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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Entwicklung antiviraler Wirkstoffe mittels Oberflächenplasmonenresonanz

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63541
Automatic Translation
1,2
1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt neue Werkzeuge für SPR-Bindungsassays zur Untersuchung der CV-N-Bindung an HA, S-Glykoprotein, verwandte Hybrid-Glykane und High-Mannose-Oligosaccharide. SPR wird verwendet, um das KD für die Bindung von entweder dimerem oder monomerem CV-N an diese Glykane zu bestimmen.

Abstract

Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wird verwendet, um die Bindung von Hämagglutinin (HA) an das domänenvertauschte Cyanovirin-N (CV-N)-Dimer zu messen und die Wechselwirkungen zwischen mannosylierten Peptiden und der hochaffinen Bindungsstelle von CV-N zu überwachen. Es wurde berichtet, dass die Virushüllenspitzen gp120, HA und Ebola-Glykoprotein (GP) 1,2 sowohl hoch- als auch niedrigaffine Bindungsstellen an dimeres CVN2 binden. Dimannosyliertes HA-Peptid ist auch an den beiden niedrigaffinen Bindungsstellen an ein konstruiertes Molekül von CVN2 gebunden, das eine hochaffine Stelle für den jeweiligen Liganden trägt und mutiert, um eine stabilisierende Disulfidbindung in der kohlenhydratbindenden Tasche zu ersetzen, wodurch eine multivalente Bindung bestätigt wird. Es wird eine HA-Bindung an eine hochaffine Bindungsstelle des Pseudo-Antikörpers CVN2 bei einer Dissoziationskonstante (KD) von 275 nM gezeigt, die das humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) durch Oligomerisierung weiter neutralisiert. Die Korrelation der Anzahl der Disulfidbrücken in domänenvertauschtem CVN2, die durch Substitution von Cystinen in polare Restpaare aus Glutaminsäure und Arginin von 4 auf 2 verringert werden, führt zu einer reduzierten Bindungsaffinität zu HA. Unter den stärksten Wechselwirkungen wird Ebola GP1,2 von CVN2 mit zwei hochaffinen Bindungsstellen im unteren nanomolaren Bereich unter Verwendung des Hüllglykans ohne Transmembrandomäne gebunden. In der vorliegenden Studie wird die Bindung des multispezifischen monomeren CV-N an das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Spike (S) Glykoprotein bei K D = 18,6 μM im Vergleich zu nanomolaren KD an diese anderen Virusspitzen und über seine rezeptorbindende Domäne im mittleren μ-molaren Bereich gemessen.

Introduction

Tetherin-assoziierte antivirale Aktivität wird durch Interferon-α induziert und umfasst proteinbasierte Tether, die zur Retention von vollständig ausgebildeten Virionen auf infizierten Zelloberflächen führen1. Die Notwendigkeit einer Tetheringlykosylierung bei der Hemmung der Virusfreisetzung bleibt ungewiss, was die Bedeutung von Glykosylierungsmustern auf rekombinant exprimierten Glykanen für In-vitro-Studien 1,2 impliziert, die von der Konformation von (im Falle des Influenzavirus) oberflächenexprimiertem Influenzahämagglutinin HA 3,4 abhängt. . Es wurde festgestellt, dass die Modifikation von Oligosaccharid, das an die N-verknüpfte Glykosylierung gebunden ist, für eine Tetherin-vermittelte Restriktion der HIV-Typ-1-Freisetzung2 ausreicht, während die Dimerisierung eine wesentliche Rolle bei der Verhinderung der Virusfreisetzung spielt, wodurch die Transmembrandomäne oder der Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol (GPI)-Anker zum Anbinden der knospenden Virionen beteiligt ist5 . Es werden einzigartige Funktionen für menschliches und murines Tetherin beschrieben, um mehrere behüllte Viren, Retroviren und Filoviren zu blockieren. BST-2/Tetherin ist ein Interferon-induzierbares antivirales Protein der angeborenen Immunität1,6, das mit antiviraler Breitbandaktivität wirkt und durch Hüllglykoproteine5 antagonisiert wird, um entweder Tetherin zu translozieren oder die Struktur von Tetherin 6 zu stören. Zum Beispiel sind oberflächenexprimierte Hüllglykoprotein HA und Neuraminidase auf Influenza-A-Virus für Tetherin-Antagonismus in einer stammspezifischen Weise bekannt7, was die Erkennung von Wirtsrezeptorbindungsstellen erleichtert8. Glykan-Targeting-Antikörper werden in der Stöchiometrie ihrer Wechselwirkungen mit den schnell anpassenden Glykanschilden auf HA untersucht, was zu einer Bindungsaffinität zu Influenza A H3N2 und H1N1 Subtypen4 führt.

Um die Bindungsmechanismen zwischen antiviralen Wirkstoffen und Virushüllenspitzen, d.h. Kohlenhydratliganden, und komplementären immunologischen und spektroskopischen Methoden aufzuklären, werden Mono-, Di- und Tri-Mannose-Einheiten chemisch synthetisiert. Die mannosylierten Peptide werden durch Azido-Glykosylierung von Glykosyl {beta}-Peracetaten zu 1,2-trans-Glykosylaziden-Transformation9 erzeugt, die das typischerweise vorkommende N-Acetylglucosamin und die Oligosaccharide mit hohem Mannosegehalt auf der Oberfläche lebensbedrohlicher Viren nachahmen. Triazol-Bioisoster werden verwendet, um Verknüpfungen nachzuahmen, die den mannosylierten Rest des HA-Peptids10 bilden, und erleichtern ortsspezifische Wechselwirkungen mit antiviralen CV-N-Derivaten um den zweiten N-verknüpften Glykosylierungspunkt auf der HA-Kopfdomäne (HA-Spitze mit 4 N-verknüpften Glykanen N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Wechselwirkungen zwischen Glutaminsäure (Glu) und Arginin (Arg) und der resultierende Helix-Dipol zeigten eine gute Stabilität sowohl von Modellpeptiden als auch von Proteinen, werden aber mit SPR visualisiert. Im Vergleich zur Erkennung einer einzelnen chemisch synthetisierten Glykosylierungsstelle auf HA10 durch direkte Hemmung der Rezeptorbindung an die Glykaneinheiten wird gezeigt, dass eine höhere Affinität einer vierfach mutierten Fc-Struktur zu ihrem Rezeptor Effektorfunktionen in vivo hervorruft, was zeigt, dass die nicht verwandte Zusammensetzung von N-verknüpften Glykanen, die an die Fc-Mutante gebunden sind, mechanistisch bestimmt werdensoll 13.

CV-N zeigt antivirale Aktivität gegen HIV 14,15, Influenza 16 und das Ebola-Virus, die durch nanomolare Bindung an hochmannose Oligosaccharidmodifikationen auf Hüllspitzenproteinenvermittelt wird 12,17,18,19. Die Bindung von Influenza HA an eine hochaffine Kohlenhydratbindungsstelle (H) in CV-N oder an zwei Hs in kovalent verknüpftem dimerem CVN2 hat Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K D) = 5,7 nM (Abbildung 1A) bzw. KD = 2,7 nM. Sowohl CV-N als auch CVN2 beherbergen weitere ein oder zwei kohlenhydratbindende Stellen mit niedriger Affinität (L)s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 bindet an 2H CVN2 mit Affinitäten im unteren nanomolaren Bereich (KD = 26 nM). CV-N WT-Bindung an Ebola GP1,2 und HA weist Affinitäten von K D = 34 nM bis KD = 5,7 nM auf (A/New York/55/04)12. Lektine wie CV-N, die spezifisch auf hochmannose Glykane auf den Virushüllen abzielen, hemmen die Replikation von Hepatitis-C-Virus, SARS-CoV, Herpesvirus, Marburg-Virus und Masernvirus22.

Das kleine CV-N-Molekül wird seit mehr als 20 Jahren gründlich untersucht, da es funktionalisiert, um eine Vielzahl von Viren zu binden, um den viralen Eintritt zu hemmen16,18. Strukturanalysen und Bindungsaffinitätstests deuten auf eine Vernetzung von zwei Ls in einem domänenvertauschten CVN2-Dimer durch bivalente Bindung im mikromolaren Bereich hin, um die Avidität zu viralen Hüllglykoproteinen zu erhöhen10,19. Die selektive Bindung von Manα1-2Manα an Man(8)-D1D3-Armen und Man(9) umfasst zwei Bindungsstellen unterschiedlicher Affinitäten, die sich auf gegenüberliegenden Proteinprotomern20 befinden und dadurch nanomolare Bindungsaffinitäten erreichen (Abbildung 1B). Daher gilt CVN2 als Pseudo-Antikörper hinsichtlich seiner Anwendung zur Bindung von Epitopen an HIV gp120, ähnlich wie virusneutralisierende Antikörper17. Hier ist der Autor daran interessiert, die mögliche Bindung von CVN2 an den SARS-CoV-2-Spike über seine Rezeptorbindungsdomäne (RBD) zu untersuchen. Bindungskurven des immobilisierten humanen Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE)-2 mit dem SARS-CoV-2 RBD ergeben KD = 4,7 nM für diese biologisch relevante Bindungsinteraktion23.

Im Gegensatz dazu erkennen ausgewählte Immunglobulinklassen spezifische und konsistente strukturelle Proteinmuster, die ein Substrat für die Affinitätsreifung in den membranverankerten HA-Regionen vermitteln24. CV-N zeigt eine hochwirksame Aktivität in fast allen Influenza-A- und B-Viren16 und ist ein weitgehend neutralisierendes antivirales Mittel. Unser Wissen ist unvollständig über die Lage von Zielepitopen am Stamm von HA1 und HA2, die möglicherweise epitopische Strukturen für das Glykan-Targeting durch stark neutralisierende Antikörper und im Vergleich zur Lektinbindungbeinhalten 25.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des SPR-Bindungsassays für CV-N-zu-Virus-Hüllkurvenspitzen. (A) SPR-Assay für CV-N-Bindung an Liganden: HA-Protein voller Länge (90 kDa). Kinetischer Datensatz (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) mit doppelter Bindung an Influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0-Variante V2 bindet an immobilisierten Liganden DM in einem Konzentrationsbereich von 500 nM bis 16 μM. Sequenz: L-Reste sind gelb markiert. H-Rückstände werden grau hervorgehoben. E58 und R73 sind ein Ersatz für Cystein im Wildtyp-Protein und machen V2 zu einer stabilen Proteinfaltung mit drei statt vier Disulfidbindungen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Während die Glykanabschirmung auf dem membrandistalen HA-Oberteil eine hochaffine Bindung anCV-N12 induziert, wurde eine CVN2-Bindung an HA neben einer Disulfidbrücke des HA-Oberteils weiter an seinen niederaffinen Stellen10,12 beobachtet. Verschiedene polare Wechselwirkungen und Interaktionsstellen werden in der Kohlenhydratbindung durch CV-N identifiziert. Diese Wechselwirkungen werden verifiziert, indem Knock-out-Varianten in der Bindungsstelle erzeugt werden, um Bindungsaffinitäten mit in silico vorhergesagter Glykosylierung zu korrelieren12. Daher zielt das Projekt darauf ab, zuvor getestete chemisch mannosylierte HA-Peptide in Bindungsaffinität und Spezifität mit kurzen Peptidsequenzen aus SARS-bezogenen 2019-nCoV-Spikes und SARS-CoV-2 zu vergleichen, die natürlich durch eine kleine Anzahl verschiedener N-verknüpfter Glykosylierungsstellen und O-verknüpfter Glykosylierung modifiziert vorkommen. Unter Verwendung von Kryo-Elektronenmikroskopie und Bindungsassays berichten Pinto und Mitarbeiter über einen monoklonalen Antikörper, S309, der möglicherweise ein Epitop auf SARS-CoV-2-Spike-Protein erkennt, das ein konserviertes Glykan innerhalb der Sarbecovirus-Untergattung enthält, ohne mit der Rezeptorbindungzu konkurrieren 26. Das Protokoll dieser Studie beschreibt, wie wichtig das Design, die Expression und die Charakterisierung von CV-N-Varianten sind, um zu untersuchen, wie CV-N und CVN2 an glykosylierte Proteine und synthetische mannosylierte Peptide unter Verwendung der SPR-Technologie10,12 binden.

Tandem-gebundenes Dimer CVN2L027 und Bindungsstellenvarianten (V2-V5) werden rekombinant exprimiert, Varianten mit Disulfidbindungsersatz (C58E und C73R) (Abbildung 2A). Auch eine Mutante mit einer Einzelpunktmutation E41A wird hergestellt, da diese Position als intermolekularer Kreuzkontaktrest angesehen wurde. Diese Mutante ist ein weiteres interessantes Molekül für SPR-Bindungsmessungen zwischen den Lektin- und High-Mannose-Oligosacchariden, die Bindungsdomänen entschlüsseln und den Vergleich mit der dimeren Form ermöglichen. Die domänenvertauschte Kristallstruktur von CVN2 zeigt einen flexiblen Linker, der sich zwischen 49 und 54 Resten erstreckt. Die beiden Domänen können sich weiterhin als starre Körper um das Scharnier bewegen und entweder ein Monomer durch intramolekulare Domänenwechselwirkungen entwickeln (Domäne A -Reste 1-39;90-101- mit Domäne B -Reste 40-89) oder ein Dimer durch intermolekularen Domänentausch [Domäne A (des ersten Monomers) mit Domäne B (des zweiten) und Domäne B (des ersten Monomers) mit Domäne A (der zweiten Kopie)]. Es gibt keine engen Wechselwirkungen zwischen den A- und B-Domänen der beiden Protomer, mit Ausnahme von Glu4128. Das Gen für CV-N kann unter Verwendung einer repetitiven PCR-Methode mit 40-mer-synthetisierten Oligos29 entwickelt und dann in die NdeI- und BamHI-Stellen von pET11a subkloniert werden, um sie in elektrokompetente Zellen umzuwandeln (Elektroporation), wie von Keeffe, J.R.27 beschrieben. Das Protein, das zur Erreichung der jeweiligen Kristallstruktur (PDB ID 3S3Y) verwendet wird, enthält eine N-terminale 6-Histidin-Reinigungsmarke, gefolgt von einer Faktor-Xa-Protease-Spaltstelle. Die ortsgesteuerte Mutagenese wird verwendet, um Punktmutationen vorzunehmen, Codons zu wechseln und einzelne oder mehrere Basen oder Codons für den Aminosäureaustausch einzufügen oder zu löschen. Diese Umwandlungen liefern unschätzbare Einblicke in die Funktion und Struktur von Proteinen. Rekombinant exprimierte und gereinigte CV-N, CVN2 und CVN3 wurden biophysikalisch gut untersucht20,21,27, sind billig herzustellen und werden daher zur Charakterisierung von Bindungsassays an Glykane verwendet, die auf SPR-Sensorchips immobilisiert sind. Der konventionelle Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bietet eine geringere Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Immobilisierungstechnik von Glykanliganden und wandelt die Echtzeitbindung verschiedener Bindungsstellenvarianten, die für SPR gezeigt wird, in Endpunktassays um.

Die Bindungsaffinitätsvariante CVN2L0-V2 (eine intakte Falte homodimeren CV-N mit einer Disulfidbrückensubstitution10) wird mit einem His-Tag in Escherichia coli (E. coli) exprimiert, über die Ni-NTA-Säule unter Anwendung der Affinitätschromatographie gereinigt und auf Bindung an HA (H3N2), monomannosyliertes HA-Peptid und dimannosyliertes HA-Peptid unter Verwendung von SPR getestet. Chemisch mannosylierte Peptide oder HA- und S-Proteine sind alle Liganden und Amin, die an die hydrophile Chipoberfläche gekoppelt sind über reaktive Ester oder Biotin-Streptavidin-Protein-Engineering. Das gleiche Verfahren der sequentiellen Durchläufe wird auf diese Liganden angewendet, wobei verschiedene Verdünnungen von CV-N und Varianten von CV-N (und CVN2) injiziert werden, um kinetische Informationen für die molekularen Interaktionsanalysen zu erhalten, wie untenbeschrieben 30. RBD-immobilisierter SPR-Sensorchip wird für Bindungsstudien an CV-N- zu S-Peptiden verwendet, und Affinitäten werden mit der SARS-CoV-2-Bindung mit dem menschlichen ACE2 verglichen.

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Protocol

Für die vorliegende Studie wurde anstelle von CV-N ein CVN-kleines Ubiquitin-like Modifier (SUMO) Fusionsprotein in enzymgebundenen Immunassays verwendet und eignet sich für zellbasierte Assays. Rekombinantes HA-H3-Protein des Influenza-A-Virus in voller Länge wird kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) oder in HEK293-Zelllinien von Säugetieren und Baculovirus-infizierten Insektenzellen gemäß Standardprotokollen12 exprimiert. Wuhan-1-Spike-Protein wird in HEK293-Zellen von Säugetieren exprimiert. Die Synthese von monomannosyliertem Peptid (MM) und dimannosyliertem Peptid (DM) ermöglicht den Nachweis homogener Liganden zu CVN2 und monomannosyliertem niedermolekularem10.

1. CV-N-Konstrukte erstellen

  1. Für jede der CVN2-Varianten und das CVN2L0-Protein (PDB ID 3S3Y) erhalten Sie das Genkonstrukt mit einer N-terminalen pelB-Leadersequenz und einem His-Tag in pET27b(+)-Vektor aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle, Zusatzdatei 1).
  2. Erhalten Sie CVN2L0 und seine Varianten (V2, V3, V4 und V5; Abbildung 2A,C) im Hintergrund eines CVN2L0-Template-Gens, das aus zwei verschiedenen DNA-Sequenzen für jede CV-N-Wiederholung besteht.
  3. Die lyophilisierte Plasmid-DNA wird in sterilem entionisiertem destilliertem Wasser (ddH2O) auf eine Endkonzentration von 100 ng/μL gelöst.

2. Herstellung von LB-Agarplatten mit Plasmid-DNA-transformierten Zellen

  1. Das Kulturmedium LB-Lennox wird durch Auflösen von 10 g/L Pepton, 5 g/L Hefeextrakt und 5 g/L NaCl inddH2O(siehe Materialtabelle) hergestellt und der pH-Wert auf 7,4 eingestellt. Die Umwandlung in kompetente E. coli BL21 (DE3) für jede Variante (V2-V5) erfolgt nach einem chemischen Verfahren nach einem zuvor veröffentlichten Bericht10.
  2. Teilen Sie die Lösung (900 μL und 100 μL), übertragen Sie 100 μL auf LB-Agarplatten (50 μg/ml Kanamycin) und verwenden Sie vorsichtig einen sterilen Zellspreizer. Die Agarplatten über Nacht bei 37 °C anbrüten.

3. Klonen

  1. Subklontierung des Gens für CV-N in die NdeI- und BamHI-Stellen von pET11a (siehe Materialtabelle) zur Umwandlung (Elektroporation) in elektrokompetente Zellen gemäß Referenz27.

4. Ortsbezogene Mutagenese

  1. Es sollten CVN2L029 und mutierte CVN-E41A im Hintergrund eines CVN2L0-Template-Gens erzeugt werden, das zwei unterschiedene DNA-Sequenzen für jede CV-N-Wiederholungenthält 27.
  2. Führen Sie Mutationen mit einem ortsgerichteten Mutagenese-Kit (siehe Materialtabelle) und spezifischen mutagenen Primern 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' und 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' für die Durchführung der PCR31 durch.
    1. Starten Sie eine Reihe von Probenreaktionen mit mehreren Konzentrationen von doppelsträngiger DNA (dsDNA)-Schablone im Bereich von 5-50 ng (z. B. 5, 10, 20 und 50 ng dsDNA-Vorlage). Halten Sie die Primerkonzentration konstant.
      HINWEIS: Die PCR-Mischung und das Thermozyklenprotokoll werden im Allgemeinen wie in der Bedienungsanleitung für das ortsgerichtete Mutagenese-Kit32 beschrieben verwendet.
  3. Fügen Sie das Restriktionsenzym Dpn I (1 μL, 10 U/μL, siehe Materialtabelle) unter die Mineralölüberlagerung ein. Gründlich und vorsichtig die Reaktionen mischen, in einer Tisch-Mikrozentrifuge für 1 min herunterdrehen und sofort bei 37 °C für 1 h inkubieren, um die elterliche supercoiled dsDNA zu verdauen.

5. Transformation von Bakterienzellen

  1. Die XL1-Blue superkompetenten Zellen (siehe Materialtabelle) vorsichtig auf Eis auftauen. Um jede Kontroll- und Probenreaktion zu transformieren, aliquoten Sie die superkompetenten Zellen (50 μL) in ein vorgekühltes Polypropylen-Rundbodenrohr (14 ml).
    1. Transfer von 1 μL der mit Dpn I behandelten einzelsträngigen DNA (ssDNA) aus jeder Kontroll- und Probenreaktion (mutierte ssDNA) in separate Aliquots der superkompetenten Zellen, die den komplementären Strang synthetisieren. Schwenken Sie die Transformationsreaktionen vorsichtig, um die Reaktionen zu mischen und 30 min auf Eis zu inkubieren.
      HINWEIS: Vor dem Transfer der mit Dpn I behandelten DNA in die Transformationsreaktion wird empfohlen, das verbleibende Mineralöl vorsichtig aus der Pipettenspitze zu entfernen. Als optionale Kontrolle muss die Transformationseffizienz der superkompetenten XL1-Blue-Zellen überprüft werden, indem 0,1 ng/μL des pUC18-Kontrollplasmids (1 μL) mit einem Aliquot von 50 μL der superkompetenten Zellen gemischt werden.
  2. Die Umwandlungsreaktionen werden 45 s lang bei 42 °C mit einem Wärmeimpuls versehen und anschließend 2 min auf Eis gelegt.
    HINWEIS: Der angelegte Wärmeimpuls wurde bereits für die genannten Bedingungen in Polypropylen-Rundbodenrohren (14 ml) optimiert.
  3. 0,5 mL NZY+ Brühe (enthält pro Liter: 10 g NZ-Amin (Kaseinhydrolysat), 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 12,5 ml 1 M MgCl2, 12,5 mL 1 M MgSO4, 10 mL 2 M Glucose, pH7,5 und auf 42 °C vorgewärmt) zugeben und die Umwandlungsreaktionen bei 37 °C mit Schütteln bei 225-250 U/min für 1 h inkubieren. Plate das korrekte Volumen jeder Transformationsreaktion (5 μL aus Kontrollplasmidtransformation; 250 μL aus Probentransformation) auf LB-Ampicillin-Agarplatten.
    HINWEIS: Für die Transformationskontrollen und Mutagenese verteilen Sie Zellen auf LB-Ampicillin-Agarplatten mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal, 80 μg/ml) und Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG, 20 mM) (siehe Materialtabelle). Beimpfen Sie 50 ml der Zellkulturen mit einer einzigen Kolonie transformierter E. coli-Zellen zur Reinigung mutierter Plasmid-DNA für Analysen. Die Mutagenese wird durch DNA-Sequenzierung an einer externen Einrichtung bestätigt.

6. Expression und Proteinreinigung

  1. Für eine groß angelegte Kultur impfen Sie eine kleine Menge LB (Ampicillin enthaltend) mit einer einzigen Kolonie von der transformierten Platte.
  2. Unter Verwendung der Übernachtkultur wird die Expressionskultur mit Zusätzen wie 10 mMMgCl2, 10 mMMgSO4 und 20 mM Glucose inokuliert, wobei die Samenkultur auf 1/100 verdünnt wird.
    1. Zellen mit kräftigem Schütteln bei 37 °C züchten. Die Zellen werden auf ein ABS von 600 nm zwischen 0,4 und 0,6 (Mid-Log-Phase) gezüchtet, bevor die Zellen auf 20 °C abgekühlt werden. Induzieren Sie mit 1 mM IPTG und wachsen Sie über Nacht.
    2. Dann ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C und verwerfen den Überstand mit einer Pipette.
  3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) Puffer und zentrifugieren Sie es bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C. Dann entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Das verbleibende Pellet wird in 10 mL Lysepuffer resuspendiert und die Suspension 1 h bei 37 °C inkubiert.
    ANMERKUNG: Zusammensetzung des Lysepuffers: (50 mMNaH2PO4, 300 mM NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/ml Lysozym, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Dithiothreitol, 1 mM MgCl2, pH 8, siehe Materialtabelle).
    1. Das Gemisch zwei Gefrier-Tau-Zyklen (-80 °C) unterziehen. Trennen Sie lösliche und unlösliche Fraktionen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C und analysieren Sie sie mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), insbesondere Natriumdodecylsulfat (SDS)-SEITE33 (Abbildung 2B,C).
      HINWEIS: Zellen können auf verschiedene Arten lysiert werden, z. B. Gefrier-Tauen, Beschallung, Homogenisierung, enzymatische Lyse oder eine Kombination dieser Methoden. Die Reinigung von Einschlusskörpern wird empfohlen, um hohe Proteinausbeuten zu sammeln26.
  4. Proteine mittels Ni-NTA-Säulenchromatographie reinigen (siehe Materialtabelle). Laden Sie die lösliche Fraktion auf eine regenerierte Ni-NTA-Perlensäule (1 ml/min). Waschen Sie das System mit TBS-Puffer (50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,5), bevor Sie einen Gradienten (0-100% 500 mM Imidazol in TBS über 60 min) beginnen und Fraktionen sammeln (1 ml/min). Dialysieren Sie die gereinigten Proteine zur biochemischen Charakterisierung gegen 100 mM PBS (Abbildung 2C,D).
  5. Alternativ kann His-Select Ni 2+ Affinitätsgel (siehe Materialtabelle) in 14-ml-Röhrchen verwendet werden, um sein markiertes rekombinant exprimiertes CV-N in Pufferlösungen mit 20 mM Imidazol bzw.250 mM Imidazol zu binden und erneut zu suspendieren. In Charge für mindestens 30 min inkubieren.
    HINWEIS: Tragen Sie diese halbgereinigten Proteine auf eine vorverpackte Einwegsäule für den Pufferaustausch und die Reinigung biologischer Proben, z. B. Kohlenhydrate und Proteine, auf, die 1-1,5 ml Eluat aus der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie laden können.
  6. Die Proteinlösungen werden mit einem 10 kDa-Sperrfilter in Zentrifugationsröhrchen überführt (siehe Materialtabelle) und durch Zentrifugieren für 10 min bei 4.500 x g und 4 °C konzentriert. Für SPR-Messungen tauschen Sie die Analytlösungen auf 10 mM HEPES, 150 mM Natriumchlorid, 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP (+), siehe Materialtabelle).
    1. Diesen SPR-Laufpuffer auf einen Verdünnungsfaktor von 1:10 geben und viermal auf das Ausgangsvolumen für 10 min bei 4.500 x g und 4 °C zentrifugieren.
  7. Bestimmung der Proteinkonzentration bei 280 nm mit einem NanoDrop UV-Vis-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) basierend auf dem berechneten Extinktionskoeffizienten (20.440 M-1 cm-1) für das Hauptprotein CVN2L0 mit einer Größe von 23.474 Da34. Verwenden Sie PBS (100 mM, pH 7,0) oder SPR-Puffer als Blindwert und messen Sie die Proteinkonzentration in drei Verdünnungsschritten (1:1, 1:10 und 1:100).

Figure 2
Abbildung 2: CV-N-Sequenzen und Expression. (A) CVN2 ohne Linker zwischen jeder CV-N-Wiederholung (je 101 Aminosäuren) und vier Disulfidbrücken wird in pET11a-Vektor in E exprimiert. Coli. (B) Ausdrücke zweier unabhängiger Kolonien für CV-N (Monomer) und CVN2 (Dimer). (C) Disulfidbindungsvarianten werden auf SDS-PAGE gereinigt und analysiert. Ein niedermolekularer Marker (6 μL) wird als Referenz verwendet. WT = CVN2L0 mit vier Disulfidbrücken gemäß Buchstabe A. V2 ist eine Variante mit einem Disulfidbindungsersatz durch polare Reste an den Positionen 58 und 73. V3-V5 sind Varianten mit zwei verbleibenden S-S-Bindungen und entweder polaren (C58E-C73R) oder unpolaren (C58W-C73M) substituierenden Aminosäuren oder einer Kombination dieser Restpaarsubstitutionen. (D) HPLC-Chromatogramme von gereinigtem CVN2L0 werden bei einer Flussrate von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 5% -65% Puffer B in Puffer A über 30 min eluiert. Puffer A ist: 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure inddH2O, Puffer B ist: 0,08% (v/v) Trifluoressigsäure in Acetonitril. Das Protein wird auf einer Hochleistungs-Silikagel-Säule 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) bei 214 nm und 280 nm analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

7. SPR-Spektroskopie

  1. Verwenden Sie das Dual-Channel SPR-System (siehe Materialtabelle) mit Laufpuffer HBS-EP(+) und 10 mM Glycin HCl pH 1,5-1,6 als Regenerationspuffer. Schalten Sie das Gerät, den Entgaser, den Autosampler und die Pumpe ein und waschen Sie das gesamte System mit ddH20 für 1 h. Legen Sie den gebrauchsfertigen Laufpuffer in eine separate Flasche.
  2. Tropfen Sie Emersionsöl auf den Detektor und montieren Sie einen Glassensorchip (siehe Materialtabelle), der mit einem dünnen Goldfilm beschichtet und auf der Oberseite mit Carboxymethyldextran-Hydrogel funktionalisiert ist, direkt auf den Detektor unterhalb der Drei-Port-Durchflusszelle. Korrigieren Sie die Einstellung, indem Sie die Handhabung herunterziehen.
    HINWEIS: C19RBDHC30M 200 nm Streptavidin derivatisiertes Carboxymethyldextran Hydrogel mit einer mittleren Dichte des biotinylierten Coronavirus-2 RBD-Proteins für schweres akutes respiratorisches Syndrom ist ein gebrauchsfertiger Sensorchip mit dem vorimmobilisierten Liganden.

8. SPR-Bindungsassay für CV-N-Bindung an HA, S-Protein und RBD

  1. Immobilisieren Sie die proteinartigen Liganden auf Sensorchips, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Öffnen Sie eine Run-Tabelle, indem Sie in der Menüleiste auf Formular und in der integrierten SPRAutoLink-Software auf Table Editor ausführen klicken (siehe Materialtabelle). Wählen und klicken Sie auf BASIC_Immobilization aus der Liste der verfügbaren Ausführungstabellen und folgen Sie den Schritten des experimentellen Verfahrens auf dem Computerbildschirm. Der jeweils verwendete Sample Editor wird in der rechten oberen Ecke angezeigt.
    2. Klicken Sie auf Sample Set Editor im Abschnitt Formular, um die Reagenzienliste für zwei Racks auszufüllen, die für weitere Analysen im Autosampler platziert sind. Klicken Sie in der Menüleiste auf Autosampler Direct Control als "Tool", um die Racks nach vorne oder nach Hause zu bringen. Wählen Sie 4 °C als Betriebstemperatur.
      HINWEIS: Die SPR-Software ermöglicht "SPR Instrument Direct Control" und "Pump Direct Control" durch Auswahl der entsprechenden Werkzeuge, sowie Autosampler-Handhabung, und durch Klicken auf Formular; Auch Run Table Editor, Data-Plot oder Post-Processing können ausgewählt werden, um Datenanalysen durchzuführen. Dateien werden direkt im Standardverzeichnis gespeichert und als scrubber.files aus dem Fenster Nachbearbeitung exportiert.
  2. Starten Sie die Pumpe, um ddH20 zu infundieren, indem Sie auf Tools und Pump Direct Control klicken und Daten aufzeichnen, indem Sie auf SPR Instrument Direct Control klicken, und jedes Mal Start in den neu erscheinenden Fenstern. Geben Sie die Kupplungsreagenzien (Schritt 8.3) in 300-μL-Fläschchen, legen Sie sie in die Autosampler-Racks und starten Sie die Run-Tabelle, indem Sie auf Run klicken.
    HINWEIS: Chipoberflächen werden entweder mit 10 mM Glycinpuffer pH 9,0 konditioniert oder können mit 1 M Natriumchlorid, 0,1 M Natriumboratpuffer pH 9,0 gespült worden sein, um die Carboxyl-derivatisierte Chipoberfläche für EDC / NHS-Aktivierungsmischung30 zu konditionieren.
  3. Für diese einfache Protein-Protein-Interaktion verwenden Sie den CMD500D-Chip (siehe Materialtabelle), um eine Mikrobrechungsindexeinheit (μRIU) = 2500 - 3000 Flusszelle mit immobilisiertem HA und μRIU = 400 Flusszelle mit Spike-Protein zu erzeugen. Bei einer Infusionsflussrate von 15 μL/min wird eine wässrige und gleichmäßige Mischung aus 0,4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC*HCl) und 0,1 M N-Hydroxysuccinimid (NHS) injiziert, indem die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte angewendet werden.
    1. Nachfüllen der Pumpe bei 25.000 μL/min, Baseline-Einstellung für 30 s, Injektion von 90 μL Probenaktivierungslösung (EDC/NHS) über 6 min Kontaktzeit und anschließendes Halten für weitere 5 Minuten.
    2. Wiederholen Sie diesen Zyklus nach dem Baseline-Lauf für 1 min bei 10 μL/min nur auf der linken Flusszelle (blau), um chemisch synthetisierte Peptide 10, HA und Spike-Protein bei20 μg/ml zu injizieren und zu immobilisieren, und ermöglichen Sie die anschließende Baseline-Einstellung mit ddH2O für 1,5 min, bevor die aktivierte Chipoberfläche mit 1 M Ethanolamin HCl pH 8,5 abgeschreckt wird.
  4. Schalten Sie die Röhrchen vom Flüssigkeitssammler zum Entgaser von ddH20 in die Flasche mit HBS-EP(+) (ergänzende Abbildung 1).
  5. Analysieren Sie die SPR-Sensorgramme.
    1. Um kinetische Studien durchzuführen, verwenden Sie verschiedene Analytkonzentrationen (10-5-10-8 M), mit einem Regenerationsschritt nach jeder Injektion und Blindmessungen nach verschiedenen Analyten. Ändern Sie die Flussrate auf 10 μL/min und beginnen Sie mit den Injektionen für 4 min Kontaktzeit, dann 5 min Baseline-Generierung und zwei Regenerationsschritten von jeweils 2 min mit einem Intervall von 30 s.
    2. Injizieren Sie die Pufferlösung für Blindmessungen, deren Sensorgramme von Probenläufen subtrahiert werden, um verschiedene Proteinkonzentrationen zu normalisieren.
  6. Klicken Sie auf Formular, scrollen Sie nach unten und wechseln Sie zu "Nachbearbeitung", indem Sie auf diesen Betriebsmodus klicken. Klicken Sie auf Hinzufügen , um die im Laufe der Zeit im Datenplotformular für jede Flusszelle generierten Bindungskurven auszuwählen, und exportieren Sie das Overlay als Scrubber-Datei (.ovr). Klicken Sie auf Datei, um die Dateispeicheroptionen zu öffnen. Erhalten Sie Antwortkurven, indem Sie linke und rechte Kurven ausrichten und Signale des zweiten Referenzkanals von denen des Ligandenkanals subtrahieren.
    HINWEIS: Die Daten werden in "Post-Processing" verarbeitet, indem Sensorgramme rechnerisch definiert werden. Es wird in eine Überlagerung von Sensorgrammen aus linken und rechten Durchflusszellen eingefügt oder als Sensorgramm aus der Differenz beider Kanäle dargestellt.
  7. Reinigen Sie die gesamte Fluidik mit 50-100 mM Glycinpuffer pH 9,5, Wasser und 20% Ethanol vor und nach den Bindungsmessungen, um Spuren von Salz oder Proteinkontamination zu entfernen, oder strenger, mit 0,5% SDS und Glycin.
    HINWEIS: Um eine Beschädigung des Instruments zu vermeiden, wird empfohlen, die mechanische Stabilität des Glaschips zu überprüfen, bevor die Chipkartusche wieder in das Instrument eingesetzt wird, wenn die Chips unter Puffer oder bei 100% Feuchtigkeit gelagert wurden.

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Representative Results

Ein dimeres domänenvertauschtes CVN2L0-Molekül wird in drei separaten SPR-Experimenten auf Bindung an die HA-Top-Region getestet und die Bindungsaffinität wird inKD-Werten dargestellt. Es wird angenommen, dass Domäne B H-Bindungsstellen umfasst, die durch den Ersatz einer Disulfidbindung in ionische Reste beeinflusst werden, und Domäne A bildet L10,18. Einzelinjektionen von CVN2L0 und den Varianten V2 (drei Disulfidbrücken) und V5 (zwei Disulfidbrücken) werden zunächst auf Bindung an den HA-gekoppelten Sensorchip getestet, um die Bindungskapazitäten abzuschätzen, bevor die Kinetik mit dem Autosampler und dem Lauftischeditor eingerichtet wird (Abbildung 3A und ergänzende Abbildung 2). Wiederholte Injektionen werden für eine Reihe von CVN2L0, V2 und V5 bei verschiedenen Konzentrationen im nanomolaren und μ-molaren Bereich im System im Zeitverlauf automatisiert (Abbildung 3B-D). CVN2L0 korreliert die Anzahl der intakten Cys-Cys-Bindungen und bindet immobilisiertes HA bei KD = 255 nM, wenn eine gute Sättigung erreicht wird. In diesem Fall stimmen beideKD-Werte, die entweder aus kinetischen Daten oder durch Anpassung der Gleichgewichtsdaten an die Langmuir-Bindungsisotherme berechnet werden, mäßig überein (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 3, ergänzende Abbildung 4).

Figure 3
Abbildung 3: SPR-Bindungsassay für die Ligandenbindung über multivalente Wechselwirkungen. CVN2 (WT) und die Bindungsstellenvarianten V2 und V5 mit Disulfidersatz in der hochaffinen kohlenhydratbindenden Tasche werden auf die Bindung kovalent immobilisierter HA getestet. (A) Linke und rechte Flusszellenbindungskurven von CVN2, V2 und V5 können aus dem SPR-Laufprotokoll extrahiert werden, und Sensorgramme werden in einem Overlay zusammengefasst. (B) Sensorgramm aus konventionellem SPR-Experiment, dargestellt als kinetische Analysen zur Bindung von CVN2L0 an HA, Injektion von Analytkonzentrationen von 10-4 bis 10-8 M. CVN2L0 wird bis zur höchsten Konzentration bei 1,5 μM (obere Linie) und bis zu 500 nM (untere Linie) gemessen, wobei keine Sättigung auf der Chipoberfläche oder Gleichgewichtsbindung erreicht wird. EVU = Reaktionseinheiten. Zum Einsatz kommt ein CMD500D Sensorchip. (C) SPR-Sensorgramm für V2-Bindung an HA. (D) V5 bindet an HA. Die Abbildung (B-D) ist mit Genehmigung von Referenz10 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

ka (M-1 s-1) KD (S-1) KD [HA]
Kinetisch		 KD [HA]
Gleichgewicht
CVN2 5.1 e3 1,3 x 10-3 255 nM 246 nM
V2 4.0 e3 1,1 x 10-3 275 nM 255 nM
V5 1.2 e3 5,8 x 10-2 5 μM 4,9 μM
CVN2L0 2.07 e4 3,0 x 10-3 147 nM 600 nM
2.27 e4 3,0 x 10-3 133 nM 490 nM

Tabelle 1: Bindungsaffinitäten von CVN2 und Varianten zu HA, gemessen über SPR. Scrubber 2.0 (eine BioLogic-Software) wird verwendet, um SPR-Assoziations- und Dissoziationskurven in Echtzeit anzupassen und die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (KD) aus kinetischen und Gleichgewichtsdaten zu berechnen. Ka = Assoziationsratenkonstante. Kd = Dissoziationsratenkonstante.

Während dieKD-Werte für die Bindung von CVN2L0 und V2 an HA beide im nanomolaren Bereich liegen, ist V5 bei der Bindung vermindert (Tabelle 1). In V5 werden zwei Disulfidbindungen durch Ionenpaarungsreste ersetzt, die potenzielle ionische Wechselwirkungen zwischen mutierten Glu- und Arg-Resten retrainieren (Abbildung 2A,3D). Die Primärdaten werden nach den integrierten Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitsgleichungen analysiert, die die Bindungskinetik der Wechselwirkung von löslichem CV-N mit immobilisiertem Liganden und die Dissoziation des gebildeten Komplexes von der Chipoberfläche beschreiben. Es werden zwei unabhängige Messungen durchgeführt und Sensorgramme analysiert, die denen von Replikaten entsprechen. KD wird berechnet als Quotient von koff/kon (Zusatztabelle 1)10,35. KD bezieht sich jedoch auf die Gleichgewichtsdaten, die zur Langmuir-Bindungsisotherme 36 passen, wobei die Gleichgewichtsbindungsantwort als Funktion der Analytkonzentration aufgetragen wird (ergänzende Abbildung 3A,4A,3B,4B). Konzentrationsabhängig wird die Dissoziationsratenkonstante kd nach Analysen bestimmt und in die Assoziationsphasenanpassung (kon) einbezogen, um die Assoziationsratenkonstante ka zu schätzen. (Tabelle 1, ergänzende Abbildung 3C, ergänzende Abbildung 4C).

Als nächstes wird die Bindung von CV-N an HA mit seiner Interaktion mit RBD verglichen. Die CV-N WT-Bindung an SARS-CoV-2 RBD wird bei schwächerer Affinität (K D = 260 μM, Abbildung 4A) im Vergleich zur Bindung an HA (KD = 5,7 nM)8,10,12 und Bindung an S-Protein (KD = 18,6 μM, Abbildung 5) gemessen. Die Konzentration versus Reaktion wird für die Bindung von CV-N WT an RBD aufgetragen, wobei ein spezifisches Targeting von möglicherweise konservierten Kohlenhydraten auf der RBD S1-Untereinheit angenommen wird (Abbildung 4A). Das gleiche Affinitätsdiagramm wird für die CVN2L0-V4-Bindung an DM gezeigt, die aufgrund des Ersatzes von Disulfidbindungen, die die hochaffine Bindung an kleine glykosylierte Peptide stören, nicht mehr analysierbar ist (Abbildung 4B).

CVN2L0-V4 (2 Disulfidbindungen im Gegensatz zum unsymmetrischen Ersatz von Cysteinresten durch entweder Glu-Arg-Reste oder amphipathische Aminosäuren Trp und Met) können unpolare Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke um die Pseudodomäne B Kohlenhydratbindungsstelle10 bilden. Eine höhere Dichte von Glykanen auf HA-Protein erreicht eine Bindung mit polaren Glu-Arg-Resten anstelle von Cystinen (Zusatztabelle 1) und eine Assoziation mit mannosylierten Peptiden (KD = 10 μM für DM) zwischen CVN2L0 und Modifikationen in Glu-Arg, zeigt jedoch eine diskontinuierliche Dissoziation von Varianten von diesem monoglykosylierten Peptid, insbesondere wenn H an beiden Monomeren modifiziert wird. Für die Wechselwirkung zwischen CVN2L0-V4 und DM ergibt das Ansprechen der 56 μM CVN2L0-V4-Injektion ein höheres Ansprechverhalten als Rmax. (Abbildung 4B). V5 (2x Glu-Arg) schlägt bei der Dissoziation von oberflächengebundenem DM fehl (Daten nicht gezeigt). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Reaktionskurven niedrigerer Konzentrationen abnehmen, bevor die Injektion für alle Sensorgramme auf CVN2-Bindung an Peptid ohne natives H und Monomerbindung an RBD beendet wird.

Figure 4
Abbildung 4: SPR-Analysen der (A) CV-N WT-Monomerbindung an RBD. K D wird durch Anpassung kinetischer Daten (linke Seite, K D = 260 μM) berechnet und mit Affinitätsdaten (rechte Seite) unter Verwendung eines einfachen biomolekularen Modells für eine 1:1-Bindung zwischen Ligand und Analyt (K D-Equil = 274 μM) verglichen. Die Gleichgewichtsbindungsantwort oder Bindungskapazität wird als Funktion der Konzentration im Vergleich zu den SPR-Bindungskurven (0-605 μM CVN) aufgetragen. H = High-affinity binding site. L = Bindungsstelle mit geringer Affinität. Beide sind auf CV-N und CVN2L0 zu finden. (B) Dimere CVN2L0-V4-Bindung an DM, unter Annahme von 2L ohne analysierbares KD. CVN2L0-V4 Konzentrationen sind 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3,5 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Mutante CVN-E41A und CV-N WT Bindung an (A) S Glykoprotein. Pfeile zeigen den Beginn der Assoziations- und Dissoziationsphase an. (B) CVN-E41A-Bindung an RBD auf SARS-CoV-2. Die Liganden werden auf HC-Polycarboxylat- und CMD500D-Sensorchips vorimmobilisiert. Covid-19 S1-Untereinheit [Pinto, D. et al.26; und Barnes, C. et al.37] wird für die RBD-Immobilisierung verwendet. Durchfluss: 30 μL/min, 25 °C; geplottete Rohdaten. Im Vergleich dazu wird die Bindung von humanen Blutserumantikörpern an RBD mit einem Verdünnungsfaktor von 1:200 dargestellt. (C) SPR-Assay der CV-N WT-Bindung an S-Glykoprotein, das auf ein Ansprechniveau von 400 μRIU immobilisiert wird, um CV-N einzufangen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Es wurde bereits gezeigt, dass monomere CV-N mit einem einzelnen L gp120 nicht ausreichend binden kann, sondern dass die Neutralisationsfähigkeit von CV-N eine Vernetzung von zwei Kohlenhydratbindungsstellen erfordert und überwiegend durch Dimerisierung wiederhergestellt wird, um mit 2H12,19 zu funktionalisieren. Daher wird eine monomere Mutante CVN-E41A exprimiert, die im Verdacht steht, die Pseudodomäne B zu destabilisieren oder die Konnektivität mit der zweiten Domäne A zu unterbrechen, wie sie in CV-N WT gefunden wird. Cvn-E41A-Monomer zeigt Stabilität bei Bindung an S-Protein, ähnlich wie CV-N-Monomer. Obwohl die SPR-Reaktion für 605-680 μM Analytkonzentrationen zu hohen Ansprecheinheiten und typischen SPR-Sensorgrammen für CV-N WT bzw. E41A-Bindung führt, ist die Mutante instabil, wenn sie verdünnt wird (Abbildung 5).

Ergänzende Abbildung 1: SPR-Sensorgramm zur Erfassung der DM-Mimikry als Teil der Influenza-HA-Oberseite. Screenshot: SPR-Datendiagramm zeigt das SPR-Laufprotokoll zur Immobilisierung von DM auf SPR-Sensorchip CMD500D, der mit 500 nm Carboxymethyldextran-Hydrogel beschichtet ist und für kinetische Analysen von niedermolekularen Analyten auf hoher Ligandendichte geeignet ist. Sensorchips werden direkt mit Emersionsöl auf den Detektor montiert und unterhalb einer Durchflusszelle mit drei Anschlüssen befestigt. Nach Abschrecken der aktivierten Chipoberfläche mit 1 M Ethanolamin HCl pH 8,5 wird CVN2 zweimal injiziert (Konzentration = 1 μM bzw. 2 μM). Lila: Unterschied zwischen Durchflusszelle 1 und Durchflusszelle 2; Die Reaktion wird in einem Intervall von 0,2 s aufgezeichnet. Blau: Durchflusszelle 1: 3000-4000 Mikro-Brechungsindexeinheiten (μRIU), beschichtet aus einer 400 nM Lösung des Liganden DM auf eine aktivierte carboxylierte Oberfläche. Rot: Referenzdurchflusszelle 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Manueller Lauf auf HA-funktionalisiertem CMD500D-Sensorchip mit Bindung von dimeren CVN2L0-V5, V2 und CVN2L0. Bei Infusionsflussraten von 30-50 μL/min werden CVN2L0- und Disulfidbindungsvarianten, die mit einem His-Tag exprimiert und über Ni-NTA gereinigt werden, im mittleren μM-Bereich injiziert und auf Bindung an HA mit einer Assoziationsphase von 3 min und einer Dissoziationsphase von 2 min getestet. Die Injektionen sind V5 (15 μM), V2 (2,4 μM), 0 μM, CVN2L0 subkloniert aus einem SUMO-Fusionsprotein (1 μM) und CVN2L0 (2 μM). Für alle Experimente bei 25 °C wird ein Laufpuffer bei physiologischem pH-Wert verwendet. Alle Lösungen werden entgast und filtriert (0,2 μm), bevor sie in das System eingespritzt werden. Lila: Unterschied zwischen Durchflusszelle 1 und Durchflusszelle 2; Die Reaktion wird in einem Intervall von 0,2 Sekunden aufgezeichnet. Blau: Durchflusszelle 1: 2540 μRIU HA. Rot: Referenzdurchflusszelle 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: CVN2-Bindung an HA. Analyse von Sensorgrammen, wenn Kurven automatisch ausgerichtet werden. (A) Sensorgramme, die mit der Scrubber-Software (links) und der Bindungsisotherme auf Null gesetzt und ausgerichtet wurden und eine konzentrationsabhängige Antwortkurve an gebundene Analyten zeigen (rechts). (B) Bindeisotherme, ausgedrückt in Prozent der Kapazität. (C) Rechenisch angepasste theoretische Assoziations- und Dissoziationskurven. (D) Kinetik auf SPR-Sensorgrammen ohne angepasste Kurven. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: CVN2-Bindung an HA. Analyse von Sensorgrammen, wenn Kurven manuell ausgerichtet werden. (A) Sensorgramme, die mit der Scrubber-Software (links) und der Bindungsisotherme auf Null gesetzt und ausgerichtet wurden und eine konzentrationsabhängige Antwortkurve an gebundene Analyten zeigen (rechts). (B) Bindeisotherme, ausgedrückt in Prozent der Kapazität. (C) Rechenisch angepasste theoretische Assoziations- und Dissoziationskurven. (D) Kinetik auf SPR-Sensorgrammen ohne angepasste Kurven. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Kinetische Daten aus SPR-Sensorgrammen für die Bindung der CVN2L0- und Cys-Cys-Bindungsvarianten V2, V4 und V5 an HA unter Verwendung eines Langmuir 1:1-Bindungsmodells. KD [M] = k off/k on  oder kd/ka. Alle Daten werden bei 25 °C im HBS-EP(+)-Puffer erzeugt.: Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Die Bindungsaffinität von CV-N korreliert mit der Anzahl der funktionalen Bindungsstellen [2H auf Domänen B und 2L auf Domänen A, wenn sie als domänenvertauschtes Dimer entwickelt wurden]. Eine Variante mit veränderter Bindungsaffinität (CVN2L0-V2, eine homodimere stabile Falte von CV-N, die einen Disulfidbrücken-Knock-out umfasst) wird in E. coli exprimiert, gereinigt und positiv auf Bindung an HA-Protein (H3N2) unter Verwendung von SPR10 getestet und zeigt eine Konformationsänderung bei Bindung von HA an H- oder L-Kohlenhydratbindungsstellen und KD1 = 49 nM und KD2 = 8 μM38 . Als die Anzahl der Disulfidbrücken in der Nähe der Glykan-Targeting-Tasche in CVN2 von 4 auf 2 abnahm, nahm die Bindungsaffinität zum HA-Protein ab (Abbildungen 3B-D und Zusatztabelle 1). Disulfidbindungsvarianten werden durch Substitution von Cys und Einfügen polarer Restpaare Glu - Arg mit leicht abnehmender Stabilität erzeugt. Die Varianten repräsentieren ansonsten das gleiche Molekül, und die vier Bindungsstellen sind funktionsfähig, obwohl die Multisite-Bindung auf dem Chip für alle Varianten beeinflusst wird, die auf zwei Disulfidsubstitutionen basieren. Eine unpolare Substitution beider Disulfidbindungen in den beiden hochaffinen Bindungstaschen bildet die Variante CVN2L0-V3, die das HA-Peptid sowohl in seiner monomannosylierten als auch in seiner dimannosylierten Form aktiv bindet. Die Wechselwirkungen mit CVN2L0-V3 werden für mikromolare Konzentrationen und Bindung mit den synthetischen Peptiden (MM und DM) in Lösung über STD-NMR bestätigt. Bemerkenswerterweise sind CVN2 SPR-Bindungsexperimente an MM aufgrund unzureichender Berechnung von Rmax, eines allgemeinen Nachteils der SPR-Technik und schwacher Bindungsaffinitäten zum immobilisierten MM10 nicht analysierbar. Eine erhöhte Ligandendichte dieses Peptids und anderer Peptide reduziert die Bindungsselektivität. Unter Verwendung von SPR zeigt dimeres CVN2L0 (2H+2L) mit hoher Stabilität eine multivalente Bindung an HA, die in Insektenzellen exprimiert wird, und eine Spezifität für Dimannose auf einer einzigen chemisch hergestellten Biomimikry für Oligosaccharide mit hohem Mannosegehalt, wobei ein Bindungsmodell 1:1 angenommen wird. Die Bindung an Oligo-Mannoside wird normalerweise durch isotherme Titrationskalorimetrie gemessen, die eine höhere Konzentration von Liganden erfordert, die gegen das Lektin17 tittert werden muss.

Eine kompetitive Bindung an Monomannose oder ein Glykan, das kleiner als Man(7) ist, wurde vor keinem derbeiden 15 gefunden, was auf die Beteiligung der chemischen Verbindung mit dem Peptidrückgrat bei der Erkennung dieser Glykaneinheiten hinweist. Die Anzahl der Mannose-Mannose-Verknüpfungen im Ziel wurde variiert, wobei Tryptophan-Wechselwirkungen in der hochaffinen Glykantasche entschlüsselt wurden. Die Art der Modifikation von Peptiden mit Triazol-verknüpfter Monomannose oder Triazol-verknüpfter Dimannose kannKD-Werte bestimmen, insbesondere zu H. Bezüglich der Bindungsaffinitäten von CVN2L0 (2H+2L) und CVN2L0-V2 (1H+2L) zu DM ist koff maximal 10-fach höher in Bezug auf die CVN2L0-V2-Dissoziation von DM gegenüber HA10. Neben der Messung kinetischer Geschwindigkeitskonstanten ermöglicht SPR die Abschätzung der Gleichgewichtskonstanten für sehr langsam ausgleichende Systeme, ohne tatsächlich ein Gleichgewicht zu erreichen (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu drückt kon gute relative Antwortwerte für alle Bindungskurven von domänenvertauschtem CVN2L0 und seinen Disulfidbindungsvarianten (V2, V4 und V5) zu HA (Zusatztabelle 1) oder DM aus, während die Dissoziationsratenkonstante koff schnellere Off-Raten für V4 und V5 zeigt, zwei Varianten mit zwei funktionellen L, und V4 mit nicht analysierbarem KD bezüglich DM (Abbildungen 4B) ). Die Zuordnung von Domäne B zu H und Domäne A des jeweiligen L ist eine frühere Erkenntnis, die Grundlage für die Disulfidbindungsvarianten ist, um unterschiedliche Bindungsaffinitäten in SPR, spezifiziert, zu HA18,28 aufzudecken.

SPR ist eines der führenden Werkzeuge für die biomolekulare Interaktionsanalyse in der biomedizinischen Forschung35. Wenn eine spezifische, zeitgesteuerte Kontrolle der Massenanalytkonzentration im SPR-Instrument möglich ist, ist die quantitative Bewertung der Kinetik des Bindungsfortschritts zwischen Makromolekülen möglich, mit zunehmendem Interesse an der Analyse von Multiproteinkomplexen39. Die Herausforderung bei der Verwendung ist die kontrollierte Positionierung einer der Interaktionskomponenten auf der weit verbreiteten Carboxymethyldextran- oder HC-Polycarboxylat-Hydrogel-Oberfläche, die kleine und große Biomoleküle einfängt. Zur Optimierung der Immobilisierung und Bindungskapazität der Chipoberfläche stehen eine Streptavidin-Biotin-Sandwich-Immobilisierung und Immobilisierung über das Protein His-Tag zu einem Anti-his-Antikörper zur Verfügung40. Die biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen oder funktionellen Gruppen kleiner Moleküle können die Immobilisierungsergebnisse beeinträchtigen, aber alle Schwierigkeiten treten mit den hier beschriebenen Glykoproteinen und Glykopeptiden auf, die kovalent über EDC / NHS-Chemie gebunden werden. Die immobilisierten Glykane, entweder Glykoprotein oder die synthetischen homogen mono- oder dimannosylierten Glykopeptide, werden auf wiederverwendbaren Chips verwendet, um verschiedene technisch hergestellte CV-N-Varianten zu screenen, und Bindungsassays werden auf vollständig gereinigte und rekombinant exprimierte Lektine angewendet. Verunreinigungen in injizierter Proteinlösung schädigen das SPR-Kanalsystem. Obwohl in dieser Studie experimentelle Verfahren an einem In-vitro-System beschrieben werden, kann das Glykosylierungsmuster auf viralen Spikes selektiv durch jede Analytkonzentration dieses kleinen Modellproteins erkannt werden, die im Laufe der Zeit mit optimierter Stofftransferbegrenzung injiziert wurde36. Die Größe von CV-N beträgt ~11 kDa und unterstützt reproduzierbare SPR-Daten für seine Bindung an virale Spike-Proteine.

Die Bindungsspezifität von CV-N an hoch-Mannose-Glykane wird durch die bivalente Bindungsinteraktion mit dem dimannosylierten Peptidmimetikum bestätigt, anstatt an strukturell funktionelle Glykane und das monomannosylierte Peptid mittels isothermer Titrationskalorimetrie zu binden (Daten nicht gezeigt). Eine Variante mit der Punktmutation Glu41Ala exprimiert das monomere 101-Restprotein mit zwei ineinander verschlungenen Kohlenhydratbindungsstellen auf jedem Protomer. Daher hebt diese Mutationsstelle einen Kontaktrest zwischen den hoch- und niederaffinen Kohlenhydratstellen auf und reduziert die molekulare Bindungsstärke an N-Acetyl-D-Glucosamin. Die Bindung von CVN-E41A an das SARS-CoV-2-Spike-Protein, das eine komplexe N-verknüpfte Glykosylierung und O-Glykosylierung trägt, wird im SPR erreicht, aber die CV-N-Bindung an diesen Spike ist sowohl für das Spike-Protein als auch für RBD ohne physiologische Relevanz, gemessen bei mikromolaren Konzentrationen (Abbildung 4,5).

Mannosylierte Peptide, die in dieser Studie entwickelt und erzeugt wurden, werden als Proteingerüste verwendet, um die Bindungseigenschaften der antiviralen Wirkstoffe durch SPR und NMR zu überprüfen, da sie unveränderliche Liganden für kohlenhydratbindende Assays darstellen, die an eine definierte Aminosäuresequenzgebunden sind 10. Darüber hinaus ist die STD-NMR-Spektroskopie eine markierungsfreie Technik wie SPR, die die Charakterisierung der Kohlenhydratbindung durch Konformationsselektion ermöglicht 10,41. In solchen Umgebungen ermöglicht STD-NMR die Entwicklung von Schnellscreening-Methoden für eine große Bibliothek von Verbindungen, um bioaktive Liganden durch Bindung, Epitopkartierung und direkte Bestimmung von KD unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu identifizieren. Genaue KD-Werte können durch Analyse der Protein-Liganden-Assoziationskurve unter Verwendung von STD-Werten an der Grenze der Nullsättigungszeit 41,42 erhalten werden. Daher wurde die Abfrage von Protein-Liganden-Interaktionen durch die STD-NMR-Methode durchgeführt, aber KDs werden auf dem SPR-System berechnet.

Es wird geschätzt, dass sich das humane 2019-nCoV (Wuhan-Hu-1-2019 novel coronavirus) zwischen 11 (von 18) vorhergesagten N-verknüpften Glykosylierungsstellen zu SARS-CoV43 unterscheidet. Epitop/Paratop-Mapping zeigt einige Wechselwirkungen mit wirtsabgeleiteten N-Glykanen und vernachlässigbare Beiträge von Antikörper-somatischen Hypermutationen zu Epitopkontakten37. Die Fähigkeit von antiviralen Lektinen und breit neutralisierenden Antikörpern, hochkonservierte Epitope an das Influenza-HA-Glykoprotein zu binden, ist für das rationale Design von Impfstoffen für präventive und therapeutische Zwecke von größter Bedeutung. Weitere Untersuchungen sind jedoch erforderlich, um die Wirkung der immunsuppressiven N-verknüpften Glykosylierung um die Bindungsstelle des Wirtsrezeptors zu bewerten. Die Daten können Aufschluss über das Potenzial von Virus-Spike-Proteinen geben, aus Antikörpern zu entkommen, die während der Infektion hervorgerufen wurden, oder nicht-immunogenes CV-N zu binden und so ein strukturbasiertes computergestütztes Proteindesign für neue optimierte antivirale CVN2-Varianten zu leiten. Im Gegensatz dazu kann die Affinität der glykosylierten Fc-Aminosäuremutante zu ihrem Rezeptor, Effektorfunktionen in vivo auszulösen, eine Zusammensetzung von Glykosylierungsstellen verwendet, und die Anzahl der beteiligten Glykane daher für die Bindungsaffinität wichtig sein, kann aber nicht für die Neutralisationsfähigkeit bestimmt werden.

Zusammengenommen wird vorhergesagt, dass weniger Rotameren Kohlenhydratliganden an Proteine binden, indem sie ein computergestütztes Proteindesign durchführen, als Protein-Protein-Interaktionen allein. Domain-swapped CVN2 jedoch, das eine unterschiedliche Anzahl von Kohlenhydratbindungsstellen trägt, bietet die notwendige Stabilität und Flexibilität, um unterschiedliche Bindungsaffinitäten aufzudecken, die H zugeschrieben werden, und die multivalenten Wechselwirkungen zwischen Oligomannose-Clustern auf viralen Hüllspitzen und neutralisierenden Antikörpern (NAb) zu bilden, so dass Inhibitionsassays experimentell validiert werden können.

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Disclosures

Der Autor hat nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Der Autor dankt Dr. Christian Derntl vom Department für Biotechnologie und Mikrobiologie der TU Wien und der Universitätsklinik für Medizin III, Abteilung für Nephrologie und Dialyse der Medizinischen Universität Wien, insbesondere Dr. Markus Wahrmann für die technische und wissenschaftliche Unterstützung. Die Proteinexpression in Säugetierzellen wurde vom Department für Biotechnologie der Universität für Bodenkultur (BOKU) Wien unterstützt. Die Autorin dankt Dr. Nico Dankbar von XanTec bioanalytics in Düsseldorf für hilfreiche wissenschaftliche Diskussionen zur Durchführung der SPR-Bindungsassays.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta primeplus Cytiva
Amicon tubes Merck C7715
Ampillicin Sigma-Aldrich A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B06320
Cell spreader Sigma-Aldrich HS86655 silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos Sigma-Aldrich OLIGO
Custom Gensynthesis GenScript #1390661  cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL Thermo Scientific 50-105-5354
Dionex UlitMate 3000 Thermo Scientific IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)  Fisher Scientific ER1701
DTT Merck DTT-RO
EDC Merck 39391
EDTA Merck E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge Sigma-Aldrich Z606235
Ethanol Merck 51976
Ethanolamine HCl Merck E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack Corning 352057
Glucose Merck G8270
Glycine HCl Merck 55097
HA H3 protein Abcam ab69751
HEPES Merck H3375
His-select Ni2+ Merck H0537
Imidazole Merck I2399
IPTG Merck I6758
Kanamycin A Sigma-Aldrich K1377
Kromasil 300-5-C4 Nouryon
LB agar Merck 52062
LB agar Merck 19344
LB Lennox Merck L3022
Lysozyme Merck 10837059001
Magnesium chloride Merck M8266
Magnesium sulfate Merck M7506
NaH2P04 Merck S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer Thermo Scientific ND2000CLAPTOP
NaOH Merck S5881
NHS Merck 130672
NZ amine (casein hydrolysate) Merck C0626
PBS Merck 806552
PD MidiTrap G-10 Sigma-Aldrich GE28-9180-11
Peptone Merck 70171
pET11a Merck Millipore (Novagen) 69436 
PMSF Merck PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) Qiagen 27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9 Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis Reichert
SDS Merck 11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid Stratagene #200518
Sodim chloride Merck S9888
Sodium acetate.Trihydrate Merck 236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M XanTec bioanalytics SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D XanTec bioanalytics SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Scientific 101R20
TBS Merck T5912 10x, solution
Triton-X100 Merck T8787
Tryptone Merck 93657
Tween20 Merck P1379
Vortex-Genie 2 Mixer Merck Z258423
X-gal Merck XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene #200236
Yeast extract Merck Y1625

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References

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Bioengineering Ausgabe 184 Cyanovirin-N Oberflächenplasmonresonanz Sättigungstransferdifferenz-NMR Hüllspitzen Glykan rekombinantes Glykoprotein
Entwicklung antiviraler Wirkstoffe <em>mittels</em> Oberflächenplasmonenresonanz
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Maier, I. Engineering Antiviral… More

Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (184), e63541, doi:10.3791/63541 (2022).

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