Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63541
Automatic Translation
1,2
1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

Summary

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için KD'yi belirlemek için kullanılır.

Abstract

Yüzey plazmon rezonansı (SPR), etki alanı ile değiştirilen Siyanovirin-N (CV-N) DIMERINE HEMAGLUTININ (HA) BAĞLANMASıNı ÖLÇMEK VE MANNOSILLENMIŞ PEPTITLER ILE CV-N'nin yüksek afiniteli bağlanma bölgesi arasındaki etkileşimleri izlemek için kullanılır. Virüs zarfı sivri uçları gp120, HA ve Ebola glikoprotein (GP) 1,2'nin dimerik CVN2 üzerinde hem yüksek hem de düşük afiniteli bağlanma bölgelerine bağlandığı bildirilmiştir. Dimannosile HA peptidi ayrıca iki düşük afiniteli bağlanma bölgesinde, ilgili ligand için yüksek afiniteli bir bölge taşıyan ve karbonhidrat bağlayıcı cepteki stabilize edici bir disülfür bağının yerini almak için mutasyona uğrayan ve böylece çok değerli bağlanmayı doğrulayan mühendislik ürünü bir CVN2 molekülüne bağlanır. HA bağlanması, oligomerizasyon yoluyla insan immün yetmezlik virüsü tip 1'i (HIV-1) daha da nötralize eden 275 nM'lik bir ayrışma sabitinde (KD) psödo-antikor CVN2'nin yüksek afiniteli bir bağlanma bölgesine gösterilmiştir. Alan değiştirilmiş CVN2'deki disülfür köprülerinin sayısının ilişkilendirilmesi, sistinlerin polar kalıntı çiftleri glutamik asit ve arginin ile değiştirilmesiyle 4'ten 2'ye düşürülür, bu da HA'ya bağlanma afinitesinin azalmasına neden olur. En güçlü etkileşimler arasında, Ebola GP1,2, transmembran alanı olmayan zarf glikanını kullanarak alt nanomolar aralıkta iki yüksek afiniteli bağlanma bölgesi olan CVN2 ile bağlanır. Bu çalışmada, multispesifik monomerik CV-N'nin şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) başak (S) glikoproteinine bağlanması, nanomolar KD ile karşılaştırıldığında diğer virüs sivri uçlarına kıyasla KD = 18.6 μM'de ve orta μ-molar aralığındaki reseptör bağlama alanı aracılığıyla ölçülmüştür.

Introduction

Teterin ile ilişkili antiviral aktivite, interferon α tarafından indüklenir ve enfekte hücre yüzeylerinde tam olarak oluşturulmuş viryonların tutulmasına yol açan protein bazlı tetherleri içerir1. Virüs salınımının inhibisyonunda tetherin glikozilasyonun gerekliliği belirsizliğini korumaktadır, bu da in vitro çalışmalar için rekombinant olarak eksprese edilen glikanlar üzerinde glikozilasyon paternlerinin önemini ima etmektedir1,2, (influenza virüsü durumunda) yüzeyde eksprese edilen influenza hemaglutinin HA 3,4'ün konformasyonuna bağlıdır. . N'ye bağlı glikozilasyona bağlı oligosakkaritin modifikasyonunun, HIV tip-1 salınım2'nin tetherin aracılı kısıtlaması için yeterli olduğu, dimerizasyonun virüs salınımını önlemede önemli bir rol oynadığı, böylece tomurcuklanan viryonları bağlamak için transmembran alanını veya glikozil-fosfatidil-inositol (GPI)-çapayı içerdiği belirtilmiştir5 . İnsan ve murin tetherininin birden fazla zarflı virüsü, retrovirüsleri ve filovirüsleri bloke etmesi için benzersiz özellikler tanımlanmıştır. BST-2 / tetherin, doğuştan gelen bağışıklık 1,6'nın interferon ile indüklenebilen bir antiviral proteinidir, geniş spektrumlu antiviral aktivite ile etki eder ve tetherini translokasyona sokmak veya tetherin 6'nın yapısını bozmak için zarf glikoproteinleri5 tarafından antagonize edilir. Örneğin, influenza A virüsü üzerinde yüzeyde eksprese edilen zarf glikoprotein HA ve nöraminidaz tetherin antagonizması için suşa özgü bir şekildeiyi bilinir 7, konakçı reseptör bağlanma bölgelerinin tanınmasını kolaylaştırır8. Glikan hedefleme antikorları, HA üzerindeki hızla özelleştirilen glikan kalkanları ile etkileşimlerinin stokiyometrisinde incelenmiştir, bu da influenza A H3N2 ve H1N1 alt tiplerine bağlanma afinitesi ile sonuçlanır4.

Antiviral ajanlar ile virüs zarfı sivri uçları, yani karbonhidrat ligandları ve tamamlayıcı immünolojik ve spektroskopik yöntemler arasındaki bağlanma mekanizmalarını aydınlatmak için mono-, di- ve tri-mannoz moieties kimyasal olarak sentezlenir. Mannosillenmiş peptitler, glikozil {beta}-perasetatların azido glikozilasyonu yoluyla 1,2-trans glikozil azid transformasyonu9'a kadar oluşturulur ve tipik olarak bulunan N-asetil glukozamin ve hayatı tehdit eden virüslerin yüzeyinde yüksek mannoz oligosakkaritlerini taklit eder. Triazol biyoisosterleri, HA peptid10'un mannosillenmiş kalıntısını oluşturan bağlantıları taklit etmek ve HA kafa alanındaki ikinci N-bağlantılı glikozilasyon noktası etrafında antiviral CV-N türevleri ile bölgeye özgü etkileşimleri kolaylaştırmak için kullanılır (4 N-bağlantılı glikan N54, N97, N181, N301 ile HA tepesi)8,11,12 . Glutamik asit (Glu) ve arginin (Arg) ve sonuçta ortaya çıkan sarmal dipol arasındaki etkileşimler, hem model peptitlerin hem de proteinlerin iyi stabilitesini göstermiştir, ancak SPR kullanılarak görselleştirilmiştir. Glikan moietilerine reseptör bağlanmasını doğrudan inhibe ederek HA10 üzerinde kimyasal olarak sentezlenmiş tek bir glikozilasyon bölgesini tanımakla karşılaştırılırsa, dört bölgeli mutasyona uğramış bir Fc yapısının reseptörüne daha yüksek bir afinitesinin in vivo olarak efektör fonksiyonlarını ortaya çıkardığı ve Fc mutantına bağlı N-bağlı glikanların ilgisiz bileşiminin mekanik olarak belirlendiğini ortaya koyduğu gösterilmiştir13.

CV-N, HIV 14,15, influenza16 ve Ebola virüsüne karşı antiviral aktivite gösterir; bu, zarf başak proteinleri12,17,18,19 üzerindeki yüksek mannoz oligosakkarit modifikasyonlarına nanomolar bağlanmanın aracılık ettiği bir durumdur. CV-N'de bir yüksek afiniteli karbonhidrat bağlanma bölgesine (H) veya kovalent olarak bağlı dimerik CVN2'de iki Hs'ye bağlanan influenza HA'nın sırasıyla denge ayrışma sabitlerine (K D) = 5.7 nM (Şekil 1A) ve KD = 2.7 nM'ye sahip olduğu belirlenmiştir. Hem CV-N hem de CVN2, bir veya iki düşük afiniteli karbonhidrat bağlama bölgesini (L)12,17,20,21 olarak barındırır. Ebola GP1,2, CVN2'nin 2H'sine alt nanomolar aralıkta (KD = 26 nM) afinitelerle bağlanır. Ebola GP1,2 ve HA'ya bağlanan CV-N WT, KD = 34 nM'den KD = 5.7 nM'ye (A / New York / 55/04) 12 arasında yakınlıklar gösterir. Özellikle viral zarflar üzerindeki yüksek mannoz glikanlarını hedef alan CV-N gibi lektinler, hepatit C virüsü, SARS-CoV, herpes virüsü, Marburg virüsü ve kızamık virüsü22'nin replikasyonunu daha da inhibe eder.

Küçük CV-N molekülü, viral girişi inhibe etmek için çok çeşitli virüsleri bağlamak için işlevselleştirildiği için 20 yıldan fazla bir süredir kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır16,18. Yapısal analizler ve bağlanma afinite testleri, viral zarf glikoproteinlerine olan tutkuyu arttırmak için mikromolar aralıkta iki valan bağlanma ile alan değiştirilmiş bir CVN2 dimerindeki iki L'nin çapraz bağlandığını göstermektedir10,19. Manα1-2Manα'nın Man(8) D1D3 kolları ve Man(9) üzerindeki seçici bağlanması, karşıt protein protomerleri20 üzerinde bulunan farklı afinitelerin iki bağlanma bölgesini içerir ve böylece nanomolar bağlanma afinitelerine ulaşır (Şekil 1B). Bu nedenle, CVN2, virüs nötralize edici antikorlara benzer şekilde, HIV gp120 üzerindeki epitopları bağlamak için uygulanmasıyla ilgili olarak psödo-birantikor olarak kabul edilir. Burada yazar, CVN2'nin reseptör bağlama alanı (RBD) aracılığıyla SARS-CoV-2 spike'ına potansiyel bağlanmasını araştırmakla ilgilenmektedir. İmmobilize insan anjiyotensin dönüştürücü enziminin (ACE)-2'nin SARS-CoV-2 RBD ile bağlanma eğrileri, biyolojik olarak ilgili bu bağlanma etkileşimi için KD = 4.7 nM ile sonuçlanır23.

Buna karşılık, seçilen immünoglobulin sınıfları, membrana implante HA bölgelerinde afinite olgunlaşması için bir substrat veren spesifik ve tutarlı yapısal protein paternlerini tanır24. CV-N, hemen hemen tüm influenza A ve B virüsleri16'da oldukça güçlü aktivite gösterir ve geniş ölçüde nötralize edici bir antiviral ajandır. HA1 ve HA2'nin gövdesi üzerinde, muhtemelen yüksek oranda nötralize edici antikorlarla glikan hedefleme için epitopik yapıları içeren ve lektin bağlayıcı25 ile karşılaştırıldığında, hedeflenen epitopların yeri hakkında bilgimiz eksiktir.

Figure 1
Şekil 1: CV-N için SPR bağlanma testinin virüs zarfı sivri uçlarına şematik gösterimi. (A) CVV-N'nin ligandaya bağlanması için SPR Testi: HA tam uzunlukta protein (90 kDa). Kinetik veri seti (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2) ile gerçek zamanlı çift referanslı bağlanmayı göstermektedir. (B) CVN2L0 varyantı V2, 500 nM ila 16 μM konsantrasyon aralığında hareketsiz ligand DM'ye bağlanır. H kalıntıları gri renkle vurgulanır. E58 ve R73, vahşi tip proteindeki sisteinlerin yerine geçer ve V2'yi dört disülfür bağı yerine üç ile kararlı bir protein kıvrımı yapar Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Membran-distal HA üst kısmındaki glikan kalkanı CV-N 12'ye yüksek afiniteli bağlanmayı indüklerken, HA üst kısmının disülfür köprüsüne bitişik olarak HA'ya bağlanan CVN2, düşük afiniteli bölgelerinde10,12'de daha fazla gözlenmiştir. CV-N ile karbonhidrat bağlanmasında çeşitli polar etkileşimler ve etkileşim bölgeleri tanımlanmıştır. Bu etkileşimler, bağlanma afinitelerini in siliko öngörülen glikozilasyon12 ile ilişkilendirmek için bağlanma bölgesinde nakavt varyantları üretilerek doğrulanır. Bu nedenle, proje, bağlanma afinitesi ve özgüllüğünde daha önce test edilmiş kimyasal olarak mannosillenmiş HA peptidlerini, SARS ile ilişkili 2019-nCoV sivri uçlarından ve SARS-CoV-2'den elde edilen kısa peptid dizileri ile karşılaştırmayı amaçlamaktadır. doğal olarak az sayıda farklı N-bağlı glikozilasyon bölgesi ve O'ya bağlı glikozilasyon ile modifiye edilmiştir. Kriyo-elektron mikroskobu ve bağlayıcı testler kullanarak, Pinto ve meslektaşları, Sarbecovirus alt cinsi içinde korunmuş bir glikan içeren SARS-CoV-2 spike proteini üzerindeki bir epitopu potansiyel olarak tanıyan bir monoklonal antikor olan S309'u raporettiler. Bu çalışmanın protokolü, CV-N ve CVN2'nin SPR teknolojisi10,12 kullanılarak glikozile proteinlere ve sentetik mannosillenmiş peptitlere nasıl bağlandığını incelemek için CV-N varyantlarının tasarlanması, eksprese edilmesi ve karakterize edilmesinin ne kadar önemli olduğunu açıklamaktadır.

Tandem bağlantılı dimer CVN2L027 ve bağlanma yeri varyantları (V2-V5) rekombinant olarak eksprese edilir ve varyantlar disülfit bağ replasmanları (C58E ve C73R) ile birlikte (Şekil 2A). Ayrıca, tek noktalı mutasyon E41A'ya sahip bir mutant hazırlanır, çünkü bu pozisyon moleküller arası çapraz temas kalıntısı olarak görülmüştür. Bu mutant, lektin ve yüksek mannoz oligosakkaritler arasındaki SPR bağlanma ölçümleri için bağlanma alanlarını deşifre eden ve dimerik form ile karşılaştırmaya izin veren bir başka ilginç moleküldür. CVN2'nin etki alanı ile değiştirilen kristal yapısı, 49 ila 54 kalıntı arasında uzanan esnek bir bağlayıcı gösterir. İki alan, menteşe etrafında katı cisimler olarak hareket etmeye devam edebilir, ya molekül içi etki alanı etkileşimleri yoluyla bir monomer geliştirebilir (alan A -kalıntıları 1-39; 90-101- B alanı -kalıntıları 40-89 ile) ya da moleküller arası etki alanı [etki alanı A (ilk monomerin) B alanı (ikinci) ile ve B alanı (ilk monomerin) A alanı (ikinci kopyanın) ile] değiştirilerek bir dimer geliştirir. İki protomerin A ve B alanları arasında, Glu4128 hariç, yakın bir etkileşim yoktur. CV-N geni, 40-mer sentezlenmiş oligolar29 ile tekrarlayan bir PCR yöntemi kullanılarak geliştirilebilir ve daha sonra Keeffe, J.R.27 tarafından tanımlandığı gibi elektroremejyen hücrelere transformasyon (elektroporasyon) için pET11a'nın NdeI ve BamHI bölgelerine alt klonlanır. İlgili kristal yapıya (PDB ID 3S3Y) ulaşmak için kullanılan protein, bir N-terminal 6-histidin saflaştırma etiketi ve ardından bir Faktör Xa proteaz bölünme bölgesi içerir. Bölgeye yönelik mutagenez, nokta mutasyonları yapmak, kodonları değiştirmek ve amino asit değişimi için tek veya çoklu bazlar veya kodonlar eklemek veya silmek için kullanılır. Bu dönüşümler, protein fonksiyonu ve yapısı hakkında paha biçilmez bir fikir verir. Rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan CV-N, CVN2 ve CVN3, biyofiziksel olarak iyi çalışılmış20,21,27, üretilmesi ucuzdur ve bu nedenle SPR sensör çipleri üzerine hareketsiz hale getirilmiş glikanlara bağlanma tahlillerini karakterize etmek için kullanılmıştır. Konvansiyonel enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA), glikan ligandlarının immobilizasyon tekniği ile ilgili daha az tekrarlanabilirlik sağlar ve SPR için gösterilen çeşitli bağlanma yeri varyantlarının gerçek zamanlı bağlanmasını son nokta analizlerine dönüştürür.

Bağlanma-afinite varyantı CVN2L0-V2 (disülfit köprü ikamesi10 ile homodimerik CV-N'nin sağlam bir kıvrımı), Escherichia coli'de (E. coli) bir His-etiketi ile ifade edilir, afinite kromatografisi uygulayan Ni-NTA sütunu üzerinde saflaştırılır ve HA'ya (H3N2) bağlanma için test edilir, monomannosillenmiş HA-peptid ve SPR kullanılarak dimannosile HA-peptid. Kimyasal olarak mannosile edilmiş peptitler veya HA ve S proteini, hepsi hidrofilik çip yüzeyine bağlanmış ligandlar ve amindir. reaktif esterler veya biotin-streptavidin protein mühendisliği yoluyla. Aynı sıralı çalışma prosedürü, aşağıda açıklandığı gibi moleküler etkileşim analizleri için kinetik bilgi elde etmek için çeşitli CV-N seyreltimleri ve CV-N (ve CVN2) varyantları enjekte edilen bu ligandlara uygulanır. RBD-immobilize SPR sensör çipi, CV-N'den S peptidlerine bağlanma çalışmaları için kullanılır ve afiniteler, insan ACE2 ile SARS-CoV-2 bağlanmasıyla karşılaştırılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada, enzime bağlı immünosorbent tahlillerinde CV-N yerine CVN-küçük ubikitin benzeri modifiye edici (SUMO) füzyon proteini kullanılmıştır ve hücre bazlı tahliller için uygundur. Rekombinant tam uzunlukta influenza A virüsü HA H3 proteini ticari olarak elde edilir ( bakınız Malzeme Tablosu) veya standart protokollere göre memeli HEK293 hücre hatları ve bakülovirüs ile enfekte böcek hücrelerinde eksprese edilir12. Wuhan-1 spike proteini, memeli HEK293 hücrelerinde eksprese edilir. Monomannosillenmiş peptid (MM) ve dimannosile peptid (DM) sentezi, CVN2 ve monomannosillenmiş küçük molekül10'a homojen ligandların saptanmasını sağlar.

1. CV-N yapıları oluşturma

  1. CVN2 varyantlarının ve CVN2L0 proteininin (PDB ID 3S3Y) her biri için , ticari kaynaklardan bir N-terminal pelB lider dizisi ve pET27b (+) vektöründe His-etiketi ile gen yapısını elde edin (bkz.
  2. CVN2L0 ve varyantlarını (V2, V3, V4 ve V5; Şekil 2A,C) her CV-N tekrarı için iki ayrı DNA dizisinden oluşan CVN2L0 şablon geninin arka planında.
  3. Liyofilize plazmid DNA'sını steril deiyonize damıtılmış suda (ddH2O) 100 ng / μL'lik bir son konsantrasyona kadar çözün.

2. Plazmid DNA'sına dönüştürülmüş hücrelerle LB-agar plakalarının hazırlanması

  1. ddH2O'da 10 g / L pepton, 5 g / L maya ekstraktı ve 5 g / L NaCl çözerek kültür ortamı LB-Lennox hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. Daha önce yayınlanmış bir rapor 10'u takiben kimyasal yöntemle her varyant (V2-V5) için yetkin E. coli BL21'e (DE3) dönüşümü gerçekleştirin.
  2. Çözeltiyi (900 μL ve 100 μL) bölün, LB-agar plakalarına (50 μg / mL kanamisin) 100 μL aktarın ve nazikçe steril bir hücre dağıtıcı kullanın. Agar plakalarını gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

3. Klonlama

  1. CV-N genini, referans27'yi takiben elektroremejman hücrelere transformasyon (elektroporasyon) için pET11a'nın NdeI ve BamHI bölgelerine (bakınız Malzeme Tablosu) alt klonlayın.

4. Sahaya yönelik mutagenezi

  1. Her CV-N tekrarı için iki ayırt edici DNA dizisi içeren bir CVN2L0 şablon geninin arka planında CVN2L029 ve mutant CVN-E41A üretmek için27.
  2. PCR31'i çalıştırmak için bölgeye yönelik bir mutagenez kiti (bakınız Malzeme Tablosu) ve spesifik mutajenik primerler 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' ve 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' kullanarak mutasyonlar yapın.
    1. 5-50 ng arasında değişen çift sarmallı DNA (dsDNA) şablonunun çoklu konsantrasyonlarını kullanarak bir dizi örnek reaksiyonu başlatın (örneğin, 5, 10, 20 ve 50 ng dsDNA şablonu). Astar konsantrasyonunu sabit tutun.
      NOT: PCR karışımı ve termal döngü protokolü genellikle sahaya yönelik mutagenez kiti32 kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi kullanılır.
  3. Dpn I kısıtlama enzimini (1 μL, 10 U/μL , bkz. Reaksiyonları iyice ve nazikçe karıştırın, 1 dakika boyunca masa üstü bir mikrosantrifüjde döndürün ve ebeveyn süper sarmal dsDNA'yı sindirmek için 1 saat boyunca 37 ° C'de hemen inkübe edin.

5. Bakteriyel hücrelerin dönüşümü

  1. XL1-Blue süper yetkin hücreleri (bakınız Malzeme Tablosu) yavaşça buz üzerinde çözün. Her kontrol ve numune reaksiyonunu dönüştürmek için, süper yetkin hücreleri (50 μL) önceden soğutulmuş bir polipropilen yuvarlak tabanlı tüpe (14 mL) alikot edin.
    1. Her kontrol ve numune reaksiyonundan (mutasyona uğramış ssDNA) Dpn I ile muamele edilmiş tek sarmallı DNA'nın (ssDNA) 1 μL'sini, tamamlayıcı ipliği sentezleyen süper yetkin hücrelerin alikotlarını ayırmak için aktarın. Reaksiyonları 30 dakika boyunca buz üzerinde karıştırmak ve inkübe etmek için dönüşüm reaksiyonlarını dikkatlice döndürün.
      NOT: Dpn I ile muamele edilmiş DNA'yı transformasyon reaksiyonuna aktarmadan önce, kalan mineral yağların pipet ucundan dikkatlice çıkarılması önerilir. İsteğe bağlı bir kontrol olarak, XL1-Blue süper yetkin hücrelerin dönüşüm verimliliğinin, pUC18 kontrol plazmidinin (1 μL) 0,1 ng / μL'si ile süper yetkin hücrelerin 50 μL'lik bir alikotunun karıştırılmasıyla kontrol edilmesi gerekir.
  2. 45 s boyunca 42 ° C'deki dönüşüm reaksiyonlarına ısı darbesi uygulayın ve ardından reaksiyonları 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
    NOT: Uygulanan ısı darbesi, polipropilen yuvarlak tabanlı borularda (14 mL) belirtilen koşullar için zaten optimize edilmiştir.
  3. 0,5 mL NZY+ et suyu (litre başına: 10 g NZ amin (kazein hidrolizat), 5 g maya ekstresi, 5 g NaCl, 12,5 mL 1 M MgCl 2, 12,5 mL 1 M MgSO4, 10 mL 2 M glikoz, pH 7,5 ve42 °C'ye önceden ısıtılmış) ekleyin ve dönüşüm reaksiyonlarını 37 °C'de 1 saat boyunca 225-250 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. LB-ampisilin agar plakaları üzerindeki her bir transformasyon reaksiyonunun doğru hacmini (kontrol plazmid dönüşümünden 5 μL; numune dönüşümünden 250 μL) plakalayın.
    NOT: Transformasyon kontrolleri ve mutagenez için, 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-gal, 80 μg / mL) ve izopropil-1-tiyo-β-D-galaktopiranosid (IPTG, 20 mM) içeren LB-ampisilin agar plakaları üzerindeki hücreleri yayınlayın (bkz. Hücre kültürlerinin 50 mL'sini dönüştürülmüş E'nin tek bir kolonisi ile aşılayın. Mutasyona uğramış plazmid DNA'sını saflaştırmak için coli hücreleri. Mutagenez, harici bir tesiste DNA dizilimi ile doğrulanır.

6. İfade ve protein saflaştırma

  1. Büyük ölçekli bir kültür için, dönüştürülmüş plakadan tek bir koloni ile az miktarda LB (ampisilin içeren) aşılayın.
  2. Gece kültürünü kullanarak, ekspresyon kültürünü 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 ve 20 mM glikoz gibi katkı maddeleri ile aşılayın ve tohum kültürünü 1/100'e seyreltin.
    1. 37 ° C'de kuvvetli sallanan hücreleri büyütün. Hücreleri 20 ° C'ye soğutmadan önce hücreleri 0.4-0.6 (orta log fazı) arasında bir Abs 600 nm'ye kadar büyütün. 1 mM IPTG ile indükleyin ve bir gecede büyüyün.
    2. Daha sonra, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj yaparak hücreleri toplayın ve süpernatantı bir pipetle atın.
  3. Hücre peletini fosfat tamponlu salin (PBS) tamponunda yeniden askıya alın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'de yeniden santrifüj yapın. Ardından, süpernatantı bir pipetle atın. Kalan peleti 10 mL lizis tamponunda yeniden askıya alın ve süspansiyonu 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: Lizis tamponunun bileşimi: (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, %2 Triton-X100, 500 ng/mL lizozim, 1 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF), 1 mM ditiyotreitol, 1 mM MgCl2, pH 8, bkz.
    1. Karışımı iki donma-çözülme döngüsüne (-80 °C) maruz bırakın. Çözünür ve çözünmeyen fraksiyonları, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile ayırın ve poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), özellikle sodyum dodesil sülfat (SDS)-PAGE33 (Şekil 2B, C) kullanarak analiz edin.
      NOT: Hücreler, donma-çözülme, sonikasyon, homojenizasyon, enzimatik lizis veya bu yöntemlerin bir kombinasyonu gibi çeşitli şekillerde lize edilebilir. Yüksek protein verimi toplamak için inklüzyon cisimciklerinden saflaştırma önerilir26.
  4. Ni-NTA kolon kromatografisini kullanarak proteinleri saflaştırın (bakınız Malzeme Tablosu). Çözünür fraksiyonu rejenere edilmiş bir Ni-NTA boncuk sütununa (1 mL/dak) yükleyin. Bir gradyanı başlatmadan (60 dakika boyunca TBS'de% 0-100 500 mM imidazol) ve fraksiyonları (1 mL / dak) toplamadan önce sistemi TBS tamponu (50 mM Tris, 150 mM sodyum klorür, pH 7.5) ile yıkayın. Biyokimyasal karakterizasyon için saflaştırılmış proteinleri 100 mM PBS'ye karşı diyalize edin (Şekil 2C,D).
  5. Alternatif olarak, sırasıyla 20 mM imidazol ve250 mM imidazol içeren tampon çözeltilerde etiketli rekombinant olarak eksprese edilen CV-N'yi bağlamak ve yeniden askıya almak için 14 mL tüplerde His-Select Ni 2+ afinite jeli ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Toplu halde en az 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu yarı saflaştırılmış proteinleri, tampon değişimi ve biyolojik numunelerin, örneğin immobilize metal afinite kromatografisinden 1-1,5 mL elüat yükleyebilen karbonhidratların ve proteinlerin temizlenmesi için tek kullanımlık önceden paketlenmiş bir kolona uygulayın.
  6. Protein çözeltilerini 10 kDa kesme filtreli santrifüjleme tüplerine aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 4.500 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj yaparak konsantre edin. SPR ölçümleri için, analit çözeltilerini 10 mM HEPES, 150 mM sodyum klorür, 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA ) ve %0,05 Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), bkz.
    1. Bu SPR çalışma tamponunu 1:10 seyreltme faktörüne ekleyin ve 4.500 x g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca başlangıç hacmine dört kez santrifüj yapın.
  7. 23.474Da 34 büyüklüğünde bir boyut gösteren CVN2L0 ana proteini için hesaplanan yok olma katsayısına (20.440 M-1 cm-1) dayanan bir NanoDrop UV-Vis spektrofotometresi (Malzeme Tablosu'na bakınız) kullanarak 280 nm'deki protein konsantrasyonunu belirleyin. PBS (100 mM, pH 7.0) veya SPR tamponunu boş olarak kullanın ve protein konsantrasyonunu üç seyreltme adımında (1:1, 1:10 ve 1:100) ölçün.

Figure 2
Şekil 2: CV-N dizileri ve ekspresyonu . (A) Her CV-N tekrarı (her biri 101 amino asit) ile dört disülfit köprüsü arasında bir bağlayıcı olmadan CVN2, E'de pET11a vektöründe ifade edilir. coli. (B) CV-N (monomer) ve CVN2 (dimer) için iki bağımsız koloninin ifadeleri. (C) Disülfür bağ varyantları SDS-PAGE üzerinde saflaştırılır ve analiz edilir. Referans olarak düşük moleküler ağırlıklı bir belirteç (6 μL) kullanılır. WT = CVN2L0, (A) ile işaretlenmiş dört disülfür köprüsü taşır. V2, 58 ve 73 pozisyonlarındaki polar kalıntılarla disülfür bağının değiştirilmesine sahip bir varyanttır. V3-V5, kalan iki S-S bağı ve ya polar (C58E-C73R) ya da polar olmayan (C58W-C73M) amino asitlerin yerini alan ya da bu kalıntı çifti ikamelerinin bir kombinasyonu olan varyantlardır. (D) Saflaştırılmış CVN2L0'ın HPLC kromatogramları, 30 dk üzerinde A tamponundaki %5-%65 tampon B'den doğrusal bir gradyan ile 1 mL/dak akış hızında elimine edilir. Tampon A: ddH2O'da %0,1 (v/v) trifloroasetik asit, tampon B: %0,08 (v/v) trifloroasetik asit asetonitrilde. Protein, 214 nm ve 280 nm'de yüksek performanslı bir silika jel 300-5-C4 (150 x 4.6 mm) sütun üzerinde analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. SPR spektroskopisi

  1. Rejenerasyon tamponu olarak HBS-EP(+) ve 10 mM glisin HCl pH 1.5-1.6 çalışan tamponlu Çift Kanallı SPR sistemini ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Cihazı, degazörü, otomatik numune alma cihazını açın ve pompalayın ve tüm sistemi ddH20 ile 1 saat boyunca yıkayın. Kullanıma hazır çalışan tamponu ayrı bir şişeye yerleştirin.
  2. Dedektörün üzerine emersion yağı bırakın ve ince bir altın film ile kaplanmış ve karboksimetildekstran hidrojel ile işlevselleştirilmiş üst tarafa doğrudan üç portlu akış hücresinin altındaki dedektöre bir cam sensör çipi ( Malzeme Tablosuna bakınız) monte edin. Taşıma işlemini aşağı çekerek ayarı düzeltin.
    NOT: C19RBDHC30M 200 nm streptavidin, orta yoğunlukta biyotinile şiddetli akut solunum sendromu koronavirüsü-2 RBD proteini ile türetilmiş karboksimetildekstran hidrojel, önceden hareketsiz hale getirilmiş ligand ile kullanıma hazır bir sensör çipidir.

8. HA, S proteini ve RBD'ye CV-N bağlanması için SPR bağlanma testi

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek proteinli ligandları sensör çiplerine hareketsiz hale getirin.
    1. Menü çubuğunda Form'a ve entegre SPRAutoLink yazılımında Tablo Düzenleyicisi'ni Çalıştır'a tıklayarak bir çalıştırma tablosu açın (bkz. Kullanılabilir çalıştırma tabloları listesinden BASIC_Immobilization seçip tıklayın ve bilgisayar ekranındaki deneysel prosedürün adımlarını izleyin. Kullanılan ilgili Örnek Editör sağ üst köşede gösterilir.
    2. Daha fazla analiz için otomatik numune alma cihazına yerleştirilen iki rafın reaktif listesini doldurmak için Form bölümündeki Örnek Kümesi Düzenleyicisi'ne tıklayın. Rafları öne veya eve getirmek için menü çubuğunda Otomatik Örnekleyici Doğrudan Kontrolü'ne "Araç" olarak tıklayın. Çalışma sıcaklığı olarak 4 °C'yi seçin.
      NOT: SPR yazılımı, ilgili aletleri seçerek , otomatik numune alma cihazının kullanımını seçerek ve Form'a tıklayarak "SPR Cihazı Doğrudan Kontrolü" ve "Pompa Doğrudan Kontrolü" ne izin verir; ayrıca veri analizi gerçekleştirmek için Run Table Editor, Data-Plot veya Post-Processing seçilebilir. Dosyalar doğrudan varsayılan dizine kaydedilir ve Son İşlem penceresinden scrubber.files olarak dışa aktarılır.
  2. Araçlar ve Pompa Doğrudan Kontrolü'ne tıklayarak ddH20'ı demlemek için pompayı başlatın ve SPR Cihazı Doğrudan Kontrolü'ne tıklayarak verileri kaydedin ve her seferinde yeni açılan pencerelerde başlatın. Kaplin reaktiflerini (adım 8.3) 300 μL şişelere koyun, otomatik numune alma raflarına koyun ve Çalıştır'a tıklayarak çalıştırma tablosunu başlatın.
    NOT: Talaş yüzeyleri ya 10 mM glisin tamponu pH 9.0 ile şartlandırılır ya da EDC/NHS aktivasyon karışımı30 için karboksil türevli talaş yüzeyini koşullandırmak üzere 1 M sodyum klorür, 0,1 M sodyum borat tampon pH 9,0 ile yıkanmış olabilir.
  3. Bu basit protein-protein etkileşimi için, CMD500D çipini kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) bir mikro-kırılma indisi birimi (μRIU) = immobilize HA ile 2500 - 3000 akış hücresi ve başak proteinli μRIU = 400 akış hücresi oluşturun. 15 μL / dak'lık bir infuse akış hızında, aşağıdaki sıralı adımları uygulayarak 0.4 M N-etil-N'-(dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC * HCl) ve 0.1 M N-hidroksisüksinamid (NHS) sulu ve eşit bir karışımını enjekte edin.
    1. 25.000 μL/dk'da dolum pompası dolumu, 30 sn için taban çizgisi ayarı yapın, 6 dk temas süresi boyunca 90 μL numune aktivasyon çözeltisi (EDC/NHS) enjekte edin ve ardından 5 dakika daha bekletin.
    2. 20 μg / mL'de kimyasal olarak sentezlenmiş peptitler 10, HA ve spike proteinini enjekte etmek ve hareketsiz hale getirmek için yalnızca sol akış hücresinde (mavi) 10 μL / dak'da 1 dakika boyunca10 μL / dak'da 1 dakika boyunca çalışan taban çizgisinden sonra bu döngüyü tekrarlayın ve aktive edilmiş talaş yüzeyini 1 M etanolamin HCl pH 8.5 ile söndürmeden önce 1,5 dakika boyunca ddH2O ile sonraki temel ayarlamaya izin verin.
  4. Tüpleri sıvı numune alma cihazından ddH20'dan degazöre HBS-EP(+) özellikli şişeye geçirin (Ek Şekil 1).
  5. SPR sensorgramlarını analiz edin.
    1. Kinetik çalışmalar yapmak için, her enjeksiyondan sonra bir rejenerasyon adımı ve farklı analitlerden sonra boş ölçümler ile çeşitli analit konsantrasyonları (10-5-10-8 M) kullanın. Akış hızını 10 μL/dk olarak değiştirin ve 4 dk temas süresi, ardından 5 dk bazal üretim ve her biri 30 sn aralıklarla 2 dakikalık iki rejenerasyon adımı için enjeksiyonlara başlayın.
    2. Farklı protein konsantrasyonlarını normalleştirmek için sensör gramları numune çalışmalarından çıkarılan boş ölçümler için tampon çözeltisini enjekte edin.
  6. Form'a tıklayın, aşağı kaydırın ve bu işlem modunu tıklatarak "İşlem Sonrası" na geçin. Her akış hücresi için Veri Grafiği Formunda zaman içinde oluşturulan bağlama eğrilerini seçmek için Ekle'ye tıklayın ve bindirmeyi bir yıkayıcı dosyası (.ovr) olarak dışa aktarın. Dosya kaydetme seçeneklerini açmak için Dosya'ya tıklayın. Sol ve sağ eğrileri hizalayarak ve ikinci referans kanalının sinyallerini ligand kanalınınkilerden çıkararak yanıt eğrileri elde edin.
    NOT: Veriler, sensorgramlar hesaplamalı olarak tanımlanarak "İşlem Sonrası" nda çalıştırılır. Sol ve sağ akış hücrelerinden sensorgramların bir bindirmesine yerleştirilir veya her iki kanalın farkından sensorgramlar olarak temsil edilir.
  7. Tüm akışkanları 50-100 mM glisin tamponu pH 9.5, su ve% 20 etanol ile temizleyin, tuz izlerini veya herhangi bir protein kontaminasyonunu veya daha sıkı% 0.5 SDS ve glisin ile gidermek için bağlama ölçümlerinden önce ve sonra.
    NOT: Cihazın hasar görmesini önlemek için, talaşlar tampon altında veya %100 nemde saklanmışsa, talaş kartuşunu cihaza yeniden takmadan önce cam talaşının mekanik stabilitesinin kontrol edilmesi önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dimerik etki alanı ile değiştirilen CVN2L0 molekülü, üç ayrı SPR deneyinde HA üst bölgesine bağlanma açısından test edilir ve bağlanma afinitesi KD değerlerinde sunulur. Etki alanı B'nin, bir disülfür bağının iyonik kalıntılara dönüştürülmesiyle etkilenen H-bağlanma bölgelerini içerdiği varsayılır ve A alanı L 10,18'i oluşturur. CVN2L0'ın tek enjeksiyonları ve V2 varyantları (üç disülfür köprüsü) ve V5 (iki disülfür köprüsü), otomatik örnekleyici ve çalışan masa düzenleyicisi kullanılarak kinetik ölçümü ayarlamadan önce bağlanma kapasitelerini tahmin etmek için HA-kuplajlı sensör çipine bağlanma açısından test edilir (Şekil 3A ve Ek Şekil 2). Tekrarlanan enjeksiyonlar, zaman içinde sistemdeki nanomolar ve μ-molar aralığında çeşitli konsantrasyonlarda bir dizi CVN2L0, V2 ve V5 için otomatikleştirilir (Şekil 3B-D). Bozulmamış Cys-Cys bağlarının sayısını ilişkilendiren CVN2L0, iyi doygunluğa ulaştığında hareketsiz HA'yı KD = 255 nM'de bağlar. Bu durumda, kinetik verilerden veya denge verilerinin Langmuir bağlayıcı izotermine uydurulmasıyla hesaplanan her iki KD değeri de orta derecede hemfikirdir (Tablo 1 ve Ek Şekil 3, Ek Şekil 4).

Figure 3
Şekil 3: Çok değerli etkileşimler yoluyla ligand bağlanması için SPR bağlama testi. CVN2 (WT) ve yüksek afiniteli karbonhidrat bağlayıcı cebinde disülfür replasmanları olan V2 ve V5 bağlayıcı saha varyantları, kovalent olarak immobilize HA'nın bağlanması için test edilmiştir. (A) CVN2, V2 ve V5'in sol ve sağ akış hücresi bağlanma eğrileri SPR çalıştırma protokolünden çıkarılabilir ve sensorgramlar bir bindirmede özetlenebilir. (B) CVN2L0'ın HA'ya bağlanması için kinetik analizler olarak gösterilen geleneksel SPR deneyinden alınan sensorgram, 10-4 ila 10-8 M arasında analit konsantrasyonları enjekte edilir. CVN2L0, 1.5 μM'de (üst çizgi) ve 500 nM'ye kadar (alt çizgi) en yüksek konsantrasyona kadar ölçülür, bunun için talaş yüzeyinde doygunluk veya denge bağlaması elde edilmez. RU = Yanıt birimleri. CMD500D sensör çipi kullanılır. (C) HA'ya V2 bağlama için SPR sensörü gramı. (D) HA'ya bağlanan V5. Şekil (B-D) referans10'un izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ka (M-1 s-1) kd (s-1) KD [HA]
Kinetik		 KD [HA]
Denge
CVN2 5.1 e3 1,3 x 10-3 255 milyon 246 milyon
Sürüm 2 4.0 e3 1,1 x 10-3 275 milyon 255 milyon
V5 Sürümü 1.2 e3 5,8 x 10-2 5 μM 4,9 μM
CVN2L0 2.07 e4 3,0 x 10-3 147 nM 600 nM
2.27 e4 3,0 x 10-3 133 milyon 490 nM

Tablo 1: SPR ile ölçülen CVN2 ve varyantlarının HA'ya bağlanma afiniteleri. Scrubber 2.0 (bir BioLogic yazılımı), gerçek zamanlı SPR ilişkilendirme ve ayrışma eğrilerine uymak ve kinetik ve denge verilerinden denge ayrışma sabitlerini (KD) hesaplamak için kullanılır. Ka = ilişkilendirme oranı sabiti. Kd = ayrışma hızı sabiti.

CVN2L0 ve V2'nin HA'ya bağlanması için KD değerleri nanomolar aralıkta iken, V5 bağlanmada azalır (Tablo 1). V5'te, iki disülfür bağı, mutasyona uğramış Glu ve Arg kalıntıları arasındaki potansiyel iyonik etkileşimleri yeniden eğiten iyon eşleştirme kalıntıları ile değiştirilir (Şekil 2A, 3D). Birincil veriler, çözünür CV-N'nin hareketsiz ligand ile etkileşiminin bağlayıcı kinetiğini ve oluşan kompleksin çip yüzeyinden ayrışmasını tanımlayan entegre ilişki hızı ve ayrışma denklemlerinin hızını takiben analiz edilir. İki bağımsız ölçüm yapılır ve replikalardan elde edilenlere eşdeğer sensorgramlar analiz edilir. KD, koff/kon (Ek Tablo 1)10,35 bölümü olarak hesaplanır. Bununla birlikte, KD, denge bağlama tepkisinin analit konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizildiği Langmuir bağlanma izotermi 36'ya uyan denge verileriyle ilgilidir (Ek Şekil 3A,4A,3B,4B). Konsantrasyona bağımlı bir şekilde, ayrışma hızısabiti k d, analizlerden sonra belirlenir ve ilişkilendirme oranı sabiti ka'yı tahmin etmek için ilişkilendirme fazı uyumuna (kon) dahil edilir. (Tablo 1, Ek Şekil 3C, Ek Şekil 4C).

Daha sonra, CV-N'nin HA'ya bağlanması, RBD ile etkileşimi ile karşılaştırılır. SARS-CoV-2 RBD'ye CV-N WT bağlanması, HA'ya bağlanma (K D = 5.7 nM) 8,10,12 ve S proteinine bağlanma (K D = 18.6 μM, Şekil 5) ile karşılaştırıldığında daha zayıf afinitede (KD = 260 μM, Şekil 4A) ölçülür. Konsantrasyona karşı yanıt, RBD'ye bağlanan CV-N WT için, RBD S1 alt birimindeki muhtemelen korunmuş karbonhidratların spesifik olarak hedeflendiği varsayılarak, çizilmiştir (Şekil 4A). Aynı afinite grafiği, küçük glikozile peptitlere yüksek afiniteli bağlanmaya müdahale eden disülfit bağlarının değiştirilmesi nedeniyle artık analiz edilemeyen DM'ye CVN2L0-V4 bağlanması için de gösterilmiştir (Şekil 4B).

CVN2L0-V4 (sistein kalıntılarının Glu-Arg kalıntıları veya amfipatik amino asitler Trp ve Met ile simetrik olmayan bir şekilde değiştirilmesine zıt 2 disülfür bağı), psödo-alan B karbonhidrat bağlanma bölgesi10 etrafında polar olmayan hidrojen bağ ağları oluşturabilir. HA proteini üzerindeki glikanların daha yüksek yoğunluğu, sistinler yerine polar Glu-Arg kalıntıları ile bağlanmaya (Ek Tablo 1) ve CVN2L0 ile Glu-Arg'a modifikasyonlar arasında mannosillenmiş peptitlerle (DM için KD = 10 μM) bir ilişkiye ulaşır, ancak özellikle H her iki monomerde de modifiye edildiğinde, bu monoglikozile peptidden varyantların süreksiz ayrışmasını gösterir. CVN2L0-V4 ile DM arasındaki etkileşim için, 56 μM CVN2L0-V4 enjeksiyonunun cevabı Rmaksimumdan daha yüksek bir yanıt verir. (Şekil 4B). V5 (2x Glu-Arg), yüzeye bağlı DM'den ayrışmada başarısız olur (veriler gösterilmemiştir). Özetle, düşük konsantrasyonların yanıt eğrileri, doğal H ve RBD'ye monomer bağlanmadan peptide bağlanan CVN2 üzerindeki tüm sensorgramlar için enjeksiyonu sonlandırmadan önce azalır.

Figure 4
Şekil 4: RBD'ye bağlanan (A) CV-N WT monomerinin SPR analizleri. K D, kinetik verilerin (sol taraf, K D = 260 μM) sığdırılmasıyla hesaplanır ve ligand ile analit arasında 1: 1 bağlanma için basit bir biyomoleküler model kullanılarak afinite verileriyle (sağ taraf) karşılaştırılır (KD equil = 274 μM). Denge bağlanma tepkisi veya bağlanma kapasitesi, SPR bağlanma eğrileri (0-605 μM CVN) ile karşılaştırıldığında konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak çizilir. H = Yüksek afiniteli bağlanma bölgesi. L = Düşük afiniteli bağlanma bölgesi. Her ikisi de CV-N ve CVN2L0'de bulunur. (B) DM'ye bağlanan dimerik CVN2L0-V4, analiz edilebilir KD olmadan 2L'yi varsayar. CVN2L0-V4 konsantrasyonları 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3.5 μM'dir.

Figure 5
Şekil 5: Mutant CVN-E41A ve CV-N WT'nin (A) S glikoproteinine bağlanması. Oklar, ilişkilendirme ve ayrışma aşamasının başlangıcını gösterir. (B) SARS-CoV-2 üzerinde RBD'ye bağlanan CVN-E41A. Ligandlar, HC polikarboksilat ve CMD500D sensör çipleri üzerine önceden hareketsiz hale getirilmiştir. RBD immobilizasyonu için Covid-19 S1 alt birimi [Pinto, D. et al.26; and Barnes, C. et al.37] kullanılmaktadır. Akış hızı: 30 μL/dak, 25 °C; çizilmiş ham veriler. Buna karşılık, insan kan serumu antikorlarının RBD'ye 1:200 seyreltme faktörü ile bağlanması tasvir edilmiştir. (C) CV-N WT'nin S glikoproteinine bağlanmasının SPR testi, CV-N'yi yakalamak için 400 μRIU'luk bir yanıt seviyesine hareketsiz hale getirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tek bir L'li monomerik CV-N'nin gp120'yi yeterince bağlayamayacağı, ancak CV-N'nin nötralizasyon yeteneğinin iki karbonhidrat bağlama bölgesinin çapraz bağlanmasını gerektirdiği ve ağırlıklı olarak 2H12,19 ile işlevselleşmek için dimerizasyon ile restore edildiği daha önce gösterilmiştir. Bu nedenle, sahte etki alanı B'yi istikrarsızlaştırdığından şüphelenilen veya CV-N WT. CVN-E41A monomerinde bulunduğu gibi ikinci alan A ile bağlantıyı kesebileceğinden şüphelenilen monomerik bir mutant CVN-E41A eksprese edilir. 605-680 μM analit konsantrasyonları için SPR yanıtı, sırasıyla CV-N WT ve E41A bağlanması için yüksek yanıt birimleri ve tipik SPR sensörgramları ile sonuçlanmasına rağmen, mutant seyreltildiğinde kararsızdır (Şekil 5).

Ek Şekil 1: influenza HA top'un bir parçası olarak DM taklidini yakalamak için SPR sensorgramı. Ekran görüntüsü: DM'nin SPR sensör çipi CMD500D üzerine immobilizasyonu için SPR çalışma protokolünü gösteren SPR veri grafiği, 500 nm karboksimetil dekstran hidrojel ile kaplanmış ve yüksek ligand yoğunluğu üzerinde düşük moleküler ağırlıklı analitlerin kinetik analizleri için uygundur. Sensorchip'ler doğrudan dedektöre emersion yağı ile monte edilir ve üç portlu bir akış hücresinin altına sabitlenir. Aktif talaş yüzeyini 1 M etanolamin HCl pH 8.5 ile söndürdükten sonra, CVN2 iki kez enjekte edilir (sırasıyla konsantrasyon = 1 μM ve 2 μM). Mor: Akış hücresi 1 ile akış hücresi 2 arasındaki fark; yanıt 0.2 s. Mavi: Akış hücresi 1: Ligand DM'nin 400 nM'lik bir çözeltisinden aktif bir karboksillenmiş yüzeye kaplanmış 3000-4000 mikro-Kırılma İndeksi Birimi (μRIU) aralığında kaydedilir. Kırmızı: Referans akış hücresi 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Dimerik CVN2L0-V5, V2 ve CVN2L0'in bağlanmasını gösteren HA işlevselleştirilmiş CMD500D sensör çipi üzerinde manuel çalıştırma. 30-50 μL/dak arasındaki infüze akış hızlarında, bir His-etiketi ile ifade edilen ve Ni-NTA üzerinden saflaştırılan CVN2L0 ve disülfür bağ varyantları orta-μM aralığında enjekte edilir ve 3 dakikalık bir ilişki fazı ve 2 dakikalık bir ayrışma fazı ile HA'ya bağlanma açısından test edilir. Enjeksiyonlar V5 (15 μM), V2 (2.4 μM), 0 μM, bir SUMO-füzyon proteininden (1 μM) alt klonlanmış CVN2L0 ve CVN2L0'dir (2 μM). Fizyolojik pH'ta çalışan tampon, 25 ° C'deki tüm deneyler için kullanılır. Tüm çözeltiler sisteme enjeksiyondan önce gazdan arındırılır ve filtrelenir (0,2 μm). Mor: Akış hücresi 1 ile akış hücresi 2 arasındaki fark; yanıt 0,2 saniyelik bir aralıkta kaydedilir. Mavi: Akış hücresi 1: 2540 μRIU HA. Kırmızı: Referans akış hücresi 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: CVN2'nin HA'ya bağlanması. Eğriler otomatik olarak hizalandığında sensör gramlarının analizi. (A) Scrubber yazılımı (solda) kullanılarak sıfırlanmış ve hizalanmış sensör gramları ve bağlı analitlere konsantrasyona bağlı tepki eğrisini gösteren izotermi bağlama (sağda). (B) Yüzde kapasite cinsinden ifade edilen bağlanma izotermi. (C) Hesaplamalı olarak uyarlanmış teorik ilişkilendirme ve ayrışma eğrileri. (D) Takılı eğriler olmadan SPR sensör gramları hakkındaki kinetik veriler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: CVN2'nin HA'ya bağlanması. Eğriler manuel olarak hizalandığında sensör gramlarının analizi. (A) Scrubber yazılımı (solda) kullanılarak sıfırlanmış ve hizalanmış sensör gramları ve bağlı analitlere konsantrasyona bağlı tepki eğrisini gösteren izotermi bağlama (sağda). (B) Yüzde kapasite cinsinden ifade edilen bağlanma izotermi. (C) Hesaplamalı olarak uyarlanmış teorik ilişkilendirme ve ayrışma eğrileri. (D) Takılı eğriler olmadan SPR sensör gramları hakkındaki kinetik veriler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 1: Langmuir 1: 1 bağlama modeli kullanılarak CVN2L0 ve Cys-Cys bağ varyantları V2, V4 ve V5'in HA'ya bağlanması için SPR sensör gramlarından elde edilen kinetik veriler. KD [M] = k kapalı/k açık  veya kd/ka. Tüm veriler HBS-EP(+) tamponunda 25 °C'de üretilir.: Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CV-N'nin bağlanma afinitesi, işlevsel bağlama sitelerinin sayısıyla ilişkilidir [B etki alanlarında 2H ve etki alanı değiştirilen dimer olarak tasarlandığında A etki alanlarında 2L]. Değiştirilmiş bağlanma afinitesine sahip bir varyant (CVN2L0-V2, bir disülfit köprü nakavtını içeren CV-N'nin homodimerik kararlı bir kıvrımı) E. coli'de ifade edilir, saflaştırılır ve SPR10 kullanılarak HA-proteinine (H3N2) bağlanma için pozitif olarak test edilir ve HA'nın H veya L karbonhidrat bağlanma bölgeleri ve KD1 = 49 nM ve KD2 = 8 μM38 ile bağlanması üzerine konformasyonel bir değişiklik gösterir. . CVN2'deki glikan hedefleme cebinin yakınındaki disülfür köprülerinin sayısı 4'ten 2'ye düştüğünde, HA proteinine bağlanma afinitesi azalmıştır (Şekil 3B-D ve Ek Tablo 1). Disülfür bağ varyantları, Cys'nin ikame edilmesi ve polar kalıntı çiftleri Glu - Arg'nin hafifçe azalan stabilite ile eklenmesiyle oluşturulur. Varyantlar aksi takdirde aynı molekülü temsil eder ve dört bağlanma bölgesi işlevseldir, ancak çip üzerindeki çok bölgeli bağlanma, iki disülfür ikamesine dayanan tüm varyantlar için etkilenir. İki yüksek afiniteli bağlanma cebinde her iki disülfit bağının polar olmayan bir ikamesi, HA-peptidi hem monomannosillenmiş hem de dimannosile formunda aktif olarak bağlayan varyant CVN2L0-V3'ü yapar. CVN2L0-V3 ile etkileşimler, mikromolar konsantrasyonlar ve STD-NMR yoluyla çözeltideki sentetik peptitler (MM ve DM) ile bağlanma için doğrulanır. Özellikle, CVN2 SPR'nin MM'ye bağlanma deneyleri, Rmax'ın yetersiz hesaplanması, SPR tekniğinin genel bir dezavantajı ve immobilize MM10'a zayıf bağlanma afiniteleri nedeniyle analiz edilemez. Bu peptidin ve diğer peptidlerin artan ligand yoğunluğu, bağlanma seçiciliğini azaltır. SPR kullanarak, yüksek stabiliteye sahip dimerik CVN2L0 (2H + 2L), böcek hücrelerinde ifade edilen HA'ya çok değerli bağlanmayı ve yüksek mannoz oligosakkaritleri için kimyasal olarak tasarlanmış tek bir biyomimikri üzerinde dimannoz için özgüllük gösterir. bağlayıcı bir model 1: 1 varsayılarak. Oligo-mannosidlere bağlanma genellikle lektin17'ye karşı titretilmesi için daha yüksek bir ligand konsantrasyonu gerektiren izotermal titrasyon kalorimetrisi ile ölçülür.

Monomannoza veya Man'dan(7) daha küçük herhangi bir glikana rekabetçi bağlanma15'ten önce bulunmamıştır, bu da bu glikan moietilerinin tanınmasında peptid omurgası ile kimyasal bağlantının katılımını göstermektedir. Hedefteki mannoz-mannoz bağlantılarının sayısı çeşitliydi ve yüksek afiniteli glikan cebindeki triptofan etkileşimlerini deşifre etti. Peptitlerin triazole bağlı monomannoz veya triazole bağlı dimannoz ile modifikasyonunun tipi, özellikle H. CVN2L0 (2H + 2L) ve CVN2L0-V2'nin (1H + 2L) DM'ye bağlanma afiniteleri ile ilgili olarak, kkapalı, CVN2L0-V2'nin DM'den HA 10'a karşı ayrışması ile ilgili maksimum10 kat daha yüksektir. Kinetik hız sabitlerini ölçmenin yanı sıra, SPR, dengeye ulaşmadan çok yavaş denge sistemleri için denge sabitlerini tahmin etmeyi sağlar (Tablo 1). Buna karşılık, kon, etki alanı ile değiştirilen CVN2L0'in tüm bağlanma eğrileri ve disülfit bağ varyantlarının (V2, V4 ve V5) HA'ya (Ek Tablo 1) veya DM'ye kadar iyi göreceli yanıt değerlerini ifade ederken, ayrışma hızı sabiti k off, V4 ve V5 için daha hızlıoff-rates gösterir, iki fonksiyonel L taşıyan iki varyant ve DM ile ilgili analiz edilemeyen KD ile V4 (Şekil 4B) ). B etki alanının H'ye ve etki alanı A'ya ilgili L'nin atanması, disülfit bağ varyantlarının SPR'de HA18,28'e belirtilen farklı bağlanma yakınlıklarını ortaya çıkarması için temel oluşturan önceki bir bulgudur.

SPR, biyomedikal araştırmalarda biyomoleküler etkileşim analizi için önde gelen araçlardan biridir35. SPR cihazında toplu analit konsantrasyonunun spesifik, zamanlanmış bir kontrolü mümkün ise, makromoleküller arasındaki bağlanma ilerlemesinin kinetiğinin kantitatif olarak değerlendirilmesi mümkündür ve çoklu protein komplekslerinin analizine olan ilgi artmaktadır39. Kullanımındaki zorluk, etkileşim bileşenlerinden birinin, küçük ve büyük biyomolekülleri yakalayan yaygın olarak kullanılan karboksimetil dekstran veya HC polikarboksilat hidrojel yüzeyi üzerinde kontrollü olarak konumlandırılmasıdır. Talaş yüzeyinin immobilizasyonunu ve bağlanma kapasitesini optimize etmek için, streptavidin-biyotin sandviç immobilizasyonu ve protein His-tag yoluyla bir anti-his antikoruna immobilizasyonu mevcuttur40. Proteinlerin biyofiziksel özellikleri veya küçük moleküllerin fonksiyonel grupları immobilizasyon sonuçlarına müdahale edebilir, ancak burada açıklanan glikoproteinler ve EDC / NHS kimyası ile kovalent olarak bağlanan glikopeptidler ile ilgili herhangi bir zorluk yaşanmaktadır. İmmobilize glikanlar, glikoprotein veya sentetik homojen mono- veya dimannosile glikopeptidler, çeşitli mühendislik CV-N varyantlarını taramak için yeniden kullanılabilir çipler üzerinde kullanılır ve bağlanma tahlilleri tamamen saflaştırılmış ve rekombinant olarak eksprese edilen lektinlere uygulanır. Enjekte edilen protein çözeltisindeki safsızlıklar SPR kanal sistemine zarar vermektedir. Bu çalışmada deneysel prosedürler in vitro bir sistem üzerinde tanımlanmış olmasına rağmen, viral sivri uçlar üzerindeki glikozilasyon paterni, optimize edilmiş kütle transferi sınırlaması ile zaman içinde enjekte edilen bu küçük model proteinin her bir analit konsantrasyonu tarafından seçici olarak tanınabilir36. CV-N'nin boyutu ~ 11 kDa'dır ve viral spike proteinlerine bağlanması için tekrarlanabilir SPR verilerini destekler.

CV-N'nin yüksek mannoz glikanlarına bağlanma özgüllüğü, yapısal olarak fonksiyonel glikanlara ve izotermal titrasyon kalorimetrisi kullanılarak mono-mannosillenmiş peptide bağlanmak yerine, dimannosile peptid mimetik ile iki değerli bağlanma etkileşimi ile doğrulanır (veriler gösterilmemiştir). Glu41Ala nokta mutasyonuna sahip bir varyant, monomerik 101-kalıntı proteinini, her protomerde iç içe geçmiş iki karbonhidrat bağlanma bölgesi ile ifade eder. Bu nedenle, bu mutasyon bölgesi, yüksek ve düşük afiniteli karbonhidrat bölgeleri arasındaki temas kalıntısını ortadan kaldırır ve N-asetil-D-glukozamine moleküler bağlanma mukavemetini azaltır. CVN-E41A'nın SARS-CoV-2 spike proteinine bağlanması, kompleks tip N-bağlı glikozilasyon ve O-glikozilasyon taşıyan SPR'de elde edilir, ancak bu spike CV-N bağlanması, mikromolar konsantrasyonlarda ölçüldüğü gibi, fizyolojik ilgisi olmayan hem spike proteini hem de RBD içindir (Şekil 4,5).

Bu çalışmada geliştirilen ve üretilen mannosillenmiş peptitler, tanımlanmış bir amino asit dizisi10'a bağlı karbonhidrat bağlayıcı testler için değişmez ligandları temsil ettikleri için, antiviral ajanların bağlanma özelliklerini SPR ve NMR ile taramak için protein iskeleleri olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, STD-NMR spektroskopisi, konformasyonel seçim10,41 ile karbonhidrat bağlanmasının karakterizasyonuna izin veren SPR gibi etiketsiz bir tekniktir. Bu tür ortamlarda, STD-NMR, farklı deneysel koşullar altında bağlanma, epitop haritalama ve KD'nin doğrudan belirlenmesi yoluyla biyoaktif ligandları tanımlamak için geniş bir bileşik kütüphanesi için hızlı tarama yöntemlerinin geliştirilmesine izin verir. Doğru KD değerleri, sıfır doygunluk süresi41,42 sınırındaki STD değerleri kullanılarak protein-ligand ilişki eğrisi analiz edilerek elde edilebilir. Bu nedenle protein-ligand etkileşimlerinin STD-NMR yöntemi ile sorgulanması sağlanmış ancak SPR sistemi üzerinde KD'lerhesaplanmıştır.

İnsan 2019-nCoV'nin (Wuhan-Hu-1-2019 yeni koronavirüs), SARS-CoV43'e N bağlantılı glikozilasyon bölgeleri arasında tahmin edilen 11 (18 üzerinden) arasında farklılık gösterdiği tahmin edilmektedir. Epitop / paratop haritalaması, konakçı kaynaklı N-glikanlarla birkaç etkileşimi ve antikor somatik hipermutasyonlarının epitop temaslarına ihmal edilebilir katkılarını ortaya koymaktadır37. Antiviral lektinlerin ve geniş ölçüde nötralize edici antikorların, influenza HA glikoproteini üzerinde yüksek oranda korunmuş epitopları bağlama yeteneği, önleyici ve terapötik kullanım için aşıların rasyonel tasarımında en önemlisidir. Bununla birlikte, konakçı reseptör bağlanma bölgesi etrafındaki immün baskılayıcı N-bağlantılı glikozilasyonun etkisini değerlendirmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Veriler, virüs spike proteinlerinin enfeksiyon sırasında ortaya çıkan antikorlardan kaçma veya immünojenik olmayan CV-N'yi bağlama potansiyeli hakkında fikir verebilir ve böylece yeni optimize edilmiş antiviral CVN2 varyantları için yapı tabanlı hesaplamalı protein tasarımına rehberlik edebilir. Buna karşılık, glikozile Fc amino asit mutantının in vivo efektör fonksiyonlarını ortaya çıkarmak için reseptörüne olan afinitesi, glikozilasyon bölgelerinin bir bileşimini kullanır ve ilgili glikanların sayısı, bu nedenle bağlanma afinitesi için önemli olabilir, ancak nötralizasyon yeteneği için belirlenemeyebilir.

Birlikte ele alındığında, daha az sayıda rotamerin, karbonhidrat ligandlarını hesaplamalı protein tasarımı ile proteinlere tek başına protein-protein etkileşimlerinden daha fazla bağladığı tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, çeşitli sayıda karbonhidrat bağlanma bölgesi taşıyan etki alanı değiştirilmiş CVN2, H'ye atfedilen farklı bağlanma afinitelerini ortaya çıkarmak ve viral zarf sivri uçları ve nötralize edici antikorlar (NAb) üzerindeki oligomannoz kümeleri arasındaki çok değerli etkileşimleri oluşturmak için gerekli stabiliteyi ve esnekliği sağlar, böylece inhibisyon tahlillerinin deneysel olarak doğrulanmasına izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgments

Yazar, TU Wien'deki Biyoteknoloji ve Mikrobiyoloji Bölümü'nden Dr. Christian Derntl'i ve Viyana Tıp Üniversitesi Tıp Bölümü III, Nefroloji ve Diyaliz Bölümü'nü, özellikle de teknik ve bilimsel destek için Dr. Markus Wahrmann'ı kabul ediyor. Memeli hücrelerinde protein ekspresyonu, Viyana Doğal Kaynaklar ve Yaşam Bilimleri Üniversitesi (BOKU) Biyoteknoloji Bölümü tarafından desteklenmiştir. Yazar, SPR bağlama tahlillerinin gerçekleştirilmesi konusunda yararlı bilimsel tartışmalar için Almanya'nın Duesseldorf kentindeki XanTec biyoanalitiğinden Dr. Nico Dankbar'a derin teşekkürlerini ifade etmek istiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta primeplus Cytiva
Amicon tubes Merck C7715
Ampillicin Sigma-Aldrich A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B06320
Cell spreader Sigma-Aldrich HS86655 silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos Sigma-Aldrich OLIGO
Custom Gensynthesis GenScript #1390661  cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL Thermo Scientific 50-105-5354
Dionex UlitMate 3000 Thermo Scientific IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)  Fisher Scientific ER1701
DTT Merck DTT-RO
EDC Merck 39391
EDTA Merck E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge Sigma-Aldrich Z606235
Ethanol Merck 51976
Ethanolamine HCl Merck E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack Corning 352057
Glucose Merck G8270
Glycine HCl Merck 55097
HA H3 protein Abcam ab69751
HEPES Merck H3375
His-select Ni2+ Merck H0537
Imidazole Merck I2399
IPTG Merck I6758
Kanamycin A Sigma-Aldrich K1377
Kromasil 300-5-C4 Nouryon
LB agar Merck 52062
LB agar Merck 19344
LB Lennox Merck L3022
Lysozyme Merck 10837059001
Magnesium chloride Merck M8266
Magnesium sulfate Merck M7506
NaH2P04 Merck S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer Thermo Scientific ND2000CLAPTOP
NaOH Merck S5881
NHS Merck 130672
NZ amine (casein hydrolysate) Merck C0626
PBS Merck 806552
PD MidiTrap G-10 Sigma-Aldrich GE28-9180-11
Peptone Merck 70171
pET11a Merck Millipore (Novagen) 69436 
PMSF Merck PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) Qiagen 27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9 Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis Reichert
SDS Merck 11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid Stratagene #200518
Sodim chloride Merck S9888
Sodium acetate.Trihydrate Merck 236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M XanTec bioanalytics SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D XanTec bioanalytics SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Scientific 101R20
TBS Merck T5912 10x, solution
Triton-X100 Merck T8787
Tryptone Merck 93657
Tween20 Merck P1379
Vortex-Genie 2 Mixer Merck Z258423
X-gal Merck XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene #200236
Yeast extract Merck Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Tags

Biyomühendislik Sayı 184 Cyanovirin-N yüzey plazmon rezonansı doygunluk transfer farkı-NMR zarf sivri uçları glikan rekombinant glikoprotein
Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral <em>Ajanların</em> Mühendisliği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maier, I. Engineering Antiviral… More

Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (184), e63541, doi:10.3791/63541 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter