Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Frysefraktur elektronmikroskopi for ekstracellulær vesicleanalyse

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/63550
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Medicine, Institute of Cell Biology, University of Ljubljana

Summary

Vi presenterer en protokoll for isolering og frysefraktur av ekstracellulære vesyrer (ELBILER) som stammer fra kreftfremkallende urotelceller. Frysefrakturteknikken avslørte ELBIL-enes diameter og form og-som en unik funksjon - den interne organiseringen av EV-membranene. Disse er av enorm betydning for å forstå hvordan elbiler samhandler med mottakermembranene.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er membranbegrensede strukturer som frigjøres fra cellene inn i det ekstracellulære rommet og er involvert i intercellulær kommunikasjon. Elbiler består av tre populasjoner av vesicles, nemlig mikrovesicles (MVs), exosomes og apoptotic kropper. Den begrensende membranen til elbiler er avgjørende involvert i samspillet med mottakercellene, noe som kan føre til overføring av biologisk aktive molekyler til mottakercellene og følgelig påvirke deres oppførsel. Frysefrakturelektronmikroskopiteknikken brukes til å studere den interne organiseringen av biologiske membraner. Her presenterer vi en protokoll for MV-isolasjon fra kultiverte kreftceller og frysebrudd av MVs i trinnene for rask frysing, oppsprekking, produksjon og rengjøring av kopiene, og analysere dem med overføringselektronmikroskopi. Resultatene viser at isolasjonsprotokollen gir en homogen populasjon av elbiler, som tilsvarer formen og størrelsen på MVs. Intramembrane partikler finnes hovedsakelig i protoplasmatisk ansikt av den begrensende membranen. Derfor er frysebrudd den valgte teknikken for å karakterisere MVs diameter, form og fordeling av membranproteiner. Den presenterte protokollen gjelder for andre populasjoner av elbiler.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er membranbegrensede vesikler som frigjøres fra celler til det ekstracellulære rommet. De tre viktigste populasjonene av elbiler er eksosomer, mikrovesicles (MVs) og apoptotiske kropper, som varierer i opprinnelse, størrelse og molekylær sammensetning 1,2,3. Sammensetningen av elbiler gjenspeiler donorcellens molekylære profil og dens fysiologiske status (dvs. sunn eller syk)4,5. Dette gir elbiler et enormt potensial i diagnostisering, prognose og terapi av menneskelige sykdommer, og de har lovende medisinske applikasjoner for bruk i persontilpasset medisin 6,7,8.

Elbiler er meglere av intercellulær kommunikasjon. De inneholder biologisk aktive proteiner, lipider og RNAer, som forstyrrer biologiske prosesser i mottakercellen og kan endre sin oppførsel 9,10. Sammensetningen av EV-begrensende membran er imidlertid avgjørende for samspillet med mottakercellemembranen.

Kildene til elbiler er kroppsvæsker og betingede kulturmedier. For å isolere en EV-populasjon må det brukes en egnet isolasjonsteknikk. For eksempel gir sentrifugering ved 10.000 × g en brøkdel beriket i MVs, mens sentrifugalkrefter på ≥ 100.000 × g gir en brøkdel beriket i eksosomer11,12. Den isolerte brøkdelen av elbiler må valideres når det gjelder renhet, størrelse og form. Til dette formålet anbefalte International Society for Extracellular Vesicles 2018 tre klasser av høyoppløselige bildeteknikker: elektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi og lysmikroskopibasert superoppløselig mikroskopi13. Ingen av disse teknikkene kan gi informasjon om EV-membranens interiør.

Frysefraktur elektronmikroskopi er en teknikk for å bryte frosne prøver for å avsløre sine indre strukturer, spesielt med tanke på membraninteriøret. Trinnene for prøvepreparering er (1) rask frysing, (2) oppsprekking, (3) som lager replikaen, og (4) rengjøring av replikaen14. I trinn 1 er prøven (valgfritt) kjemisk festet, kryoprekket med glyserol og frosset i flytende freon. I trinn 2 er den frosne prøven oppsprukket i en frysefrakturenhet, som eksponerer det indre av membranen bilayer. I trinn 3 skygges de eksponerte oppsprukne ansiktene med platina (Pt) og karbon (C) for å produsere kopier. I trinn 4 fjernes det organiske materialet. Kopien analyseres i transmisjonselektronmikroskopet (TEM). For nøyaktig tolkning av mikrografene må man følge retningslinjer for riktig orientering14,15. Kort sagt er skyggenes retning i mikrografen en referanse for å orientere mikrografen (dvs. for å bestemme retningen av Pt-skyggelegging) og følgelig å bestemme konvekse og konkave former (figur 1). To innvendige visninger kalt oppsprukne ansikter av membranen bilayer kan sees som et resultat av splitting av membranen ved frys-oppsprekking: det protoplasmiske ansiktet (P-ansikt) og det eksoplasmiske ansiktet (E-ansikt). P-ansiktet representerer membranbrosjyren ved siden av celleprotoplasma, mens E-ansiktet representerer membranbrosjyren ved siden av det ekstracellulære rommet. Integrale membranproteiner og deres assosiasjoner blir sett på som fremspringende intramembranpartikler14,15.

Her er målet å bruke frysefrakturteknikken for å karakterisere MVs når det gjelder størrelse, form og strukturen til deres begrensende membran. Her presenterer vi en protokoll for isolering og frysefraktur av MVs som stammer fra humane invasive blærekreftøse urotelceller.

Protocol

1. Culturing kreftfremkallende urotheliale celler og isolering av elbiler

MERK: En protokoll for å få elbiler fra en human invasiv blærekreft urothelial (T24) cellelinje presenteres. Culturing-betingelser må imidlertid optimaliseres for å bruke andre celletyper.

  1. Plate T24-celler med en tetthet på 3 × 104 celler/cm2 i tre kolber (voksende overflate på 75 cm2) og begynn med å dyrke cellene i en CO 2-inkubator i 3 dager ved 37 °C og 5 % CO2 (figur 2A).
    1. Bruk et kulturmedium for T24-celler i en 1:1 (v/v) blanding av A-DMEM og F12 supplert med 5% fetal bovin serum (FBS), 4 mM Glutamax, 100 mg / ml streptomycin og 100 U / ml penicillin.
      MERK: Følgende isolasjon gir elbiler beriket i MVer. Før du starter isolasjonen, må du inspisere cellene med et lysmikroskop for å bekrefte levedyktighet og samløp (figur 2B). Begynn å samle elbilene fra de betingede kulturmediene når T24-cellene er på 70% samløp.
  2. Samle kulturmediet med MVs med en pipette fra kolber (T75) i koniske sentrifugerør (figur 2C). Sentrifuge ved 300 × g i 10 min ved 4 °C (figur 2D).
  3. Samle supernatanten forsiktig inn i et nytt sentrifugerør med pipetten (figur 2E).
  4. Sentrifuger supernatanten ved 2000 × g i 20 minutter ved 4 °C.
  5. Samle forsiktig supernatanten med pipetten i et nytt sentrifugerør.
  6. Sentrifuge ved 10.000 × g i 40 min ved 4 °C. Se etter tilstedeværelsen av en hvitaktig pellet på bunnen av røret.
    MERK: Bytt om nødvendig sentrifugerotoren for å nå den nødvendige g-kraften. EV-pelletsen blir sett på som en hvit pellet på bunnen av sentrifugerøret (figur 2F); for å unngå å miste pellets under pipettering (figur 2G).
  7. Kast forsiktig supernatanten med en pipette. Til pellets, tilsett 1,5 ml PBS og resuspend pellet som inneholder MVs. Sett suspensjonen i et nytt sentrifugerør.
  8. Sentrifuge ved 10.000 × g i 40 min ved 4 °C og se etter tilstedeværelsen av en hvit pellets nederst på røret.
    MERK: EV-pelletsen blir sett på som en hvit flekk på bunnen av sentrifugerøret; for å unngå å miste pellets under pipettering.
  9. Kast forsiktig supernatanten med en pipette. Tilsett forsiktig fixative, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakroktylatbuffer (pH 7.2). La stå i 20 min ved 4 °C (figur 2H).
    FORSIKTIG: Glutaraldehyd og natriumkaktocylat er giftige. Arbeid i en avtrekkshette, bruk vernehansker og kast dem på riktig måte.
  10. Fjern forsiktig fikseringsmiddelet med en pipette. Tilsett vaskebuffer (0,1 M natriumkaktokylatbuffer) i pelletsen. La i 10 min ved 4 °C uten å bruke pelletsen på nytt.

2. Frysing av elbiler

MERK: Før frysing må prøvene først kryopresekteres med glyserol.

  1. Forbered 0,1 M natriumkaktokylatbuffer. Fjern vaskebufferen og tilsett 50 μL 30% glyserol i 0,1 M kaktocylatbuffer. Resuspend EVene forsiktig for å gjøre løsningen homogen. Inkuber i 30 min ved 4 °C.
  2. Rengjør kobberbærerne med en sentral grop i ultralydbadet med kloroform i 5 min (figur 3A). Lufttørk dem og merk dem med farger hvis du bruker flere prøver (figur 3B). Inntil bruk må bærerne holdes på et tørt, rent sted (f.eks. på linsepapir i en Petri-tallerken). Ikke berør bærerne med bare hender.
    1. Forbered pipetter, løsninger, filterpapir, pinsett, et stereomikroskop, en Dewar-kolbe med freon og flytende nitrogen (LN2), en metallstang og kryotruer. Kjøl det ned med LN2.
      FORSIKTIG: Bruk verneutstyr og arbeid deretter ved håndtering av LN2 og avkjølt freon.
  3. Bruk elbilene på nytt før frysing. Unngå dannelse av luftbobler.
    MERK: Utfør trinn 2.4-2.7 raskt.
  4. Arbeid under et stereomikroskop (figur 3C). Overfør 1,5-1,7 μL av prøven til kobberbærerens sentrale grop for å gjøre en konveks dråpe som når høyere enn kobberbærerkanten mens du ikke søler prøven over kanten (figur 3D). Ved overspill, bruk filterpapir for å tørke den ytre ringen på bæreren.
  5. Bland størknet freon med en metallstang for å flytende den igjen (figur 3E).
  6. Ta tak i den ytre ringen på kobberbæreren med pinsett og senk den ned i avkjølt freon med en skånsom risting av pinsett i 8 s (figur 3F). Etter 8 s, raskt overføre transportøren til en annen Dewar kolbe fylt med LN2.
  7. Fortsett umiddelbart med oppsprekking eller lagring av prøvene i LN2. I sistnevnte tilfelle markerer du en kryovial og avkjøler hetteglasset og pinsettspissene ved å senke dem ned i LN2 (figur 3G). Under LN2 samler du frosne kobberbærere i hetteglasset, lukker det og oppbevarer dem i LN 2-beholderen (figur 3H) til det fryser oppsprekking.

3. Oppsprekking av elbiler og lage kopier

MERK: Klargjør frysesprekkingsenheten i henhold til produsentens bruksanvisning. (figur 4A). Rengjør kammeret på enheten. Plasser platinapistoler (Pt/C) og karbonpistoler (C) i vinkler på henholdsvis 45° og 90°(figur 4B).

  1. Start enhetens vakuumsystem. Når trykket på 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) nås, kjøler du ned enhetskammeret til −150 °C.
  2. Overfør kobberbærerne med frosne prøver til en frysefrakturenhet ved hjelp av tørre pinsett (figur 4C). Bruk kryotransfer eller arbeid raskt for å unngå å tine prøven og avsetningen av iskrystallene. Fest transportørene på prøvetabellen.
  3. Vent til vakuumet når igjen 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr), og sett deretter knivtemperaturen til −100 °C (figur 4D).
  4. Vent til vakuumet når 1,0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr).
  5. Vær oppmerksom på prøven med kikkert og nærme deg kniven nøye (figur 4E).
  6. Begynn å seksjonere prøven ved å slå på den motoriserte bevegelsen av kniven (figur 4F) og seksjonen til overflaten av prøven er jevn (figur 4G).
  7. For oppsprekking, slå av den motoriserte bevegelsen av kniven og fortsett med langsom manuell kontroll av kniven, og dermed brudd på prøven (figur 4H). For å beskytte den oppsprukne overflaten fra å danne iskrystaller og rusk til skygge, flytt kniven over den oppsprukne prøven.
  8. Fortsett med Pt-skyggen ved 45° (figur 4I, J).
    1. Forbered en stoppeklokke og/eller slå på kvartskrystallmonitoren på frysefrakturenheten, som gjør det mulig å overvåke tykkelsen på Pt på prøven. Den anbefalte tykkelsen på Pt-laget målt på kvartskrystallmonitoren er 2,5 nm, noe som tilsvarer 4 s skygge ved en gitt høy spenning og strøm (dvs. hastigheten på Pt-skyggelegging er 0,63 nm / s).
    2. Før du starter skyggen, må du flytte kniven bort fra prøven. Påfør høy spenning på Pt / C-pistolen (1600 V), og øk strømmen til 60 mA. Gnister av Pt skal vises og bør begynne å skygge prøven. På dette tidspunktet starter du nedtellingen på 4 s og/eller observerer og finner posisjonen til Pt på kvartskrystallmonitoren.
      MERK: Den anbefalte tykkelsen på C-laget er 2,5 nm, noe som tilsvarer 10 s skygge ved en gitt høy spenning og strøm.
    3. Slå av strømmen og den høye spenningen når ønsket tykkelse på Pt oppnås.
  9. Fortsett med C-skyggen ved 90° (dvs. hastigheten på C-skyggelegging er 0,25 nm/s).
    1. Påfør høy spenning på C-pistolen (1900 V), øk strømmen til 90 mA, og gnister av C skal vises og begynne å skygge prøven; i det øyeblikket, start nedtellingen på 10 s. Slå av strømmen og den høye spenningen når ønsket tykkelse på C oppnås.

4. Rengjøring av replikaer og replikaanalyse

  1. Bruk kobberbærerne fra prøvebordet og overfør dem med pinsett til destillert vann ved romtemperatur i en porselen 12-brønnsplate (figur 4K). Kopiene vil flyte på vannoverflaten, mens bærerne synker (figur 4L).
  2. Overfør kopiene med en trådsløyfe fra destillert vann til en brønn med natriumhypokloritt. Dekk til og la det stå over natten ved romtemperatur i en avtrekkshette.
    FORSIKTIG: Natriumhypokloritt er giftig. Arbeid i en avtrekkshette, bruk vernehansker og kast dem på riktig måte.
  3. Overfør kopiene til ddH2O og vask i 30 min. Gjenta 3 ganger.
  4. Overfør kopiene med en trådsløyfe til et TEM-rutenett i netting av kobber (f.eks. firkantet eller honningkake 100+ mesh). Lufttørk gitteret i 2 timer, og lagre dem deretter i en nettlagringsboks til mikroskopi.
    MERK: Generelt kan gitter lagres i månedsvis i mørke, tørre, romtemperaturforhold.
  5. Bruk et TEM-mikroskop til å avbilde replikaene og hente mikrografer.
    1. Dette gjør du ved å sette inn et TEM-rutenett med en replika og starte TEM-avbildningen i henhold til produsentens bruksanvisning. Arbeid på 80 kV eller 100 kV.
  6. Inspiser prøven og skaff mikrografer ved lavere og høyere forstørrelser med et kamera på TEM.
  7. Analyser mikrografene til MVene. For målinger av MV-diametrene, bruk Fiji / ImageJ-programvare16. Diameteren på MVs er 4/π ganger målingen på mikrografene i henhold til Hallett et al.17.

Representative Results

MVs ble isolert fra det betingede mediet av kreft urothelial T24 celler etter differensial sentrifugering. Etter protokollen ble EV-fraksjonen først oppdaget etter sentrifugering ved 10.000 × g da den ble sett på som en hvit pellets (figur 2G).

Deretter ble elbilene behandlet i henhold til protokollen ovenfor og undersøkt under TEM. Pkt/C-skyggering produsert (figur 4L) relativt store kopier som ofte brøt opp i mindre fragmenter under rengjøringstrinnet. Store kopier og deres mindre fragmenter ble plukket på TEM-rutenettet og sammenlignet under mikroskopet. Resultatene viste ingen forskjeller i kvaliteten på kopiflatene uavhengig av størrelse, og de kan derfor alle brukes. Lave forstørrelsesundersøkelser viste områder av replikaen med i) en homogen overflate (bakgrunn), ii) konkav og konvekse sfæriske profiler (vesikler) og iii) områder med skadet overflate (artefakter; Figur 5A). Typiske artefakter ble sett på som brudd, folder og uregelmessige dimmerskygger (dvs. kopier av iskrystallavsetninger på prøven). Det er også viktig å merke seg at det ikke ble sett cellerester eller cellulære organeller, noe som bekrefter renheten av prøven (figur 5B).

De isolerte vesiklene ble ofte samlet enten i klynger på tre eller flere eller ble individuelt fordelt (figur 5B). Vesikler var sfæriske, noe som peker på god bevaring av ultrastrukturen under isolasjon, fiksering og frysing (figur 5C). "Flatball" og langstrakte vesikler (figur 5C), som ble sett av og til, var antagelig gjenstander for forberedelse og ble ikke inkludert i de etterfølgende målingene av vesicle diameter. Diameteren på de synlige profilene var 238,5 nm (±8,0 nm, n = 190), som, med tanke på korreksjonsfaktoren foreslått av Hallett et al.17, tilsvarer gjennomsnittlig vesicle diameter på 304 nm (±10 nm; Figur 5D). Størrelsen korrelerer med et diameterområde på MVs mellom 100 nm og 1000 nm og beviser effektiviteten av den brukte isolasjonsprotokollen. Bildene av vesiklene sammen med diameterbestemmelse bekreftet utvetydig at elbilene i isolasjonen var beriket med MVs.

Analysen av kopiene avslørte organiseringen av P-ansikt og E-ansikt av MV-begrensende membraner. MVs ble observert som konkave og konvekse runde former (figur 5C, E, F), som reflekterer bruddplanet. De konvekse formene representerer E-ansikter (dvs. oppsprukket eksoplasmisk brosjyre av membranene; Figur 5E). De eksoplasmiske ansiktene til ELBIL-ene hadde et glatt, jevnt utseende. De konkave figurene tilsvarer P-ansikter (figur 5F). I P-ansiktene ble det sett noen fremspringende intramembranpartikler i glatte membraner (figur 5C, F). Dette innebærer at MVs isolert fra kreft urothelial T24 celler inneholder bare en lav mengde membran proteiner.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk presentasjon av membranbestemmelse etter frysefraktur. (A) Mikrovesicles knopp fra plasmamembranen inn i det ekstracellulære rommet. (B) Mikrovesicle er begrenset med P- og E-membranbrosjyre til frysefraksjonering, som deler brosjyrene og eksponerer den indre utsikten over brosjyrer, kalt oppsprukne ansikter. (C) Etter Pt / C skygge, to oppsprukne ansikter er merkbare: det protoplasmatiske ansiktet (P-ansikt) med en konveks form vendt mot cytoplasma (protoplasma) og et eksoplasmisk ansikt (E-ansikt) med en konkav form vendt mot det ekstracellulære rommet. Figur 1 ble opprettet ved hjelp av Biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Isolering av elbiler T24-celler dyrket i en CO2-inkubator undersøkes med (B) et lysmikroskop for å bekrefte deres levedyktighet og samløp før MV-isolasjon. (C) Cellekulturmediet samles inn og (D) sentrifugeres fortløpende ved 300 × g og ved 2000 × g (E) hver gang supernatanten samles inn. (F,G) Etter sentrifugeringen på 10.000 × g er en hvit flekk som indikerer at en pellets er synlig og merket. Supernatanten fjernes og (H) fiksering legges forsiktig til pelletsen uten å bruke den på nytt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Frysing av elbiler( A) Lufttørkede rene kobberbærere med en sentral grop er (B) merket før bearbeiding. Mikrovesicles er resuspendert i glyserol for å få en homogen prøve og (C) lagt til en sentral grop av en cooper carrier under et stereomikroskop. (D) Man må legge til et volum av prøven slik at den danner en konveks dråpe i den sentrale gropen. (E) Umiddelbart før frysing, bland LN2-avkjølt freon med en metallstang for å flytende freonen. (F) Frys prøven ved å senke den ned i freon, og (G) overfør den deretter til LN2. (H) Bærere med den frosne prøven kan samles i kryovariasjoner og lagres i en LN2 Dewar-beholder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Fryse oppsprekking og lage en kopi. (A) Frys oppsprekkingsenheten. Inne i enhetskammeret (B) er en platina (Pt) og karbon (C) elektronpistol, en kniv og prøvebordet. (C) For å starte oppsprekking overføres bærere med prøven til prøvebordet, (D) frysefrakturenheten avkjøles, og det etableres et vakuum. (E) Seksjonering gjøres ved motorisert (F) bevegelse av kniven, men oppsprekking gjøres fortrinnsvis manuelt. (G) Prøve før seksjonering og (H) etter oppsprekking. (I) Umiddelbart etter oppsprekking gjøres kopien. (J) I løpet av denne prosessen skygges Pt på prøven. Platina skyggering blir sett på som et sterkt lys (gnister) i kammeret. (K) Prøvebærere samles i en porselenbrønn fylt med vann. (L) Kopi (pil) som flyter i natriumhypoklorittoppløsningen under rengjøringstrinnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Elektronmikrografer av frysefraktur og Pt/C skyggelagte MVs. (A) En oversikt over den frysefrakturnende og skyggefulle EV-pelletsen (i) ved lavere forstørrelse. Den homogene overflaten er bakgrunn (ii), lyse områder er brudd i kopiene (iii), mørkere områder er bretter av kopier (stjerne), og uregelmessige dimmerskygger skyldes iskrystaller (to stjerner). (B) Klynge av rundformede elbiler med konkave og konvekse overflater. (C) Høy forstørrelse av elbiler. Ved konvekse frakturer, som viser P-ansiktet til EV-membranene, ses intramembranpartikler (piler) og flekker av en jevn overflate (pilspisser). Ekstracellulære vesicles med langstrakte (stjerne) og flatballformer (to stjerner) er funnet. (D) Gjennomsnittlig diameter på isolerte urothelial MVs er 304 nm ± 10 nm i henhold til størrelsesmålingene som foreslått av Hallett et al.17. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. (E,F) E-ansikt og P-face av MVs. Legend: piler = intramembrane partikler i P-ansikt, omringede piler = retningen av Pt / C skyggelegging. Skalastenger: A = 10 μm, B-F = 400 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Karakteriseringen av MVs, eller en annen befolkning av isolerte elbiler, er av største betydning til å begynne med før du starter nedstrømsanalyser som "omics" studier eller funksjonelle studier11,18. Heri ble elbiler fra human invasiv blærekreft urotelial T24-celler isolert ved sentrifugering, og etter den medfølgende protokollen for analyse ved frysefrakturelektronmikroskopi viste vi at den isolerte fraksjonen ble beriket i MVs11,13. Isolering av MVs var blottet for cellerester eller organeller, og bekreftet en vellykket isolasjons- og renseprotokoll.

Kombinasjonen av kjemisk fiksering og frysing, som er kritiske trinn i protokollen, beholdt den sfæriske formen på ELBILER12. Forholdsregler er imidlertid nødvendig ved vurdering av EV-diameter ved frys-oppsprekking17. Siden bruddet passerer gjennom prøven tilfeldig, deles MV-membraner inn i deres ekvatoriale og ikke-ekvatoriale plan. For å gi en streng metode for å analysere bildene av frysefrakturerte og skyggelagte prøver, viste Hallett et al. at gjennomsnittlig vesicle diameter er 4/π ganger den faktiske størrelsen på den biliske diameteren på bildet17. Når det gjelder dette, ble elbiler fra T24-celler beregnet til å ha en diameter på 304 nm, som passer i MVs teoretiske størrelsesfordelingsområde på 100-1000 nm19.

Frysefraktur kan supplere negativ farging, den mest brukte TEM-teknikken for å visualisere elbiler. Ved negativ farging er prøven ofte kjemisk festet, tørket og festet til et TEM-rutenett, og kontrastert med uranyloppløsning. Uten støttende medier har elbiler en tendens til å kollapse, noe som gir dem et koppformet utseende. Ved frys-oppsprekking viser vi at MVs er sfærer, noe som gjenspeiler deres form i ekstracellulære rom og kroppsvæsker12. Med det er våre resultater også i samsvar med observasjoner av elbiler i kryo-ultratynneseksjoner 20.

En avgjørende fordel med frysefrakturteknikken er dens evne til å løse den interne organiseringen av den begrensende membranen, som er en nøkkelfaktor for å forstå hvordan elbiler er målrettet mot og samhandler med mottakermembraner. Her analyserte vi membranene til MVs, men frysefraktur kunne avsløre membranorganisasjonen til en hvilken som helst annen befolkning av elbiler. MVs dannes av plasmamembran spirende; Derfor forventes plasmamembranproteiner og proteinklynger å bli funnet i MV-membranen. Våre resultater støttet at MVene fra T24-cellene inneholdt intramembranpartikler, og presenterte integrerte membranproteiner. Basert på partikkelfordeling mellom E-ansiktet og P-ansiktet, er det rimelig å forvente at partiklene som observeres i MVs er transmembrane proteiner uroplakins, som er urothelial cellespesifikke21,24. De observerte partiklene var sparsommelige, noe som er i samsvar med tidligere studier som rapporterte en reduksjon i uroplakins under urothelial karsinogenese 21,22,23. For å undersøke proteinsammensetningen av MV-membraner ytterligere, anbefales imidlertid bruk av frysefraktur-kopi immunmerking (FRIL) -teknikken. FRIL er en oppgradering av den presenterte frysefrakturteknikken og er dedikert til å avsløre identiteten til proteiner i kopier ved antistoffgjenkjenning24,25. For å oppsummere er frysefrakturteknikken en elektronmikroskopiteknikk som er egnet for karakterisering av EV-begrensende membran, samt formen, størrelsen og renheten til de isolerte EV-fraksjonene. Den presenterte protokollen kan også brukes til vurdering av andre populasjoner av isolerte elbiler; Derfor fortjener frysefrakturteknikken inkludering i International Society for Extracellular Vesicles retningslinjer for studier som utforsker organiseringen av EV-begrensende membraner.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av Det slovenske forskningsbyrået (forskningskjernefinansieringsnr. P3-0108 og prosjekt J7-2594) og MRIC UL IP-0510 Infrastrukturprogram. Dette arbeidet bidrar til COST Action CA17116 International Network for Translating Research on Perinatal Derivatives into Therapeutic Approaches (SPRINT), støttet av COST (European Cooperation in Science and Technology). Forfatterne vil takke Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič og Sabina Železnik for teknisk hjelp med cellekulting og klargjøring av prøvene og Marko Vogrinc, Ota Širca Roš og Nejc Debevec for teknisk hjelp til å forberede videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A-DMEM ThermoFisher Scientific, USA 12491015
Balzers freeze-fracture device Balzers AG, Liechtenstein Balzers BAF 200
Centrifuge Eppendorf, Germany model 5810R
CO2 incubator HeraCell  Heraues, Germany
Copper carriers Balzers BB 113 142-2 100+ mesh
Copper grids SPI, United States 2010C
Culture flask T75 TPP, Switzerland growing surface 75 cm2
F12 (HAM) Sigma-Aldrich, Germany 21765029
FBS Gibco, Life Technologies, USA 10500064
Glazed Porcelain Plate 6 Well Fischer Sientific, United States 50-949-072
Glycerol Kemika, Croatia 711901 final concentration 30 % (v/v)
Glutaradehyde  Serva, Germany 23114.01 final concentration 2.5 % (v/v)
GlutaMAX Gibco, Life Technologies 35050-079 final concentration 4 mM
Penicillin Gibco, Life Technologies 15140163 final concentration 100 U/ml
Phase-contast inverted microscope Nikon, Japan model Eclipse
Rotor Eppendorf, Germany A 4-44
Rotor  Eppendorf, Germany F-34-6-38
Serological pipetts TPP, Switzerland 50mL volume
Sodium hypochloride solution in water Carlo Erba, Italy 481181
Stereomicroscope Leica, Germany
Streptomycin Gibco, Life Technologies 35050038 final concentration 100 mg/mL
Transmission electron microscope Philips, The Netherlands model CM100 working at 80 kV
Tweezers SPI, United States

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Willms, E., Cabanas, C., Mager, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  3. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
  4. Cocucci, E., Racchetti, G., Meldolesi, J. Shedding microvesicles: Artefacts no more. Trends in Cell Biology. 19 (2), 43-51 (2009).
  5. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 29-39 (2020).
  6. Tricarico, C., Clancy, J., D'Souza-Schorey, C. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  7. Georgantzoglou, N., Pergaris, A., Masaoutis, C., Theocharis, S. Extracellular vesicles as biomarkers carriers in bladder cancer: Diagnosis, surveillance, and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2744 (2021).
  8. Słomka, A., Urban, S. K., Lukacs-Kornek, V., Żekanowska, E., Kornek, M. Large extracellular vesicles: Have we found the holy grail of inflammation. Frontiers in Immunology. 9, 2723 (2018).
  9. Han, L., Lam, E. W. F., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: Old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  10. Muralidharan-Chari, V., Clancy, J. W., Sedgwick, A., D'Souza-Schorey, C. Microvesicles: Mediators of extracellular communication during cancer progression. Journal of Cell Science. 123, 1603-1611 (2010).
  11. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  12. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  13. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  14. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2 (3), 547-576 (2007).
  15. Severs, N. J., Robenek, H. Freeze-fracture cytochemistry in cell biology. Methods in Cell Biology. 88, 181-186 (2008).
  16. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  17. Hallett, F. R., Nickel, B., Samuels, C., Krygsman, P. H. Determination of vesicle size distributions by freeze-fracture electron microscopy. Journal of Electron Microscopy Technique. 17 (4), 459-466 (1991).
  18. Nigro, A., et al. Selective loss of microvesicles is a major issue of the differential centrifugation isolation protocols. Scientific Reports. 11, 3589 (2021).
  19. Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1153 (2017).
  20. Iliev, D., et al. Stimulation of exosome release by extracellular DNA is conserved across multiple cell types. The FEBS Journal. 285 (16), 3114-3133 (2018).
  21. Zupančič, D., Zakrajšek, M., Zhou, G., Romih, R. Expression and localization of four uroplakins in urothelial preneoplastic lesions. Histochemistry and Cell Biology. 136 (4), 491-500 (2011).
  22. Wu, X. R., Manabe, M., Yu, J., Sun, T. T. Large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins I, II, and III. Molecular markers of urothelial differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 19170-19179 (1990).
  23. Kreft, M. E., Hudoklin, S., Jezernik, K., Romih, R. Formation and maintenance of blood-urine barrier in urothelium. Protoplasma. 246 (1-4), 3-14 (2010).
  24. Kreft, M. E., Robenek, H. Freeze-fracture replica immunolabelling reveals urothelial plaques in cultured urothelial cells. PLoS One. 7 (6), 38509 (2012).
  25. Robenek, H., et al. Topography of lipid droplet-associated proteins: Insights from freeze-fracture replica immunogold labeling. Journal of Lipids. 2011, 409371 (2011).

Tags

Kreftforskning utgave 187
Frysefraktur elektronmikroskopi for ekstracellulær vesicleanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Resnik, N., Romih, R., Kreft, M. E., … More

Resnik, N., Romih, R., Kreft, M. E., Hudoklin, S. Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis. J. Vis. Exp. (187), e63550, doi:10.3791/63550 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter