يصف البروتوكول الحالي قياسا مستمرا طويل الأجل لتدفق الدم الكلوي في الفئران الواعية وتسجيل ضغط الدم في نفس الوقت باستخدام القسطرة المزروعة (المملوءة بالسوائل أو عن طريق القياس عن بعد).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
القياس المستمر طويل الأجل لتدفق الدم الكلوي في الفئران الواعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب الكلى دورا مهما في الحفاظ على توازن سوائل الجسم. تنظيم تدفق الدم الكلوي (RBF) ضروري للوظائف الحيوية للترشيح والتمثيل الغذائي في وظائف الكلى. تم إجراء العديد من الدراسات الحادة على الحيوانات المخدرة لقياس RBF في ظل ظروف مختلفة لتحديد الآليات المسؤولة عن تنظيم تروية الكلى. ومع ذلك ، لأسباب فنية ، لم يكن من الممكن قياس RBF بشكل مستمر (24 ساعة / يوم) في الفئران غير المقيدة غير المخدرة على مدى فترات طويلة. تسمح هذه الطرق بالتحديد المستمر ل RBF على مدى عدة أسابيع مع تسجيل ضغط الدم (BP) في نفس الوقت مع القسطرة المزروعة (مملوءة بالسوائل أو عن طريق القياس عن بعد). يتم إجراء مراقبة RBF مع الفئران الموضوعة في قفص دائري يتم التحكم فيه بواسطة مؤازر للفئران والذي يمكن من الحركة غير المقيدة للفئران طوال فترة الدراسة. في الوقت نفسه ، يتم منع تشابك الكابلات من مسبار التدفق والقسطرة الشريانية. يتم تزويد الفئران أولا بوضع مسبار تدفق بالموجات فوق الصوتية على الشريان الكلوي الأيسر وقسطرة شريانية مزروعة في الشريان الفخذي الأيمن. يتم توجيهها تحت الجلد إلى مؤخرة الرقبة ، وتوصيلها بمقياس التدفق ومحول الضغط ، على التوالي ، لقياس RBF و BP. بعد الزرع الجراحي ، يتم وضع الفئران على الفور في القفص للتعافي لمدة أسبوع واحد على الأقل وتحقيق الاستقرار في تسجيلات التحقيق بالموجات فوق الصوتية. جمع البول ممكن أيضا في هذا النظام. يتم عرض الإجراءات الجراحية وما بعد الجراحة للمراقبة المستمرة في هذا البروتوكول.
المقدمة
الكلى هي فقط 0.5 ٪ من وزن الجسم ولكنها غنية بتدفق الدم ، وتتلقى 20 ٪ -25 ٪ من إجمالي النتاج القلبي1. يعد تنظيم تدفق الدم الكلوي (RBF) أمرا أساسيا لوظائف الكلى وسوائل الجسم وتوازن الكهارل. تتضح أهمية تنظيم تدفق الدم إلى الكلى بشكل جيد من خلال الزيادة الكبيرة في RBF في الكلى المتبقية بعد استئصال الكلية من جانب واحد2،3،4 ومن خلال تخفيضات RBF التي تحدث في الفشل الكلوي5،6،7. ما إذا كانت هذه التغييرات في RBF تحدث استجابة للتغيرات في وظائف الكلى أو انخفاض في الوظيفة بسبب انخفاض RBF كان من الصعب التأكد من الحيوانات المخدرة المعدة جراحيا أو البشر. هناك حاجة إلى دراسات زمنية يمكن فيها تحديد الأحداث قبل وبعد تغيير محدد وملاحظتها في نفس الحيوان أثناء تقدم الأحداث. في الدراسات الحيوانية والبشرية ، تم تقدير RBF بشكل غير مباشر من خلال إزالة حمض الهيبوريك شبه الأميني (PAH) 8،9،10 وفي الآونة الأخيرة عن طريق تقنيات التصوير مثل الموجات فوق الصوتية 9،11،12 ، التصوير بالرنين المغناطيسي4،13 ، و PET-CT14،15 التي تعطي صورا مفيدة لكل كلية والتي يمكن أن تتبع تطور المرض. من الصعب تقييم RBF في الحيوانات الصغيرة عن طريق الموجات فوق الصوتية أو التصوير بالرنين المغناطيسي دون تخدير. كان من المستحيل قياس RBF باستمرار في ظل ظروف واعية في نفس الجرذ على مدى فترات طويلة.
لذلك ، طور البروتوكول الحالي تقنيات تمكن من إجراء قياسات متزامنة مستمرة على مدار 24 ساعة / يوم ل RBF ، والتي تم دمجها مع طرق قياس ضغط الدم المستمر للفئران التي تتحرك بحرية كما هو موضح سابقا16،17،18،19،20،21 . تسمح هذه التقنية بالتقييم الزمني ل RBF في نماذج مختلفة من الفئران لدراسة العلاقات بين السبب والنتيجة في مختلف الاضطرابات الكلوية في المستقبل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على البروتوكول من قبل كلية الطب في ويسكونسن لرعاية واستخدام الحيوان المؤسسي. تم استخدام فئران دال الحساسة للملح (ذكور وإناث) ، ~ 8 أسابيع من العمر ، 200-350 جم ، في التجارب.
1. إعداد الحيوانات
- قم بتركيب نظام قفص استجابة الحركة للفأر ، ووحدة تدفق حول الأوعية الدموية ، ومضخة حقنة ، وجهاز تسجيل ، وبرنامج (انظر جدول المواد) في غرفة الحيوان.
- ضع الفئران في القفص لتتعرف على البيئة والغذاء ونظام الماء على الأقل في الأسبوع السابق للجراحة. صيام الفئران من اليوم السابق للجراحة لأن المحتوى العالي في المعدة قد يتداخل مع وضع مسبار التدفق في الشريان الكلوي الأيسر ويمكن أن يسبب شفط القصبة الهوائية.
- قم بتوصيل 5 سم من أنابيب البولي يوريثين (القطر الداخلي 0.30 مم والقطر الخارجي 0.64 مم) بنهاية 90 سم من أنابيب البولي يوريثين (القطر الداخلي 0.64 مم والقطر الخارجي 1.02 مم) بالأسمنت PVC لعمل قسطرة شريانية الفخذية (انظر جدول المواد).
- تعقيم القسطرة باستخدام معقم أكسيد الإيثيلين ، ومسبار التدفق بنسبة 2.5٪ جلوتارالدهيد ، والأدوات الجراحية في الأوتوكلاف بالبخار. امسح الطاولات الجراحية والفحص المجهري والأضواء باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 1٪.
2. الجراحة
- ضع مسبار RBF باتباع الخطوات أدناه.
- تخدير الفئران بنسبة 2.0٪ -2.5٪ إيزوفلوران لدرجة أن الفئران لا تستجيب لمحفز الألم. ضعه على طاولة الجراحة عند 37 درجة مئوية وحقن 0.09 مجم / كجم من البوبرينورفين SR و 15 مجم / كجم من سيفازولين (انظر جدول المواد) قبل الجراحة.
- حلق البطن بالكامل باستخدام مقص كهربائي ومنطقة على مؤخرة الرقبة حول فقراتعنق الرحم 7 حيث ستخرج القسطرة وأسلاك التدفق.
- بعد الحلاقة ، امسح المنطقة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، و 10٪ من البوفيدون اليود ، ومرة أخرى بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- ضع الجرذ في وضعية الانبطاح. قم بعمل قطع 1 سم باستخدام مشرط على مؤخرة الرقبة والجناح الأيسر. بعد ذلك ، قم بإجراء تشريح حاد باستخدام ملقط مرقئ وقم بمسح مساحة تحت الجلد من شق الجناح إلى الجزء الخلفي من الرقبة.
- مرر مسبار التدفق عبر هذا النفق تحت الجلد من الرقبة إلى شق الجناح باستخدام ملقط مرقئ.
- ضع الجرذ في وضع ضعيف. قم بعمل شق في البطن بطول 4-5 سم.
- قم بتشريح المنطقة المحيطة بالشريان الكلوي باستخدام ملاقط منحنية لكشف مساحة كافية لوضع مسبار التدفق (انظر جدول المواد). ثم اخترق بصراحة عضلة ألم الظهر الرباعية اليسرى مع ملقط مرقئ واسحب رأس مسبار التدفق إلى تجويف البطن.
- قم بتوصيل طرف مسبار التدفق بالشريان الكلوي الأيسر وقم بتوصيله بمقياس التدفق (انظر جدول المواد). أضف بعض الجل حول طرف المسبار ، وستظهر قيمة معدل التدفق على مقياس التدفق.
ملاحظة: على الرغم من أن ذلك يعتمد على حجم الجرذ ، إلا أنه سيتم ملاحظة تدفق حوالي 3-5 مل / دقيقة في فأر 230 جرام. - قم بلصق شبكة ألياف البوليستر المرفقة بالمسبار بنسيج لاصق على جدار البطن وامسكها حتى تجف وترتبط (~ 1-2 دقيقة). بمجرد أن يصبح التدفق في مكانه ، افصل مسبار التدفق عن مقياس التدفق وقم بتغطية البطن بشاش مبلل بالمحلول الملحي وانتقل إلى خطوة إدخال القسطرة.
- أدخل قسطرة الفخذ باتباع الخطوات أدناه.
ملاحظة: طريقة إدخال قسطرة مملوءة بالسوائل هي نفس تركيبات القياس عن بعد العادية. على الرغم من تفضيل القياس عن بعد ، إلا أن القسطرة الشريانية تتيح مراقبة الضغط وأخذ عينات دم الدورة الشهرية من الفئران الواعية.- أولا ، املأ القسطرة بمحلول ملحي وقم بتثبيتها بملقط وعائي قبل إجراء شق جلدي 1 سم باستخدام مشرط على الفخذ الأيسر لتشريح وكشف الشريان الفخذي. أثناء منع التدفق في الجانب القريب من الشريان الفخذي بخيط ، أدخل القسطرة.
- اغسل بكمية صغيرة من المحلول الملحي ، وقم بتوصيله بسلك غير قابل للصدأ بحجم مناسب ، واربط القسطرة بخيط لإصلاحها.
- بمجرد ربط الرباط حول القسطرة ، قم بإنشاء نفق تحت الجلد باستخدام مبزل من الفولاذ المقاوم للصدأ من الفخذ إلى مؤخرة الرقبة لإحضار القسطرة إلى منطقة الرقبة. قم بتثبيته بخيوط حريرية 3-0 موضوعة في العضلة شبه المنحرفة.
- خياطة المسبار.
- أدر الجرذ إلى وضعية الانبطاح وقم بخياطة الحلقة الدائرية لمسبار التدفق تحت الجلد على الجناح. خياطة شق في الخاصرة والرقبة مع خياطة جراحية 4-0 (انظر جدول المواد).
- قم بتوصيل زر الجلد بمسبار التدفق وقم بخياطته بحرير 3-0 في الجزء الخلفي من الرقبة.
- قم بتوصيل مسبار التدفق بمقياس التدفق مرة أخرى ، وأعد الجرذ إلى الوضع الظهري للتحقق من RBF ، وقم بإجراء التعديلات النهائية لمسبار التدفق لتحسين موضعه على الشريان الكلوي.
- أخيرا ، قم بخياطة العضلات بالحرير 3-0 والجلد بخياطة جراحية 4-0.
3. استعادة الحيوان
- بعد المراقبة الدقيقة ، حتى تتعافى الفئران تماما من التخدير ، أعد الفئران إلى نظام قفص استجابة الحركة ، وقم بتوصيل مسبار التدفق بمقياس تدفق الدم ، والسماح بفترة نقاهة مدتها أسبوع تقريبا لتثبيت المسبار وقياس التدفق.
ملاحظة: لا يلزم إجراء التسجيل خلال هذه الفترة. - ضخ محلول ملحي بنسبة 3٪ هيبارين بشكل مستمر طوال فترة الدراسة من القسطرة الشريانية بمعدل 100 ميكرولتر / ساعة لمنع التجلط.
- عندما يستقر التدفق بعد 5-6 أيام ، اضبط معايرة مقياس التدفق لقياس تدفق الدم عند 0-20 مل / دقيقة وابدأ التسجيل المستمر ل RBF.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم عرض متوسط بيانات الضغط الشرياني (الشكل 1 أ) وبيانات تدفق الدم (الشكل 1 ب) من ذكر تمثيلي لفأر دال حساس للملوحة. يتم الحفاظ على الفئران الدال الحساسة للملح في مستعمرة ويتم تربيتها في كلية الطب في ويسكونسن. أجريت الجراحة في عمر 8 أسابيع ، وكان وزن الجسم 249 جراما وقت الجراحة. تم تغذية الفئران بنظام غذائي 0.4٪ كلوريد الصوديوم ، وتم تغيير النظام الغذائي إلى نظام غذائي 4٪ كلوريد الصوديوم في سن 10 أسابيع. استمرت القياسات لمدة 3 أسابيع على نظام غذائي 4٪ كلوريد الصود...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف البروتوكول الحالي تقنية تستخدم الأجهزة المتاحة تجاريا لتسجيل RBF والضغط الشرياني بشكل مستمر على مدى عدة أسابيع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن جمع البول باستخدام الجهاز الموضح في الخطوة 1.1. يمكن استخدامه أيضا لتقييم المستقلبات في البول ، وعندما يتم زرع قسطرة شريانية ، أخذ عينات الدم لتحليلها.
تقليديا ، تم الحصول على قياسات RBF بشكل حاد في الحيوانات المخدرة المعدة جراحيا أو تقديرها عن طريق إزالة PHA. ومع ذلك ، فقد ثبت أن التخدير والجراحةالمختلفة 22,23
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة بمنح للبحث العلمي (P01 HL116264 ، RO1 HL137748). يود المؤلفون أن يشكروا تيريزا كورث على نصائحها ومساعدتها في الحفاظ على البيئة التجريبية كمديرة للمختبر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1RB مسبار | ترانسونيك | 1RB | مسبار التدفق بالموجات فوق الصوتية |
| Betadine | Avrio Health | povidone-iodine | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | Buprenorphine | |
| Cefazolin | APOTEX | NDC 60505 | Cefazolin |
| Crile Hemostats | الأدوات الجراحية الدقيقة | 13004-14 | Hemostats للتشريح الحاد |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794 | Isoflurane |
| متوسط الشفاف الأسمنت PVC | Oatey | الأسمنت PVC | |
| ألياف البوليستر Mersilene شبكة ألياف | شبكة | ألياف | |
| البوليستر MetriCide28 | Metrex | SKU 10-2805 | 2.5٪ جلوتارالديهايد |
| Micro-Renathane 0.025 x 0.012 | Braintree Scientific | MRE 025 | استخدام ل القسطرة |
| MINI HYPE-WIPE | التقنيات الحالية | # 9803 | 1٪ هيبوكلوريت الصوديوم |
| Oatey متوسط الشفاف PVC الأسمنت | Oatey | # 31018 | مضخة حقنة PHD2000 الأسمنت |
| هارفارد | 71-2000 | مضخة حقنة | |
| Ponemah | تسجيل DSI | ||
| الدقة 3630 برج | Dell | كمبيوتر لتسجيل | |
| نظام Raturn المستقل | BASi | MD-1407 | نظام قفص استجابة الحركة |
| أنابيب الضغط عالية الدقة RenaPulse 0.040 × 0.025 | Braintree Scientific | RPT 040 | استخدام للقسطرة |
| صفعة سيليكون | الجلد AAPC102 | الصوت | |
| زيوت التشحيم الجراحية المعقمة للجراثيم | Fougera | 0168-0205-36 | Gell ل مسبار التدفق |
| Tergazyme | Alconox | البروتياز المحتوي على منظف أنيوني | |
| TS420 وحدة التدفق المحيطي | TS420 | وحدة | التدفق المحيط بالأوعية |
| عبر الصوت Vetbond | 3M | 1469SB | لاصق الأنسجة |
| WinDaq | برنامج تسجيل DATAQ |
المراجع
- Chonchol, M., Smogorzewski, M., Stubbs, J., Yu, A. Brenner & Rector's The Kidney. 11, Elsevier Inc. Philadelphia, PA. (2019).
- Chen, J. -K., et al. Phosphatidylinositol 3-kinase signaling determines kidney size. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2429-2444 (2015).
- Sigmon, D. H., Gonzalez-Feldman, E., Cavasin, M. A., Potter, D. L., Beierwaltes, W. H. Role of nitric oxide in the renal hemodynamic response to unilateral nephrectomy. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (6), 1413-1420 (2004).
- Romero, C. A., et al. Noninvasive measurement of renal blood flow by magnetic resonance imaging in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 314 (1), 99-106 (2018).
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Comprehensive Physiology. 2 (2), 1303-1353 (2012).
- Regan, M. C., Young, L. S., Geraghty, J., Fitzpatrick, J. M. Regional renal blood flow in normal and disease states. Urological Research. 23 (1), 1-10 (1995).
- Ter Wee, P. M. Effects of calcium antagonists on renal hemodynamics and progression of nondiabetic chronic renal disease. Archives of Internal Medicine. 154 (11), 1185(1994).
- Mazze, R. I., Cousins, M. J., Barr, G. A. Renal effects and metabolism of isoflurane in man. Anesthesiology. 40 (6), 536-542 (1974).
- Corrigan, G., et al. PAH extraction and estimation of plasma flow in human postischemic acute renal failure. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 277 (2), 312-318 (1999).
- Laroute, V., Lefebvre, H. P., Costes, G., Toutain, P. -L. Measurement of glomerular filtration rate and effective renal plasma flow in the conscious beagle dog by single intravenous bolus of iohexol and p-aminohippuric acid. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 17-25 (1999).
- Wei, K., et al. Quantification of renal blood flow with contrast-enhanced ultrasound. Journal of the American College of Cardiology. 37 (4), 1135-1140 (2001).
- Cao, W., et al. Contrast-enhanced ultrasound for assessing renal perfusion impairment and predicting acute kidney injury to chronic kidney disease progression. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (17), 1397-1411 (2017).
- Markl, M., Frydrychowicz, A., Kozerke, S., Hope, M., Wieben, O. 4D flow MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 36 (5), 1015-1036 (2012).
- Juillard, L., et al. Dynamic renal blood flow measurement by positron emission tomography in patients with CRF. American Journal of Kidney Diseases. 40 (5), 947-954 (2002).
- Juárez-Orozco, L. E., et al. Imaging of cardiac and renal perfusion in a rat model with 13N-NH3 micro-PET. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 31 (1), 213-219 (2015).
- Mori, T., Cowley, A. W. Role of pressure in angiotensin II-induced renal injury. Hypertension. 43 (4), 752-759 (2004).
- Mori, T., et al. High perfusion pressure accelerates renal injury in salt-sensitive hypertension. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (8), 1472-1482 (2008).
- Polichnowski, A. J., Cowley, A. W. Pressure-induced renal injury in angiotensin II versus norepinephrine-induced hypertensive rats. Hypertension. 54 (6), 1269-1277 (2009).
- Polichnowski, A. J., Jin, C., Yang, C., Cowley, A. W. Role of renal perfusion pressure versus angiotensin II renal oxidative stress in angiotensin II-induced hypertensive rats. Hypertension. 55 (6), 1425-1430 (2010).
- Evans, L. C., et al. Increased perfusion pressure drives renal T-cell infiltration in the dahl salt-sensitive rat. Hypertension. 70 (3), 543-551 (2017).
- Shimada, S., et al. Renal perfusion pressure determines infiltration of leukocytes in the kidney of rats with angiotensin II-induced hypertension. Hypertension. 76 (3), 849-858 (2020).
- Cousins, M. J., Mazze, R. I. Anaesthesia, surgery and renal function: Immediate and delayed effects. Anaesthesia and Intensive Care. 1 (5), 355-373 (1973).
- Cousins, M. J., Skowronski, G., Plummer, J. L. Anaesthesia and the kidney. Anaesthesia and Intensive Care. 11 (4), 292-320 (1983).
- Schiffer, T. A., Christensen, M., Gustafsson, H., Palm, F. The effect of inactin on kidney mitochondrial function and production of reactive oxygen species. PLOS ONE. 13 (11), 0207728(2018).
- Evans, R. G., et al. Chronic renal blood flow measurement in dogs by transit-time ultrasound flowmetry. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 38 (1), 33-39 (1997).
- Bell, T. D., DiBona, G. F., Biemiller, R., Brands, M. W. Continuously measured renal blood flow does not increase in diabetes if nitric oxide synthesis is blocked. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (5), 1449-1456 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
