Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ingeniør antivirale midler via overfladeplasmonresonans

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63541
Automatic Translation
1,2
1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

Summary

Den nuværende protokol beskriver nye værktøjer til SPR-bindingsassays til undersøgelse af CV-N-binding til HA, S-glycoprotein, relaterede hybrid-type glycaner og oligosaccharider med høj mannose. SPR bruges til at bestemme KD til binding af enten dimerisk eller monomer CV-N til disse glycaner.

Abstract

Overfladeplasmonresonans (SPR) bruges til at måle hæmagglutinin (HA) binding til domænebyttet Cyanovirin-N (CV-N) dimer og til at overvåge interaktioner mellem mannosylerede peptider og CV-N's bindingssted med høj affinitet. Virus kuvertspidser gp120, HA og Ebola glycoprotein (GP) 1,2 er blevet rapporteret at binde både bindingssteder med høj og lav affinitet på dimerisk CVN2. Dimannosyleret HA-peptid er også bundet på de to bindingssteder med lav affinitet til et konstrueret molekyle af CVN2, som bærer et sted med høj affinitet for den respektive ligand og muteret for at erstatte en stabiliserende disulfidbinding i kulhydratbindingslommen, hvilket bekræfter multivalent binding. HA-binding er vist til et bindingssted med høj affinitet af pseudo-antistof CVN2 ved en dissociationskonstant (KD) på 275 nM, der yderligere neutraliserer human immundefektvirus type 1 (HIV-1) gennem oligomerisering. Korrelation af antallet af disulfidbroer i domænebyttet CVN2, som reduceres fra 4 til 2 ved at erstatte cystiner i polære restpar af glutaminsyre og arginin, resulterer i reduceret bindingsaffinitet til HA. Blandt de stærkeste interaktioner er Ebola GP1,2 bundet af CVN2 med to bindingssteder med høj affinitet i det nedre nanomolære område ved hjælp af konvolutglycan uden et transmembrandomæne. I denne undersøgelse måles bindingen af det multispecifikke monomere CV-N til alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein ved K D = 18,6 μM sammenlignet med nanomolær KD til de andre virusspidser og via dets receptorbindende domæne i det midterste μ-molære område.

Introduction

Tetherin-associeret antiviral aktivitet induceres af interferon-α, og det omfatter proteinbaserede tethers, der fører til tilbageholdelse af fuldt dannede virioner på inficerede celleoverflader1. Nødvendigheden af tetheringlycosylering ved hæmning af virusfrigivelse er fortsat usikker, hvilket indebærer betydningen af glykosyleringsmønstre på rekombinant udtrykte glycaner til in vitro-undersøgelser 1,2, hvilket afhænger af konformationen af (i tilfælde af influenzavirus) overfladeudtrykt influenzahæmagglutinin HA 3,4 . Det er blevet bemærket, at modifikation af oligosaccharid bundet til N-bundet glykosylering er tilstrækkelig til tetherinmedieret begrænsning af HIV type-1-frigivelse2, mens dimerisering spiller en væsentlig rolle i forebyggelsen af virusfrigivelse og derved involverer transmembrandomænet eller glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) -anker til tøjring af de spirende virioner5 . Unikke funktioner er beskrevet for human og murine tetherin til at blokere flere indhyllede vira, retrovirus og filovirus. BST-2/tetherin er et interferoninducerbart antiviralt protein af den medfødte immunitet1,6, der virker med bredspektret antiviral aktivitet og modarbejdes af kuvertglycoproteiner5 for enten at translokere tetherin eller forstyrre strukturen af tetherin6. For eksempel er overfladeudtrykt kuvertglycoprotein HA og neuraminidase på influenza A-virus velkendte for tetherinantagonisme på en stammespecifik måde7, hvilket letter genkendelsen af værtsreceptorbindingssteder8. Glykanmålretningsantistoffer undersøges i støkiometrien af deres interaktioner med de hurtigt tilpassede glycanskærme på HA, hvilket resulterer i bindingsaffinitet til influenza A H3N2 og H1N1 undertype4.

For at belyse bindingsmekanismerne mellem antivirale midler og viruskuvertspidser, dvs. kulhydratligander og komplementære immunologiske og spektroskopiske metoder, syntetiseres mono-, di- og tri-mannose-dele kemisk. De mannosylerede peptider dannes via azidoglycosylering af glycosyl {beta}-peracetater til 1,2-transglycosylazider transformation9, der efterligner de typisk fundne N-acetylglucosamin og høj-mannose oligosaccharider på overfladen af livstruende vira. Triazolbioisosterer anvendes til at efterligne bindinger, der danner den mannosylerede rest af HA-peptid10 og lette stedspecifikke interaktioner med antivirale CV-N-derivater omkring det andet N-bundne glykosyleringssted på HA-hoveddomænet (HA-top med 4 N-bundne glycaner N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Interaktioner mellem glutaminsyre (Glu) og arginin (Arg) og den resulterende helixdipol manifesterede god stabilitet af både modelpeptider og proteiner, men visualiseres ved hjælp af SPR. Hvis sammenlignet med at genkende et enkelt kemisk syntetiseret glykosyleringssted på HA10 ved direkte at hæmme receptorbinding på glycandelene, viser det sig, at en højere affinitet af en fire-site muteret Fc-struktur til dens receptor fremkalder effektorfunktioner in vivo, hvilket afslører, at den ikke-relaterede sammensætning af N-bundne glycaner bundet til Fc-mutant er mekanisk bestemt13.

CV-N viser antiviral aktivitet mod HIV 14,15, influenza16 og Ebola-virus, som medieres af nanomolær binding til oligosaccharidmodifikationer med høj mannose på kuvert spike-proteiner12,17,18,19. Influenza HA-binding til et kulhydratbindingssted med høj affinitet (H) i CV-N eller to Hs i kovalent bundet dimerisk CVN2 bestemmes til at have ligevægtsdissociationskonstanter (K D) = henholdsvis 5,7 nM (figur 1A) og KD = 2,7 nM. Både CV-N og CVN2 har en anden en eller to kulhydratbindingssteder med lav affinitet (L) s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 binder til 2H CVN2 med affiniteter i det nedre nanomolære område (KD = 26 nM). CV-N WT binding til Ebola GP1,2 og HA udviser affiniteter fra K D = 34 nM til KD = 5,7 nM (A / New York / 55/04)12. Lektiner, såsom CV-N, som specifikt er målrettet mod glycaner med høj mannose på de virale konvolutter, hæmmer yderligere replikation af hepatitis C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus og mæslingevirus22.

Det lille CV-N-molekyle er blevet undersøgt grundigt i mere end 20 år, da det funktionaliserer for at binde en bred vifte af vira for at hæmme viral indgang16,18. Strukturelle analyser og bindende affinitetsassays indikerer tværbinding af to L'er i en domænebyttet CVN2-dimer ved bivalent binding i det mikromolære område for at øge aviditeten til virale kuvertglycoproteiner10,19. Selektiv binding af Manα1-2Manα på Man(8) D1D3-arme og Man(9) omfatter to bindingssteder med forskellige affiniteter placeret på modsatte proteinprotomerer20 og derved når nanomolære bindingsaffiniteter (figur 1B). CVN2 betragtes således som et pseudoantistof vedrørende dets anvendelse til at binde epitoper på HIV gp120, svarende til virusneutraliserende antistoffer17. Heri er forfatteren interesseret i at undersøge den potentielle binding af CVN2 til SARS-CoV-2-spidsen via dets receptorbindende domæne (RBD). Bindingskurver af immobiliseret humant angiotensinkonverterende enzym (ACE)-2 med SARS-CoV-2 RBD resulterer i KD = 4,7 nM for denne biologisk relevante bindingsinteraktion23.

I modsætning hertil genkender udvalgte immunglobulinklasser specifikke og konsistente strukturelle proteinmønstre, som giver et substrat til affinitetsmodning i de membranforankrede HA-regioner24. CV-N viser meget potent aktivitet i næsten alle influenza A- og B-vira16, og det er et bredt neutraliserende antiviralt middel. Vores viden er ufuldstændig om placeringen af målrettede epitoper på stammen af HA1 og HA2, der muligvis involverer epitopstrukturer til glycan-målretning ved stærkt neutraliserende antistoffer og sammenlignet med lektinbinding25.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af SPR-bindingsassay for CV-N til viruskuvertspidser. (A) SPR-analyse for CV-N-binding til ligand: HA-protein i fuld længde (90 kDa). Kinetisk datasæt (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM), der viser dobbeltrefereret binding i realtid til influenza HA A/New York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variant V2 binding til immobiliseret ligand DM inden for et koncentrationsområde på 500 nM til 16 μM. Sekvens: L-rester er fremhævet med gult. H-rester er fremhævet med gråt. E58 og R73 er en erstatning for cysteiner i vildtypeproteinet og gør V2 til en stabil proteinfold med tre i stedet for fire disulfidbindinger Klik her for at se en større version af denne figur.

Mens glycanskjoldet på den membrandistale HA-topdel inducerer binding med høj affinitet til CV-N 12, er CVN2-binding til HA ved siden af en disulfidbro af HA-topdelen yderligere blevet observeret på dens steder med lav affinitet10,12. Forskellige polære interaktioner og interaktionssteder identificeres i kulhydratbinding af CV-N. Disse interaktioner verificeres ved at generere knock-out-varianter i bindingsstedet for at korrelere bindingsaffiniteter til in silico forudsagt glykosylering12. Projektet sigter således mod at sammenligne tidligere testede kemisk mannosylerede HA-peptider i bindingsaffinitet og specificitet med korte peptidsekvenser fra SARS-relaterede 2019-nCoV-pigge og SARS-CoV-2, naturligt forekommende modificeret af et lille antal forskellige N-bundne glykosyleringssteder og O-bundet glykosylering. Ved hjælp af kryo-elektronmikroskopi og bindende assays rapporterer Pinto og kolleger et monoklonalt antistof, S309, der potentielt genkender en epitop på SARS-CoV-2 spike-protein indeholdende en konserveret glycan i Sarbecovirus-undergenus uden at konkurrere med receptorbinding26. Protokollen for denne undersøgelse beskriver, hvordan design, udtryk og karakterisering af CV-N-varianter er vigtige for at studere, hvordan CV-N og CVN2 binder til glykosylerede proteiner og syntetiske mannosylerede peptider ved hjælp af SPR-teknologien10,12.

Tandembundet dimer CVN2L027 og bindingsstedsvarianter (V2-V5) udtrykkes rekombinant, og varianter er med disulfidbindingserstatninger (C58E og C73R) (figur 2A). Der fremstilles også en mutant med en enkeltpunktsmutation E41A, fordi denne position er blevet set som en intermolekylær krydskontaktrest. Denne mutant er et andet interessant molekyle til SPR-bindingsmålinger mellem lektin- og højmannoseoligosaccharider, der dechifrerer bindingsdomæner og tillader sammenligning med den dimere form. Den domænebyttede krystalstruktur af CVN2 viser en fleksibel linker, der strækker sig mellem 49 og 54 rester. De to domæner kan fortsætte med at bevæge sig rundt om hængslet som stive legemer og udvikle enten en monomer gennem intramolekylære domæneinteraktioner (domæne A -rester 1-39; 90-101- med domæne B -rester 40-89) eller en dimer ved intermolekylær domænebytte [domæne A (af den første monomer) med domæne B (af den anden) og domæne B (af den første monomer) med domæne A (af den anden kopi)]. Der er ingen tætte interaktioner mellem de to protomerers A- og B-domæner, bortset fra Glu4128. Genet for CV-N kan udvikles ved hjælp af en gentagen PCR-metode med 40-mer syntetiserede oligoer29 og subklones derefter i NdeI- og BamHI-stederne i pET11a til transformation (elektroporation) til elektrokompetente celler som beskrevet af Keeffe, J.R.27. Proteinet, der bruges til at opnå den respektive krystalstruktur (PDB ID 3S3Y), inkluderer et N-terminal 6-histidinrensningsmærke efterfulgt af et Faktor Xa protease-spaltningssted. Site-rettet mutagenese bruges til at lave punktmutationer, skifte kodoner og indsætte eller slette enkelte eller flere baser eller kodoner til aminosyreudveksling. Disse transformationer giver uvurderlig indsigt i proteinfunktion og struktur. Rekombinant udtrykt og oprenset CV-N, CVN2 og CVN3 er blevet biofysisk godt undersøgt20,21,27, er billige at producere og bruges derfor til at karakterisere bindende assays til glycaner immobiliseret på SPR-sensorchips. Konventionel enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) giver mindre reproducerbarhed vedrørende immobiliseringsteknikken for glycanligander og omdanner realtidsbinding af forskellige bindingsstedsvarianter, som er vist for SPR, til endepunktsassays.

Binding-affinitetsvariant CVN2L0-V2 (en intakt fold af homodimerisk CV-N med en disulfidbrosubstitution10) udtrykkes med et His-tag i Escherichia coli (E. coli), renset over Ni-NTA-søjle under anvendelse af affinitetskromatografi og testet for binding til HA (H3N2), monomannosyleret HA-peptid og dimannosyleret HA-peptid ved anvendelse af SPR. Kemisk mannosylerede peptider eller HA- og S-protein er alle ligander og amin koblet til den hydrofile chipoverflade via reaktive estere eller biotin-streptavidin protein engineering. Den samme procedure for sekventielle kørsler anvendes på disse ligander, idet forskellige fortyndinger af CV-N og varianter af CV-N (og CVN2) injiceres for at opnå kinetisk information til molekylære interaktionsanalyser som beskrevet nedenfor30. RBD-immobiliseret SPR-sensorchip bruges til bindingsundersøgelser af CV-N til S-peptider, og affiniteter sammenlignes med SARS-CoV-2-binding med den humane ACE2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Til denne undersøgelse er et CVN-lille ubiquitinlignende modifikator (SUMO) fusionsprotein blevet anvendt i enzymbundne immunosorbentassays i stedet for CV-N og er egnet til cellebaserede assays. Rekombinant influenza A-virus HA H3-protein i fuld længde opnås kommercielt (se Materialetabel) eller udtrykkes i pattedyrs HEK293-cellelinjer og baculovirusinficerede insektceller i henhold til standardprotokoller12. Wuhan-1 spike-protein udtrykkes i pattedyrs HEK293-celler. Syntesen af monomannosyleret peptid (MM) og dimannosyleret peptid (DM) tillader påvisning af homogene ligander til CVN2 og monomannosyleret lille molekyle10.

1. Oprettelse af CV-N-konstruktioner

  1. For hver af CVN2-varianterne og CVN2L0-proteinet (PDB ID 3S3Y) opnås genkonstruktionen med en N-terminal pelB-ledersekvens og His-tag i pET27b(+)-vektor fra kommercielle kilder (se Materialetabel, supplerende fil 1).
  2. Få CVN2L0 og varianter heraf (V2, V3, V4 og V5; Figur 2A,C) i baggrunden af et CVN2L0-skabelongen bestående af to forskellige DNA-sekvenser for hver CV-N-gentagelse.
  3. Det lyofiliserede plasmid-DNA opløses i sterilt deioniseret destilleret vand (ddH2O) til en endelig koncentration på 100 ng/μL.

2. Fremstilling af LB-agarplader med plasmid-DNA transformerede celler

  1. Kulturmediet LB-Lennox fremstilles ved at opløse 10 g/l peptone, 5 g/l gærekstrakt og 5 g/l NaCl i ddH2O (se materialetabel), og pH-værdien justeres til 7,4. Omdannelsen til kompetent E. coli BL21 (DE3) for hver variant (V2-V5) udføres efter kemisk metode efter en tidligere offentliggjort rapport10.
  2. Opløsningen opdeles (900 μL og 100 μL), 100 μL overføres på LB-agarplader (50 μg/ml kanamycin), og brug forsigtigt en steril cellespreder. Agarpladerne inkuberes natten over ved 37 °C.

3. Kloning

  1. Subklon genet for CV-N i NdeI- og BamHI-stederne for pET11a (se materialetabel) til transformation (elektroporation) til elektrokompetente celler efter reference27.

4. Stedstyret mutagenese

  1. At generere CVN2L029 og mutant CVN-E41A i baggrunden af et CVN2L0-skabelongen, der indeholder to fornemme DNA-sekvenser for hver CV-N-gentagelse27.
  2. Lav mutationer ved hjælp af et stedrettet mutagenesesæt (se Materialetabel) og specifikke mutagene primere 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' og 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' til kørsel af PCR31.
    1. Start en række prøvereaktioner ved hjælp af flere koncentrationer af dobbeltstrenget DNA (dsDNA) skabelon, der spænder fra 5-50 ng (f.eks. 5, 10, 20 og 50 ng dsDNA-skabelon). Hold primerkoncentrationen konstant.
      BEMÆRK: PCR-blandingen og den termiske cykelprotokol bruges generelt som beskrevet i brugsanvisningen til det stedrettede mutagenesesæt32.
  3. Tilsæt Dpn I-restriktionsenzymet (1 μL, 10 U/μL, se Materialetabel) under mineralolieoverlejringen. Bland reaktionerne grundigt og forsigtigt, centrifuger ned i en bordplademikrocentrifuge i 1 min., og inkuberes straks ved 37 °C i 1 time for at fordøje forældrenes supercoiled dsDNA.

5. Transformation af bakterieceller

  1. Optø de XL1-blå superkompetente celler (se Materialetabel) forsigtigt på is. For at omdanne hver kontrol- og prøvereaktion aliquot de superkompetente celler (50 μL) til et forkølet polypropylen-rundtliggende rør (14 ml).
    1. Overfør 1 μL af det Dpn I-behandlede enkeltstrengede DNA (ssDNA) fra hver kontrol- og prøvereaktion (muteret ssDNA) til separate alikvoter af de superkompetente celler, som syntetiserer den komplementære streng. Hvirvl transformationsreaktionerne forsigtigt for at blande og inkubere reaktionerne på is i 30 minutter.
      BEMÆRK: Før overførsel af Dpn I-behandlet DNA til transformationsreaktionen anbefales det at fjerne eventuel resterende mineralolie forsigtigt fra pipettespidsen. Som en valgfri kontrol skal transformationseffektiviteten af XL1-Blue superkompetente celler kontrolleres ved at blande 0,1 ng / μL af pUC18-kontrolplasmidet (1 μL) med en 50 μL aliquot af de superkompetente celler.
  2. Påfør varmepuls på transformationsreaktionerne ved 42 °C i 45 s, og læg derefter reaktionerne på is i 2 minutter.
    BEMÆRK: Den påførte varmepuls er allerede optimeret til de nævnte forhold i polypropylen rundbundede rør (14 ml).
  3. Tilsæt 0,5 ml NZY+ bouillon (indeholdende pr. liter: 10 g NZ-amin (kaseinhydrolysat), 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl, 12,5 ml 1 M MgCl2, 12,5 ml 1 M MgSO4, 10 ml 2 M glucose, pH 7,5 og forvarmet til 42 °C) og inkuber transformationsreaktionerne ved 37 °C med omrystning ved 225-250 o/min i 1 time. Det korrekte volumen af hver transformationsreaktion (5 μL fra kontrolplasmidtransformation; 250 μL fra prøvetransformation) plades på LB-ampicillin agarplader.
    BEMÆRK: Til transformationskontrol og mutagenese spredes celler på LB-ampicillin agarplader med 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal, 80 μg / ml) og isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG, 20 mM) (se materialetabel). Pod 50 ml af cellekulturerne med en enkelt koloni af transformeret E. coli-celler til oprensning af muteret plasmid-DNA til analyser. Mutagenese bekræftes ved DNA-sekventering på en ekstern facilitet.

6. Ekspression og proteinoprensning

  1. For en storskala kultur podes en lille mængde LB (indeholdende ampicillin) med en enkelt koloni fra den transformerede plade.
  2. Ved hjælp af natten til dag inokuleres ekspressionskulturen med tilsætningsstoffer, såsom 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 og 20 mM glucose, fortynding af frøkulturen til 1/100.
    1. Celler vokser med kraftig omrystning ved 37 °C. Dyrk cellerne til en Abs 600 nm mellem 0,4-0,6 (midt i logfasen), før cellerne afkøles til 20 °C. Inducer med 1 mM IPTG og vokse natten over.
    2. Derefter høstes cellerne ved centrifugering ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres med en pipette.
  3. Cellepelleten resuspenderes i phosphatbufferet saltvand (PBS) buffer og centrifugeres igen ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Kassér derefter supernatanten med en pipette. Den resterende pellet resuspenderes i 10 ml lysisbuffer, og suspensionen inkuberes i 1 time ved 37 °C.
    BEMÆRK: Sammensætning af lysisbuffer: (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/ml lysozym, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM dithiothreitol, 1 mM MgCl2, pH 8, se materialetabel).
    1. Blandingen udsættes for to fryse-optøningscyklusser (-80 °C). Separaturopløselige og uopløselige fraktioner ved centrifugering ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C og analyser dem ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese (PAGE), især natriumdodecylsulfat (SDS)-SIDE33(figur 2B,C).
      BEMÆRK: Celler kan lyseres på flere måder, såsom fryse-optøning, sonikering, homogenisering, enzymatisk lysis eller en kombination af disse metoder. Oprensning fra inklusionsorganer anbefales til opsamling af høje proteinudbytter26.
  4. Rens proteiner ved hjælp af Ni-NTA-søjlekromatografi (se Materialetabel). Læg den opløselige fraktion på en regenereret Ni-NTA perlesøjle (1 ml / min). Systemet vaskes med TBS-buffer (50 mM Tris, 150 mM natriumchlorid, pH 7,5), inden en gradient startes (0-100% 500 mM imidazol i TBS over 60 min) og opsamling af fraktioner (1 ml/min). Dialysér de oprensede proteiner til biokemisk karakterisering mod 100 mM PBS (figur 2C,D).
  5. Alternativt kan du bruge His-Select Ni 2+ affinitetsgel (se materialetabel) i 14 ml rør til at binde og genophænge his-tagged rekombinant udtrykt CV-N i bufferopløsninger med henholdsvis 20 mM imidazol og 250 mM imidazol. Inkuberes i batch i mindst 30 min.
    BEMÆRK: Påfør disse halvrensede proteiner på en færdigpakket kolonne til engangsbrug til bufferudveksling og oprydning af biologiske prøver, for eksempel kulhydrater og proteiner, som kan indlæse 1-1,5 ml eluat fra immobiliseret metalaffinitetskromatografi.
  6. Proteinopløsningerne overføres til centrifugeringsrør med et 10 kDa afskæringsfilter (se Materialetabel), og dem koncentreres ved centrifugering i 10 minutter ved 4.500 x g og 4 °C. Til SPR-målinger udveksles analysandopløsningerne til 10 mM HEPES, 150 mM natriumchlorid, 3 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), se Materialetabel).
    1. Denne SPR-løbebuffer tilsættes til en fortyndingsfaktor på 1:10, og der centrifugeres fire gange til det oprindelige volumen i 10 minutter ved 4 500 x g og 4 °C.
  7. Proteinkoncentrationen bestemmes ved 280 nm ved hjælp af et NanoDrop UV-Vis-spektrofotometer (se Materialetabel) baseret på den beregnede udryddelseskoefficient (20.440 M-1 cm-1) for hovedproteinet CVN2L0, der viser en størrelse på 23.474 Da34. Brug PBS (100 mM, pH 7,0) eller SPR-buffer som blindprøve, og mål proteinkoncentrationen ved tre fortyndingstrin (1:1, 1:10 og 1:100).

Figure 2
Figur 2: CV-N-sekvenser og udtryk. (A) CVN2 uden en linker mellem hver CV-N-gentagelse (101 aminosyrer hver) og fire disulfidbroer udtrykkes i pET11a-vektor i E. Coli. (B) Udtryk for to uafhængige kolonier for CV-N (monomer) og CVN2 (dimer). (C) Disulfidbindingsvarianter renses og analyseres på SDS-PAGE. En markør med lav molekylvægt (6 μL) bruges som reference. WT = CVN2L0 med fire disulfidbroer som markeret i (A). V2 er en variant med en disulfidbindingserstatning med polære rester ved position 58 og 73. V3-V5 er varianter med to resterende S-S-bindinger og enten polære (C58E-C73R) eller ikke-polære (C58W-C73M), der erstatter aminosyrer eller en kombination af disse restparsubstitutioner. (D) HPLC-kromatogrammer af oprenset CVN2L0 elueres med en strømningshastighed på 1 ml/min med en lineær gradient fra 5%-65% buffer B i buffer A over 30 min. Buffer A er: 0,1% (v/v) trifluoreddikesyre i ddH2O, buffer B er: 0,08% (v/v) trifluoreddikesyre i acetonitril. Protein analyseres på en højtydende silicagel 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) søjle ved 214 nm og 280 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

7. SPR-spektroskopi

  1. Brug Dual Channel SPR-systemet (se Materialetabel) med kørende buffer HBS-EP(+) og 10 mM glycin HCl pH 1,5-1,6 som regenereringsbuffer. Tænd for instrumentet, afgasseren, autoprøvetageren og pumpen, og vask hele systemet med ddH20 i 1 time. Anbring klar til brug løbende buffer i en separat flaske.
  2. Slip emersionsolie på detektoren, og monter en glassensorchip (se Materialetabel) belagt med en tynd guldfilm og på oversiden funktionaliseret med carboxymethyldextranhydrogel direkte på detektoren under flowcellen med tre porte. Fastgør indstillingen ved at trække håndteringen ned.
    BEMÆRK: C19RBDHC30M 200 nm streptavidin derivatiseret carboxymethyldextran hydrogel med en medium densitet af biotinyleret alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus-2 RBD-protein, er en klar til brug sensorchip med den præ-immobiliserede ligand.

8. SPR-bindende assay for CV-N-binding til HA, S-protein og RBD

  1. Immobiliser de proteinholdige ligander til sensorchips ved at følge nedenstående trin.
    1. Åbn en kørselstabel ved at klikke på Form i menulinjen og Kør tabeleditor i den integrerede SPRAutoLink-software (se Materialetabel). Vælg og klik på BASIC_Immobilization fra listen over tilgængelige kørselstabeller og følg trinene i den eksperimentelle procedure på computerskærmen. Den respektive anvendte eksempeleditor vises i øverste højre hjørne.
    2. Klik på Sample Set Editor i formularafsnittet for at udfylde reagenslisten for to racks placeret i autosampleren for yderligere analyser. Klik på Autosampler Direct Control som et "Værktøj" i menulinjen for at bringe stativerne frem eller hjem. Vælg 4 °C som driftstemperatur.
      BEMÆRK: SPR-softwaren giver mulighed for "SPR Instrument Direct Control" og "Pump Direct Control" ved at vælge de tilsvarende værktøjer samt autosampler-håndtering og ved at klikke på Form; Kør også tabeleditor, dataplot eller efterbehandling kan vælges til at udføre dataanalyse. Filer gemmes direkte i standardmappen og eksporteres som scrubber.files fra vinduet Efterbehandling.
  2. Start pumpen for at tilføre ddH20 ved at klikke på Værktøjer og pumpe direkte kontrol og registrere data ved at klikke på SPR Instrument Direct Control og hver gang Start i de nyligt viste vinduer. Sæt koblingsreagenserne (trin 8.3) i 300 μL hætteglas, læg dem i autosamplerstativerne, og start kørselstabellen ved at klikke på Kør.
    BEMÆRK: Spånoverflader er enten konditioneret med 10 mM glycinbuffer pH 9,0 eller kan være skyllet med 1 M natriumchlorid, 0,1 M natriumboratbuffer pH 9,0 for at konditionere carboxylafledt chipoverflade til EDC / NHS-aktiveringsblanding30.
  3. Til denne enkle protein-protein-interaktion skal du bruge CMD500D-chippen (se Materialetabel) til at generere en mikrobrydningsindeksenheder (μRIU) = 2500 - 3000 flowcelle med immobiliseret HA og μRIU = 400 flowcelle med spike-protein. Ved en infusionsstrømningshastighed på 15 μL/min injiceres en vandig og lige blanding af 0,4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodimidhydrochlorid (EDC*HCI) og 0,1 M N-hydroxysuccinimid (NHS) ved anvendelse af følgende sekventielle trin.
    1. Genopfyld pumpepåfyldning ved 25.000 μL/min, udfør baselinejustering i 30 s, injicer 90 μL prøveaktiveringsopløsning (EDC/NHS) over 6 minutters kontakttid, og hold derefter i yderligere 5 minutter.
    2. Gentag denne cyklus efter baseline, der kører i 1 minut ved 10 μL/min på kun venstre flowcelle (blå) for at injicere og immobilisere kemisk syntetiserede peptider 10, HA og spike-protein ved20 μg/ml, og tillad den efterfølgende baselinejustering med ddH2O i 1,5 min., før den aktiverede spånoverflade slukkes med 1 M ethanolamin HCl pH 8,5.
  4. Rør fra væskeprøvetageren til afgasseren fra ddH20 omstilles til flasken med HBS-EP(+) (supplerende figur 1).
  5. Analyser SPR-sensorgrammerne.
    1. For at udføre kinetiske undersøgelser skal du bruge forskellige analysandkoncentrationer (10-5-10-8 M) med et regenereringstrin efter hver injektion og blankmålinger efter forskellige analytter. Skift strømningshastigheden til 10 μL/min, og start injektioner i 4 minutters kontakttid, derefter 5 minutters baselinegenerering og to regenereringstrin på 2 minutter hver med et interval på 30 s.
    2. Bufferopløsningen injiceres til blindmålinger, hvis sensorgrammer trækkes fra prøvekørsler for at normalisere forskellige proteinkoncentrationer.
  6. Klik på Form, rul ned og skift til "Efterbehandling" ved at klikke på denne handlingstilstand. Klik på Tilføj for at vælge bindingskurver, der genereres over tid i dataplotformularen for hver flowcelle, og eksporter overlejringen som en scrubberfil (.ovr). Klik på Filer for at åbne fillagringsindstillingerne. Der opnås responskurver ved at justere venstre og højre kurve og trække signaler fra den anden referencekanal fra ligandkanalens.
    BEMÆRK: Data betjenes i "Efterbehandling" ved at definere sensorgrammer beregningsmæssigt. Det sættes i et overlay af sensorgrammer fra venstre og højre flowceller eller repræsenteres som sensorgrammer fra forskellen mellem begge kanaler.
  7. Rengør hele fluidikken med 50-100 mM glycinbuffer pH 9,5, vand og 20% ethanol før og efter bindingsmålinger for at fjerne spor af salt eller proteinforurening eller strengere med 0,5% SDS og glycin.
    BEMÆRK: For at forhindre instrumentskader anbefales det at kontrollere glaschippens mekaniske stabilitet, før chippatronen indsættes i instrumentet igen, hvis chips er blevet opbevaret under buffer eller ved 100% fugtighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et dimerisk domænebyttet CVN2L0-molekyle testes for binding til HA-topregionen i tre separate SPR-eksperimenter, og bindingsaffinitet præsenteres i KD-værdier. Domæne B antages at omfatte H-bindingssteder, som påvirkes ved at erstatte en disulfidbinding i ionrester, og domæne A danner L10,18. Enkeltinjektioner af CVN2L0 og varianterne V2 (tre disulfidbroer) og V5 (to disulfidbroer) testes først for binding til den HA-koblede sensorchip for at estimere bindingskapaciteten, inden kinetikmålingen opsættes ved hjælp af autosampleren og kørende tabeleditor (figur 3A og supplerende figur 2). Gentagne injektioner automatiseres for en række CVN2L0, V2 og V5 i forskellige koncentrationer i det nanomolære og μ-molære område i systemet over tid (figur 3B-D). CVN2L0 korrelerer antallet af intakte Cys-Cys-bindinger og binder immobiliseret HA ved KD = 255 nM, når den når god mætning. I dette tilfælde er begge K D-værdier, beregnet enten ud fra kinetiske data eller ved at tilpasse ligevægtsdataene til Langmuir-bindingsisotermen, i moderat overensstemmelse (tabel 1 og supplerende figur 3, supplerende figur 4).

Figure 3
Figur 3: SPR-bindende assay for ligandbinding via multivalente interaktioner. CVN2 (WT) og bindingsstedsvarianterne V2 og V5 med disulfidudskiftninger i kulhydratbindingslommen med høj affinitet testes for binding af kovalent immobiliseret HA. (A) Venstre og højre flowcellebindingskurve for CVN2, V2 og V5 kan ekstraheres fra SPR-kørselsprotokollen, og sensorgrammer opsummeres i et overlay. (B) Sensorgram fra konventionelt SPR-eksperiment vist som kinetiske analyser til binding af CVN2L0 til HA, injektion af analysandkoncentrationer fra 10-4 til 10-8 M. CVN2L0 måles op til den højeste koncentration ved 1,5 μM (toplinje) og op til 500 nM (bundlinje), for hvilken der ikke opnås mætning på spånoverfladen eller ligevægtsbinding. RU = Svarenheder. Der anvendes en CMD500D-sensorchip. (C) SPR-sensorgram til V2-binding til HA. D) V5, der er bindende for HA. Figuren (B-D) er gengivet med tilladelse fra reference10. Klik her for at se en større version af denne figur.

ka (M-1 s-1) KD (S-1) KD [HA]
Kinetisk		 KD [HA]
Ligevægt
Cvn2 5.1 E3 1,3 x10-3 255 nm 246 mio.
V2 4,0 e3 1,1 x10-3 275 nm 255 nm
V5 1.2 E3 5,8 x10-2 5 μM 4,9 μM
Cvn2L0 2,07 e4 3,0 x10-3 147 nm 600 nM
2,27 e4 3,0 x10-3 133 nM 490 nM

Tabel 1: Bindende affiniteter af CVN2 og varianter til HA målt via SPR. Scrubber 2.0 (en BioLogic-software) bruges til at passe SPR-associerings- og dissociationskurver i realtid og til at beregne ligevægtsdissociationskonstanterne (KD) ud fra kinetiske og ligevægtsdata. Ka = tilknytningshastighed konstant. Kd = dissociationshastighed konstant.

Mens KD-værdier for binding af CVN2L0 og V2 til HA begge ligger i nanomolarområdet, mindskes V5 i binding (tabel 1). I V5 erstattes to disulfidbindinger af ionparringsrester, der omskoler potentielle ioniske interaktioner mellem muterede Glu- og Arg-rester (figur 2A,3D). Primære data analyseres efter den integrerede associeringshastighed og dissociationsligningshastigheden, som beskriver bindingskinetikken af interaktionen mellem opløselig CV-N og immobiliseret ligand og dissociationen af det dannede kompleks fra chipoverfladen. Der udføres to uafhængige målinger, og sensorgrammer svarende til dem, der opnås fra replikater, analyseres. KD beregnes som kvotienten for koff/kon (supplerende tabel 1)10,35. KD er imidlertid relateret til ligevægtsdataene, der passer til Langmuir-bindingsisoterm36, hvor ligevægtsbindingsresponsen afbildes som en funktion af analysandkoncentrationen (supplerende figur 3A, 4A, 3B, 4B). På en koncentrationsafhængig måde bestemmes dissociationshastighedskonstanten kd efter analyser og indarbejdes i associeringsfasetilpasning (kon) for at estimere associeringshastighedskonstanten ka. (Tabel 1, supplerende figur 3C, supplerende figur 4C).

Dernæst sammenlignes bindingen af CV-N til HA med dets interaktion med RBD. CV-N WT-binding til SARS-CoV-2 RBD måles ved svagere affinitet (K D = 260 μM, figur 4A) sammenlignet med binding til HA (KD = 5,7 nM)8,10,12 og binding til S-protein (KD = 18,6 μM, figur 5). Koncentration versus respons er plottet for CV-N WT-binding til RBD, forudsat specifik målretning af muligvis konserverede kulhydrater på RBD S1-underenheden (figur 4A). Det samme affinitetsplot er vist for CVN2L0-V4-binding til DM, som ikke længere kan analyseres på grund af udskiftning af disulfidbindinger, der interfererer med binding med høj affinitet til små glycosylerede peptider (figur 4B).

CVN2L0-V4 (2 disulfidbindinger modsat usymmetrisk udskiftning af cysteinrester med enten Glu-Arg-rester eller amfipatiske aminosyrer Trp og Met) kan danne ikke-polære hydrogenbindingsnetværk omkring pseudodomænet B-kulhydratbindingsstedet10. Højere tæthed af glycaner på HA-protein når binding med polære Glu-Arg-rester i stedet for cystiner (supplerende tabel 1) og en sammenhæng med mannosylerede peptider (KD = 10 μM for DM) mellem CVN2L0 og modifikationer til Glu-Arg, men viser diskontinuerlig dissociation af varianter fra dette monoglycosylerede peptid, især når H modificeres på begge monomerer. For interaktionen mellem CVN2L0-V4 og DM giver responsen på 56 μM CVN2L0-V4-injektion et højere respons end Rmax. (Figur 4B). V5 (2x Glu-Arg) fejler i dissociation fra overfladebundet DM (data vises ikke). Alt i alt falder responskurver for lavere koncentrationer, før injektionen for alle sensorgrammer på CVN2-binding til peptid uden native H og monomerbinding til RBD afsluttes.

Figure 4
Figur 4: SPR-analyser af (A) CV-N WT-monomerbinding til RBD. K D beregnes ved at tilpasse kinetiske data (venstre side, K D = 260 μM) og sammenlignes med affinitetsdata (højre side) ved hjælp af en simpel biomolekylær model for 1: 1-binding mellem ligand og analysand (K D-equil = 274 μM). Ligevægtsbindingsrespons eller bindingskapacitet afbildes som en funktion af koncentrationen sammenlignet med SPR-bindingskurverne (0-605 μM CVN). H = Bindingssted med høj affinitet. L = Bindingssted med lav affinitet. Begge findes på CV-N og CVN2L0. (B) Dimeric CVN2L0-V4 binding til DM, forudsat 2L uden analyserbar KD. CVN2L0-V4 koncentrationer er 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3,5 μM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Mutant CVN-E41A og CV-N WT binding til (A) S glycoprotein. Pile angiver begyndelsen af forenings- og dissociationsfasen. (B) CVN-E41A bindende for RBD på SARS-CoV-2. Liganderne er præ-immobiliseret på HC polycarboxylat og CMD500D sensorchips. Covid-19 S1-underenhed [Pinto, D. et al.26; og Barnes, C. et al.37] bruges til RBD-immobilisering. Strømningshastighed: 30 μL/min, 25 °C; plottet rådata. Til sammenligning er bindingen af humane blodserumantistoffer til RBD med en fortyndingsfaktor på 1:200 afbildet. (C) SPR-assay af CV-N WT-binding til S-glycoprotein, der immobiliseres til et responsniveau på 400 μRIU for at fange CV-N. Klik her for at se en større version af denne figur.

Det har tidligere vist sig, at monomere CV-N med et enkelt L ikke kan binde gp120 tilstrækkeligt, men at CV-N's neutraliseringsevne kræver tværbinding af to kulhydratbindingssteder og overvejende genoprettes ved dimerisering for at funktionalisere med 2H12,19. Derfor udtrykkes en monomer mutant CVN-E41A, som mistænkes for at destabilisere pseudodomæne B eller kan afbryde forbindelsen med det andet domæne A, såsom fundet i CV-N WT. CVN-E41A monomer afslører stabilitet ved binding til S-protein svarende til CV-N-monomer. Selvom SPR-respons for 605-680 μM analysandkoncentrationer resulterer i høje responsenheder og typiske SPR-sensorgrammer for henholdsvis CV-N WT- og E41A-binding, er mutanten ustabil, når den fortyndes (figur 5).

Supplerende figur 1: SPR-sensorgram til optagelse af DM-efterligning som en del af influenza HA-top. Skærmbillede: SPR-dataplot, der viser SPR-kørselsprotokollen til immobilisering af DM på SPR-sensorchip CMD500D, som er belagt med 500 nm carboxymethyl dextranhydrogel og egnet til kinetikanalyser af analytter med lav molekylvægt på høj liganddensitet. Sensorchips monteres direkte på detektoren med emersionsolie og fastgøres under en tre-port flowcelle. Efter slukning af den aktiverede chipoverflade med 1 M ethanolamin HCl pH 8,5 injiceres CVN2 to gange (koncentration = henholdsvis 1 μM og 2 μM). Lilla: Forskel mellem flowcelle 1 og flowcelle 2; respons registreres med et interval på 0,2 s. Blå: Flowcelle 1: 3000-4000 mikrobrydningsindeksenheder (μRIU) belagt fra en 400 nM opløsning af liganden DM til en aktiveret carboxyleret overflade. Rød: Referenceflowcelle 2. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Manuel kørsel på HA-funktionaliseret CMD500D-sensorchip, der viser binding af dimerisk CVN2L0-V5, V2 og CVN2L0. Ved infusionsstrømningshastigheder fra 30-50 μL/min injiceres CVN2L0- og disulfidbindingsvarianter udtrykt med et His-tag og renses over Ni-NTA i mellem-μM-området og testes for binding til HA med en associeringsfase på 3 min og dissociationsfase på 2 min. Injektioner er V5 (15 μM), V2 (2,4 μM), 0 μM, CVN2L0 subkloneret fra et SUMO-fusionsprotein (1 μM) og CVN2L0 (2 μM). Løbende buffer ved fysiologisk pH anvendes til alle forsøg ved 25 °C. Alle opløsninger afgasses og filtreres (0,2 μm) inden injektion i systemet. Lilla: Forskel mellem flowcelle 1 og flowcelle 2; respons registreres med et interval på 0,2 sek. Blå: Flowcelle 1: 2540 μRIU HA. Rød: Referenceflowcelle 2. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: CVN2 bindende for HA. Analyser af sensorgrammer, når kurver er automatisk justeret. (A) Sensorgrammer nulstillet og justeret ved hjælp af scrubbersoftware (venstre) og bindingsisoterm, der viser koncentrationsafhængig responskurve til bundne analytter (højre). (B) Bindende isoterm udtrykt i procent kapacitet. (C) Beregningsmæssigt tilpassede teoretiske associerings- og dissociationskurver. (D) Kinetiske data om SPR-sensorgrammer uden monterede kurver. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: CVN2 bindende for HA. Analyser af sensorgrammer, når kurver justeres manuelt. (A) Sensorgrammer nulstillet og justeret ved hjælp af scrubbersoftware (venstre) og bindingsisoterm, der viser koncentrationsafhængig responskurve til bundne analytter (højre). (B) Bindende isoterm udtrykt i procent kapacitet. (C) Beregningsmæssigt tilpassede teoretiske associerings- og dissociationskurver. (D) Kinetiske data om SPR-sensorgrammer uden monterede kurver. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Kinetiske data opnået fra SPR-sensorgrammer til binding af CVN2L0- og Cys-Cys-bindingsvarianterne V2, V4 og V5 til HA ved hjælp af en Langmuir 1: 1-bindingsmodel. KD [M] = k off/k on  eller kd/ka. Alle data genereres ved 25 °C i HBS-EP(+)-buffer.: Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CV-N's bindingsaffinitet er korreleret med antallet af funktionelle bindingssteder [2H på domæner B og 2L på domæne(r) A, når de konstrueres som domænebyttet dimer]. En variant med en ændret bindingsaffinitet (CVN2L0-V2, en homodimerisk stabil fold af CV-N bestående af en disulfidbro-knock-out) udtrykkes i E. coli, renses og testes positivt for binding til HA-protein (H3N2) ved anvendelse af SPR10 og viser en konformationsændring ved binding af HA med enten H eller L kulhydratbindingssteder og KD1 = 49 nM og KD2 = 8 μM38 . Da antallet af disulfidbroer nær den glycanmålretningslomme i CVN2 faldt fra 4 til 2, faldt bindingsaffiniteten til HA-protein (figur 3B-D og supplerende tabel 1). Disulfidbindingsvarianter skabes ved at erstatte Cys og indsætte polære restpar Glu - Arg med let faldende stabilitet. Varianterne repræsenterer ellers det samme molekyle, og de fire bindingssteder er funktionelle, selvom multisitebinding på chippen påvirkes for alle varianter baseret på to disulfidsubstitutioner. En ikke-polær substitution af begge disulfidbindinger i de to bindingslommer med høj affinitet gør variant CVN2L0-V3, som aktivt binder HA-peptidet i både dets monomannosylerede og dimannosylerede form. Interaktionerne med CVN2L0-V3 bekræftes for mikromolære koncentrationer og binding med de syntetiske peptider (MM og DM) i opløsning via STD-NMR. Især er CVN2 SPR-bindingseksperimenter til MM ikke analyserbare på grund af utilstrækkelig beregning afR-max, en generel ulempe ved SPR-teknikken og svage bindingsaffiniteter til den immobiliserede MM10. Øget liganddensitet af dette peptid og andre peptider reducerer bindingsselektiviteten. Ved hjælp af SPR viser dimerisk CVN2L0 (2H+2L) med høj stabilitet multivalent binding til HA, som udtrykkes i insektceller, og specificitet for dimannose på en enkelt kemisk konstrueret biomimik for oligosaccharider med høj mannose, forudsat en bindingsmodel 1:1. Binding til oligo-mannosider måles normalt ved isotermisk titreringskalorimetri, hvilket kræver en højere koncentration af ligand, der skal titteres mod lektinet17.

Der er ikke fundet konkurrencebinding til monomannose eller glycan, der er mindre end Man(7), før nogen af15, hvilket indikerer involveringen af den kemiske forbindelse med peptidet rygraden i anerkendelse af disse glycandele. Antallet af mannose-mannose-forbindelser i målet var varieret, dechiffrering af tryptofaninteraktioner i glycanlommen med høj affinitet. Typen af modifikation af peptider med triazolbundet monomannose eller triazolbundet dimannose kan bestemme KD-værdier, især til H. Med hensyn til bindingsaffiniteter af CVN2L0 (2H + 2L) og CVN2L0-V2 (1H + 2L) til DM er koff maksimalt 10 gange højere vedrørende CVN2L0-V2-dissociation fra DM versus HA10. Udover at måle kinetiske hastighedskonstanter giver SPR mulighed for at estimere ligevægtskonstanterne for meget langsomt ligevægtssystemer uden faktisk at nå ligevægt (tabel 1). I modsætning hertiludtrykker k on gode relative responsværdier for alle bindingskurve for domænebyttet CVN2L0 og dets disulfidbindingsvarianter (V2, V4 og V5) til HA (supplerende tabel 1) eller DM, mens dissociationshastighedskonstanten k off viser hurtigereoff-rater for V4 og V5, to varianter med to funktionelle L og V4 med ikke-analyserbar KD vedrørende DM (figur 4B ). Tildeling af domæne B til H og domæne A den respektive L er en tidligere konstatering, der danner grundlag for, at disulfidbindingsvarianterne afslører forskellige bindende affiniteter i SPR, specificeret, til HA18,28.

SPR er et af de førende værktøjer til biomolekylær interaktionsanalyse i biomedicinsk forskning35. Hvis en specifik, tidsbestemt kontrol af bulkanalysandkoncentrationen er mulig i SPR-instrumentet, er den kvantitative evaluering af kinetikken for bindingsfremskridt mellem makromolekyler mulig med stigende interesse for at analysere multiproteinkomplekser39. Udfordringen i dets anvendelse er den kontrollerede positionering af en af interaktionskomponenterne på den meget anvendte carboxymethyldextran eller HC polycarboxylathydrogeloverflade, som fanger små og store biomolekyler. For at optimere immobilisering og bindingskapacitet af chipoverfladen er streptavidin-biotin sandwich immobilisering og immobilisering via protein His-tag til et anti-hans antistof tilgængelige40. De biofysiske egenskaber ved proteiner eller funktionelle grupper af små molekyler kan forstyrre immobiliseringsresultaterne, men der opleves eventuelle vanskeligheder med de heri beskrevne glycoproteiner og glycopeptider, der er kovalent bundet via EDC / NHS-kemi. De immobiliserede glycaner, enten glycoprotein eller de syntetiske homogent mono- eller dimannosylerede glycopeptider, anvendes på genanvendelige chips til at screene forskellige konstruerede CV-N-varianter, og bindende assays påføres fuldt oprensede og rekombinant udtrykte lektiner. Urenheder i injiceret proteinopløsning beskadiger SPR-kanalsystemet. Selvom eksperimentelle procedurer er beskrevet på et in vitro-system i denne undersøgelse, kan glykosyleringsmønsteret på virale pigge genkendes selektivt af hver analysandkoncentration af dette lille modelprotein som injiceret over tid med optimeret masseoverførselsbegrænsning36. Størrelsen af CV-N er ~ 11 kDa og understøtter reproducerbare SPR-data for dets binding til virale spikeproteiner.

CV-N's bindingsspecificitet til glycaner med høj mannose bekræftes af den bivalente bindingsinteraktion med dimannosyleret peptidmimetik snarere end binding til strukturelt funktionelle glycaner og det mono-mannosylerede peptid ved anvendelse af isotermisk titreringskalorimetri (data ikke vist). En variant med punktmutationen Glu41Ala udtrykker det monomere 101-restprotein med to sammenflettede kulhydratbindingssteder på hver protomer. Derfor afskaffer dette mutationssted en kontaktrest mellem kulhydratstederne med høj og lav affinitet og reducerer molekylær bindingsstyrke til N-acetyl-D-glucosamin. Binding af CVN-E41A til SARS-CoV-2 spikeprotein, der bærer kompleks type N-bundet glykosylering og O-glykosylering, opnås i SPR, men CV-N-binding til denne spike er for både spike-proteinet og RBD uden fysiologisk relevans målt ved mikromolære koncentrationer (figur 4,5).

Mannosylerede peptider, der er udviklet og genereret i denne undersøgelse, anvendes som proteinstilladser til at screene de antivirale midlers bindingsegenskaber ved SPR og NMR, da de repræsenterer uforanderlige ligander til kulhydratbindende assays bundet til en defineret aminosyresekvens10. Desuden er STD-NMR-spektroskopi en etiketfri teknik, såsom SPR, som tillader karakterisering af kulhydratbinding ved konformationsvalg10,41. I sådanne indstillinger giver STD-NMR mulighed for udvikling af hurtige screeningsmetoder til et stort bibliotek af forbindelser til identifikation af bioaktive ligander via binding, epitopkortlægning og direkte bestemmelse af KD under forskellige eksperimentelle betingelser. Nøjagtige K D-værdier kan opnås ved at analysere protein-ligand-associeringskurven ved hjælp afSTD-værdier ved grænsen for nulmætningstid41,42. Derfor blev forhøret af protein-ligand-interaktioner ved STD-NMR-metoden udført, men KD'erberegnes på SPR-systemet.

Human 2019-nCoV (Wuhan-Hu-1-2019 ny coronavirus) anslås at afvige blandt 11 (ud af 18) forudsagte N-linkede glykosyleringssteder til SARS-CoV43. Epitop/paratopkortlægning afslører nogle få samspil med værtsafledte N-glycaner og ubetydelige bidrag fra antistof somatiske hypermutationer til epitopkontakter37. Antivirale lektiners og bredt neutraliserende antistoffers evne til at binde stærkt konserverede epitoper på influenza HA glycoprotein er vigtigst for det rationelle design af vacciner til forebyggende og terapeutisk brug. Yderligere undersøgelse er imidlertid nødvendig for at evaluere effekten af immunundertrykkende N-bundet glykosylering omkring værtsreceptorbindingsstedet. Dataene kan give indsigt i potentialet for virus spike proteiner til at undslippe fra antistoffer fremkaldt under infektion eller til at binde ikke-immunogene CV-N og dermed guide strukturbaseret beregningsproteindesign for nye optimerede antivirale CVN2-varianter. I modsætning hertil kan affiniteten af glycosyleret Fc-aminosyremutant til dens receptor for at fremkalde effektorfunktioner in vivo anvende en sammensætning af glykosyleringssteder, og antallet af involverede glycaner kan derfor være vigtig for bindende affinitet, men kan ikke bestemmes for neutraliseringsevne.

Samlet set forudsiges færre rotamere at binde kulhydratligander til proteiner ved beregningsproteindesign end protein-proteininteraktioner alene. Domænebyttet CVN2, der bærer forskellige antal kulhydratbindingssteder, giver imidlertid den nødvendige stabilitet og fleksibilitet til at afsløre forskellige bindingsaffiniteter, der tilskrives H, og til at danne de multivalente interaktioner mellem oligomannoseklynger på virale konvolutspidser og neutraliserende antistoffer (NAb), hvilket gør det muligt at validere hæmningsassays eksperimentelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatteren anerkender Dr. Christian Derntl fra Institut for Bioteknologi og Mikrobiologi ved TU Wien og Institut for Medicin III, Division of Nephrology and Dialysis ved Medical University of Vienna, især Dr. Markus Wahrmann for teknisk og videnskabelig støtte. Proteinekspression i pattedyrceller blev støttet af Institut for Bioteknologi ved University of Natural Resources and Life Sciences (BOKU) Wien. Forfatteren ønsker at udtrykke sin dybe anerkendelse til Dr. Nico Dankbar fra XanTec bioanalytics i Düsseldorf, Tyskland, for nyttige videnskabelige diskussioner om udførelse af SPR-bindende assays.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta primeplus Cytiva
Amicon tubes Merck C7715
Ampillicin Sigma-Aldrich A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B06320
Cell spreader Sigma-Aldrich HS86655 silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos Sigma-Aldrich OLIGO
Custom Gensynthesis GenScript #1390661  cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL Thermo Scientific 50-105-5354
Dionex UlitMate 3000 Thermo Scientific IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)  Fisher Scientific ER1701
DTT Merck DTT-RO
EDC Merck 39391
EDTA Merck E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge Sigma-Aldrich Z606235
Ethanol Merck 51976
Ethanolamine HCl Merck E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack Corning 352057
Glucose Merck G8270
Glycine HCl Merck 55097
HA H3 protein Abcam ab69751
HEPES Merck H3375
His-select Ni2+ Merck H0537
Imidazole Merck I2399
IPTG Merck I6758
Kanamycin A Sigma-Aldrich K1377
Kromasil 300-5-C4 Nouryon
LB agar Merck 52062
LB agar Merck 19344
LB Lennox Merck L3022
Lysozyme Merck 10837059001
Magnesium chloride Merck M8266
Magnesium sulfate Merck M7506
NaH2P04 Merck S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer Thermo Scientific ND2000CLAPTOP
NaOH Merck S5881
NHS Merck 130672
NZ amine (casein hydrolysate) Merck C0626
PBS Merck 806552
PD MidiTrap G-10 Sigma-Aldrich GE28-9180-11
Peptone Merck 70171
pET11a Merck Millipore (Novagen) 69436 
PMSF Merck PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) Qiagen 27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9 Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis Reichert
SDS Merck 11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid Stratagene #200518
Sodim chloride Merck S9888
Sodium acetate.Trihydrate Merck 236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M XanTec bioanalytics SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D XanTec bioanalytics SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Scientific 101R20
TBS Merck T5912 10x, solution
Triton-X100 Merck T8787
Tryptone Merck 93657
Tween20 Merck P1379
Vortex-Genie 2 Mixer Merck Z258423
X-gal Merck XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene #200236
Yeast extract Merck Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Tags

Bioengineering udgave 184 Cyanovirin-N overfladeplasmonresonans mætningsoverførselsforskel-NMR konvolutspidser glycan rekombinant glycoprotein
Ingeniør antivirale midler <em>via</em> overfladeplasmonresonans
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maier, I. Engineering Antiviral… More

Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (184), e63541, doi:10.3791/63541 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter