Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مبسطا لعزل خلايا الظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE) عن عيون الفئران بطريقة تدريجية. يتضمن البروتوكول استئصال وتشريح عيون الفئران ، يليه عزل خلايا RPE وبذرها وزراعتها.

Abstract

تقع طبقة الظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE) خلف المستقبلات الضوئية مباشرة وتؤوي نظاما استقلابيا معقدا يلعب العديد من الأدوار الحاسمة في الحفاظ على وظيفة المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، فإن هيكل RPE ووظيفته ضروريان للحفاظ على الرؤية الطبيعية. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا راسخا لعزل خلايا RPE الأولية للماوس. عزل RPE هو أداة رائعة للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء أمراض RPE في نماذج الفئران المختلفة لاضطرابات العين. علاوة على ذلك ، يمكن أن يساعد عزل RPE في مقارنة خلايا RPE الأولية للفئران المعزولة من الفئران البرية والمعدلة وراثيا ، وكذلك اختبار الأدوية التي يمكن أن تسرع من تطوير العلاج للاضطرابات البصرية. تقدم المخطوطة بروتوكول عزل RPE خطوة بخطوة. يستغرق الإجراء بأكمله ، من النوى إلى البذر ، حوالي 4 ساعات. لا ينبغي تغيير الوسائط لمدة 5-7 أيام بعد البذر ، للسماح بنمو الخلايا المعزولة دون اضطراب. ويتبع هذه العملية توصيف المورفولوجيا والتصبغ وعلامات محددة في الخلايا عن طريق التألق المناعي. يمكن تمرير الخلايا بحد أقصى ثلاث أو أربع مرات.

Introduction

تقع خلايا ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) بين المشيمية والشبكية العصبية ، وتشكل طبقة أحادية بسيطة من الخلايا التكعيبية التي تقع خلف خلايا المستقبلات الضوئية (PR)1. يلعب RPE دورا حاسما في الحفاظ على بيئة صحية لخلايا العلاقات العامة ، وذلك أساسا عن طريق الحد من التراكم المفرط لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وما يترتب على ذلك من أضرار مؤكسدة1. تشرف خلايا RPE على العديد من الوظائف ، مثل تحويل وتخزين الرتينويدات ، وامتصاص الضوء المتناثر ، ونقل السوائل والأيونات ، وكثرة البلعمة في غشاء الجزء الخارجي من PR 2,3. يمكن أن تؤدي التغيرات في RPE (المورفولوجيا / الوظيفة) إلى إضعاف وظيفتها مما يؤدي إلى اعتلال الشبكية وهذه سمة مشتركة بين العديد من اضطرابات العين4. ترتبط العديد من أمراض العين بتغيرات في مورفولوجيا ووظيفة خلايا RPE ، بما في ذلك بعض الأمراض الوراثية مثل التهاب الشبكية الصباغي ، وداء الأذنين الخلقي ، والمهق4،5،6 ، بالإضافة إلى اضطرابات العين المرتبطة بالعمر مثل اعتلال الشبكية السكري (DR) والتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) 7,8 . الخلايا البشرية هي الأكثر استحسانا ، وبالتالي سيكون من المثالي دراسة اضطرابات RPE في خلايا RPE البشرية الأولية لتشكيل طبقات RPE الأحادية. ومع ذلك ، فإن المسائل الأخلاقية ومحدودية توافر المتبرعين من البشر يرجع ذلك إلى حقيقة أن معظم هذه الاضطرابات تؤدي إلى المراضة9 ، ولكن ليس بالضرورة الوفيات10 ، وبالتالي منع عزل خلايا RPE البشرية الأولية. وهذا يجعل زراعة خلايا RPE من متبرعين حيوانيين غير بشريين بديلا مفضلا. تعتبر القوارض ، وخاصة الفئران ، نموذجا رائعا لدراسة أمراض العين المختلفة نظرا لأن التكنولوجيا المعدلة وراثيا مثبتة على نطاق أوسع في هذه الأنواع11. على الرغم من أن استخدام خلايا RPE الأولية المستزرعة يوفر العديد من المزايا ، فقد كان من الصعب الحفاظ على الخلايا المتنامية للعديد من الممرات ، أو تخزين الخلايا وإعادة استخدامها. القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو عمر الفئران. يجب أن تكون الفئران المستخدمة لعزل RPE في سن مبكرة جدا (18-21 يوما هي الأمثل) حيث كان من الصعب زراعة خلايا RPE من الفئران البالغة11،12،13. يمكن عزل خلايا RPE عن عيون الفئران في أي عمر ، ولكن ما يصل إلى أربعة ممرات خلوية كانت ناجحة فقط مع الفئران الصغيرة (18-21 يوما). تم إجراء عزل RPE من شبكية العين الفئران ، باستخدام كل من الفئران C57BL6 والفئران المعدلة وراثيا مع حذف مستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDARs) في خلايا RPE ، لدراسة تأثير الحمض الأميني المرتفع الحمض الأميني على تطور وتطور AMD14. بالإضافة إلى ذلك ، ساعدت خلايا RPE الأولية المعزولة في اقتراح هدف علاجي ل AMD عن طريق تثبيط NMDARs في خلايا RPE14. هناك بعض حاصرات NMDAR التي تمت الموافقة عليها من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) وتستخدم حاليا لعلاج الارتباك المعتدل إلى الشديد (الخرف) المرتبط بمرض الزهايمر (AD) ، مثل الميمانتين16 ، والذي يمكن أن يكون هدفا علاجيا محتملا ل AMD14. علاوة على ذلك ، تم استخدام خلايا RPE الأولية المعزولة للفئران للكشف عن العلامات الالتهابية والحث المقترح للالتهاب كآلية أساسية للميزات التي يسببها الحمض الأميني من AMD و AD باستخدام فأر معدل وراثيا (CBS) ، والذي يقدم مستوى عال من الحمض الأميني16,17.

تم استخدام هذا البروتوكول لعزل خلايا RPE عن كل من الفئران C57BL/6 من النوع البري والفئران المعدلة وراثيا التي تم تطويرها في مختبرنا كتكييف مبسط لبروتوكولات العزل المنشورة الأخرى13،18،19 للوصول إلى بروتوكول سهل التطبيق وموثوق به. لا يوجد تفضيل جنسي في هذا البروتوكول. في حين أن أعمار الفئران ضرورية لعملية العزل ، فقد تم استخدام الفئران الصغيرة والمسنين (18-21 يوما) والفئران الأكبر سنا في أي عمر (حتى 12 شهرا) لعزل RPE. ومع ذلك ، لاحظنا أن خلايا RPE المعزولة عن الفئران الصغيرة عاشت لفترة أطول ، ويمكن إجراء ما يصل إلى أربعة ممرات. يمكن تمرير خلايا RPE المعزولة من الفئران الأكبر سنا مرة أو مرتين ، ثم تتوقف عن النمو بمعدل طبيعي وتغير شكلها لتكون أكثر استطالة (خلايا تشبه الخلايا الليفية ). كما لوحظ فقدان التصبغ وانخفاض الالتصاق بصفيحة زراعة الأنسجة متبوعا بانفصال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استخدام الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لبروتوكول الحيوان IACUC بجامعة أوكلاند رقم 21063 والمبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.

1. إعداد الحل

  1. قم بتحضير وسائط زراعة خلايا RPE الكاملة عن طريق استكمال خليط النسر المتوسط / الغذائي المعدل من Dulbecco F-12 (DMEM / F12) مع مصل بقري جنيني بنسبة 25٪ (FBS) ، و 1.5٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 0.02٪ جنتاميسين.
  2. تحضير إنزيم A عن طريق استكمال 741 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) مع 127 ميكرولتر من محلول مخزون الكولاجيناز و 132 ميكرولتر من محلول مخزون الهيالورونيداز. هذا يجعل الحجم النهائي من 1 مل ، والتي يمكن أن تعالج أربع عيون.
    1. تحضير محلول مخزون الكولاجيناز عن طريق إذابة 1 ملغ من الكولاجيناز من كلوستريديوم هيستوليتيكوم في 41 مل من HBSS (19.5 وحدة / مل).
    2. تحضير محلول مخزون الهيالورونيداز عن طريق إذابة 1 ملغ من الهيالورونيداز من الخصيتين البقريتين في 18.4 مل من HBSS (38 وحدة / مل).
  3. تحضير إنزيم B عن طريق إضافة جزأين من 0.25٪ Trypsin-EDTA إلى ثلاثة أجزاء من HBSS. لاحظ أن الحجم الكلي يعتمد على عدد العيون التي تم تشريحها ؛ يمكن استخدام 1 مل من إنزيم B لعلاج أربع عيون.

2. الاستئصال

  1. القتل الرحيم أخلاقيا للفأر باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO2) وفقا لمعايير IACUC21.
    1. باختصار ، ضع الحيوان (الحيوانات) في غرفة CO 2 لإدخال 100٪ CO 2 بمعدل ملء 30٪ -70٪ من حجم الغرفة في الدقيقة مع CO 2 لتحقيق فقدان الوعي في غضون2 إلى 3 دقائق ، مع الحد الأدنى من الضيق للفئران.
    2. تأكد من الموت (نقص التنفس ولون العين الباهت) ، ثم حرك الفأر من القفص إلى منطقة جراحية نظيفة معقمة (يتم تنظيفها بالكحول) مجهزة بمعدات جراحية معقمة.
  2. ضع الماوس على وسادة سفلية معقمة.
  3. قم بتحريك العينين عن طريق الضغط على ملاقط على غرار 5/45 على المنطقة المدارية للحث على البروبتوسيس ، يليه تحريك الملقط إلى الجزء الخلفي من العين. استخراج العينين ، مع العصب البصري سليمة ، عن طريق سحب العينين بلطف من التجويف المداري.
  4. باستخدام ملقط ، غمر العينين في أنبوب طرد مركزي دقيق 2 مل يحتوي على 1 مل من 5٪ Povidone-Iodine. احتضان العينين في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
  5. قم بإزالة العينين من محلول البوفيدون واليود وضعهما في طبق بتري. باستخدام ماصة نقل معقمة ، اغسل العينين باستخدام HBSS حتى يختفي اللون البرتقالي للبوفيدون اليود. هذا يستغرق حوالي اثنين أو ثلاثة غسلات.
  6. ضع العينين في طبق بتري جديد بحجم 60 مم واغمرهما في وسط زراعة خلايا RPE كامل بارد (2-8 درجة مئوية) تم إعداده في الخطوة 1.1.

3. التشريح

  1. تحت المجهر الجراحي ، استخدم ملاقط على غرار M5S ومقص Vannas لإزالة النسيج الضام والعضلات خارج العين.
    ملاحظة: يتم التشريح تحت غطاء الأنسجة في بيئة معقمة تماما. ومع ذلك ، لأغراض الفيديو ، تم وضع المجهر التشريحي خارج غطاء المحرك لتحقيق عرض توضيحي / تصوير عالي الجودة. وضع قطعة صغيرة من المناديل الورقية الخالية من الوبر تحت العين يحسن الاستقرار أثناء التشريح. يمكن بعد ذلك الاحتفاظ بالعينين مؤقتا (ليس لأكثر من 1 ساعة) في وسائط زراعة خلايا RPE الباردة. ومع ذلك ، يفضل المتابعة مباشرة إلى الخطوة التالية مباشرة بعد تنظيف العينين.
  2. انقل العينين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من محلول الإنزيم A لكل أربع عيون. ثم ، احتضن العينين في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
  3. إزالة العينين من الحاضنة وأنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم قم بنقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد يحتوي على 1 مل من محلول إنزيم B لكل أربع عيون. احتضن الأنبوب في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.
  4. ضعي العينين في طبق جديد من مستنبتات التعليق مقاس 60 مم يحتوي على 10 مل من وسائط نمو خلايا RPE الكاملة. ثم احتضن العينين عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. ضع الطبق تحت المجهر الجراحي وابدأ في التشريح.
  6. قم بإزالة الجزء الأمامي من العين (القرنية والقزحية والعدسة) من الجزء الخلفي من كأس العين (الشبكية الخلفية).
    1. أمسك العين باستخدام ملقط على غرار M5S وقم بعمل شق في قسم أورا سيراتا (الجزء الأمامي من شبكية العين حيث ينتهي اللون الأزرق الفاتح) باستخدام شفرة # 11 أو إبرة حقنة.
    2. أمسك الجزء الداخلي من الشق بزوج واحد من الملقط ، وأمسك القرنية بزوج آخر من الملقط. ابدأ في سحب القرنية ببطء أو تمزيقها من شبكية العين. تأكد من التمزق بزيادات صغيرة وتحريك المسيل للدموع لأسفل أثناء إزالة القرنية ، للتأكد من أن RPE لا يزال سليما في الغالب ويؤدي إلى تمزق أنظف.
      ملاحظة: بمجرد فصل القرنية تماما، يمكن رؤية القزحية والعدسة.
    3. افصل كل من القرنية والقزحية.
  7. افصل العدسة عن فنجان العين بضغط لطيف على النصف الخلفي من العين.
  8. لإزالة شبكية العين العصبية من طبقة RPE ، أمسك الطبقة الخارجية من كأس العين بزوج واحد من الملقط وضع ذراع زوج ثان من الملقط بين كل من RPE والطبقات العصبية. من هناك ، اسحب أو اغرف الشبكية العصبية برفق بعيدا عن طبقة RPE. تخلص من شبكية العين العصبية.
    ملاحظة: في الفيديو، تتم إزالة الشبكية العصبية والعدسة معا. ومع ذلك ، بالنسبة للمبتدئين ، سيكون من الأسهل إزالة كل منها على حدة. ما تبقى هو RPE ، المشيمية ، والصلبة.
  9. تخلص من القرنية والقزحية والعدسة والشبكية العصبية. حرك كوب العين المتبقي إلى منطقة جديدة على الطبق خالية من الحطام.
  10. لفصل RPE عن المشيمية والصلبة ، قم بكشط الجزء الداخلي من الكأس بلطف باستخدام ملاقط على غرار 5/45 لضمان فصل خلايا RPE. تظهر خلايا RPE غائمة عند تعليقها في وسائط نمو خلايا RPE الكاملة.
  11. استنشاق الخلايا باستخدام ماصة نقل معقمة 3.2 مل ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل يحتوي على وسائط نمو خلايا RPE كاملة.

4. الطرد المركزي

  1. ضع أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل الذي يحتوي على خلايا RPE الأولية داخل جهاز طرد مركزي وقم بطرد الخلايا عند 300 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بشفط السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات باستخدام 10 مل من وسائط نمو RPE الكاملة. تعد وسائط نمو RPE الكاملة أكثر تحديدا لنمو RPE من الخلايا الملوثة الأخرى ، مثل خلايا مولر أو الخلايا البطانية المشيمية. تتطلب خلايا مولر وسائط عالية من الجلوكوز ، بينما تتطلب الخلايا البطانية المشيمية عوامل نمو محددة. من خلال تغيير الوسائط وتمرير الثقافة ، ستستمر خلايا RPE فقط في النمو.

5. زراعة الخلايا

  1. قم بلصق خلايا RPE الأولية المعاد تعليقها على طبق بتري معقم مقاس 100 مم ونقلها إلى حاضنة (بعد التحقق من النقاء عن طريق تلطيخ الخلايا بعلامات خلايا RPE / Müller محددة ، كما هو موضح في الشكل 1E-N). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    ملاحظة: العلامات المستخدمة مذكورة في جدول المواد. يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد إنشاء الثقافة.
  2. احتضان الخلايا لمدة 5 أيام تقريبا للنمو. خلال هذا الوقت ، لا تقم بتغيير الوسائط أو إزعاج الخلايا أو تحريك لوحة زراعة الخلايا (هذه خطوة حاسمة في البروتوكول ؛ بعد العزل ، يجب احتضان الخلايا وعدم إزعاجها لمدة 5 أيام).
    ملاحظة: يعتمد عدد الخلايا على عدد العيون المستخدمة للعزل. عدد أكبر من العيون المعزولة سوف ينتج عنه عدد أكبر من الخلايا. سيؤدي عزل RPE من عينين إلى إنتاج حوالي 440،000-880،000 خلية ، أو 5٪ -10٪ من طبق Petri 100 ملم ، والذي يمكن أن يحتوي على 8.8 مليون خلية.

6. المرور

  1. استنشاق الوسائط وغسلها ب 2 مل من PBS. ثم استنشق PBS.
  2. أضف 4 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA (1x) ، أو ما يكفي لتغطية قاعدة الطبق. حضانة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف 8 مل من وسائط RPE التي تم تسخينها مسبقا أو ضعف حجم كمية التربسين المستخدمة في الخطوة 6.2. ثم جمع الخلايا ووضعها في أنبوب طرد مركزي 15 مل.
  4. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات في 10 مل من وسائط زراعة خلايا RPE الكاملة. طبق التعليق بأكمله في طبق بتري معقم 100 ملم.
    ملاحظة: يمكن تمرير الخلايا حتى أربعة أو خمسة في18. ومع ذلك ، تم العثور على نتائج التجربة الأكثر اتساقا بعد مقطعين أو ثلاثة. بعد مقطعين إلى أربعة ممرات ، غيرت الخلايا شكلها (كما هو موضح في الشكل 1D) لتكون أكثر استطالة ، متراكمة في منتصف اللوحة ، وتوقفت عن النمو ، وفصلت.
  5. استخدم بروتوكولات التألق المناعي ، وفقا للطرق المنشورة سابقا8،14،15،16 ، لتلطيخ والتحقق من خصوصية RPE.

7. التألق المناعي

ملاحظة: تم إجراء التألق المناعي وفقا للطرق المنشورة سابقا8،14،15،16،17،18 لتلطيخ والتحقق من خصوصية RPE. عادة ما يتم تلطيخ خلايا RPE الأولية في الممرات P1 و P2. هنا ، يتم تقديم نظرة عامة موجزة على بروتوكول الفلورسنت المناعي.

  1. زرع الخلايا على شريحة غرفة زراعة الخلايا (30000 خلية لكل بئر لشريحة غرفة 8 آبار).
  2. استزرع الخلايا في وسائط زراعة خلايا RPE كاملة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24-48 ساعة.
  3. عندما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 80٪ -90٪ ، قم بشفط الوسائط وغسل شريحة الغرفة باستخدام 1x PBS.
  4. إصلاح الشريحة مع 4 ٪ بارافورمالديهايد لمدة 10-15 دقيقة.
  5. استنشق 4٪ من بارافورمالديهايد ثم قم بحظره بمحلول الحجب (انظر جدول المواد).
  6. استخرج محلول الحجب وأضف الجسم المضاد الأساسي ، RPE65 ، واحتضنه لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية (مع تركيز الأجسام المضادة يتراوح من 1:200-1:250 في المخزن المؤقت المانع ، بحجم 150-200 ميكرولتر / شريحة). ثم اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS / TX-100 (5-10 دقائق لكل غسلة).
  7. استنشاق الجسم المضاد الأساسي وإضافة الجسم المضاد الثانوي (مع تركيز الجسم المضاد 1: 1000 في المخزن المؤقت المانع ، بحجم 150-200 ميكرولتر / شريحة). احتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
  8. استنشاق الجسم المضاد الثانوي. يغسل ثلاث مرات باستخدام PBS / Trtion X-100 (5-10 دقائق لكل غسلة).
  9. أضف قطرة من وسيط تركيب DAPI لتسمية النوى ووضع غطاء فوق الشريحة. تأكد من عدم وجود فقاعات تحت الغطاء.
  10. بعد ذلك ، التقط صورا باستخدام مجهر فلورسنت ، مصحوبا بكاميرا مجهر عالية الدقة (HRM) وبرنامج معالجة الصور (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التحقق من خصوصية ونقاء ووظيفة حاجز / تشكيل خلايا RPE المعزولة
تم فحص الخلايا المعزولة تحت المجهر الضوئي للتحقق من جدواها ومورفولوجيتها وتصبغها. والتقطت صور من P0 وP1 (الشكل 1A، B) وصور من P0 وP4 (الشكل 1C، D) لإظهار التغيرات في الخلايا؛ الشكل والحجم والتصبغ مع انتقال الممرات إلى المقطع الرابع (تشير الأسهم السوداء إلى خلايا RPE المعزولة في P4). تم استخدام جسم مضاد لبروتين RPE65 للتحقق من هوية الخلايا المعزولة. تم إجراء تلطيخ التألق المناعي للخلايا المعزولة باستخدام جسم مضاد ضد RPE65 ، يليه الفحص تحت المجهر الفلوري (الشكل 1E ، F: التكبير المنخفض ، والشكل 1G ، H: التكبير العالي ، مما يدل على خلايا RPE ملطخة بشكل إيجابي باللون الأخضر وعلامة نووية ، DAPI ، باللون الأزرق). RPE65 هو إيزوميروهيدرولاز يتم التعبير عنه في RPE. من الضروري تجديد الصباغ البصري المطلوب للرؤية بوساطة قضبان ومخروط21 . للتحقق من صحة وظيفة الحاجز للمعزول
تم استخدام الخلايا ، كل من البروتين الخلوي الهيكلي F-actin وبروتين التوصيل الضيق ZO-1 المناعي التلطيخ8 للخلايا المعزولة (الشكل 1I ، J: الأخضر ZO-1 والتلطيخ النووي الأزرق). والشكل 1K ، L: الأحمر F-actin والتلطيخ النووي الأزرق). ومع ذلك ، فإن الشكل المرصوف بالحصى النموذجي ل RPE واضح جدا عندما تكون الخلايا ملتقية بالكامل.

تم استخدام التحكم السلبي في التجارب حيث تمت إضافة الجسم المضاد الثانوي إلى خلايا RPE دون إضافة الجسم المضاد الأساسي ، للتأكد من خصوصية الجسم المضاد واللون الناتج خاص بالأجسام المضادة التي تم استخدامها (غير معروضة).

للتحقق من نقاء وتلوث RPE المعزول بواسطة خلايا مولر ، تم استخدام تلطيخ التألق المناعي للخلايا المعزولة بعلامة خلية محددة لخلايا مولر ، vimentin ، (الأخضر والأزرق للتلطيخ النووي كما هو موضح في الشكل 1M ، N) باستخدام خلايا مولر كعنصر تحكم إيجابي. أظهرت خلايا RPE المعزولة تلطيخا سلبيا للفيمنتين.

تم فحص الخلايا المعزولة تحت المجهر الضوئي للتحقق من جدواها ومورفولوجيتها وتصبغها. تم التقاط صور من P0 و P1 (الشكل 1K ، L) وصور من P0 و P4 (الشكل 1M ، N) لإظهار التغيرات في شكل الخلايا وحجمها وتصبغها مع انتقال الممرات إلى المقطع الرابع (تشير الأسهم السوداء إلى خلايا RPE المعزولة في P4).

Figure 1
الشكل 1: التحقق من صحة عزل RPE. (أ) المجهر الضوئي لمرور RPE صفر (P0). (ب) المجهر الضوئي للمرور الأول (P1). (ج) توصيف المورفولوجيا في P0. (د) توصيف المورفولوجيا في P4. (ه) تلطيخ مناعي ل RPE65 عند تكبير منخفض. (و) تلطيخ مناعي ل RPE65 مع تلطيخ نووي باستخدام DAPI. (ز) تلطيخ مناعي ل RPE65 عند التكبير العالي. (ح) تلطيخ مناعي ل RPE65 مع تلطيخ نووي مع DAPI عند تكبير عالي. (I) تلطيخ ZO-1 لخلايا RPE. (ز) تلطيخ ZO-1 لخلايا RPE مع تلطيخ نووي مع DAPI. (ك) تلطيخ F-actin لخلايا RPE. (L) تلطيخ F-actin لخلايا RPE مع تلطيخ نووي مع DAPI. (م) تلطيخ فيمنتين لخلايا RPE. (ن) تلطيخ فيمنتين لخلايا مولر كعنصر تحكم إيجابي (RMc-1) مع تلطيخ نووي باستخدام DAPI. قضبان المقياس تساوي 300 ميكرومتر و 20 ميكرومتر و 300 ميكرومتر و 300 ميكرومتر و 50 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 50 ميكرومتر و 50 ميكرومتر و 50 ميكرومتر على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول الحالي هو إجراء مفصل تم الإبلاغ عنه وتعديله وتبسيطه لعزل RPE عن عيون الماوس. يتضمن البروتوكول استئصال وتشريح وجمع وبذر وزراعة وتوصيف خلايا RPE المعزولة عن عيون الفئران.

هناك بعض القيود والخطوات الحاسمة التي يجب الوفاء بها لعزل RPE بنجاح ، مثل عمر الفئران ، وعدد العيون التي تم تشريحها ، وحجم لوحة أو طبق زراعة الأنسجة ، والتحذيرات بعد البذر والتخزين والتمرير. لتكون قادرة على تمرير الخلايا المعزولة تصل إلى ثلاث أو أربع مرات ، فإن أفضل أعمار الفئران تتراوح بين 18-21 يوما. للحصول على عدد معقول من الخلايا المعزولة القادرة على النمو والتكاثر ، هناك حاجة إلى عينين على الأقل للعزل الفردي. يتناسب عدد الخلايا التي تؤدي إلى العزلة مع عدد العيون التي تم تشريحها (~ 220000 خلية / عين). يوصى باستخدام طبق / قارورة بتري معقمة مقاس 100 مم للحصول على عدد أكبر من الخلايا في ممر مبكر (P0). بعد البذر ، لا ينبغي إزعاج الخلايا عن طريق تحريك لوحة زراعة الأنسجة من الحاضنة أو عن طريق تغيير الوسائط لمدة 5 أيام على الأقل. أيضا ، واحدة من القيود المفروضة علىهذه التقنية هو تخزين وتمرير الخلايا المعزولة. لا يمكن تخزين الخلايا (تجميدها وإعادة إذابتها) ويمكن تمريرها ثلاث أو أربع مرات فقط. بعد المقطع 4 ، تبدأ الخلايا في تغيير حجمها وشكلها لتصبح ممدودة (شكل المغزل) مع انخفاض ملحوظ في تصبغ الخلايا (الشكل 1D).

يختلف هذا البروتوكول عن البروتوكولات المنشورة القيمة والموثوقة الأخرى لعزل RPE الأساسي للماوس1 3,19,20 من حيث أنه مبسط مع بضع خطوات يسهل اتباعها. يمكن التعرف على خلايا RPE من خلال مورفولوجيتها وتصبغها وعلامات RPE المحددة مثل RPE65 4,5,21. تم التحقق من صحة نقاء خلايا مولر وتلوثها عن طريق تلطيخ الخلايا المعزولة بعلامة خلية محددة لخلايا مولر (vimentin)22. تم استخدام العديد من التقنيات لتقييم سلامة حاجز الدم والشبكية (BRB) في المختبر ، مثل فحص المجهر الإلكتروني (EM) ، وتقييم بروتينات الوصلة الضيقة (TJPs) ، وفحص تسرب ديكستران FITIC ، وقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TER) الذي يقيم الوظيفة الفسيولوجية ل RPE كطبقة واحدة 8,23 . تلعب خلايا RPE دورا مهما في الحفاظ على BRB الخارجي ، وللتحقق من صحة هذه الوظيفة ، قمنا بتقييم بروتينات الوصلة الضيقة (TJPs) مثل Zona ocludin-1 (ZO-1) والبروتينات الهيكلية الخلوية مثل F-actin كما نشرت سابقا8. يعد تقييم TJPs طريقة أكثر ملاءمة لتقييم سلامة BRB ووظيفة الحاجز التي لا تتطلب معدات باهظة الثمن قد لا تكون متوفرة في جميع مختبرات الأبحاث ، على عكس تقييم EM أو TER.

عزل RPE الأولي هو تقنية يمكن أن تكون أداة مهمة لدراسة الآليات الأساسية والإمراض ، ولاقتراح تطبيقات علاجية جديدة لأمراض العيون المختلفة. مكنت التقنية الحالية من دراسة التغيرات في بنية خلية RPE ووظيفتها وتأثيرها على BRB الخارجي في التنكس البقعي المرتبط بالعمر8. علاوة على ذلك ، ساعد في دراسة التغيرات في خلايا RPE المعزولة من الفئران C57BL6 من النوع البري والفئران المختلفة المعدلة وراثيا ، وكذلك اختبار المركبات الدوائية المختلفة التي تبحث عن هدف علاجي ل AMD14,16.

في الختام ، أظهرت العديد من البروتوكولات المنشورة المتاحة عزل RPE الأولي للماوس. البروتوكول المقدم هو إجراء مبسط ناتج عن تعديل بعض البروتوكولات الحالية ، باستخدام المواد والأساليب والمعدات المتوفرة في معظم مختبرات الأبحاث لعزل خلايا RPE الأولية عن عيون الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عن صلته بمحتوى هذه المقالة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعيون (NEI) ، صندوق المعهد الوطني للعيون (NEI) R01 EY029751-04

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

علم الأحياء ، العدد 189 ،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter