ננומטר עד 16 מיקרומטר. רצף: שאריות L מודגשות בצהוב. שאריות H מודגשות באפור. E58 ו-R73 הם תחליף לציסטאינים בחלבון ה-wildtype והופכים את V2 לקפל חלבון יציב עם שלושה במקום ארבעה קשרים דיסולפידיים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בעוד שמגן הגליקן בחלק העליון של HA הדיסטלי של הממברנה גורם לקשירת זיקה גבוהה ל-CV-N 12, קשירת CVN2 ל-HA הסמוכה לגשר דיסולפיד של החלק העליון של HA נצפתה גם באתרי הזיקה הנמוכה שלו10,12. אינטראקציות קוטביות שונות ואתרי אינטראקציה מזוהים בקשירת פחמימות על ידי CV-N. אינטראקציות אלה מאומתות על ידי יצירת וריאנטים נוק-אאוט באתר הקשירה כדי לתאם זיקות קשירה לגליקוזילציה חזויה בסיליקו 12. לפיכך, הפרויקט שואף להשוות פפטידי HA שעברו מנוזילציה כימית שנבדקו בעבר בזיקה ובספציפיות מחייבת עם רצפי פפטידים קצרים מקוצים הקשורים לסארס 2019-nCoV ו- SARS-CoV-2, המתרחשים באופן טבעי על ידי מספר קטן של אתרי גליקוזילציה שונים המקושרים ל- N וגליקוזילציה מקושרת O. באמצעות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים ומבחני קשירה, פינטו ועמיתיו מדווחים על נוגדן חד-שבטי, S309, שעשוי לזהות אפיטופ על חלבון ספייק SARS-CoV-2 המכיל גליקן שמור בתוך תת-הסוג Sarbecovirus, מבלי להתחרות בחיבור הקולטן26. הפרוטוקול של מחקר זה מתאר כיצד תכנון, הבעה ואפיון של וריאנטים של CV-N חשובים כדי לחקור כיצד CV-N ו-CVN2 נקשרים לחלבונים מסוכררים ולפפטידים מאנוסילטים סינתטיים באמצעות טכנולוגיית SPR10,12.

דימר CVN2L027 וגרסאות של אתר קשירה (V2-V5) מבוטאים באופן רקומביננטי וריאנטים הם עם תחליפי קשרים דיסולפידיים (C58E ו-C73R) (איור 2A). כמו כן, מוטציה עם מוטציה חד-נקודתית E41A מוכנה מכיוון שתנוחה זו נתפסה כשאריות של מגע צולב בין-מולקולרי. מוטציה זו היא מולקולה מעניינת נוספת למדידות קשירת SPR בין הלקטין לאוליגוסכרידים בעלי מנוז גבוה המפענחת תחומי קשירה ומאפשרת השוואה לצורה הדימרית. המבנה הגבישי המוחלף בתחום של CVN2 מראה מקשר גמיש, המשתרע בין 49 ל-54 שאריות. שני התחומים יכולים להמשיך לנוע סביב הציר כגופים קשיחים, ולפתח מונומר באמצעות אינטראקציות תחום תוך-מולקולריות (תחום A -שאריות 1-39;90-101- עם תחום B -שאריות 40-89) או דימר על ידי החלפת תחום בין-מולקולרי [תחום A (של המונומר הראשון) עם תחום B (של השני), ותחום B (של המונומר הראשון) עם תחום A (של העותק השני)]. אין אינטראקציות קרובות בין תחומי A ו-B של שני הפרוטומרים, למעט Glu4128. ניתן לפתח את הגן עבור CV-N בשיטת PCR חוזרת עם אוליגוס מסונתז 40-mer29 ולאחר מכן הוא משויך לאתרים NdeI ו- BamHI של pET11a לטרנספורמציה (אלקטרופורציה) לתאים אלקטרו-מוכשרים כפי שתואר על ידי Keeffe, J.R.27. החלבון, המשמש להשגת המבנה הגבישי המתאים (PDB ID 3S3Y), כולל תג טיהור N-terminal 6-histidine ואחריו אתר ביקוע פרוטאז פקטור Xa. מוטגנזה מכוונת אתר משמשת ליצירת מוטציות נקודתיות, להחלפת קודונים ולהוספה או מחיקה של בסיסים או קודונים בודדים או מרובים להחלפת חומצות אמינו. טרנספורמציות אלה מספקות תובנה שלא תסולא בפז לגבי תפקוד ומבנה החלבון. CV-N, CVN2 ו-CVN3 עם ביטוי רקומביננטי וטיהור רקומביננטי נחקרו היטב מבחינה ביופיזית20,21,27, הם זולים לייצור, ולכן משמשים לאפיון מבחני קשירה לגליקנים המשותקים על שבבי חיישן SPR. בדיקה חיסונית קונבנציונלית הקשורה לאנזים (ELISA) מספקת פחות יכולת שכפול בנוגע לטכניקת האימוביליזציה של ליגנדות גליקן והופכת קשירה בזמן אמת של גרסאות שונות של אתרי קשירה, המוצגת עבור SPR, למבחני נקודות קצה.

וריאנט זיקה מחייבת CVN2L0-V2 (קפל שלם של CV-N הומודימרי עם החלפת גשר דיסולפידית10) מבוטא בתג שלו ב-Escherichia coli (E. coli), מטוהר מעל עמודת Ni-NTA תוך שימוש בכרומטוגרפיית זיקה ונבדק לקשירת HA (H3N2), פפטיד HA-פפטיד מונומנוזילי ופפטיד דימנוזילי באמצעות SPR. פפטידים מנוזיליים כימית, או חלבון HA ו-S, כולם ליגנדים ואמינים המוצמד למשטח השבב ההידרופילי באמצעות אסטרים תגובתיים או הנדסת חלבונים ביוטין-סטרפטאווידין. אותו הליך של ריצות עוקבות מוחל על ליגנדות אלה, המזריקות דילולים שונים של CV-N וריאנטים של CV-N (ו- CVN2) כדי לקבל מידע קינטי עבור ניתוחי האינטראקציה המולקולרית כמתואר להלן30. שבב חיישן SPR משותק RBD משמש לקשירת מחקרים על פפטידי CV-N ל-S, והזיקות מושוות לקשירת SARS-CoV-2 עם ACE2 האנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עבור המחקר הנוכחי, חלבון היתוך דמוי יוביקוויטין קטן (SUMO) של CVN שימש בבדיקות אימונוסורבנט הקשורות לאנזימים במקום CV-N והוא מתאים לבדיקות מבוססות תאים. שפעת רקומביננטית באורך מלא חלבון HA H3 מתקבל באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) או מבוטא בקווי תאים HEK293 של יונקים ובתאי חרקים נגועים ב-baculovirus על פי פרוטוקולים סטנדרטיים12. חלבון הספייק של ווהאן-1 מתבטא בתאי HEK293 של יונקים. הסינתזה של פפטיד מונומנוזילי (MM) ופפטיד דימנוזילי (DM) מאפשרת זיהוי של ליגנדות הומוגניות ל-CVN2 ולמולקולה קטנה מונומנוזילית10.

1. יצירת מבני CV-N

  1. עבור כל אחת מגרסאות CVN2 וחלבון CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), קבל את מבנה הגן עם רצף מוביל pelB מסוף N ואת התג שלו בווקטור pET27b(+) ממקורות מסחריים (ראה טבלת חומרים, קובץ משלים 1).
  2. השג CVN2L0 וגרסאותיו (V2, V3, V4 ו- V5; איור 2A,C) ברקע של גן בתבנית CVN2L0 המורכב משני רצפי דנ"א נפרדים עבור כל CV-N חוזר.
  3. ממיסים את הדנ"א הפלסמיד הליופילי במים מזוקקים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (ddH2O) לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מיקרול.

2. הכנת צלחות LB-agar עם תאים מותמרים של DNA פלסמיד

  1. הכינו את מדיום התרבית LB-Lennox על ידי המסת 10 גרם/ליטר של פפטון, 5 גרם/ליטר של תמצית שמרים ו-5 גרם/ליטר של NaCl ב-ddH2O (ראו טבלת חומרים), והתאימו את ה-pH ל-7.4. בצע את הטרנספורמציה ל- E. coli BL21 (DE3) מוכשר עבור כל גרסה (V2-V5) בשיטה כימית בעקבות דוח10 שפורסם בעבר.
  2. לפצל את התמיסה (900 μL ו- 100 μL), להעביר 100 μL על לוחות LB-agar (50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin), ולהשתמש בעדינות מפזר תאים סטריליים. לדגום את צלחות אגר לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

3. שיבוט

  1. החלף את הגן עבור CV-N לאתרי NdeI ו- BamHI של pET11a (ראה טבלת חומרים) לצורך טרנספורמציה (אלקטרופורציה) לתאים אלקטרו-מוכשרים לאחר הפניה27.

4. מוטגנזה מכוונת אתר

  1. כדי ליצור CVN2L029 ומוטציה CVN-E41A ברקע של גן תבנית CVN2L0 המכיל שני רצפי DNA מובחנים עבור כל CV-N חוזר27.
  2. צור מוטציות באמצעות ערכת מוטגנזה מכוונת אתר (ראה טבלת חומרים) ופריימרים מוטגניים ספציפיים 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' ו-5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' להפעלת PCR31.
    1. התחל סדרה של תגובות דגימה באמצעות ריכוזים מרובים של תבנית דנ"א דו-גדילי (dsDNA) הנעה בין 5-50 ng (לדוגמה, 5, 10, 20 ו-50 ng של תבנית dsDNA). שמור על ריכוז פריימר קבוע.
      הערה: תערובת ה-PCR ופרוטוקול המחזור התרמי משמשים בדרך כלל כמתואר במדריך ההוראות של ערכת המוטגנזההמכוונת לאתר 32.
  3. הוסף את אנזים ההגבלה Dpn I (1 μL, 10 U/μL, ראה טבלת חומרים) מתחת לשכבת העל של השמן המינרלי. ערבבו תגובות ביסודיות ובעדינות, סובבו כלפי מטה במיקרוצנטריפוגה שולחנית למשך דקה אחת, ודגרו מיד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לעיכול ה-dsDNA המוגף-על ההורי.

5. טרנספורמציה של תאי חיידקים

  1. הפשירו בעדינות את התאים הסופר-מוכשרים של XL1-Blue (ראו טבלת חומרים) על קרח. כדי להפוך כל תגובת בקרה ודגימה, aliquot את התאים supercompetent (50 μL) לצינור פוליפרופילן תחתון עגול מראש (14 מ"ל).
    1. העבר 1 μL של הדנ"א החד-גדילי שטופל ב- Dpn I (ssDNA) מכל תגובת בקרה ודגימה (ssDNA שעבר מוטציה) כדי להפריד בין אליקוטים של התאים העל-טבעיים, אשר מסנתזים את הגדיל המשלים. סובבו בזהירות את תגובות הטרנספורמציה כדי לערבב ולדגור את התגובות על הקרח במשך 30 דקות.
      הערה: לפני העברת הדנ"א המטופל ב-Dpn I לתגובת הטרנספורמציה, מומלץ להסיר את כל השמן המינרלי שנותר בזהירות מקצה הפיפטה. כבקרה אופציונלית, יש לבדוק את יעילות הטרנספורמציה של התאים הסופר-מוכשרים XL1-Blue על ידי ערבוב 0.1 ng/μL של פלסמיד הבקרה pUC18 (1 μL) עם aliquot של 50 μL של התאים העל-מוכשרים.
  2. יש למרוח את פעימת החום על תגובות הטרנספורמציה בטמפרטורה של 42°C למשך 45 שניות, ולאחר מכן להניח את התגובות על הקרח למשך 2 דקות.
    הערה: פולס החום המיושם כבר עבר אופטימיזציה לתנאים שהוזכרו בצינורות פוליפרופילן עם תחתית עגולה (14 מ"ל).
  3. הוסיפו 0.5 מ"ל של ציר NZY+ (המכיל לליטר: 10 גרם של אמין NZ (קזאין הידרוליזט), 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של NaCl, 12.5 מ"ל של 1 M MgCl 2, 12.5 מ"ל של 1 M MgSO4, 10 מ"ל של2 M גלוקוז, pH 7.5, וחומם מראש ל-42 °C) ודגרו את תגובות הטרנספורמציה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-225-250 סל"ד למשך שעה אחת. צלחת את הנפח הנכון של כל תגובת טרנספורמציה (5 μL מטרנספורמציית פלסמיד בקרה; 250 μL מטרנספורמציית דגימה) על לוחות אגר LB-אמפיצילין.
    הערה: עבור בקרות הטרנספורמציה והמוטגנזה, יש לפזר תאים על לוחות אגר LB-אמפיצילין בעלי 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטופירנוזיד (X-gal, 80 מיקרוגרם/מ"ל) ואיזופרופיל-1-תיו-β-D-גלקטופירנוזיד (IPTG, 20 mM) (ראו טבלת חומרים). לחסן 50 מ"ל של תרביות התאים עם מושבה אחת של E מותמר. תאי קולי לטיהור דנ"א פלסמיד שעבר מוטציה לצורך ניתוחים. מוטגנזה מאושרת על ידי ריצוף DNA במתקן חיצוני.

6. ביטוי וטיהור חלבונים

  1. עבור תרבית בקנה מידה גדול, לחסן כמות קטנה של LB (המכיל אמפיצילין) עם מושבה אחת מן הלוח מותמר.
  2. באמצעות תרבית הלילה, לחסן את תרבות הביטוי עם תוספים, כגון 10 mM של MgCl2, 10 mM של MgSO 4, ו 20 mM של גלוקוז, דילול תרבות הזרעים ל 1/100.
    1. לגדל תאים עם רעידות נמרצות ב 37 מעלות צלזיוס. לגדל תאים ל-Abs 600 ננומטר בין 0.4-0.6 (שלב אמצע הלוג) לפני קירור התאים ל-20 מעלות צלזיוס. השרה עם 1 mM IPTG ולגדול בן לילה.
    2. לאחר מכן, קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהשליך את supernatant עם פיפטה.
  3. יש להשעות את כדור התא במאגר מי מלח עם אגירת פוספטים (PBS) ולבצע צנטריפוגה מחדש ב-4,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להשליך את supernatant עם פיפטה. יש להשעות את הגלולה הנותרת ב-10 מ"ל של חיץ ליזה ולדגירה של המתלים למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: הרכב של מאגר ליזה: (50 mM של NaH 2 PO4, 300 mM של NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/mL של ליזוזים, 1 mM של פנילמתיל-סולפונילפלואוריד (PMSF), 1 mM של dithiothreitol, 1 mM של MgCl2, pH 8, ראה טבלת חומרים).
    1. מעבירים את התערובת לשני מחזורי הפשרה בהקפאה (-80°C). הפרד שברים מסיסים ובלתי מסיסים על-ידי צנטריפוגה ב-4,000 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ונתח אותם באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE), בפרט, נתרן דודציל סולפט (SDS)-PAGE33 (איור 2B,C).
      הערה: תאים יכולים להיות lysed במספר דרכים, כגון הפשרה הקפאה, סוניקציה, הומוגניזציה, תזה אנזימטית, או שילוב של שיטות אלה. טיהור מגופי הכללה מומלץ לאיסוף תפוקות חלבון גבוהות26.
  4. טהרו חלבונים באמצעות כרומטוגרפיית עמודה Ni-NTA (ראו טבלת חומרים). טען את החלק המסיס על עמודת חרוזים Ni-NTA מתחדשת (1 מ"ל/דקה). שטפו את המערכת עם חיץ TBS (50 מ"מ של טריס, 150 מ"מ של נתרן כלורי, pH 7.5) לפני תחילת שיפוע (0-100% 500 mM imidazole ב- TBS מעל 60 דקות) ואיסוף שברים (1 מ"ל לדקה). דיאליזה של החלבונים המטוהרים לאפיון ביוכימי כנגד PBS של 100 mM (איור 2C,D).
  5. לחלופין, השתמש בג'ל זיקה His-Select Ni 2+ (ראה טבלת חומרים) בצינורות של 14 מ"ל כדי לקשור ולהשעות מחדש את CV-N המתויג שלו באופן רקומביננטי בתמיסות חיץ עם 20 mM imidazole ו-250 mM imidazole, בהתאמה. דגירה באצווה במשך 30 דקות לפחות.
    הערה: החל חלבונים מטוהרים למחצה אלה על עמודה חד-פעמית ארוזה מראש להחלפת חיץ וניקוי של דגימות ביולוגיות, לדוגמה, פחמימות וחלבונים, שיכולים לטעון 1-1.5 מ"ל מ-eluate מכרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת.
  6. העבירו את תמיסות החלבון לצינורות צנטריפוגה באמצעות מסנן חיתוך של 10 kDa (ראו טבלת חומרים) ורכזו אותן על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4,500 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס. למדידות SPR, החלף את תמיסות האנליטים ל- 10 mM HEPES, 150 mM נתרן כלורי, 3 mM חומצה אתילנדיאמינטטראאצטית (EDTA), ו- 0.05% Tween20, pH 7.4 (HBS-EP(+), ראה טבלת חומרים).
    1. הוסף את מאגר הריצה SPR זה למקדם דילול של 1:10 וצנטריפוגה ארבע פעמים לנפח ההתחלתי למשך 10 דקות ב- 4,500 x g ו- 4 °C.
  7. קבע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop UV-Vis (ראו טבלת חומרים) בהתבסס על מקדם ההכחדה המחושב (20,440 M-1 cm-1) עבור החלבון העיקרי CVN2L0 המציג גודל של 23,474 Da34. השתמש ב-PBS (100 mM, pH 7.0) או במאגר SPR כריק, ומדוד את ריכוז החלבון בשלושה שלבי דילול (1:1, 1:10 ו-1:100).

Figure 2
איור 2: רצפי CV-N והבעה . (A) CVN2 ללא קישור בין כל חזרה של CV-N (101 חומצות אמינו כל אחת) וארבעה גשרים דיסולפידיים מבוטא בווקטור pET11a ב-E. קולי. (B) ביטויים של שתי מושבות עצמאיות עבור CV-N (מונומר) ו-CVN2 (דימר). (C) גרסאות הקשר הדיסולפידיות מטוהרות ומנותחות ב-SDS-PAGE. סמן משקל מולקולרי נמוך (6 μL) משמש כהפניה. WT = CVN2L0 הנושא ארבעה גשרים דיסולפידיים כפי שמסומנים ב-(A). V2 הוא גרסה עם החלפת קשר דיסולפידית על ידי שאריות קוטביות בעמדות 58 ו-73. V3-V5 הן גרסאות עם שני קשרי S-S שנותרו וקוטביות (C58E-C73R) או לא-קוטביות (C58W-C73M) המחליפות חומצות אמינו או שילוב של תחליפי זוגות שאריות אלה. (D) כרומטוגרמות HPLC של CVN2L0 מטוהרות מלוטות בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה עם שיפוע ליניארי מ-5%-65% מאגר B במאגר A מעל 30 דקות. חיץ A הוא: 0.1% (v/v) חומצה טריפלואורואצטית ב-ddH2O, חיץ B הוא: 0.08% (v/v) חומצה טריפלואורואצטית באצטוניטריל. חלבון מנותח על עמוד ג'ל סיליקה בעל ביצועים גבוהים 300-5-C4 (150 x 4.6 מ"מ) ב-214 ננומטר ו-280 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

7. ספקטרוסקופיית SPR

  1. השתמש במערכת SPR דו-ערוצית (ראה טבלת חומרים) עם מאגר פועל HBS-EP(+) ו-10 mM גליצין HCl pH 1.5-1.6 כמאגר ההתחדשות. הפעל את המכשיר, degasser, דוגם אוטומטי, משאבה ולשטוף את המערכת כולה עם ddH20 במשך 1 שעות. יש להניח את מאגר ההפעלה המוכן לשימוש בבקבוק נפרד.
  2. יש להפיל שמן אמרסיה על הגלאי ולהרכיב שבב חיישן זכוכית (ראו טבלת חומרים) המצופה בסרט זהב דק ובצדו העליון מתפקד עם הידרוג'ל קרבוקסימתילדקסטרן ישירות על הגלאי שמתחת לתא הזרימה בעל שלוש היציאות. תקן את ההגדרה על-ידי משיכת הטיפול כלפי מטה.
    הערה: C19RBDHC30M 200 ננומטר סטרפטווידין נגזר קרבוקסימתילדקסטרן הידרוג'ל עם צפיפות בינונית של ביוטינילציה תסמונת נשימתית חריפה חמורה coronavirus-2 חלבון RBD, הוא שבב חיישן מוכן לשימוש עם ליגנד משותק מראש.

8. בדיקת קשירת SPR לקשירת CV-N ל-HA, חלבון S ו-RBD

  1. שיתקו את הליגנדות החלבוניות לשבבי חיישנים לפי השלבים הבאים.
    1. פתח טבלת הפעלה על ידי לחיצה על טופס בשורת התפריטים והפעל עורך טבלאות בתוכנת SPRAutoLink המשולבת (ראה טבלת חומרים). בחר ולחץ על BASIC_Immobilization מרשימת טבלאות ההפעלה הזמינות ובצע את השלבים של ההליך הניסויי על מסך המחשב. עורך הדוגמאות המתאים שבו נעשה שימוש מוצג בפינה השמאלית העליונה.
    2. לחץ על עורך ערכת דוגמאות במקטע טופס כדי למלא את רשימת הריאגנטים עבור שני ארונות תקשורת הממוקמים בדוגם האוטומטי לניתוחים נוספים. לחץ על Autosampler Direct Control כ"כלי" בשורת התפריטים כדי להחזיר את המדפים קדימה או אחורה. בחר 4 °C כטמפרטורת ההפעלה.
      הערה: תוכנת SPR מאפשרת "שליטה ישירה במכשיר SPR" ו"שליטה ישירה במשאבה " באמצעות בחירת הכלים המתאימים, כמו גם טיפול בדגימה אוטומטית, ועל ידי לחיצה על טופס; ניתן גם להפעיל את עורך הטבלה, מתווה הנתונים או לאחר העיבוד כדי לבצע ניתוח נתונים. הקבצים נשמרים ישירות בספריית ברירת המחדל ומיוצאים כ- scrubber.files מהחלון שלאחר העיבוד.
  2. הפעל את המשאבה כדי להחדיר ddH20 על ידי לחיצה על כלים ושליטה ישירה משאבה ולהקליט נתונים על ידי לחיצה על SPR מכשיר שליטה ישירה, ובכל פעם התחל בחלונות החדשים שהופיעו. שים את ריאגנטים צימוד (שלב 8.3) בבקבוקונים 300 μL, לשים אותם לתוך מדפי autosampler ולהתחיל את שולחן ההפעלה על ידי לחיצה על הפעלה.
    הערה: משטחי השבב מותנים ב-pH 9.0 של חיץ גליצין של 10 mM או שהם נשטפים ב-1 M נתרן כלורי, 0.1 M נתרן בוראט בופר pH 9.0 כדי למצב משטח שבב שמקורו בקרבוקסיל עבור תערובת הפעלה EDC/NHS30.
  3. עבור אינטראקציה פשוטה זו בין חלבון לחלבון, השתמש בשבב CMD500D (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור יחידות אינדקס מיקרו-שבירה (μRIU) = 2500 - 3000 תא זרימה עם HA משותק ו- μRIU = 400 תא זרימה עם חלבון ספייק. בקצב זרימה של 15 μL/min, להזריק תערובת מימית ושווה של 0.4 M N-אתיל-N'-(דימתילאמינופרופיל) קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC*HCl) ו-0.1 M N-הידרוקסיוקסינימיד (NHS) על ידי יישום הצעדים הרציפים הבאים.
    1. מילוי מחדש של משאבת המילוי ב-25,000 μL/min, בצע התאמה בסיסית למשך 30 שניות, הזרקת 90 μL של תמיסת הפעלת דגימה (EDC/NHS) במשך 6 דקות זמן מגע, ולאחר מכן החזק למשך 5 דקות נוספות.
    2. חזור על מחזור זה לאחר שקו הבסיס פועל במשך דקה אחת ב-10 μL/min רק על תא הזרימה השמאלי (כחול) כדי להזריק ולשתק פפטידים מסונתזים כימית10, HA וחלבון ספייק ב-20 מיקרוגרם/מ"ל, ולאפשר את התאמת הבסיס הבאה עם ddH2O למשך 1.5 דקות לפני המרווה את משטח השבב המופעל עם 1 M אתנולמין HCl pH 8.5.
  4. החלף את הצינורות מהדוגם הנוזלי לדגה מ- ddH20 לבקבוק עם HBS-EP(+) (איור משלים 1).
  5. נתחו את חיישני ה-SPR.
    1. כדי לבצע מחקרים קינטיים, השתמש בריכוזי אנאליטים שונים (10-5-10-8 M), עם שלב התחדשות לאחר כל זריקה ומדידות ריקות לאחר אנליזות שונות. שנה את קצב הזרימה ל-10 μL/min והתחל בזריקות למשך 4 דקות זמן מגע, לאחר מכן 5 דקות ייצור בסיסי, ושני שלבי התחדשות של 2 דקות כל אחד עם מרווח של 30 שניות.
    2. הזריקו את תמיסת המאגר למדידות ריקות שהחיישנים שלהן מופחתים מריצות דגימה כדי לנרמל ריכוזי חלבונים שונים.
  6. לחץ על טופס, גלול מטה ושנה ל"לאחר עיבוד "על ידי לחיצה על מצב פעולה זה. לחץ על הוסף כדי לבחור עקומות איגוד שנוצרו לאורך זמן בטופס התוויית הנתונים עבור כל תא זרימה, וייצא את שכבת העל כקובץ scrubber ( .ovr). לחץ על קובץ כדי לפתוח את אפשרויות שמירת הקבצים. השג עקומות תגובה על-ידי יישור עקומות לשמאל ולימין והפחתת אותות של ערוץ הייחוס השני מאלו של ערוץ הליגנד.
    הערה: הנתונים מופעלים ב"לאחר עיבוד" על ידי הגדרת חיישנים באופן חישובי. הוא מוכנס לתוך שכבה של חיישנים מתאי זרימה שמאליים וימניים, או מיוצג כסנסוגרמות מההפרש של שני הערוצים.
  7. נקו את כל הנוזלים עם pH 9.5 של מאגר גליצין של 50-100 mM, מים ו-20% אתנול לפני ואחרי מדידות קשירה כדי להסיר עקבות של מלח או כל זיהום חלבוני, או מחמיר יותר, עם 0.5% SDS וגליצין.
    הערה: כדי למנוע נזק למכשיר, מומלץ לבדוק את היציבות המכנית של שבב הזכוכית לפני הכנסה מחדש של מחסנית השבב למכשיר אם השבבים אוחסנו מתחת למאגר או בלחות של 100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מולקולת CVN2L0 שהוחלפה על-ידי תחום דימרי נבדקת להיקשרות לאזור העליון של HA בשלושה ניסויי SPR נפרדים, וזיקת הקישור מוצגת בערכיK D. ההנחה היא שתחום B כולל אתרי קשירה H, המושפעים מהחלפת קשר דיסולפיד בשאריות יוניות, ותחום A יוצר L10,18. הזרקות בודדות של CVN2L0 וגרסאות V2 (שלושה גשרים דיסולפידיים) ו-V5 (שני גשרים דיסולפידיים) נבדקות תחילה לצורך קשירה לשבב החיישן המצומד ל-HA כדי להעריך את יכולות הקישור לפני הגדרת מדידת הקינטיקה באמצעות הדגימה האוטומטית ועורך טבלת הריצה (איור 3A ואיור משלים 2). הזרקות חוזרות ונשנות הן אוטומטיות עבור סדרה של CVN2L0, V2 ו-V5 בריכוזים שונים בתחום הננומולר והטוחנות μ במערכת לאורך זמן (איור 3B-D). בקורלציה בין מספר קשרי Cys-Cys שלמים, CVN2L0 מחייב HA משותק ב- KD = 255 nM כאשר מגיעים לרוויה טובה. במקרה זה, שני ערכיK D, המחושבים מנתונים קינטיים או על ידי התאמת נתוני שיווי המשקל לאיזותרם המחייב של Langmuir, נמצאים בהסכמה מתונה (טבלה 1 ואיור משלים 3, איור משלים 4).

Figure 3
איור 3: בדיקת קשירת SPR לקשירת ליגנד באמצעות אינטראקציות רב-ערכיות. CVN2 (WT) וגרסאות האתר המחייבות V2 ו-V5 עם תחליפי דיסולפידים בכיס קושר הפחמימות בעל זיקה גבוהה נבדקים לקשירת HA משותק קוולנטית. (A) ניתן לחלץ עקומות קשירה של תאי זרימה שמאליים וימניים של CVN2, V2 ו- V5 מפרוטוקול ההפעלה SPR, וחיישנים מסוכמים בשכבת-על. (B) סנסוגרמה מניסוי SPR קונבנציונלי שהוצגה כאנליזות קינטיות לקשירת CVN2L0 ל-HA, הזרקת ריכוזי אנליטים מ-10-4 ל-10-8 M. CVN2L0 נמדדת עד לריכוז הגבוה ביותר ב-1.5 מיקרומטר (שורה עליונה) ועד 500 ננומטר (שורה תחתונה), שעבורו לא מושגת רוויה על משטח השבב או קשירת שיווי משקל. RU = יחידות תגובה. נעשה שימוש בשבב חיישן CMD500D. (C) חיישן SPR לקשירת V2 ל-HA. (D) V5 מחייב ל-HA. האיור (B-D) מועתק באישור הפניה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ka (M-1 s-1) קד (S-1) קד [הא]
קינטית		 קד [הא]
שיווי משקל
CVN2 5.1 ה3 1.3 x10-3 255 נאנומטר 246 נאנומטר
V2 4.0 ה3 1.1 x10-3 275 נאנומטר 255 נאנומטר
V5 1.2 ה3 5.8 x10-2 5 מיקרומטר 4.9 מיקרומטר
CVN2L0 2.07 ה4 3.0 x10-3 147 נאנומטר 600 נאנומטר
2.27 ה4 3.0 x10-3 133 נאנומטר 490 ננומטר

טבלה 1: זיקות מחייבות של CVN2 וריאנטים ל-HA שנמדדו באמצעות SPR. Scrubber 2.0 (תוכנת BioLogic) מנוצלת כדי להתאים לעקומות שיוך SPR ודיסוציאציה בזמן אמת ולחישוב קבועי הדיסוציאציה של שיווי המשקל (KD) מנתונים קינטיים ושיווי משקל. Ka = קצב אסוציאציה קבוע. Kd = קבוע קצב דיסוציאציה.

בעוד שערכיK D לקשירת CVN2L0 ו-V2 ל-HA נמצאים שניהם בתחום הננו-מולר, V5 פוחת בכריכה (טבלה 1). ב-V5, שני קשרים דיסולפידיים מוחלפים על-ידי שאריות זיווג יונים שמפעילות מחדש אינטראקציות יוניות פוטנציאליות בין שאריות Glu ו-Arg שעברו מוטציה (איור 2A,3D). נתונים ראשוניים מנותחים בעקבות קצב השיוך המשולב וקצב משוואות הדיסוציאציה, המתארות את הקינטיקה המחייבת של האינטראקציה של CV-N מסיס עם ליגנד משותק ואת הדיסוציאציה של הקומפלקס שנוצר משטח השבב. מבוצעות שתי מדידות בלתי תלויות, ומנותחות סנסיגרמות, שוות ערך לאלה המתקבלות משכפלים. KD מחושב כמניין של koff/kon (טבלה משלימה 1)10,35. עם זאת, KD קשור לנתוני שיווי המשקל המתאימים לאיזותרם קשירת לנגמיור 36, כאשר תגובת קשירת שיווי המשקל משורטטת כפונקציה של ריכוז האנליטים (איור משלים 3A,4A,3B,4B). באופן תלוי ריכוז, קבוע קצב הדיסוציאציה kd נקבע לאחר ניתוחים ומשולב בהתאמת שלב האסוציאציה (kon) כדי להעריך את קבוע קצב השיוך ka. (לוח 1, איור משלים 3C, איור משלים 4C).

לאחר מכן, הכריכה של CV-N ל- HA מושווית לאינטראקציה שלה עם RBD. קשירת CV-N WT ל-SARS-CoV-2 RBD נמדדת בזיקה חלשה יותר (K D = 260 μM, איור 4A) בהשוואה להיקשרות ל-HA (KD = 5.7 ננומטר)8,10,12 וקשירה לחלבון S (KD = 18.6 μM, איור 5). ריכוז לעומת תגובה משורטטים עבור קשירת CV-N WT ל-RBD, בהנחה שמיקוד ספציפי של פחמימות שאולי נשמרו בתת-היחידה RBD S1 (איור 4A). אותה עלילת זיקה מוצגת עבור קשירת CVN2L0-V4 ל-DM שאינה ניתנת עוד לניתוח עקב החלפת קשרים דיסולפידיים המפריעים לקשירת זיקה גבוהה לפפטידים גליקוזילים קטנים (איור 4B).

CVN2L0-V4 (2 קשרים דיסולפידיים הפוכים להחלפה לא סימטרית של שאריות ציסטאין על ידי שאריות גלו-ארג או חומצות אמינו אמפיפתיות Trp ו-Met) יכולים ליצור רשתות קשרי מימן לא קוטביים סביב האתר המדומה B לקשירת פחמימות10. צפיפות גבוהה יותר של גליקנים על חלבון HA מגיעה להיקשרות עם שאריות Glu-Arg קוטביות במקום ציסטינים (טבלה משלימה 1), וקשר עם פפטידים מנוזילים (KD = 10 μM עבור DM) בין CVN2L0 ושינויים לתוך Glu-Arg, אך מראה דיסוציאציה לא רציפה של גרסאות מפפטיד מונוגליקוזילט זה, בפרט כאשר H משתנה על שני המונומרים. עבור האינטראקציה בין CVN2L0-V4 עם DM, התגובה של הזרקת 56 μM CVN2L0-V4 מניבה תגובה גבוהה יותר מאשר Rמקסימום. (איור 4B). V5 (2x Glu-Arg) נכשל בדיסוציאציה מ-DM הקשור לפני השטח (הנתונים אינם מוצגים). לסיכום, עקומות התגובה של ריכוזים נמוכים יורדות לפני סיום ההזרקה עבור כל החיישנים ב- CVN2 קושרים לפפטיד ללא קשירת H מקורית ומונומר ל- RBD.

Figure 4
איור 4: ניתוחי SPR של (A) מונומר CV-N WT המחייב ל-RBD. K D מחושב על ידי התאמת נתונים קינטיים (צד שמאל, K D = 260 μM) ומושווה לנתוני זיקה (צד ימין) באמצעות מודל ביומולקולרי פשוט לקשירת 1:1 בין ליגנד לאנליטי (K D equil = 274 μM). תגובת קשירת שיווי משקל או יכולת קשירה משורטטת כפונקציה של ריכוז בהשוואה לעקומות הקשירה SPR (0-605 μM CVN). H = אתר קשירה בעל זיקה גבוהה. L = אתר קשירה בעל זיקה נמוכה. שניהם נמצאים ב-CV-N וב-CVN2L0. (B) דימריק CVN2L0-V4 נקשר ל-DM, בהנחה של 2L ללא KD הניתן לניתוח. ריכוזי CVN2L0-V4 הם 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3.5 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: מוטציה CVN-E41A ו-CV-N WT נקשרים לגליקופרוטאין (A) S. החצים מציינים את תחילת שלב האסוציאציה והדיסוציאציה. (B) קשירת CVN-E41A ל-RBD ב-SARS-CoV-2. הליגנדות משותקות מראש על שבבי חיישנים מסוג HC polycarboxylate ו-CMD500D. יחידת המשנה Covid-19 S1 [Pinto, D. et al.26; ו- Barnes, C. et al.37] משמשת לאימוביליזציה של RBD. קצב זרימה: 30 μL / min, 25 ° C; נתונים גולמיים מתווים. לשם השוואה, מתוארת קשירת נוגדנים בסרום הדם האנושי ל- RBD עם מקדם דילול של 1:200. (C) בדיקת SPR של CV-N WT הנקשרת לגליקופרוטאין S המשותקת לרמת תגובה של 400 μRIU כדי ללכוד CV-N. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הוכח בעבר כי CV-N מונומרי עם L יחיד אינו יכול לקשור מספיק gp120, אך יכולת הנטרול של CV-N דורשת קישור צולב של שני אתרי קשירת פחמימות והיא משוחזרת בעיקר על ידי דימריזציה כדי לתפקד עם 2H12,19. לפיכך, מוטציה מונומרית CVN-E41A באה לידי ביטוי, אשר חשודה כמערערת את היציבות של תחום B או יכולה להפריע לקישוריות עם התחום השני A, כמו שנמצא ב- CV-N WT. CVN-E41A מונומר חושף יציבות בעת קשירה לחלבון S בדומה למונומר CV-N. אף על פי שתגובת SPR עבור ריכוזי אנליטים של 605-680 μM גורמת ליחידות תגובה גבוהות ולחיישני SPR טיפוסיים עבור קשירת CV-N WT ו-E41A, בהתאמה, המוטציה אינה יציבה כאשר היא מדוללת (איור 5).

איור משלים 1: חיישן SPR ללכידת חיקוי DM כחלק מהחלק העליון של שפעת HA. צילום מסך: תרשים נתוני SPR המציג את פרוטוקול הריצה של SPR לאימוביליזציה של DM על שבב חיישן SPR CMD500D, המצופה בהידרוג'ל קרבוקסימתיל דקסטרן 500 ננומטר ומתאים לניתוחי קינטיקה של אנליזות בעלות משקל מולקולרי נמוך על צפיפות ליגנד גבוהה. שבבי חיישנים מותקנים ישירות על הגלאי עם שמן אמרסיה ומקובעים מתחת לתא זרימה בעל שלוש יציאות. לאחר מרווה את משטח השבב המופעל עם 1 M אתנולמין HCl pH 8.5, CVN2 מוזרק פעמיים (ריכוז = 1 μM ו 2 μM, בהתאמה). סגול: ההבדל בין תא זרימה 1 לתא זרימה 2; התגובה נרשמת במרווח של 0.2 שניות כחול: תא זרימה 1: 3000-4000 יחידות מיקרו-שבירה אינדקס שבירה (μRIU) מצופות מתמיסת 400 ננומטר של הליגנד DM למשטח קרבוקסילי מופעל. אדום: תא זרימת הפניה 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: הפעלה ידנית על שבב חיישן CMD500D המתפקד על-ידי HA, המציג קשירה של CVN2L0-V5, V2 ו-CVN2L0 דימריים. בקצבי זרימת החדרה של 30-50 μL/min, CVN2L0 וגרסאות קשר דיסולפידיות המבוטאות בתג His-ומטוהרות מעל Ni-NTA מוזרקות בטווח האמצעי של μM ונבדקות לקשירת HA עם שלב אסוציאציה של 3 דקות ושלב דיסוציאציה של 2 דקות. ההזרקות הן V5 (15 μM), V2 (2.4 μM), 0 μM, CVN2L0 תת-שיבוט מחלבון פיוז'ן SUMO (1 μM), ו- CVN2L0 (2 μM). חיץ ריצה ב- pH פיזיולוגי משמש לכל הניסויים ב- 25 מעלות צלזיוס. כל התמיסות מתפרקות ומסוננות (0.2 מיקרומטר) לפני ההזרקה למערכת. סגול: ההבדל בין תא זרימה 1 לתא זרימה 2; התגובה נרשמת במרווח של 0.2 שניות. כחול: תא זרימה 1: 2540 μRIU HA. אדום: תא זרימת הפניה 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: CVN2 נקשר ל-HA. ניתוח של חיישנים כאשר עקומות מיושרות באופן אוטומטי. (A) חיישנים מאופסים ומיושרים באמצעות תוכנת Scrubber (משמאל) ואיזותרמים קושרים המציגים עקומת תגובה תלוית ריכוז לאנליטים מאוגדים (מימין). (ב) איזותרם מחייב המבוטא באחוזי קיבולת. (C) עקומות האסוציאציה התיאורטית והדיסוציאציה המותאמות באופן חישובי. (D) נתוני קינטיקה על חיישני SPR ללא עקומות מותאמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: CVN2 מחייב ל-HA. ניתוח של חיישנים כאשר עקומות מיושרות באופן ידני. (A) חיישנים מאופסים ומיושרים באמצעות תוכנת Scrubber (משמאל) ואיזותרמים קושרים המציגים עקומת תגובה תלוית ריכוז לאנליטים מאוגדים (מימין). (ב) איזותרם מחייב המבוטא באחוזי קיבולת. (C) עקומות האסוציאציה התיאורטית והדיסוציאציה המותאמות באופן חישובי. (D) נתוני קינטיקה על חיישני SPR ללא עקומות מותאמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: נתונים קינטיים המתקבלים מחיישני SPR לקשירת גרסאות הקשר CVN2L0 ו-Cys-Cys V2, V4 ו-V5 ל-HA באמצעות מודל קשירה של Langmuir 1:1. KD [M] = k כבוי/k מופעל  או kd/ka. כל הנתונים נוצרים ב-25 °C במאגר HBS-EP(+): אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיקת הקשירה של CV-N מתואמת עם מספר אתרי הקישור הפונקציונליים [2H על דומיינים B, ו-2L על דומיינים A כאשר הם מהונדסים כדימר מוחלף דומיין]. גרסה עם זיקה מחייבת משתנה (CVN2L0-V2, קפל יציב הומודימרי של CV-N הכולל נוק-אאוט של גשר דיסולפיד) מתבטאת ב- E. coli, מטוהרת, ונבדקת חיובית לקשירת חלבון HA (H3N2) באמצעות SPR10, ומראה שינוי קונפורמי בעת קשירת HA עם אתרי קשירת פחמימות H או L ו- KD1 = 49 nM ו- KD2 = 8 μM38 . ככל שמספר הגשרים הדיסולפידים ליד כיס ההתמקדות בגליקן ב-CVN2 ירד מ-4 ל-2, הזיקה לחלבון HA פחתה (איורים 3B-D וטבלה משלימה 1). גרסאות קשר דיסולפידיות נוצרות על ידי החלפת Cys והכנסת זוגות שאריות קוטביות Glu - Arg עם יציבות פוחתת מעט. הווריאנטים מייצגים את אותה מולקולה, וארבעת אתרי הקשירה הם פונקציונליים, אם כי קשירה מרובת אתרים על השבב מושפעת מכל הווריאנטים בהתבסס על שני תחליפי דיסולפידים. החלפה לא-קוטבית של שני הקשרים הדיסולפידיים בשני כיסי הקישור בעלי הזיקה הגבוהה יוצרת גרסה CVN2L0-V3, הקושרת באופן פעיל את ה-HA-פפטיד הן בצורתו המונומנוזילית והן בצורתו הדימנוזילית. האינטראקציות עם CVN2L0-V3 מאושרות לריכוזים מיקרומולריים וקשירה עם הפפטידים הסינתטיים (MM ו-DM) בתמיסה באמצעות STD-NMR. יש לציין כי ניסויי קשירת CVN2 SPR ל-MM אינם ניתנים לניתוח בשל חישוב לא מספיק שלR max, חיסרון כללי של טכניקת SPR, וזיקות קשירה חלשות ל-MM10 המשותק. צפיפות ליגנד מוגברת של פפטיד זה ופפטידים אחרים מפחיתה את הסלקטיביות המחייבת. באמצעות SPR, CVN2L0 דימריק (2H+2L) עם יציבות גבוהה מראה קשירה רב-ערכית ל-HA, המתבטאת בתאי חרקים, וספציפיות לדימנוז על ביומימיקריה מהונדסת כימית אחת עבור אוליגוסכרידים בעלי מנוז גבוה, בהנחה של מודל מחייב 1:1. קשירה לאוליגו-מנוזידים נמדדת בדרך כלל על ידי קלורימטריית טיטרציה איזותרמית, הדורשת ריכוז גבוה יותר של ליגנד כנגד הלקטין17.

קשירה תחרותית למונומנוז או לכל גליקן קטן יותר מ-Man(7) לא נמצאה לפני אף אחדמה-15, מה שמעיד על מעורבות הקישור הכימי עם עמוד השדרה הפפטידי בהכרה בגליקנים אלה. מספר הקישורים בין מנוז למנוז במטרה היה מגוון, ופענח אינטראקציות טריפטופן בכיס הגליקן בעל הזיקה הגבוהה. סוג השינוי של פפטידים עם מונומנוז המקושר לטריאזול או דימנוז המקושר לטריאזול עשוי לקבוע ערכיK D, במיוחד ל-H. בנוגע לזיקות מחייבות של CVN2L0 (2H+2L) ו-CVN2L0-V2 (1H+2L) ל-DM, kכבוי הוא גבוה פי 10 לכל היותר לגבי דיסוציאציה של CVN2L0-V2 מ-DM לעומת HA10. מלבד מדידת קבועי קצב קינטי, SPR מאפשר להעריך את קבועי שיווי המשקל עבור מערכות שיווי משקל איטיות מאוד מבלי להגיע לשיווי משקל בפועל (טבלה 1). לעומת זאת, kon מבטא ערכי תגובה יחסיים טובים עבור כל עקומות הקישור של CVN2L0 שהוחלפו בתחום וגרסאות הקשר הדיסולפידיות שלו (V2, V4 ו-V5) ל-HA (טבלה משלימה 1), או DM, בעוד שקבוע קצב הדיסוציאציה koff מציג קצבי יציאה מהירים יותר עבור V4 ו-V5, שתי גרסאות הנושאות שני L פונקציונליים, ו-V4 עם KD שאינו ניתן לניתוח בנוגע ל-DM (איורים 4B ). הקצאת תחום B לתחום H ולתחום A בהתאמה L היא ממצא קודם המהווה בסיס לגרסאות הקשר הדיסולפידיות כדי לחשוף זיקות מחייבות שונות ב- SPR, שצוינו, ל- HA18,28.

SPR הוא אחד הכלים המובילים לניתוח אינטראקציות ביומולקולריות במחקר ביו-רפואי35. אם שליטה ספציפית ומתוזמנת בריכוז האנליטים בתפזורת אפשרית במכשיר SPR, הערכה כמותית של הקינטיקה של התקדמות הקשירה בין מקרומולקולות אפשרית, עם עניין גובר בניתוח קומפלקסים מרובי חלבונים39. האתגר בשימוש בו הוא המיקום המבוקר של אחד ממרכיבי האינטראקציה על משטח ההידרוג'ל קרבוקסימתיל הנמצא בשימוש נרחב, או HC polycarboxylate hydrogel, הלוכד ביומולקולות קטנות וגדולות. כדי לייעל את יכולת האימוביליזציה והקשירה של משטח השבב, אימוביליזציה של כריך סטרפטאווידין-ביוטין ואימוביליזציה באמצעות חלבון His-tag לנוגדן נגד שלו זמינים40. המאפיינים הביופיזיקליים של חלבונים או קבוצות פונקציונליות של מולקולות קטנות עשויים להפריע לתוצאות אימוביליזציה, אך כל קושי נחווה עם הגליקופרוטאינים והגליקופפטידים המתוארים להלן, הקשורים באופן קוולנטי באמצעות כימיה של EDC/NHS. הגליקנים המשותקים, או גליקופרוטאין או גליקופפטידים מונוגניים או דימנוסילטים סינתטיים, משמשים על שבבים הניתנים לשימוש חוזר כדי לסנן גרסאות CV-N מהונדסות שונות, ומבחני קשירה מוחלים על לקטינים מטוהרים במלואם ומבוטאים באופן רקומביננטי. זיהומים בתמיסת חלבון מוזרקת פוגעים במערכת תעלות SPR. אף על פי שהליכים ניסיוניים מתוארים במערכת מבחנה במחקר זה, דפוס הגליקוזילציה על קוצים נגיפיים עשוי להיות מזוהה באופן סלקטיבי על ידי כל ריכוז אנליטי של חלבון מודל קטן זה כפי שהוזרק לאורך זמן עם מגבלת העברת מסה אופטימלית36. הגודל של CV-N הוא ~ 11 kDa ותומך בנתוני SPR הניתנים לשחזור עבור קשירתו לחלבוני ספייק ויראליים.

ספציפיות הקשירה של CV-N לגליקנים בעלי מנוז גבוה מאושרת על ידי האינטראקציה המקשרת הדו-ערכית עם הפפטיד הדימנוזילי המימטי במקום להיקשר לגליקנים פונקציונליים מבחינה מבנית ולפפטיד החד-מנוזילי באמצעות קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (הנתונים לא מוצגים). גרסה עם המוטציה הנקודתית Glu41Ala מבטאת את החלבון המונומרי 101-שאריות עם שני אתרים קושרי פחמימות שלובים זה בזה על כל פרוטומר. לכן, אתר מוטציה זה מבטל שאריות מגע בין אתרי הפחמימות בעלי זיקה גבוהה ונמוכה ומפחית את חוזק הקשירה המולקולרית ל-N-אצטיל-D-גלוקוזאמין. קשירה של CVN-E41A לחלבון ספייק SARS-CoV-2, הנושא גליקוזילציה מסוג N ו-O-גליקוזילציה, מושגת ב-SPR, אך קשירת CV-N לספייק זה היא גם עבור חלבון הספייק וגם עבור RBD ללא רלוונטיות פיזיולוגית, כפי שנמדד בריכוזים מיקרומולריים (איור 4,5).

פפטידים מאנוזיליים שפותחו ונוצרו במחקר זה משמשים כפיגומי חלבון כדי לסנן את מאפייני הקישור של החומרים האנטי-ויראליים על ידי SPR ו-NMR, מכיוון שהם מייצגים ליגנדות בלתי פוסקות עבור מבחני קשירת פחמימות המחוברים לרצף חומצות אמינומוגדר 10. יתר על כן, ספקטרוסקופיית STD-NMR היא טכניקה נטולת תוויות, כגון SPR, המאפשרת אפיון של קשירת פחמימות על ידי בחירה קונפורמית 10,41. במסגרות כאלה, STD-NMR מאפשר פיתוח שיטות סינון מהירות לספרייה גדולה של תרכובות לזיהוי ליגנדות ביו-אקטיביות באמצעות קשירה, מיפוי אפיטופים וקביעה ישירה של KD בתנאי ניסוי שונים. ניתן לקבל ערכיK D מדויקים על ידי ניתוח עקומת האסוציאציה של חלבון-ליגנד תוך שימוש בערכי STD בגבול זמן הרוויה האפסי41,42. לכן, החקירה של אינטראקציות חלבון-ליגנד על ידי שיטת STD-NMR הושלמה, אבל KDs מחושבים על מערכת SPR.

על פי הערכות, נגיף הקורונה האנושי 2019-nCoV (נגיף הקורונה החדש של ווהאן-הו-1-2019) שונה בין 11 (מתוך 18) אתרי גליקוזילציה חזויים הקשורים ל-N ל-SARS-CoV43. מיפוי אפיטופ/פראטופ חושף כמה יחסי גומלין עם N-גליקנים שמקורם בפונדקאי ותרומות זניחות של היפרמוטציות סומטיות של נוגדנים למגעי אפיטופ37. היכולת של לקטינים אנטי-ויראליים ונוגדנים מנטרלים באופן נרחב לקשור אפיטופים שמורים מאוד על גליקופרוטאין שפעת HA חשובה ביותר לתכנון הרציונלי של חיסונים לשימוש מונע וטיפולי. עם זאת, יש צורך בחקירה נוספת כדי להעריך את ההשפעה של גליקוזילציה N-הקשורה למערכת החיסון סביב אתר הקישור של קולטן המארח. הנתונים עשויים לספק תובנה לגבי הפוטנציאל של חלבוני ספייק של הנגיף לברוח מנוגדנים המתעוררים במהלך ההדבקה או לקשור CV-N שאינו אימונוגני, ובכך להנחות תכנון חלבונים חישובי מבוסס מבנה עבור גרסאות CVN2 אנטי-ויראליות חדשות וממוטבות. לעומת זאת, הזיקה של מוטציה של חומצת אמינו Fc גליקוזילית לקולטן שלה כדי לעורר פונקציות אפקטים in vivo, משתמשת בהרכב של אתרי גליקוזילציה, ומספר הגליקנים המעורבים, עשויה לפיכך להיות חשובה לזיקה מחייבת, אך לא ניתן לקבוע אותה ליכולת נטרול.

יחד, פחות רוטמרים צפויים לקשור ליגנדות פחמימות לחלבונים על ידי תכנון חלבונים חישובי מאשר אינטראקציות חלבון-חלבון בלבד. CVN2 המוחלף בתחום, לעומת זאת, הנושא מספר שונה של אתרי קשירת פחמימות, מספק את היציבות והגמישות הדרושות כדי לחשוף זיקות-קשירה שונות המיוחסות ל-H וליצור את האינטראקציות הרב-ערכיות בין צבירי אוליגומנוז על קוצים של מעטפת נגיפית ונוגדנים מנטרלים (NAb), ובכך לאפשר אימות ניסיוני של מבחני עיכוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחבר אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחבר מודה לד"ר כריסטיאן דרנטל מהמחלקה לביוטכנולוגיה ומיקרוביולוגיה ב- TU Wien והמחלקה לרפואה III, המחלקה לנפרולוגיה ודיאליזה באוניברסיטה הרפואית של וינה, במיוחד ד"ר מרקוס ורמן על תמיכה טכנית ומדעית. ביטוי חלבונים בתאי יונקים נתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה באוניברסיטה למשאבי טבע ומדעי החיים (BOKU) וינה. המחברת רוצה להביע את התודה העמוקה שלה לד"ר ניקו דנקבר מ- XanTec bioanalytics בדיסלדורף, גרמניה, על דיונים מדעיים מועילים על ביצוע מבחני הכריכה של SPR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta primeplus Cytiva
Amicon tubes Merck C7715
Ampillicin Sigma-Aldrich A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B06320
Cell spreader Sigma-Aldrich HS86655 silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos Sigma-Aldrich OLIGO
Custom Gensynthesis GenScript #1390661  cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL Thermo Scientific 50-105-5354
Dionex UlitMate 3000 Thermo Scientific IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)  Fisher Scientific ER1701
DTT Merck DTT-RO
EDC Merck 39391
EDTA Merck E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge Sigma-Aldrich Z606235
Ethanol Merck 51976
Ethanolamine HCl Merck E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack Corning 352057
Glucose Merck G8270
Glycine HCl Merck 55097
HA H3 protein Abcam ab69751
HEPES Merck H3375
His-select Ni2+ Merck H0537
Imidazole Merck I2399
IPTG Merck I6758
Kanamycin A Sigma-Aldrich K1377
Kromasil 300-5-C4 Nouryon
LB agar Merck 52062
LB agar Merck 19344
LB Lennox Merck L3022
Lysozyme Merck 10837059001
Magnesium chloride Merck M8266
Magnesium sulfate Merck M7506
NaH2P04 Merck S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer Thermo Scientific ND2000CLAPTOP
NaOH Merck S5881
NHS Merck 130672
NZ amine (casein hydrolysate) Merck C0626
PBS Merck 806552
PD MidiTrap G-10 Sigma-Aldrich GE28-9180-11
Peptone Merck 70171
pET11a Merck Millipore (Novagen) 69436 
PMSF Merck PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) Qiagen 27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9 Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis Reichert
SDS Merck 11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid Stratagene #200518
Sodim chloride Merck S9888
Sodium acetate.Trihydrate Merck 236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M XanTec bioanalytics SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D XanTec bioanalytics SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Scientific 101R20
TBS Merck T5912 10x, solution
Triton-X100 Merck T8787
Tryptone Merck 93657
Tween20 Merck P1379
Vortex-Genie 2 Mixer Merck Z258423
X-gal Merck XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene #200236
Yeast extract Merck Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 184 ציאנובירין-N תהודת פלסמון פני השטח הפרש העברת רוויה-NMR קוצים במעטפות גליקאן גליקופרוטאין רקומביננטי
הנדסת חומרים אנטי-ויראליים <em>באמצעות</em> תהודה פלסמונית על פני השטח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maier, I. Engineering Antiviral… More

Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (184), e63541, doi:10.3791/63541 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter