Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Co-kultur af Murine tyndtarmsepitelorganoider med medfødte lymfoide celler

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner til etablering af murine tyndtarmsorganoider, isolering af medfødte lymfoidceller af type 1 fra murine tyndtarmen lamina propria og etablering af 3-dimensionelle (3D) co-kulturer mellem begge celletyper for at studere tovejsinteraktioner mellem tarmepitelceller og type 1 medfødte lymfoide celler.

Abstract

Komplekse co-kulturer af organoider med immunceller giver et alsidigt værktøj til at forhøre de tovejs interaktioner, der understøtter den delikate balance i slimhindehomeostase. Disse 3D, multicellulære systemer tilbyder en reduktionistisk model til håndtering af multifaktorielle sygdomme og løsning af tekniske vanskeligheder, der opstår, når man studerer sjældne celletyper såsom vævsresidente medfødte lymfoide celler (ILC'er). Denne artikel beskriver et murinsystem, der kombinerer tyndtarmsorganoider og tyndtarm lamina propria afledt hjælperlignende type 1 ILC'er (ILC1'er), som let kan udvides til andre ILC- eller immunpopulationer. ILC'er er en vævsbeboerpopulation, der er særligt beriget i slimhinden, hvor de fremmer homeostase og hurtigt reagerer på skade eller infektion. Organoide co-kulturer med ILC'er er allerede begyndt at kaste lys over nye epitel-immune signalmoduler i tarmen, hvilket afslører, hvordan forskellige ILC-delmængder påvirker tarmepitelbarrierens integritet og regenerering. Denne protokol vil muliggøre yderligere undersøgelser af gensidige interaktioner mellem epitel- og immunceller, som har potentiale til at give ny indsigt i mekanismerne for slimhindehomeostase og inflammation.

Introduction

Kommunikation mellem tarmepitelet og tarm-resident immunforsvaret er centralt for opretholdelsen af intestinal homeostase1. Forstyrrelser i disse interaktioner er forbundet med både lokale og systemiske sygdomme, herunder inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og gastrointestinale kræftformer2. Et bemærkelsesværdigt eksempel på en nyere beskrevet kritisk regulator af homeostase kommer fra undersøgelsen af medfødte lymfoide celler (ILC'er), der er opstået som nøgleaktører i tarmimmunlandskabet3. ILC'er er en gruppe heterogene medfødte immunceller, der regulerer intestinal homeostase og orkestrerer inflammation stort set gennem cytokinmedieret signalering4.

Murine ILC'er er bredt opdelt i undertyper baseret på transkriptionsfaktor,receptor og cytokinekspressionsprofiler5. Type-1 ILC'er, som omfatter cytotoksiske Natural Killer (NK) celler og hjælperlignende type-1 ILC'er (ILC1'er), defineres ved ekspression af transkriptionsfaktoren (eomesodermin) Eomes og T-box protein udtrykt i henholdsvis T-celler (T-bet)6 og udskiller cytokiner forbundet med T-hjælper type-1 (TH1) immunitet: interferon-γ (IFNγ) og tumornekrosefaktor (TNF) som reaktion på interleukin (IL)-12, IL-15 og IL-187. Under homeostase udskiller vævsresidente ILC1'er Transforming Growth Factor β (TGF-β) for at drive epitelproliferation og matrix-ombygning8. Type-2 ILC'er (ILC2'er) reagerer primært på helminthinfektion via sekretion af T-hjælper type-2 (TH2) associerede cytokiner: IL-4, IL-5 og IL-13 og er karakteriseret ved ekspression af retinsyrerelateret forældreløs receptor (ROR) α (ROR-α)9 og GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Hos mus karakteriseres intestinale "inflammatoriske" ILC2'er yderligere ved ekspression af Killer cell lectin-lignende receptor (underfamilie G-medlem 1, KLRG)13, hvor de reagerer på epiteltuftcelle afledt IL-2514,15. Endelig er type-3 ILC'er, som omfatter lymfoide vævsinducerceller og hjælperlignende type-3 ILC'er (ILC3'er), afhængige af transkriptionsfaktoren ROR-γt16 og klynger sig i grupper, der udskiller enten Granulocyt Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), IL-17 eller IL-22 som reaktion på lokale IL-1β- og IL-23-signaler17. Lymfoide vævsinducerceller klynger sig i Peyers patches og er afgørende for udviklingen af disse sekundære lymfoide organer under udvikling18, mens ILC3'er er den mest rigelige ILC-undertype i den voksne murine tyndtarm lamina propria. Et af de tidligste murine intestinale organoide co-kultursystemer med ILC3'er blev udnyttet til at drille virkningen af cytokinet IL-22 på signaltransducer og aktivator af transkription 3 (STAT-3) medieret leucinrig gentagelse indeholdende G-proteinkoblet receptor 5 (Lgr5) + intestinal stamcelleproliferation19, et stærkt eksempel på en regenerativ ILC-epitelinteraktion. ILC'er udviser aftryk-heterogenitet mellem organer20,21 og udviser plasticitet mellem delmængder som reaktion på polariserende cytokiner22. Hvad der driver disse vævsspecifikke aftryk og plasticitetsforskelle, og hvilken rolle de spiller i kroniske sygdomme som IBD23, forbliver spændende emner, der kan behandles ved hjælp af organoide co-kulturer.

Tarmorganoider har vist sig som en vellykket og pålidelig model til at studere tarmepitelet24,25. Disse genereres ved dyrkning af tarmepitel Lgr5+ stamceller eller hele isolerede krypter, som omfatter Paneth-celler som en endogen kilde til Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Disse 3D-strukturer opretholdes enten i syntetiske hydrogeler26 eller i biomaterialer, der efterligner den basale lamina propria, for eksempel Termisk tværbinding basal ekstracellulær matrix (TBEM), og suppleres yderligere med vækstfaktorer, der efterligner den omgivende niche, især epitelvækstfaktor (EGF), knoglemorfogenetisk protein (BMP)-hæmmer Noggin og en Lgr5-ligand og Wnt-agonist R-Spondin127 . Under disse betingelser opretholder organoider epitel-apico-basal polaritet og rekapitulerer krypt-villi-strukturen i tarmepitelet med spirende stamcellekrypter, der terminalt differentierer sig til absorberende og sekretoriske celler i midten af organoidet, som derefter kaster ind i det indre pseudolumen ved anoikis28. Selvom tarmorganoider alene har været enormt fordelagtige som reduktionistiske modeller for epiteludvikling og dynamik isoleret29,30, har de et enormt fremtidigt potentiale for at forstå, hvordan denne adfærd reguleres, påvirkes eller endda forstyrres af immunrummet.

I den følgende protokol beskrives en metode til co-kultur mellem murine tyndtarmsorganoider og lamina propria afledte ILC1'er, som for nylig blev brugt til at identificere, hvordan denne population uventet reducerer intestinale signaturer af inflammation og i stedet bidrager til øget epitelproliferation via TGF-β i dette system8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg skal gennemføres i overensstemmelse med og i overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer for anvendelse af dyr. Etisk godkendelse af undersøgelsen beskrevet i den følgende artikel og video blev erhvervet i overensstemmelse med og i overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer for dyrebrug.

Alle mus blev aflivet ved cervikal dislokation i henhold til den standard etiske procedure, udført af uddannede individer. Før organ- og vævshøst blev der foretaget udskæring af lårbensarterien eller halshugning (alt efter hvad der var relevant for den foreliggende protokol) som bekræftende vurderinger af dødsfaldet. Dyrene blev opstaldet under specifikke patogenfrie forhold (medmindre andet er angivet) på en akkrediteret kommerciel enhed og King's College London dyreenhed i overensstemmelse med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK Home Office Project License (PPL:70/7869 til september 2018; P9720273E fra september 2018).

1. Etablering af murine tyndtarmsorganoider

BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen beskriver dannelsen af tarmorganoider fra tyndtarmen. Krypter isoleres først fra væv, resuspenderes i TBEM og inkuberes derefter med medier, der indeholder EGF, Noggin og R-Spondin (ENR). Etablering af murine tyndtarmsorganoider er også blevet godt beskrevet andetsteds 24,25,27.

  1. Anbring TBEM på is for at tø op (40 μL/brønd), og sæt en standard vævskultur behandlet (refererer til plader med en hydrofil og negativt ladet overflade) 24-brønds plade i en 37 ° C inkubator til forvarmning.
    BEMÆRK: 500 μL TBEM vil tø op i ca. 2-4 timer; Lad det ikke stå ved stuetemperatur.
  2. Forbered ~ 4 ml eller 550 ml pr. Brønd AF ENR-MEDIUM VED AT TILSÆTTE EGF, Noggin og R-Spondin til basalmedium (tabel 1) og læg det i en 37 ° C inkubator.
  3. Cull et 6-12 uger gammelt dyr og disseker tyndtarmen ved hjælp af tang og mikrodissektionssaks. Læg det i 15 ml fosfatbufret saltvand (PBS) på is.
  4. Brug maven og caecum som orienteringspunkter til at isolere det ønskede område af tyndtarmen (tolvfingertarmen, jejunum eller ileum). I denne protokol er ileum isoleret.
  5. Sænk tarmen i PBS på en 10 cm2 petriskål på is. Brug tang til at fjerne fedt forsigtigt, men helt, fra tarmen.
  6. Skær vævet i længderetningen ved hjælp af mikrodissektionssaks (helst med afrundede spidser for at undgå perforering). Holde tarmen nedsænket i PBS, ryste for at fjerne fækalt stof og opretholde slimhindesiden op for at spore vævsorientering.
  7. Overfør væv til det tørre låg på en petriskål på is, og placer tarmslimhinden/villussiden op. Hold den ene ende af tarmen med tang, skrab forsigtigt slim væk ved hjælp af den vinklede kant af et rent glasglas.
  8. Fyld pladen med iskold PBS og skyl vævet.
  9. Fordæk et 50 ml rør med PBS2 (PBS + 2% FCS; se tabel 1) for at forhindre vedhæftning af vævet til plasten og tilsæt 10 ml iskold PBS til dette rør. Skær tarmen i små (~ 2 mm) segmenter og overfør dem til 50 ml røret forbelagt med PBS2.
  10. Ved hjælp af en 25 ml pipette, der er forbelagt med PBS2, pipetterer segmenterne op og ned 5-10 gange for at rense vævsfragmenterne.
  11. Lad segmenterne nøjes i 15-30 s, fjern og kassér PBS-supernatanten, og gentag trin 1,10 og 1,11, indtil opløsningen er klar (ca. 3-4 gange).
  12. Lad segmenterne afregne og kassere PBS-supernatanten. Tilsæt 30 ml iskold kryptisoleringsbuffer (tabel 1).
  13. Anbring rørene på en vandret rulle eller vippe ved 30-60 o / min (eller blid) i 30 minutter ved 4 ° C. Inkubation ikke ved hurtigere hastigheder, højere temperaturer eller længere varighed, da krypterne for tidligt vil løsne sig og blive enkeltceller med lavere levedygtighed og udbytte.
    BEMÆRK: Fra dette stadium og fremefter skal alle procedurer udføres i et aseptisk miljø ved hjælp af sterile materialer og reagenser.
  14. Lad tarmsegmenter slå sig ned ved bunden af 50 ml røret. Fjern kryptisoleringsbuffer uden at forstyrre de bundfældede segmenter, og overfør den til et 50 ml rør på is.
    BEMÆRK: Hvis kryptisoleringsprocessen var for streng, kan krypter ses i denne brøkdel. Det kan derfor opbevares som en reserve, men vil optimalt blive kasseret i slutningen af protokollen.
  15. Tilsæt 20 ml iskold PBS til tarmsegmenter. Ved hjælp af en 25 ml pipette, der er forbelagt med PBS2, pipette tarmsegmenter op og ned 5-8 gange.
  16. Lad segmenterne nøjes med 30 s. Forbetræk et 50 ml rør og 25 ml pipette med PBS2. Brug denne pipette til at samle supernatanten (fraktion 1) i det forbelagte 50 ml rør og læg røret på is.
    BEMÆRK: Denne fraktion tjener til at skylle den resterende kryptisoleringsbuffer væk. Det fungerer dog også som et ekstra kvalitetskontroltrin; hvis pipettering var for kraftig, vil krypter være rigelige i denne skyllefraktion, og hvis den var for blid, vil der være meget lidt snavs i denne fraktion. Optimalt kasseres fraktion 1 i slutningen af protokollen, men den kan bruges til at fremstille organoider, hvis der opstår problemer med fraktioner 2-4 opnået nedenfor.
  17. Gentag trin 1,15 og 1,16, men tilsæt 10 ml iskold PBS i stedet for 20 ml, og anbring supernatanten i et frisk 50 ml rør, der er forbelagt med PBS2 (fraktion 2).
  18. Gentag trin 1.17 to gange mere, men pool den resulterende supernatant med fraktion 2 (i det samme 50 ml rør fra trin 1.17) for at opnå fraktioner 2-4. Dette enkelte 50 ml rør skal indeholde de løsrevne krypter i 30 ml iskold PBS.
  19. Fjern en 50 μL alikvote fra de samlede 2-4 fraktioner og læg den på et dækslip. Vurder for tilstedeværelsen af epitelkrypter ved hjælp af et omvendt lysmikroskop.
    BEMÆRK: Hvis krypter ikke er til stede, skal du gentage trin 1.17 og 1.18 ved hjælp af mere kraft under pipettering, indtil krypter frigives. Sørg for, at krypter ikke blev fjernet for tidligt i kryptisoleringsbufferen fra trin 1.14 eller i fraktion 1 fra trin 1.16.
  20. Forbetræk en 100 μm sil og 50 ml rør med PBS2. Før de samlede kryptfraktioner gennem denne sil og ind i det forbelagte 50 ml rør.
  21. Spin ned anstrengte kryptfraktioner ved 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
  22. Kassér supernatanten, og genophænd krypterne i 10 ml iskold Advanced DMEM/F12. Flyt krypterne til et 15 ml rør.
  23. Spin ned krypter ved 210 x g i 5 minutter ved 4 ° C for at fjerne enkeltceller og lymfocytter.
  24. Resuspend krypter i 1 ml iskold Avanceret DMEM / F12.
  25. Fjern en 10 μL alikvote og læg den på en dækseddel. Brug et omvendt lysmikroskop til at tælle antallet af krypter for at bestemme kryptkoncentrationen.
  26. Beregn det volumen, der kræves for ~ 400 og ~ 1.500 krypter. Forbetræk en p1000-spids med PBS2, og brug denne spids til at pipette de krævede mængder (indeholdende ~ 400 og ~ 1.500 krypter) i separate 1,5 ml rør.
  27. Spin ned krypterne ved 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
  28. Fjern så meget supernatant som muligt, og krypterne skal derefter suspenderes igen i 80 μL TBEM, der er anbragt på is (forkølede pipettespidser ved 4 °C for at forhindre matrixgelering, som forekommer ved 12 °C).
  29. Fjern 24-brøndpladen, placeret i trin 1.1, fra inkubatoren. Rør forsigtigt 40 μL krypter ind i midten af en brønd i en langsom, cirkulær bevægelse for at danne en flad, men 3D-kuppelstruktur eller i tre separate små kupler.
    BEMÆRK: Organoidernes levedygtighed er den laveste i midten af kuplen, hvor næringsstoffer og gasser gennemsyrer mindre effektivt31; således er det afgørende at maksimere overfladearealet udsat for medier, samtidig med at der opretholdes klare 3D-strukturer.
  30. Gentag trin 1.29 for at oprette i alt to brønde med en tæthed på ~ 200 krypter pr. Brønd og yderligere to brønde med en tæthed på ~ 750 krypter pr. Brønd. Anbring pladen direkte i en inkubator (37 °C og 5 % CO2) i 15-20 minutter, og pas på ikke at forstyrre de tyktflydende, men stadig flydende matrixkupler.
  31. Tilsæt 550 μL forvarmede ENR-medier pr. brønd (fra trin 1.2) og inkuber i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2. På dette stadium foreslås det at supplere ENR-medium med 5 μM Wnt-agonist (CHIR 99021) og 5 μM Rho Kinase-hæmmer (Y-27632) i de første 24 timers kultur efter isolering for at forbedre udbyttet og effektiviteten af organoidgenerering af krypter, der er frisk isoleret fra væv.
    BEMÆRK: Krypter skal være tæt på at danne afrundede strukturer inden for 24 timer, og kryptknopper skal vises inden for 2-4 dage (figur 1A).
  32. Udskift med frisk ENR-medium i slutningen af inkubationen i trin 1.31 og derefter hver ~ 2. dag, eller når phenol pH-indikatoren i kulturmediet bliver lys orange, men før den bliver gul.

2. Vedligeholdelse af murine tyndtarmsorganoider

BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen beskriver vedligeholdelse og passering af murine tyndtarmsorganoider. Organoider høstes først og forstyrres derefter mekanisk ved hjælp af en bøjet p1000-spids. Denne proces bryder store organoider bestående af talrige krypter i flere mindre fragmenter til ekspansion og frigiver døde celler, der er akkumuleret i pseudolumen. Murine tyndtarmsorganoid vedligeholdelse er også blevet godt beskrevet andetsteds 24,25,27. Alle procedurer skal udføres i et aseptisk miljø ved hjælp af sterile materialer og reagenser. Passage eller udvide organoider en gang hver 4-5 dage, før sprængning af organoiderne sker fra betydelig ophobning af snavs i organoid lumen. Organoider kan passeres i et forhold på 1:2-1:3 afhængigt af organoiddensiteten, hvilket optimalt vil være mellem 100-200 organoider pr. Brønd.

  1. Som i trin 1.1 og 1.2 optøes TBEM på is (40 μL/brønd) og enr-medium (550 μL pr. brønd). Den mellemstore og standard vævskulturbehandlede 24-brønds plade anbrings i en 37 °C inkubator.
  2. Fjern pladen indeholdende organoider fra inkubatoren. Kassér medierne fra brønden, der skal passeres.
  3. Tilsæt 500 μL iskold Advanced DMEM/F12 til brønden. Brug en p1000-spids (forbelagt med medier for at undgå, at organoid klæber til spidsens indre), høst organoiderne i et 15 ml rør.
  4. Skyl bunden af brønden med 250-300 μL iskold Advanced DMEM/F12, der sikrer, at der ikke er nogen organoider tilbage i brønden, og pool i 15 ml-røret, der indeholder høstede organoider fra trin 2.3. Gentag trin 2.3 og 2.4, når du passerer flere brønde, og pool organoiderne fra flere brønde i det samme 15 ml rør.
  5. Spin ned organoider ved 300 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
  6. Ved centrifugering skal du sikre dig, at der er fire synlige fraktioner: en basisfraktion med sunde organoider, en central og klar matrixfraktion, en matrixfraktion indeholdende enkelt- og døde celler og et øvre supernatantlag indeholdende enkelt- og døde celler. Fjern supernatanten, snavsfraktionen og så meget af det klare matrixfragment som muligt uden at forstyrre pellet af organoider.
  7. Bøj forsigtigt spidsen af en p1000 pipettespids (ca. 2-5 mm bøjning). Forbetræk dette tip i PBS2 eller Advanced DMEM/F12. Ved hjælp af dette tip pipetter organoiderne op og ned 10-20 gange for mekanisk at forstyrre organoiderne og den resterende matrix.
  8. Spin ned ved 210 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  9. Som i trin 2.6 skal du fjerne supernatanten, affaldsfraktionen og så meget af det klare matrixfragment som muligt uden at forstyrre pelleten af dissocierede krypter. Hvis sunde krypter eller små organoider ikke har dannet en klar pellet, centrifugeres igen ved 300 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
  10. Beregn det krævede volumen TBEM (80-120 μL pr. Brønd høstede organoider afhængigt af om der anvendes et passageforhold på 1:2 eller 1:3).
  11. Resuspend pelleten i det beregnede volumen af TBEM og påfør 40 μL pr. Brønd på den forvarmede 24-brønds plade for at danne en kuppel. Anbring pladen direkte i inkubatoren (37 °C; 5 % CO2) i 15-20 minutter.
  12. Der tilsættes 550 μL ENR-medium pr. brønd, og der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2. Kontroller kulturer for organoiddannelse efter 24 timer. Udskift med frisk ENR-medium hver 2-3 dage efter passage.

3. Isolering af tyndtarmslamina propria medfødte lymfoide celler

BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen beskriver isoleringen af ILC1 fra murine tyndtarm lamina propria af RORγtGFP reporter mus. Dette involverer fjernelse af epitelceller, vævsfordøjelse, densitetsgradientseparation af lymfocytter og ILC1-isolering via fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). FACS-isolering efter gating-strategien i figur 2 kræver den ekstracellulære farvningsmastermix (tabel 4) med de yderligere farvningskontroller, der er beskrevet i tabel 2 og tabel 3 for maskinen (tabel 2) og gating (tabel 3), der er oprettet. RORγtGFP-reportermusene bruges til at isolere levende, ren ILC1 og gate out RORγtGFP+ ILC3. Vævsbehandling til isolering af lamina propria lymfocytter er også velbeskrevet andetsteds32.

  1. Vævsbehandling
    BEMÆRK: Væv fra individuelle biologiske dyrereplikater holdes adskilt i denne protokol. Disse prøver bør mærkes på passende vis og opbevares på is, når det er muligt. Alle reagenser undtagen fordøjelsesenzymer bør have lov til at nå stuetemperatur for at sikre hurtig vævsfordøjelse.
    1. Læg TBEM på is for at tø op (40 μL/brønd). Opbevar en standard vævskultur behandlet 24-brønds plade i en 37 ° C inkubator til forvarm.
    2. Forbered frisk epitelfjernelsesbuffer og fordøjelsesbuffer (se tabel 1). Forbered isotonisk gradientmedium med lav viskositet (LVDGM) (90% LVDGM og 10% 10x PBS), 40% isotonisk LVDGM og 80% isotonisk LVDGM i neutraliserende buffer (tabel 1).
    3. Cull et 6-12 uger gammelt dyr, disseker tyndtarmen ved hjælp af tang og mikrodissektionssaks, og læg tarmen i 15 ml PBS på is.
    4. Nedsænk tarmen i PBS på en 10 cm2 petriskål på is og brug tang til at fjerne fedt forsigtigt, men helt fra tarmen.
    5. Fjern Peyers patches (~ 5-10; kører i en linje modsat fedtvævslinjen) ved hjælp af mikrodissektionssaks til at nedbryde lymfoide vævsinducerceller og B-celler.
      BEMÆRK: Peyers pletter er fraværende i Rag-/- og andre slægtsudtømte dyr. I modsætning til luftbobler forbliver Peyers patches på plads, hvis de skubbes.
    6. Skær vævet i længderetningen ved hjælp af mikrodissektionssaks (helst med afrundede spidser for at undgå perforering). Hold tarmen nedsænket i PBS, ryst for at fjerne fækalt stof.
    7. Skær vævet i 2-4 cm lange stykker og overfør dem til et 50 ml rør.
    8. Tilsæt ca. 20-40 ml iskold PBS og ryst kraftigt i 5-15 s for at fjerne slim og snavs.
    9. Kassér indholdet af røret på en frisk petriskål og udskift tarmfragmenter i det samme 50 ml rør ved hjælp af tang.
    10. Gentag trin 3.1.8 og 3.1.9 3-4 gange, eller indtil PBS er klar.
  2. Fjernelse af epitel
    1. Læg tarmfragmenter i en frisk petriskål på is. Brug tang til at afhente tarmsegmenter og fjerne overskydende væske ved at tappe på en tør overflade.
    2. Skær vævet i ~ 0,75-1 cm stykker og overfør dem til et nyt 50 ml rør. Tilsæt 5-7 ml epitelfjernelsesbuffer (tabel 1). Hvirvel røret og sørg for, at alle tarmsegmenterne er nedsænket i bufferen.
    3. Inkuber prøverne ved 37 °C med gyngen (100-150 o/min.) i 12-15 min. Vortex røret i 20-30 s.
    4. Gentag trin 3.2.1-3.2.3 endnu en gang, kassér det overskyede supernatant (fraktion indeholder epitel- og intraepitelceller) og erstat det med frisk epitelfjernelsesbuffer.
  3. Fordøjelse af vævet
    1. Tip indholdet på en frisk petriskål. Brug tang til at samle tarmsegmenterne op og trykke på en tør overflade for at kassere overskydende væske. Læg segmenterne i en frisk petriskål på is.
    2. Klynge segmenterne i midten af petriskålen i en tæt masse. Brug enten to skalpeller eller skarpe sakse til at makulere vævet fint, indtil det når en viskøs konsistens, der kan passere gennem en p1000 pipettespids.
    3. Brug pincet til at placere hakket væv i et rent 50 ml rør. Skyl petriskålen med 1-2 ml fordøjelsesbuffer (tabel 1) for at samle eventuelt resterende væv og samle det i 50 ml røret med det strimlede væv.
    4. Tilsæt 5-7 ml fordøjelsesbuffer til det strimlede væv og sørg for, at alt væv opsamles i bunden af røret.
    5. Inkuber prøverne ved 37 ° C med medium rocking (~ 100-150 o / min) i 15 minutter. Vortex røret i 20-30 s hvert 5. minut for at hjælpe fordøjelsen.
    6. Mens prøverne inkuberer, anbringes en 40 μm cellesil oven på et frisk 50 ml rør for hver prøve. Belæg filtrene med 1-2 ml neutraliserende buffer (tabel 1).
    7. Vortex prøverne i 20-30 s efter inkubationen er afsluttet.
    8. Det delvist fordøjede væv filtreres gennem det overtrukne 40 μm-filter i det 50 ml rør, der indeholder neutraliserende buffer.
    9. Brug pincet til at opsamle ufordøjet væv fra 40 μm filteret og læg det tilbage i 50 ml røret, som fordøjelsen blev udført i, til anden fordøjelsesrunde. Fjern filtre og skyl dem med fordøjelsesbuffer for at løsne ufordøjet væv, der klæber til filteret.
    10. Når så meget ufordøjet væv som muligt er fjernet fra filteret og anbragt tilbage i det 50 ml rør, som fordøjelsen blev udført i, skylles filteret med 1-2 ml neutraliserende buffer over 50 ml røret, der indeholder det filtrerede supernatant.
    11. Tilsæt 20-25 ml neutraliserende buffer til det filtrerede supernatant og læg det på is for at opretholde levedygtigheden af isolerede celler under anden runde af vævsfordøjelsen.
    12. Tilsæt yderligere 5-10 ml fordøjelsesbuffer til det ufordøjede væv, og gentag trin 3.3.5-3.3.10, og sørg for at filtrere det fordøjede væv i det samme rør som anvendt i trin 3.3.8 (det samme filter kan også genbruges). Skyl filteret med neutraliserende buffer, indtil 50 ml-linjen er nået, og kassér derefter eventuelt resterende ufordøjet væv.
  4. Lymfocytisolering ved densitetsgradient
    1. Spin de indsamlede supernatanter for hver biologisk replikat ved 500 x g i 10 minutter.
    2. Under trin 3.4.1 tilsættes 5 ml 80% isotonisk LVDGM til et 15 ml rør for hver biologisk replikat.
    3. Efter centrifugering kasseres supernatanten fra det filtrerede, fordøjede væv. Resuspend pellet i 10 ml 40% isotonisk LVDGM, hvilket sikrer, at pelleten er godt homogeniseret, og der ikke er store klumper tilbage.
    4. Indstilling af pipettehjælpen til den langsomste indstilling, vip 15 ml-røret, der indeholder 80% isotonisk LVDGM, og overlejr meget forsigtigt 10 ml cellesuspension i 40% isotonisk LVDGM, hvilket sikrer, at cellesuspensionen ikke blandes med 80% fraktionen.
      BEMÆRK: Hvis fraktionerne nogensinde skulle blande sig ved et uheld, skal du hurtigt fordele lymfocytter, der nåede 80% fraktionen mellem to 50 ml rør fyldt med PBS og centrifuge i 10 minutter ved 500 x g. Kassér derefter supernatanten, og gentag trin 3.4.3-3.4.4.
    5. Rør rørene drejes ved 900 x g og 20 °C, og accelerationen og deaccelerationen er indstillet til den laveste indstilling for at sikre, at fraktionerne ikke forstyrres. Centrifuge i 20 minutter (ikke inklusive pausetid).
      BEMÆRK: Alle procedurer fra dette trin og fremefter skal udføres i en aseptisk vævskulturhætte ved hjælp af sterile materialer og reagenser.
    6. Forbetræk et 50 ml rør til hver prøve med PBS2 og tilsæt 45 ml iskold PBS.
    7. Efter centrifugering skal du forsigtigt fjerne det øverste snavslag fra 15 ml-røret. Coat en p1000-spids med PBS2 og brug den til at opsamle den lymfocytbelastede interfase mellem 40%-80% gradienterne i 50 ml-røret, der indeholder 45 ml iskold PBS.
    8. Rør rørene drejes ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    9. Kassér supernatanten, og brug pillen igen i 500 μL FACS-buffer (PBS, 2 % FCS, 0,5 mM EDTA og 10 mM HEPES; se tabel 1). Forbetræk et 40 μm filter med FACS-buffer, og brug det til at filtrere cellesuspensionen i et flowrør. Skyl 50 ml røret med yderligere 500 μL FACS-buffer og filtrer i det samme flowrør.
    10. Fjern en 10 μL alikvote fra den resulterende 1 ml cellesuspension. Tæl lymfocytudbyttet ved hjælp af en celletæller eller hæmocytometer, og beregn cellekoncentrationen for hver prøve.
  5. Prøveforberedelse til sortering - ekstracellulær farvning
    BEMÆRK: Antistofferne, der anvendes i den ekstracellulære farvningsmastermix, samt reagenserne til fremstilling af det fikserbare levedygtighedsfarvestof og Fc-blokopløsningen anvendes i koncentrationer, der er tilstrækkelige til op til 5 x 106 celler pr. 100 μL. Volumener bør justeres i overensstemmelse hermed. For at FACS-maskinkompensation kan sortere ILC1, kræves enfarvede kontroller for hver af fluoroforerne i den ekstracellulære farvningsmastermix. Til antistofferne kan der anvendes kompensationsperler, der indeholder en positiv antistofbindende perlepopulation og en negativ antistof-ikke-bindende perlepopulation. Til ultraviolet (UV) fixerbar levedygtighed farvestof enkelt farvekontrol kan kompensationsperler, der indeholder amin-reaktive (for positivt signal) og ikke-reaktive (for negativt signal) populationer anvendes. Det anbefales ikke at bruge celler fra RORγtGFPreportermus til UV-fixerbar levedygtighed farvestof enkelt farvekontrol, da disse celler vil indeholde en GFP+ signal.
    1. Fjern en lille alikvote på ~ 10 μL fra hver prøve, og pool den i et separat flowrør indeholdende 250 μL FACS-buffer. Placer røret på is. Dette vil blive brugt til den ikke-tilbageholdte kontrol.
    2. Der tilsættes 1 ml PBS til det resterende volumen i prøverørene. Centrifuge ved 300-400 x g i 3-5 min.
    3. Forbered 200 μL UV-fikserbar levedygtighedsfarvestofopløsning pr. Prøve. Fortynd UV-fixerbart levedygtighedsfarvestof (resuspended i DMSO efter producentens anvisninger) 1:500 i PBS (eller efter producentens anvisninger).
    4. Kassér supernatanten, og genophæng prøverne i 200 μL UV-fixerbar levedygtighedsfarvestofopløsning. Hvirvelrørene og inkuber i mørke ved 4 °C i 10-15 min.
    5. Tilsæt 2 ml FACS-buffer til rørene for at slukke det UV-fikserbare levedygtighedsfarvestof, hvirvel i 10 s, og centrifuger rørene ved 300-400 x g i 3-5 minutter ved 4 ° C. Kassér supernatanten fra de centrifugerede rør.
    6. Der fremstilles 200 μL Fc-blokopløsning pr. prøve (0,25 mg/ml Fc-blok i FACS-bufferen).
    7. Der tilsættes 200 μL Fc-blokopløsning til hver af prøverne fra trin 3.5.5, hvirvel i 10 s, og der inkuberes i mørke ved 4 °C i 10 minutter.
    8. Tilsæt 500 μL FACS-buffer til et nyt flowrør. Fjern en 2-5 μL alikvote fra hver prøve, og pool den i røret til fluorescens minus en (FMO) kontrol.
    9. Vortex FMO-røret i 10 s og fordel jævnt (100 μL pr. Rør) i friske flowrør mærket for hver af FMO-kontrollerne (Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO og NK1.1 FMO; se tabel 3). Tilsæt alle antistoffer undtagen det antistof, der er af interesse for hvert rør (som beskrevet i tabel 3) og hvirvel i 10 s. Placer FMO-kontrollerne til side i mørke ved 4 ° C.
    10. Centrifugering af prøverne (ikke FMO-kontroller) ved 300-400 x g i 3-5 minutter ved 4 °C.
    11. Ekstracellulær farvning mastermix (200 μL pr. prøve) forberedes med de endelige antistoffortyndinger som beskrevet i tabel 4. Juster farvningsvolumenet for den passende cellekoncentration (op til 5 x 106 celler pr. 100 μL) afhængigt af celletællingerne fra trin 3.4.10.
    12. Tilsæt ekstracellulær farvning mastermix til prøverne, hvirvel i 10 s, og læg dem til side i mørket ved 4 ° C.
    13. Forbered en frisk enkelt farvekontrol for hvert antistof, der er beregnet til at blive anvendt i gating-strategien (figur 2). Vortex-antistofkompensationsperler til 20 s, tilsæt 1 dråbe perler til et flowrør, plet med 0,5 μL antistof (som vist i tabel 2 eller efter producentens anvisninger) og hvirvel i 10 s.
    14. Forbered et UV-fikserbart levedygtighedsfarvestof enkelt farvekontrol ved hjælp af et amin-reaktivt kompensationsperlesæt. Vortex amin-reaktive kompensationsperler til 20 s, tilsæt 1 μL levende / dødt UV-farvestof (som vist i tabel 2 eller efter producentens anvisninger) og hvirvel i 10 s.
    15. Inkuber prøverne, FMO'erne og enkeltfarvekontrollerne i mørke i 30 minutter ved 4 ° C.
    16. I løbet af denne tid skal du forberede rør til at indsamle de sorterede celler. Tilsæt 400-500 μL 10% FBS i Advanced DMEM/F12 til 1,5 ml rør for hver prøve.
    17. Efter inkubationen tilsættes 2 ml PBS2 til hver af prøverne, FMO-kontrollerne og enkeltfarvekontrollerne.
    18. Centrifugering af prøverne, FMO-kontroller og enkeltfarvekontroller ved 300-400 x g i 3-5 minutter ved 4 ° C.
    19. Kassér supernatanten fra alle de centrifugerede rør. Resuspend prøverne og FMO-kontrollerne i 250 μL FACS-buffer og hvirvel i 10 s.
    20. Genophæv de enkelte farvekontroller i 250 μL PBS2. Tilsæt kun 1 dråbe amin ikke-reaktive perler til UV-fikserbar levedygtighed farvestof enkelt farvekontrol. Vortex alle kontroller i 10 s.
    21. Cellerne er nu klar til at blive sorteret. Opbevar prøver, FMO-kontroller og enkeltfarvekontroller på is i mørke, når det er muligt for at forbedre cellens levedygtighed og forhindre tab af signal fra fotoblegning.

4. Samkultur af tyndtarmsorganoider med medfødte lymfoide celler

BEMÆRK: I dette afsnit beskrives samkulturen af sorteret murine tyndtarm ILC1 (isoleret efter protokollen i punkt 3) med murine tyndtarmsorganoider (beskrevet i afsnit 1 og 2). Organoider bør optimalt anvendes 1-2 dage efter passage. Samkultur indebærer høst af organoiderne, tilsætning af det passende antal ILC1, centrifugering til pelletsorganoider og ILC1 sammen og genoplivning i TBEM. Udfyld dette afsnit så hurtigt som muligt, når ILC1 er blevet isoleret. Alle procedurer skal udføres i et aseptisk miljø ved hjælp af sterile materialer og reagenser.

  1. Sørg for, at TBEM fra trin 3.1.1 er optøet.
  2. Høst 1-2 dage gamle organoider som beskrevet i trin 2.3 og 2.4.
  3. Resuspend organoid pellet i 1 ml kold iskold Advanced DMEM / F12. Bøj ikke p1000-spidsen som gjort, når du passerer organoiderne, da hensigten her er at opretholde organoidstrukturen til samkultur. Om nødvendigt anbringes organoiderne i separate PBS2-belagte 1,5 ml-rør på is i en kort periode, der skal fordeles mellem forskellige samkulturforhold.
    BEMÆRK: Begynd først at forberede organoider, når ILC-prøver er klar til samkultur; arbejde på is og hurtigt, så snart organoider er høstet for at minimere epitelcelledød.
  4. Pre-coat et 1,5 ml rør med PBS2 pr. ILC replikat prøve. Fordel ~ 100-200 organoider (ca. 1 brønd af en 24-brønds plade) i hvert rør.
  5. Forbetræk en p1000-spids i PBS2, og brug den til at vurdere volumenet af ILC1'er efter FACS-rensning (250-300 μL + sorteret volumen). Bestem koncentrationen af ILC1 pr. ml ved hjælp af antallet af celler, der er registreret fra sorteringen, og bestem det krævede volumen.
  6. Brug den samme PBS2-belagte p1000-spids til at tilføje ikke færre end 500 ILC1'er til det PBS2-belagte 1,5 ml-rør, der indeholder organoiderne. Hvis antallet af ILC1'er, der er givet fra sorteringen, er mindre end 500, tilsættes organoiden direkte til røret, der indeholder den oprindelige sort for at minimere tabet af celler fra overførslen.
  7. Spin ned ILC1 og organoider ved 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Hvis det er muligt, undgå bordpladecentrifuger med lille diameter, da disse vil samle cellerne langs kanten af rørets indre i modsætning til at skabe en pellet ved spidsen af røret. Da cellenumre er meget lave, er det bydende nødvendigt at minimere tabet af celler under disse trin.
  8. Fjern langsomt og forsigtigt så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre pelleten (som muligvis ikke er synlig for øjet, især i ikke-organoid ILC-eneste kontroller). Læg prøven på is.
  9. Resuspend den kolde pellet i 30 μL pr. Brønd af TBEM. Mens du holder røret på en kold overflade (f.eks. En lille æske is placeret i vævskulturhætten), blandes organoiderne og ILC mindst 10-15 gange for at sikre en jævn fordeling. Triturere ofte, men forsigtigt, for at undgå at beskadige organoiderne og dannelsen af bobler.
  10. Påfør 30 μL pr. brønd ILC-organoider i TBEM på en forvarmet plade med 24 eller 48 brønde for at danne en enkelt kuppel. Anbring pladen direkte i inkubatoren (37 °C og 5 % CO2) i 10-20 minutter.
    BEMÆRK: Det anbefales kraftigt, at der oprettes kontroller, der kun er ILC og kun organoider, til downstream-analyse. ILC1 er sjældne, men GFP-ILC2 kan erstattes af immunofluorescens eller FSC/SSC-flowcytometrikontroller, hvor det er videnskabeligt hensigtsmæssigt.
  11. Der tilsættes 550 μL (pr. brønd) komplet ILC1-medium (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoethanol; se tabel 1) med eventuelle ønskede eksperimentelle cytokiner eller blokerende antistoffer og inkuberes ved 37 °C og 5 %CO2 i 24 timer.
  12. Efter 24 timer skal du forsigtigt fjerne pladen fra inkubatoren og lade pladen sidde i en vævskulturhætte i 1 minut for at sikre, at lymfocytterne er afgjort.
  13. Fjern 200-250 μL medier og læg det i en tom brønd på en 24-brønds plade. Kontroller denne supernatant med et omvendt mikroskop for at sikre, at ingen lymfocytter blev fjernet.
    1. Hvis supernatanten er klar, tilsættes 300 μL frisk ILC1-medium til samkulturen i den oprindelige brønd. Hvis lymfocytter er til stede i supernatanten, centrifugeres ved 300-400 x g i 3-5 minutter ved 4 °C og resuspendres i 300 μL frisk ILC1-medium og tilsættes dette til de resterende 200-250 μL medier i den oprindelige brønd. Sørg for at genopfylde medier hver 1-2 dag, eller når medier bliver blegorange/gule.
      BEMÆRK: Lad ikke medier fordampe tilstrækkeligt til, at spidsen af matrixkuplen bryder mediets overflade. Sørg altid for, at matrixen er helt nedsænket. Overskydende fordampning kan undgås ved at anvende centrale brønde i vævskulturpladerne og tilføje ~ 600 μL PBS til de omgivende brønde. Samkulturer med voksen ILC er stabile i 1-4 dage, hvorefter de organoider, der blev podet uden større forstyrrelser, vil briste og reseed som nye krypter. Ved analyse af epitelet anbefales det, at kulturer analyseres inden for 1-4 dage efter etablering af co-kulturer.
    2. Udføre downstream-analyse ved hjælp af immunofluorescens, flowcytometri eller FACS-oprensning af målpopulationer til lysisbuffer til genekspressionsanalyse ved hjælp af enkeltcelle- eller bulk-RNA-seq eller RT-qPCR som beskrevet i reference8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når det er afsluttet, skal friskisolerede krypter danne spirende kryptstrukturer inden for 2-4 dage (figur 1A). Sunde og robuste organoidkulturer bør vokse aktivt og kan passeres og udvides som beskrevet i protokollen.

Denne protokol beskriver isoleringen af tyndtarm ILC1 fra RORγtGFP murine transgen reporterlinje, som tillader isolering af levende ILC1 af FACS (figur 2). Ved hjælp af den protokol, der er skitseret her, er det forventede ILC1-tælleområde 350-3.500 isolerede celler.

Efter at være blevet podet med organoider kan co-kulturer visualiseres ved immunocytokemi (figur 3A-B). ILC'er og epitelceller kan også analyseres ved flowcytometri, som vist i figur 3C. ILC1 opregulerer epitel-CD44, som karakteriseret ved flowcytometri (figur 4A-B) og immunocytokemi (figur 4C). Specifikt inducerer ILC1 ekspression af CD44 v6 splejsningsvarianten i organoider, som demonstreret ved RT-qPCR (figur 4D).

Tabel 1: Medie- og buffersammensætninger. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Enkeltfarvekontroller. Sammensætning af enkeltfarvekontroller til isolering af tyndtarm lamina propria ILC1 ved hjælp af gating-strategien defineret i figur 2. Detaljer om anvendte antistoffer findes i materialetabellen. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Fluorescens minus en (FMO) mastermixes. Sammensætning af FMO mastermixes til Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO og NK1.1 FMO. FMO-masterblandinger indeholder alle de anvendte antistoffer undtagen det antistof, der er af interesse, og bruges til at plette en prøvealikvote. Afstamningscocktail er defineret som CD19, CD3e, CD5, Ly-6G / Ly-6C. Detaljer om anvendte antistoffer findes i materialetabellen. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Ekstracellulær farvning mastermix. Koncentrationerne justeres for farvning af op til 5 x 106 celler i 200 μL FACS-buffer. Detaljer om anvendte antistoffer findes i materialetabellen. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 1
Figur 1: Murine tyndtarmsorganoider. Repræsentativt billede af (A) med succes genererede tyndtarmsorganoider 2-3 dage efter passage og (B) mislykket kultur. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Gating-strategi til isolering af ILC1'er fra tyndtarmslaminaproprien hos de transgene RORγtGFP-reportermus . Repræsentativt flowcytometrisk plot af ILC1-isolering fra tyndtarmen lamina propria af de transgene RORγtGFP reporter mus af FACS. ILC1'er defineres som live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ og NK1.1+. Repræsentant fra N = >50 mus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Organoid- og ILC1-samkulturer. Lysfeltbilleder (A), konfokalmikroskopibilleder (B) og FACS-plots (C) af tyndtarmsorganoider (SIO) dyrket alene (øverst) eller med ILC1'er (nederst) (repræsentative for forsøg med ILC1'er fra N = 3 mus). (B) Farvning med CD45 illustrerer ILC1'er og Zonula occludens protein 1 (ZO-1) markerer epitelceller i organoider. Skalastænger: 50 μm. (C) Tidligere gated på enkelte, levende celler. Epitelcellulært adhæsionsmolekyle (EpCAM) markerer tarmepitelceller (IEC) i organoider og CD45 markerer ILC1'er. Figuren er tilpasset fra reference8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: ILC1'er i co-kultur med tyndtarmsorganoider driver opregulering af CD44 i intestinale epitelceller. (A) Et repræsentativt cytometrisk plot af CD44-ekspression i epitelcellulært adhæsionsmolekyle (EpCAM) positive epitelceller (levende, CD45-, EpCAM+) fra tyndtarmsorganoider (SIO) dyrket alene (venstre) eller med ILC1'er i 4 dage (højre). (B) Flowkvantificering af CD44-ekspression i tarmepitelceller (IEC) (ILC1'er fra N = 5 mus). (C) Repræsentativt konfokalmikroskopibillede af CD44-lokalisering i d4 SIO alene (venstre) eller samvokset med ILC1'er (højre) (repræsentativ for N = 3 mus). Skalabjælker: 50 μm. (D) RT-qPCR med exon-specifikke primere til CD44-splejsningsvarianter v4 og v6 (N = 3). Dette tal er tilpasset fra reference8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver metoderne til etablering af murine tyndtarmsorganoider, isolering af sjældne ILC1 ved at minimere tabet af lymfocytter under tarmsociationsprotokollen og etablere co-kulturer mellem disse to rum. Der er mange trin i denne protokol, og mens nogle er specifikke for ILC1'er, kan denne tilgang anvendes på andre intestinale immuncelletyper, og co-kulturopsætninger kan modulært tilpasses til individuelle forskningsspørgsmål. Flere kritiske trin (som anbefales ikke at afvige fra) samt fejlfindingsretningslinjer for de mere teknisk udfordrende elementer i denne protokol fremhæves her.

Brugen af murine tyndtarmsorganoider fra enkelte Lgr5+-eGFP-tarmstamceller bliver stadig mere veletableret33,34; I denne protokol foreslås det imidlertid at isolere intakte, hele krypter af Lieberkuehn fra CD45.1 dyr. Ikke alene genopretter intakte krypter hurtigere end enkelte Lgr5+ celler, men brugen af CD45.1 dyr uden en GFP-reporter sikrer, at ingen krydsforurenende CD45.2+ ILC analyseres fra de organoide co-kulturer og er kompatibel med brugen af immunceller, der indeholder en GFP-baseret reporter. Efter forfatternes erfaring overføres ingen mesenkymale eller immunceller efter 1-3 passager af organoiderne. Anvendelsen af CD45.2 eller andre dyr til etablering af organoider er derfor fuldt ud acceptabel. Under organoid etablering, hvis krypter ikke er til stede på trin 1.1.19, kan strengere manuel rystelse være nødvendig for at løsne de intakte krypter. Miljøfaktorer såsom omgivende stuetemperatur (f.eks. om proceduren udføres om sommeren eller vinteren) kan tilføje en vis variation i inkubationstidspunktet under dissociation. Såningstætheden af krypter vil påvirke det indledende organoiddannelsesudbytte; det anbefales derfor at så mindst to forskellige tætheder for at sikre succes (f.eks. 200-750 foreslået her, men dette interval kan tilpasses ud fra individuelle behov).

Når de er etableret, er tarmorganoidkulturer heterogene både mellem linjer etableret fra den samme musestamme, langs mave-tarmkanalen (f.eks. Tolvfingertarmen versus ileum) og endda inden for samme brønd af organoidkulturer35,36. Selvom denne protokol viste sig at være robust over mange forskellige partier organoider, kunne denne heterogenitet bidrage til datavariabilitet. Det er god praksis at være i overensstemmelse med organoidvedligeholdelse (passaging og medieændringer) for at reducere teknisk støj fra fænotypisk irrelevante data. Dette inkluderer at være i overensstemmelse med tidslinjen for præ-seedning passaging og med den kraft, der bruges til at dissociere organoider. Det anbefales også at anvende den samme basalmatrix til forsøg, der sammenlignes, og til forsøg, der skal udføres ved hjælp af biologiske replikater af organoider afledt af forskellige dyr (når det er økonomisk og teknisk muligt) for at sikre, at resultaterne er solidt reproducerbare.

Ved etablering af co-kulturer er forholdet mellem immun- og epitelceller en kritisk overvejelse, der vil kræve optimering baseret på forskningsspørgsmålene. Hvis epitelcellernes indvirkning på ILC undersøges, skal antallet af organoider, der podes, være tilstrækkeligt til at mætte al ILC. Omvendt, når man vurderer ILC's indvirkning på epitelet, kan forskellige ILC / epitelforhold resultere i forskellige fænotypiske output, hvilket afspejler differentielle tilstande af ILC-delmængdeberigelse i slimhinden. ILC1 levedygtighed er godt vedligeholdt i kultur, og befolkningen vil gennemgå en mild ekspansion, med ~ 500 ILC1 og 100 tyndtarmsorganoider (SIO), der gennemgår en 2-3 gange ekspansion i gennemsnit. Dette udbytte vil dog blive påvirket af yderligere behandlinger, hvor TGF-neutralisering forbedres og p38-hæmning reducerer det absolutte antal ILC1 efter co-kultur8. Ethvert uventet tab på mere end 50 % af de podede ILC1-numre kan være resultatet af enten et ubalanceret forhold mellem ILC1 og SIO (øge antallet af podede krypter), SIO-kontaminering (sørg for, at antibiotikacocktailen fungerer, og test supernatanten for mycoplasma) eller af kvalitetsproblemer i cytokinlagrene, hvor ILC1 er særligt følsom over for mangel på IL-2 eller IL-15. Co-kultur supernatanter fra koncentrerede 96- eller 48-brøndsplader er blevet anvendt med succes til ELISA'er. Ved dissociation af co-kulturer anbefales det at inkubere celler med DNase efter en 20 minutters blid trypsinudskiftning eller udføre EDTA-baseret dissociation til enkeltceller for at forhindre celleklumpning fra beskadigede epitelceller.

En styrke ved denne protokol er, at den afbalancerer reduktionistiske dyrkningsbetingelser med komplekse celletyper. Imidlertid kan adfærden hos andre ILC-delmængder i disse kulturer være afhængig af faktorer, der ikke er til stede i denne særlige protokol. I Lindemans' protokol, der blev brugt til ILC3-cokulturer, blev IL-23 f.eks. desuden suppleret til co-kulturmedier for at understøtte ILC3-vedligeholdelse og -aktivering8. IL-15 viste sig at være særlig vigtig i vedligeholdelsen af ILC1 i co-kultursystemet beskrevet i denne protokol, hvilket var i overensstemmelse med tidligere rapporter om ILC1, der krævede dette cytokin til homeostase, men ikke udvikling6. For at aktivere ILC eller for at opretholde ILC2'er kan vækstmediet kræve yderligere optimering. Desuden regulerer andre cellulære rum i tarmen, bortset fra epitelet, ILC'er. For eksempel er intestinale neuroner kendt for at modulere ILC2'er delvist gennem aktiviteten af udskillede neuropeptider37. Mikrobielle faktorer påvirker også ILC-fænotype38. Denne begrænsning kan overvindes ved tilsætning af disse elementer, f.eks. cytokiner, peptider eller mikrobielle faktorer, i co-kultursystemet. Dette kunne endda give mulighed for forhør af interaktionen mellem ILC'er og flere cellulære rum i en reduktionistisk indstilling. Efter denne logik er det afgørende, at antibiotiske / anti-mykotiske reagenser tilsættes og ofte genopfyldes til organoide medier, inden der etableres co-kulturer. Det er også afgørende, at alle kulturer udføres i aseptiske miljøer, fordi enhver kulturforurening (f.eks. Svampevækst eller mycoplasma) sandsynligvis vil aktivere antigenet ikke-specifikke ILC'er og skabe signifikante fænotyper, der muligvis ikke er til stede i ikke-forurenede kulturer. Af denne grund anbefales det ikke at trække antibiotiske /mykotiske reagenser, selv i co-kulturer, da de ikke viste sig at forårsage en negativ indvirkning på epitelet eller ILC'erne.

Denne metode giver en unik måde at karakterisere signalmoduler mellem ILC'er og tarmepitelet, hvilket gør det muligt at undersøge biologien i begge rum. Sammenlignet med andre in vitro-metoder , der består af en enkelt celletype, er det system, der præsenteres her, mere sammenligneligt med in vivo-fysiologi og gør det muligt at forhøre flere potentielle signalmekanismer mellem epitelceller og ILC'er. Andre metoder til in vitro ILC-dyrkning er overvejende afhængige af stromalfødercellelinjer, såsom OP9 eller OP9-DL139. Denne linje er afledt af nyfødte mus calvaria, som ikke er repræsentativ for tarmmiljøet. Selv om disse hidtil har udgjorde guldstandarden for opretholdelse af ILC'er in vitro , lider de under betydelige begrænsninger i deres anvendelse til at forstå ILC's indvirkning på epitelet.

Den her beskrevne co-kulturprotokol mellem murine tyndtarmsorganoider og lamina propria-afledte ILC'er har betydelige forskningsanvendelser. Dette system af co-kultur er allerede blevet brugt til at bestemme rollen som ILC1-afledt TGF-β i udvidelsen af CD44 + epitelkrypter8, hvilket bidrager til forståelsen af epiteldynamik i inflammatorisk tarmsygdom. Disse undersøgelser bidrager til en stigende mængde litteratur, der understøtter den kritiske betydning af epitel-ILC-signalering i intestinal homeostase og inflammation3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

E.R. anerkender et ph.d.-stipendium fra Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. anerkender et ph.d.-stipendium fra Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). DC anerkender en ph.d. studerende fra NIHR GSTT BRC. J.F.N. anerkender et Marie Skłodowska-Curie-stipendium, et King's Prize-stipendium, et RCUK/UKRI Rutherford Fund-stipendium (MR/R024812/1) og en Seed Award in Science fra Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Vi takker også BRC flow cytometri kerneteamet baseret på Guy's Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reportermus var en generøs gave fra G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankrig). CD45.1 C57BL/6 mus blev venligst givet af T. Lawrence (King's College London, London) og P. Barral (King's College London, London).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Tags

Immunologi og infektion udgave 181
Co-kultur af Murine tyndtarmsepitelorganoider med medfødte lymfoide celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D.,… More

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter