Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Электронная микроскопия с замораживанием и разрушением для анализа внеклеточных пузырьков

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/63550
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Medicine, Institute of Cell Biology, University of Ljubljana

Summary

Мы представляем протокол выделения и замораживания внеклеточных везикул (EV), происходящих из раковых уротелиальных клеток. Метод замораживания-разрушения показал диаметр и форму электромобилей и, как уникальную особенность, внутреннюю организацию мембран EV. Они имеют огромное значение для понимания того, как электромобили взаимодействуют с мембранами-реципиентами.

Abstract

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой мембранно-ограниченные структуры, высвобождаемые из клеток во внеклеточное пространство и участвующие в межклеточной связи. EV состоят из трех популяций везикул, а именно микровезикул (MV), экзосом и апоптотических тел. Ограничивающая мембрана EV критически участвует во взаимодействиях с клетками-реципиентами, что может привести к переносу биологически активных молекул к клеткам-реципиентам и, следовательно, повлиять на их поведение. Метод электронной микроскопии замораживания-разрушения используется для изучения внутренней организации биологических мембран. Здесь мы представляем протокол выделения МВ из культивируемых раковых уротелиальных клеток и замораживания-разрушения МВ на этапах быстрого замораживания, разрыва, изготовления и очистки реплик и их анализа с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Результаты показывают, что протокол изоляции дает однородную популяцию EV, которые соответствуют форме и размеру MV. Внутримембранные частицы находятся в основном в протоплазматической грани ограничивающей мембраны. Следовательно, замораживание-разрушение является методом выбора для характеристики диаметра, формы и распределения мембранных белков MW. Представленный протокол применим к другим популяциям электромобилей.

Introduction

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой мембранно-ограниченные везикулы, высвобождаемые из клеток во внеклеточное пространство. Тремя основными популяциями EV являются экзосомы, микровезикулы (МВ) и апоптотические тела, которые различаются по своему происхождению, размеру и молекулярному составу 1,2,3. Состав EV отражает молекулярный профиль донорской клетки и ее физиологический статус (т.е. здоровый или больной)4,5. Это дает EV огромный потенциал в диагностике, прогнозе и терапии заболеваний человека, и они имеют перспективные медицинские приложения для использования в персонализированной медицине 6,7,8.

Электромобили являются посредниками межклеточной связи. Они содержат биологически активные белки, липиды и РНК, которые вмешиваются в биологические процессы в клетке-реципиенте и могут изменять ее поведение 9,10. Однако состав ограничивающей мембраны EV имеет решающее значение для взаимодействия с клеточной мембраной-реципиентом.

Источниками EV являются жидкости организма и условные питательные среды. Чтобы изолировать популяцию EV, необходимо использовать подходящую технику изоляции. Например, центрифугирование при 10 000 × г дает фракцию, обогащенную МВ, тогда как центробежные силы ≥100 000 × г дают фракцию, обогащенную экзосомами11,12. Изолированная фракция электромобилей должна быть проверена с точки зрения чистоты, размера и формы. С этой целью Международное общество внеклеточных везикул 2018 года рекомендовало три класса методов визуализации с высоким разрешением: электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия и микроскопия сверхвысокого разрешения на основе световой микроскопии13. Ни один из этих методов не может предоставить информацию о внутренней части мембраны EV.

Электронная микроскопия с замораживанием и разрушением представляет собой метод разрушения замороженных образцов для выявления их внутренних структур, в частности, для получения вида на внутреннюю часть мембраны. Этапы подготовки образца включают (1) быстрое замораживание, (2) разрыв пласта, (3) изготовление реплики и (4) очистку реплики14. На этапе 1 образец (необязательно) химически фиксируется, криозащита глицерином и замораживается в жидком фреоне. На этапе 2 замороженный образец разбивается в блоке замораживания-разрушения, который обнажает внутреннюю часть мембранного бислоя. На этапе 3 обнаженные трещины затеняют платиной (Pt) и углеродом (C) для получения реплик. На этапе 4 органический материал удаляется. Реплика анализируется в просвечивающем электронном микроскопе (ТЭМ). Для точной интерпретации микроснимков необходимо следовать рекомендациям по их правильной ориентации14,15. Вкратце, направление теней на микрофотографии является ориентиром для ориентации микрофотографии (т. е. для определения направления затенения Pt) и, следовательно, для определения выпуклых и вогнутых форм (рисунок 1). Два внутренних вида, называемых трещинами мембранного бислоя, можно увидеть в результате расщепления мембраны путем замораживания-разрыва: протоплазматическая грань (P-грань) и экзоплазматическая грань (E-грань). P-грань представляет собой мембранный листок, прилегающий к протоплазме клетки, в то время как E-грань представляет собой мембранный листок, прилегающий к внеклеточному пространству. Интегральные мембранные белки и их ассоциации рассматриваются как выступающие внутримембранные частицы14,15.

Здесь цель состоит в том, чтобы применить технику замораживания-разрушения для характеристики МВ с точки зрения размера, формы и структуры их ограничивающей мембраны. Здесь мы представляем протокол выделения и замораживания-разрыва МВ, происходящих из инвазивных раковых уротелиальных клеток мочевого пузыря человека.

Protocol

1. Культивирование раковых уротелиальных клеток и выделение EV

ПРИМЕЧАНИЕ: Представлен протокол получения EV из инвазивной уротелиальной клеточной линии рака мочевого пузыря человека (Т24). Тем не менее, условия культивирования должны быть оптимизированы для использования других типов клеток.

  1. Пластинчатые Т24 клетки плотностью 3 × 104 клетки/см2 в трех колбах (растущая поверхность 75см2) и начинают с культивирования клеток в инкубатореСО2 в течение 3 дней при 37 °C и 5% CO2 (Рисунок 2A).
    1. Используйте культуральную среду для Т24-клеток в смеси 1:1 (v/v) A-DMEM и F12, дополненной 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 4 мМ Глутамакса, 100 мг/мл стрептомицина и 100 Ед/мл пенициллина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая изоляция дает электромобили, обогащенные МВ. Перед началом изоляции осмотрите клетки с помощью светового микроскопа, чтобы подтвердить жизнеспособность и слияние (рисунок 2B). Начните собирать EV из кондиционированной культуральной среды, когда клетки T24 находятся на 70% слиянии.
  2. Собрать питательную среду с МВ с пипеткой из колб (Т75) в конические центрифужные трубки (рис. 2С). Центрифуга при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C (рисунок 2D).
  3. Аккуратно соберите супернатант в новую центрифужную трубку с пипеткой (рисунок 2Е).
  4. Центрифугировать супернатант при 2000 × г в течение 20 мин при 4 °C.
  5. Аккуратно соберите супернатант с пипеткой в новую центрифужную трубку.
  6. Центрифуга при 10 000 × г в течение 40 мин при 4 °C. Обратите внимание на наличие беловатой гранулы на дне трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости измените ротор центрифуги для достижения требуемой перегрузки. Гранула EV видна как белая гранула в нижней части трубки центрифуги (рисунок 2F); обозначьте его местоположение, чтобы избежать потери гранулы во время пипетки (рисунок 2G).
  7. Осторожно выбросьте супернатант пипеткой. К грануле добавить 1,5 мл PBS и повторно суспендировать гранулу, содержащую MVs. Поместите суспензию в новую центрифужную трубку.
  8. Центрифугу при 10 000 × г в течение 40 мин при 4 °C и ищите наличие белой гранулы на дне трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула EV видна как белое пятно на дне трубки центрифуги; обозначьте его расположение, чтобы избежать потери гранулы во время пипетки.
  9. Осторожно выбросьте супернатант пипеткой. Осторожно добавьте фиксатор, 2,5% глутаровый альдегид в буфер какодилата натрия 0,1 М (рН 7,2). Оставьте на 20 мин при 4 °C (рисунок 2H).
    ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид и какодилат натрия токсичны. Работайте в вытяжном капюшоне, надевайте защитные перчатки и выбрасывайте их соответствующим образом.
  10. Аккуратно снимите фиксатор пипеткой. Добавьте промывочный буфер (0,1 М буфера какодилата натрия) к грануле. Оставить на 10 мин при 4 °C без повторного использования гранулы.

2. Замораживание электромобилей

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед замораживанием сначала криозащитите образцы глицерином.

  1. Готовят 0,1 М буфера какодилата натрия. Удалите буфер промывки и добавьте 50 мкл 30% глицерина в буфер 0,1 М какодилата. Осторожно повторно суспендируйте электромобили, чтобы сделать раствор однородным. Инкубировать в течение 30 мин при 4 °C.
  2. Очистите медоносцы центральной ямой в ультразвуковой ванне хлороформом в течение 5 мин (рисунок 3А). Высушите их на воздухе и пометьте цветами при использовании нескольких образцов (рисунок 3B). До использования храните носители в сухом, чистом месте (например, на бумаге для линз в чашке Петри). Не прикасайтесь к носителям голыми руками.
    1. Подготовьте пипетки, растворы, фильтровальную бумагу, пинцет, стереомикроскоп, колбу Дьюара с фреоном и жидким азотом (LN2), металлический стержень и криовиалы. Охладите его с помощью LN2.
      ВНИМАНИЕ: Носите защитное снаряжение и работайте соответственно при обращении с LN2 и охлажденным фреоном.
  3. Повторно суспендируйте электромобили перед замораживанием. Избегайте образования пузырьков воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Быстро выполните шаги 2.4-2.7.
  4. Работа под стереомикроскопом (рисунок 3С). Перенесите 1,5-1,7 мкл образца в центральную яму меденосца, чтобы сделать выпуклое падение, достигающее выше края медного носителя, не проливая образец через край (рисунок 3D). В случае чрезмерного разлива используйте фильтровальную бумагу для сушки наружного кольца носителя.
  5. Смешайте затвердевший фреон с металлическим стержнем, чтобы снова разжижить его (рисунок 3E).
  6. Захватите пинцетом наружное кольцо медного носителя и погрузите его в охлажденный фреон с легким встряхиванием пинцета в течение 8 с (рисунок 3F). Через 8 секунд быстро перенесите носитель в другую колбу Дьюара, наполненную LN2.
  7. Немедленно приступайте к ГРП или хранению образцов в LN2. В последнем случае пометьте криовиал и охладите кончики флакона и пинцета, погрузив их в LN2 (рисунок 3G). В соответствии с LN2 соберите замороженные носители меди во флакон, закройте его и храните их в контейнере LN2 (рисунок 3H) до замораживания разрыва пласта.

3. Разрыв электромобилей и изготовление реплик

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте установку замораживания-разрыва пласта в соответствии с инструкциями производителя по эксплуатации. (Рисунок 4А). Очистите камеру агрегата. Позиционируйте платиновые (Pt/C) и углеродные (C) пушки под углами 45° и 90° соответственно (рисунок 4B).

  1. Запустите вакуумную систему установки. При достижении давления 6,6 × 10−2 Па (5 × 10−4 Торр) охладите камеру блока до −150 °C.
  2. Переложите медные носители с замороженными образцами в установку замораживания-разрыва пласта с помощью сухого пинцета (рисунок 4С). Используйте криотрансфер или работайте быстро, чтобы избежать размораживания образца и осаждения кристаллов льда. Закрепите носители на столе образцов.
  3. Подождите, пока вакуум снова не достигнет 6,6 × 10−2 Па (5 × 10−4 Торр), а затем установите температуру ножа на −100 °C (рисунок 4D).
  4. Подождите, пока вакуум достигнет 1,0 × 10−3 Па (8 × 10−6 Торр).
  5. Понаблюдайте за образцом в бинокль и внимательно подойдите к ножу (рисунок 4Е).
  6. Начните секционирование образца, включив моторизованное движение ножа (рисунок 4F) и сечение до тех пор, пока поверхность образца не станет гладкой (рисунок 4G).
  7. Для разрыва пласта выключите моторизованное движение ножа и приступайте к медленному ручному управлению ножом, тем самым разрывая образец (рисунок 4H). Чтобы защитить трещиноватую поверхность от образования кристаллов льда и обломков до затенения, переместите нож над сломанным образцом.
  8. Продолжайте затенение Pt под углом 45° (рисунок 4I, J).
    1. Подготовьте секундомер и/или включите монитор кристаллов кварца на блоке замораживания-разрыва пласта, что позволит контролировать толщину Pt на образце. Рекомендуемая толщина слоя Pt, измеренная на кварцевом кристаллическом мониторе, составляет 2,5 нм, что соответствует 4 с затенения при заданном высоком напряжении и токе (т.е. скорость затенения Pt составляет 0,63 нм/с).
    2. Перед началом затенения отведите нож от образца. Нанесите высокое напряжение на пушку Pt/C (1 600 В) и увеличьте ток до 60 мА. Искры Pt должны появиться и должны начать затенять образец. На этом этапе начните обратный отсчет 4 с и/или наблюдайте и определяйте положение Pt на кварцевом кристаллическом мониторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая толщина слоя C составляет 2,5 нм, что соответствует 10 с затенения при заданном высоком напряжении и токе.
    3. Выключите ток и высокое напряжение при получении желаемой толщины Pt.
  9. Продолжайте затенение C под углом 90° (т.е. скорость затенения C составляет 0,25 нм/с).
    1. Нанесите высокое напряжение на пистолет С (1 900 В), увеличьте ток до 90 мА, и искры С должны появиться и начать затенять образец; в этот момент начните обратный отсчет 10 с. Выключите ток и высокое напряжение при получении желаемой толщины С.

4. Очистка реплик и анализ реплик

  1. Используйте медные носители со стола для образцов и переложите их пинцетом в дистиллированную воду комнатной температуры в фарфоровой 12-луночной пластине (рисунок 4К). Реплики будут плавать на поверхности воды, в то время как носители тонут (рисунок 4L).
  2. Перенесите реплики с помощью проволочной петли из дистиллированной воды в колодец с гипохлоритом натрия. Накройте крышкой и оставьте на ночь при комнатной температуре в вытяжке.
    ВНИМАНИЕ: Гипохлорит натрия токсичен. Работайте в вытяжном капюшоне, надевайте защитные перчатки и выбрасывайте их соответствующим образом.
  3. Переведите реплики на ddH2Oи мойте в течение 30 мин. Повторите 3 раза.
  4. Перенесите реплики с помощью проволочной петли в сетчатую медную сетку ТЭМ (например, квадратную или сотовую сетку 100+). Высушите сетки на воздухе в течение 2 ч, а затем храните их в ячейке для хранения сетки до микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, сетки могут храниться в течение нескольких месяцев в темных, сухих условиях комнатной температуры.
  5. Используйте микроскоп TEM для получения изображений реплик и получения микроснимков.
    1. Для этого вставьте сетку ТЕА с репликой и запустите визуализацию ТЭМ в соответствии с руководствами по эксплуатации завода-изготовителя. Работа на 80 кВ или 100 кВ.
  6. Осмотрите образец и получите микроснимки при все большем и большем увеличении с помощью камеры на ТЕА.
  7. Проанализируйте микроснимки МВ. Для измерения диаметров среднего напряжения используйте программное обеспечение Fiji/ImageJ16. Диаметр МВ в 4/π раз больше, чем измерение на микроснимках согласно Hallett et al.17.

Representative Results

МВ были выделены из обусловленной среды раковых уротелиальных Т24-клеток после дифференциального центрифугирования. Следуя протоколу, фракция EV была впервые обнаружена после центрифугирования при 10 000 × г, когда она рассматривалась как белая гранула (рисунок 2G).

Затем электромобили были обработаны в соответствии с вышеупомянутым протоколом и исследованы в рамках ТЕА. Затенение Pt/C производило (рисунок 4L) относительно большие реплики, которые часто распадались на более мелкие фрагменты на этапе очистки. Большие реплики и их более мелкие фрагменты были отобраны на сетке ТЕА и сравнены под микроскопом. Результаты не показали различий в качестве поверхностей реплик независимо от их размера, и поэтому все они могут быть использованы. Исследования с малым увеличением показали области реплики с i) однородной поверхностью (фоном), ii) вогнутыми и выпуклыми сферическими профилями (везикулами) и iii) областями поврежденной поверхности (артефакты); Рисунок 5А). Типичные артефакты рассматривались как разрывы, складки и неправильные тусклые тени (т. Е. Копии ледяных кристаллических отложений на образце). Также важно отметить, что не было обнаружено клеточного мусора или клеточных органелл, что подтверждает чистоту образца (рисунок 5B).

Изолированные везикулы обычно собирали либо в кластеры по три или более человек, либо были индивидуально распределены (рисунок 5B). Везикулы были сферическими, что указывает на хорошую сохранность ультраструктуры при выделении, фиксации и замораживании (рисунок 5C). «Плоские шары» и удлиненные везикулы (рисунок 5С), которые были замечены изредка, предположительно были артефактами приготовления и не были включены в последующие измерения диаметра везикул. Диаметр видимых профилей составил 238,5 нм (±8,0 нм, n = 190), что с учетом поправочного коэффициента, предложенного Hallett et al.17, соответствует среднему диаметру пузырьков 304 нм (±10 нм; Рисунок 5D). Размер коррелирует с диапазоном диаметров МВ от 100 нм до 1000 нм и доказывает эффективность используемого протокола изоляции. Изображения везикул вместе с определением диаметра однозначно подтвердили, что EV в изоляте были обогащены МВ.

Анализ реплик выявил организацию P-грани и E-грани ограничивающих мембран MV. МВ наблюдались в виде вогнутых и выпуклых круглых форм (рисунок 5C,E,F), отражающих плоскость разрушения. Выпуклые формы представляют собой E-грани (т.е. сломанные экзоплазматические листочки мембран; Рисунок 5Е). Экзоплазматические грани электромобилей имели гладкий, однородный вид. Вогнутые формы соответствуют P-граням (рисунок 5F). На P-гранях несколько выступающих внутримембранных частиц были замечены внутри гладких мембран (рисунок 5C, F). Это означает, что МВ, выделенные из раковых уротелиальных Т24-клеток, содержат только небольшое количество мембранных белков.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление определения мембраны после замораживания-разрыва. (А) Микровезикулы выходят из плазматической мембраны во внеклеточное пространство. (B) Микровезикла ограничена листком P- и E-мембраны до замораживания-фракционирования, которое расщепляет листочки и обнажает внутренние виды листовок, называемые трещиноватыми гранями. (C) После тени Pt/C различимы две сломанные грани: протоплазматическое лицо (P-лицо) с выпуклой формой, обращенной к цитоплазме (протоплазма) и экзоплазматическое лицо (E-face) с вогнутой формой, обращенной к внеклеточному пространству. Рисунок 1 был создан с использованием Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Выделение EV. (A) Т24-клетки, выращенные в инкубаторе CO2, исследуют с помощью (B) светового микроскопа, чтобы подтвердить их жизнеспособность и слияние до выделения MV. (C) Клеточная культуральная среда собирается и (D) последовательно центрифугируется при 300 × г и при 2000 × г (E) каждый раз при сборе супернатанта. (Ф,Г) После центрифугирования при 10 000 × г видно и маркируется белое пятно, указывающее на гранулу. Супернатант удаляется и (H) фиксатор осторожно добавляется в гранулу без повторного использования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Замораживание электромобилей. (А) Высушенные на воздухе чистые медные носители с центральной ямой маркируются (В) перед обработкой. Микровезикулы повторно суспендируют в глицерине для получения однородного образца и (С) добавляют в центральную яму медного носителя под стереомикроскопом. D) Необходимо добавить объем образца таким образом, чтобы он образовывал выпуклую каплю в центральной яме. (E) Непосредственно перед замораживанием смешайте фреон, охлажденный LN2, с металлическим стержнем для разжижения фреона. (F) Заморозить образец, погрузив его во фреон, а затем (G) перенести его в LN2. (H) Носители с замороженным образцом могут быть собраны в криовиалы и сохранены в контейнере LN2 Dewar. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Замораживание-разрыв и изготовление реплики. (А) Установка замораживания-разрыва пласта. Внутри камеры блока (B) находится платиновый (Pt) и углеродный (C) электронный пистолет, нож и таблица образцов. (C) Для начала разрыва пласта носители с образцом переносятся на стол проб, (D) установка замораживания-разрыва охлаждается и устанавливается вакуум. (E) Секционирование производится моторизованным (F) движением ножа, но разрыв пласта предпочтительно выполняется вручную. (G) Проба до секционирования и (H) после разрыва пласта. (I) Сразу после разрыва пласта производится реплика. (J) Во время этого процесса Pt затеняется на образце. Платиновое затенение видно как яркий свет (искры) в камере. (K) Носители для образцов собираются в фарфоровый колодец, наполненный водой. (L) Реплика (стрелка), плавающая в растворе гипохлорита натрия на этапе очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Электронные микроснимки замороженных и Pt/C затененных МВ. (A) Обзор замерзающих и затененных гранул EV (i) при меньшем увеличении. Однородная поверхность является фоном (ii), светлые области - разрывы в репликах (iii), более темные области - складки реплик (звездочка), а неправильные тусклые тени обусловлены кристаллами льда (две звездочки). (B) Кластер электромобилей круглой формы с вогнутыми и выпуклыми поверхностями. (C) Большое увеличение электромобилей. В выпуклых переломах, которые проявляют P-грань мембран EV, видны внутримембранные частицы (стрелки) и пятна гладкой поверхности (наконечники стрел). Найдены внеклеточные везикулы с вытянутыми (звездчатыми) и плоскими шаровыми формами (две звезды). (D) Средний диаметр изолированных уротелиальных МВ составляет 304 нм ± 10 нм в соответствии с измерениями размера, предложенными Hallett et al.17. Данные представлены в виде среднего ± SEM. (E,F) E-грань и P-грань MVs. Легенда: стрелки = внутримембранные частицы в P-грани, окруженные стрелки = направление pt/C тени. Шкала стержней: A = 10 мкм, B-F = 400 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Характеристика МВ или любой другой популяции изолированных EV имеет первостепенное значение для начала, прежде чем начинать последующие анализы, такие как исследования «омики» или функциональные исследования11,18. При этом EV из инвазивных уротелиальных Т24-клеток рака мочевого пузыря человека были выделены центрифугированием, и в соответствии с предоставленным протоколом анализа методом электронной микроскопии с замораживанием-трещиной мы продемонстрировали, что изолированная фракция была обогащена МВ11,13. Изолят МВ был лишен клеточного мусора или органелл, что подтверждало успешный протокол выделения и очистки.

Сочетание химической фиксации и замораживания, которые являются критическими этапами протокола, сохранило сферическую форму ev12. Тем не менее, необходимы меры предосторожности при оценке диаметра EV путем замораживания-разрывапласта 17. Поскольку трещина проходит через выборку случайным образом, мембраны MV расщепляются на их экваториальную и неэкваториальную плоскости. Чтобы обеспечить строгий метод анализа изображений замороженных и затененных образцов, Hallett et al. показали, что средний диаметр пузырьков в 4/π раз превышает фактический размер диаметра везикула на изображении17. Учитывая это, было рассчитано, что электромобили из ячеек T24 имеют диаметр 304 нм, что соответствует теоретическому диапазону распределения размеров MV 100-1000 нм19.

Замораживание разрыва может дополнить отрицательное окрашивание, наиболее широко используемую технику TEM для визуализации электромобилей. При отрицательном окрашивании образец обычно химически фиксируют, сушат и прикрепляют к сетке ТЕА и противопоставляют раствору уранила. Без поддержки средств массовой информации электромобили, как правило, разрушаются, что придает им чашевидный вид. Путем замораживания-разрыва мы показываем, что МВ являются сферами, что отражает их форму во внеклеточных пространствах и жидкостях организма12. Таким образом, наши результаты также согласуются с наблюдениями ev в крио-ультратонких секциях20.

Решающим преимуществом метода замораживания-разрушения является его способность разрешать внутреннюю организацию ограничивающей мембраны, что является ключевым фактором в понимании того, как EV нацелены на мембраны реципиента и взаимодействуют с ними. Здесь мы проанализировали мембраны МВ, но замораживание-разрыв может выявить мембранную организацию любой другой популяции EV. МВ образуются при почковании плазматической мембраны; поэтому ожидается, что белки плазматической мембраны и белковые кластеры будут обнаружены в мембране MV. Наши результаты подтвердили, что МВ из Т24-клеток содержали внутримембранные частицы, представляющие собой интегральные мембранные белки. Основываясь на распределении частиц между E-гранью и P-гранью, разумно ожидать, что частицы, наблюдаемые в МВ, являются трансмембранными белками уроплакинов, которые специфичны для уротелиальных клеток21,24. Наблюдаемые частицы были разреженными, что в соответствии с предыдущими исследованиями, сообщающими о снижении уроплакинов во время уротелиального канцерогенеза 21,22,23. Однако для дальнейшего изучения белкового состава мембран MV рекомендуется использовать метод иммуномаркировки реплики фриз-перелома (FRIL). FRIL является обновлением представленной методики замораживания-разрушения и посвящен выявлению идентичности белков в репликах путем распознавания антител24,25. Подводя итог, можно сказать, что метод замораживания-разрушения представляет собой метод электронной микроскопии, подходящий для характеристики ограничивающей мембраны EV, а также формы, размера и чистоты изолированных фракций EV. Представленный протокол может быть использован также для оценки других популяций изолированных EV; таким образом, метод замораживания-разрыва заслуживает включения в руководящие принципы Международного общества внеклеточных везикул для исследований, изучающих организацию ограничивающих мембран EV.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось Словенским исследовательским агентством (основное финансирование исследований нет. P3-0108 и проект J7-2594) и инфраструктурная программа MRIC UL IP-0510. Эта работа вносит вклад в Международную сеть COST Action CA17116 по переводу исследований перинатальных производных в терапевтические подходы (SPRINT), поддерживаемую COST (Европейское сотрудничество в области науки и техники). Авторы хотели бы поблагодарить Линду Штрус, Саню Чабраю, Наду Павлицу Дубарич и Сабину Железник за техническую помощь в культивировании клеток и подготовке образцов, а также Марко Вогринца, Ота Ширца Рош и Нейц Дебевец за техническую помощь в подготовке видео.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A-DMEM ThermoFisher Scientific, USA 12491015
Balzers freeze-fracture device Balzers AG, Liechtenstein Balzers BAF 200
Centrifuge Eppendorf, Germany model 5810R
CO2 incubator HeraCell  Heraues, Germany
Copper carriers Balzers BB 113 142-2 100+ mesh
Copper grids SPI, United States 2010C
Culture flask T75 TPP, Switzerland growing surface 75 cm2
F12 (HAM) Sigma-Aldrich, Germany 21765029
FBS Gibco, Life Technologies, USA 10500064
Glazed Porcelain Plate 6 Well Fischer Sientific, United States 50-949-072
Glycerol Kemika, Croatia 711901 final concentration 30 % (v/v)
Glutaradehyde  Serva, Germany 23114.01 final concentration 2.5 % (v/v)
GlutaMAX Gibco, Life Technologies 35050-079 final concentration 4 mM
Penicillin Gibco, Life Technologies 15140163 final concentration 100 U/ml
Phase-contast inverted microscope Nikon, Japan model Eclipse
Rotor Eppendorf, Germany A 4-44
Rotor  Eppendorf, Germany F-34-6-38
Serological pipetts TPP, Switzerland 50mL volume
Sodium hypochloride solution in water Carlo Erba, Italy 481181
Stereomicroscope Leica, Germany
Streptomycin Gibco, Life Technologies 35050038 final concentration 100 mg/mL
Transmission electron microscope Philips, The Netherlands model CM100 working at 80 kV
Tweezers SPI, United States

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Willms, E., Cabanas, C., Mager, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  3. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
  4. Cocucci, E., Racchetti, G., Meldolesi, J. Shedding microvesicles: Artefacts no more. Trends in Cell Biology. 19 (2), 43-51 (2009).
  5. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 29-39 (2020).
  6. Tricarico, C., Clancy, J., D'Souza-Schorey, C. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  7. Georgantzoglou, N., Pergaris, A., Masaoutis, C., Theocharis, S. Extracellular vesicles as biomarkers carriers in bladder cancer: Diagnosis, surveillance, and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2744 (2021).
  8. Słomka, A., Urban, S. K., Lukacs-Kornek, V., Żekanowska, E., Kornek, M. Large extracellular vesicles: Have we found the holy grail of inflammation. Frontiers in Immunology. 9, 2723 (2018).
  9. Han, L., Lam, E. W. F., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: Old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  10. Muralidharan-Chari, V., Clancy, J. W., Sedgwick, A., D'Souza-Schorey, C. Microvesicles: Mediators of extracellular communication during cancer progression. Journal of Cell Science. 123, 1603-1611 (2010).
  11. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  12. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  13. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  14. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2 (3), 547-576 (2007).
  15. Severs, N. J., Robenek, H. Freeze-fracture cytochemistry in cell biology. Methods in Cell Biology. 88, 181-186 (2008).
  16. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  17. Hallett, F. R., Nickel, B., Samuels, C., Krygsman, P. H. Determination of vesicle size distributions by freeze-fracture electron microscopy. Journal of Electron Microscopy Technique. 17 (4), 459-466 (1991).
  18. Nigro, A., et al. Selective loss of microvesicles is a major issue of the differential centrifugation isolation protocols. Scientific Reports. 11, 3589 (2021).
  19. Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1153 (2017).
  20. Iliev, D., et al. Stimulation of exosome release by extracellular DNA is conserved across multiple cell types. The FEBS Journal. 285 (16), 3114-3133 (2018).
  21. Zupančič, D., Zakrajšek, M., Zhou, G., Romih, R. Expression and localization of four uroplakins in urothelial preneoplastic lesions. Histochemistry and Cell Biology. 136 (4), 491-500 (2011).
  22. Wu, X. R., Manabe, M., Yu, J., Sun, T. T. Large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins I, II, and III. Molecular markers of urothelial differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 19170-19179 (1990).
  23. Kreft, M. E., Hudoklin, S., Jezernik, K., Romih, R. Formation and maintenance of blood-urine barrier in urothelium. Protoplasma. 246 (1-4), 3-14 (2010).
  24. Kreft, M. E., Robenek, H. Freeze-fracture replica immunolabelling reveals urothelial plaques in cultured urothelial cells. PLoS One. 7 (6), 38509 (2012).
  25. Robenek, H., et al. Topography of lipid droplet-associated proteins: Insights from freeze-fracture replica immunogold labeling. Journal of Lipids. 2011, 409371 (2011).

Tags

Исследование рака выпуск 187
Электронная микроскопия с замораживанием и разрушением для анализа внеклеточных пузырьков
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Resnik, N., Romih, R., Kreft, M. E., … More

Resnik, N., Romih, R., Kreft, M. E., Hudoklin, S. Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis. J. Vis. Exp. (187), e63550, doi:10.3791/63550 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter