Summary
يصف البروتوكول الحالي نموذجا لإصابة الرئة في الفئران التي تستخدم حمض الأوليك لتقليد متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS). يزيد هذا النموذج من الوسطاء الالتهابيين على الوذمة ويقلل من امتثال الرئة. يستخدم حمض الأوليك في شكل ملح (أوليات) لأن هذا الشكل الفسيولوجي يتجنب خطر الانسداد.
Abstract
تشكل متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) تهديدا كبيرا للمرضى المصابين بأمراض خطيرة مع ارتفاع معدل الوفيات. يمكن أن يؤدي التعرض للملوثات ودخان السجائر والعوامل المعدية والأحماض الدهنية إلى الإصابة بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة. يمكن للنماذج الحيوانية أن تحاكي الآلية المرضية المعقدة لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة. ومع ذلك ، كل واحد منهم لديه قيود. والجدير بالذكر أن حمض الأوليك (OA) يزداد في المرضى المصابين بأمراض خطيرة مع آثار ضارة على الرئة. يمكن أن يؤدي هشاشة العظام إلى إصابة الرئة عن طريق الصمات ، وتعطيل الأنسجة ، وتغيير درجة الحموضة ، وإضعاف إزالة الوذمة. يشبه نموذج إصابة الرئة الناجم عن الزراعة العضوية ميزات مختلفة من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة مع إصابة بطانية ، وزيادة نفاذية السنخية ، والتهاب ، وتشكيل غشاء هيالين ، وموت الخلايا. هنا ، يتم وصف تحريض إصابة الرئة عن طريق حقن الزراعة العضوية (في شكل ملح) مباشرة في الرئة وعن طريق الوريد في الفأر لأنه الشكل الفسيولوجي ل OA عند درجة الحموضة 7. وبالتالي ، فإن حقن الزراعة العضوية في شكل ملح هو نموذج حيواني مفيد لدراسة إصابة الرئة / متلازمة الضائقة التنفسية الحادة دون التسبب في الصمات أو تغيير درجة الحموضة ، وبالتالي الاقتراب مما يحدث في المرضى المصابين بأمراض خطيرة.
Introduction
وصف Ashbaugh et al.1 ، في عام 1967 ، لأول مرة متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) ومنذ ذلك الحين خضع لمراجعات متعددة. وفقا لتعريف برلين ، فإن متلازمة الضائقة التنفسية الحادة هي التهاب رئوي يؤدي إلى فشل تنفسي حاد ونقص الأكسجة (PaO 2 / FiO 2 > 300 ملم زئبق) بسبب عدم التوازن في نسبة التهوية إلى التروية ، والضرر السنخي الثنائي المنتشر (DAD) والتسلل ، وزيادة وزن الرئة ، والوذمة 2,3. النسيج البرنشيمي الرئوي بيئة خلوية معقدة تضاعفها الخلايا الطلائية والبطانية والخلايا الأخرى. تشكل هذه الخلايا حواجز وتراكيب مسئولة عن تبادل الغازات والاتزان الداخلي في الحويصلات الهوائية3. الخلايا الأكثر وفرة داخل الحاجز الظهاري هي الخلايا السنخية من النوع الأول (AT1) مع مساحة سطح أكبر لتبادل الغازات وإدارة السوائل من خلال Na / K-ATPase. أيضا ، تنتج الخلايا السنخية من النوع الثاني (AT2) الفاعل بالسطح ، مما يقلل من التوتر السطحي في الحويصلات الهوائية4. في الأسفل، تشكل الخلايا البطانية حاجزا شبه نافذ يفصل الدورة الدموية الرئوية عن النسيج الخلالي. وتشمل وظائفه الكشف عن المحفزات ، وتنسيق الاستجابات الالتهابية ، والهجرة الخلوية5. تنظم الخلايا البطانية أيضا تبادل الغازات ، وتوتر الأوعية الدموية ، والتخثر5. لذلك ، قد تؤدي اضطرابات الوظيفة البطانية والظهارية إلى تفاقم النمط الظاهري للالتهابات ، مما يتسبب في تلف الرئة مما يؤدي إلى متلازمة الضائقة التنفسية الحادة5.
يرتبط تطور متلازمة الضائقة التنفسية الحادة بالمخاطر بالالتهاب الرئوي الجرثومي والفيروسي أو العوامل غير المباشرة مثل الإنتان غير الرئوي والصدمات وعمليات نقل الدم والتهاب البنكرياس6. تتسبب هذه الحالات في إطلاق الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) والأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (DAMPs) ، مما يؤدي إلى تحفيز السيتوكينات الالتهابية والكيموكينات مثل TNF-α و IL-1β و IL-6 و IL-85. يرتبط TNF-α بتدهور الكاديرين البطاني الوعائي (VE-cadherin) في اضطراب الحاجز البطاني وتسلل الكريات البيض إلى حمة الرئة. العدلات هي الخلايا الأولى التي تهاجر ، وتجذبها IL-8 و LTB45،7،8. تزيد العدلات من السيتوكينات المسببة للالتهابات ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) 9 ، وتكوين مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) مما يؤدي إلى تلف إضافي في البطانة والظهارية10. يؤدي الضرر الظهاري إلى التهاب وتنشيط المستقبلات الشبيهة بالحصيلة في خلايا AT2 والبلاعم المقيمة ، مما يؤدي إلى إطلاق chemokines التي تجذب الخلايا الالتهابية إلى الرئتين4. أيضا ، يؤدي إنتاج السيتوكينات مثل الإنترفيرون β (INFβ) إلى مستقبلات محفزة لموت الخلايا المبرمج المرتبطة بعامل نخر الورم (TRAIL) ، مما يؤدي بخلايا ATII إلى موت الخلايا المبرمج ، مما يضعف السائل ووضوح الأيونات4. يسمح اضطراب بنية الحاجز البطاني والظهاري بتدفق السوائل والبروتينات وخلايا الدم الحمراء والكريات البيض إلى الفضاء السنخي ، مما يسبب الوذمة. مع إنشاء الوذمة ، يتم تغيير الجهد الرئوي للحفاظ على التنفس وتبادل الغازات11. يؤدي فرط ثنائي أكسيد الكربون ونقص الأكسجة في الدم إلى موت الخلايا واضطراب نقل الصوديوم ، مما يؤدي إلى تفاقم الوذمة السنخية بسبب ضعف قدرة التخليص10. تحتوي متلازمة الضائقة التنفسية الحادة أيضا على مستويات مرتفعة من IL-17A ، المرتبطة بخلل وظيفي في الأعضاء ، وزيادة نسبة العدلات السنخية ، ونفاذية السنخية9.
كان هناك تقدم مستمر في الأبحاث حول الفيزيولوجيا المرضية وعلم الأوبئة وعلاج متلازمة الضائقة التنفسية الحادة في السنوات الأخيرة12,13. ومع ذلك ، فإن متلازمة الضائقة التنفسية الحادة هي متلازمة غير متجانسة على الرغم من التقدم في البحوث العلاجية مما أدى إلى التهوية الميكانيكية وتحسين العلاج بالسوائل. وبالتالي ، لا تزال هناك حاجة إلى علاج دوائي مباشر أكثر فعالية10 ، وقد تساعد الدراسات على الحيوانات في الكشف عن آليات وأهداف متلازمة الضائقة التنفسية الحادة للتدخل.
نماذج ARDS الحالية ليست قادرة على تكرار علم الأمراض بشكل كامل. وبالتالي ، غالبا ما يختار الباحثون النموذج الذي يمكن أن يناسب اهتماماتهم بشكل أفضل. على سبيل المثال ، يحفز نموذج تحريض عديد السكاريد الشحمي (LPS) متلازمة الضائقة التنفسية الحادة عن طريق الصدمة السمية الداخلية الناتجة بشكل رئيسي عن TLR414. يحاكي تحريض حمض الهيدروكلوريك شفط الحمض ، والضرر يعتمد علىالعدلات 14. من ناحية أخرى ، فإن نموذج أوليات الصوديوم الحالي يحفز تلف البطانة الذي يزيد من نفاذية الأوعية الدموية وذمة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام أوليات الصوديوم بدلا من حمض الأوليك في شكل سائل يتجنب مخاطر الانسداد والتغيير في درجة الحموضة في الدم15.
نماذج الحيوانات لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة
تساعد الدراسات قبل السريرية في النماذج الحيوانية على فهم علم الأمراض وهي ضرورية لأبحاث علاجات متلازمة الضائقة التنفسية الحادة الجديدة. يحتاج النموذج الحيواني المثالي إلى خصائص تشبه الحالة السريرية والتكاثر الجيد لآليات المرض مع السمات الفيزيولوجية المرضية ذات الصلة لكل مرحلة من مراحل المرض والتطور والإصلاح14. تستخدم العديد من النماذج الحيوانية لتقييم إصابة الرئة الحادة في متلازمة الضائقة التنفسية الحادة قبل السريرية. ومع ذلك ، نظرا لأن جميع النماذج لها قيود ، فإنها لا تعيد إنتاج علم الأمراض البشري بشكل كامل6،14،16. يتم استخدام متلازمة الضائقة التنفسية الحادة التي يسببها حمض الأوليك في أنواع حيوانية مختلفة17. الخنازير18 والأغنام19 والكلاب20 المقدمة لحقن الزراعة العضوية تقدم العديد من السمات السريرية للمرض مع خلل في الغشاء السنخي الشعري وزيادة النفاذية مع تسلل البروتين والخلايا.
على سبيل المثال ، حقن OA عند 1.25 ميكرومتر عن طريق الوريد النقل عبر الظهارة مما أدى إلى الوذمة السنخية15. بدلا من ذلك ، في النموذج المختبري باستخدام خلايا A549 ، لم يغير الزراعة العضوية بتركيز 10 ميكرومتر قناة الصوديوم الظهارية (eNAC) أو التعبير عن Na / K-ATPase. ومع ذلك ، يبدو أن الزراعة العضوية ترتبط بكلتا القناتين ، مما يعيق نشاطهابشكل مباشر 21. تسبب الحقن الوريدي OA عند 0.1 مل / كجم في احتقان أنسجة الرئة وتورمها ، وانخفاض المساحات السنخية مع الحاجز السنخي السميك ، وزيادة عدد خلايا الدم الالتهابية والحمراء22. أيضا ، OA الناجم عن موت الخلايا المبرمج والنخر في الخلايا البطانية والظهارية في الرئة15. حقن محلول tris-oleate ، داخل القصبة الهوائية في الفئران ، عزز تسلل العدلات والوذمة في وقت مبكر من 6 ساعات بعد التحفيز23. أدى حقن الزراعة العضوية عند 24 ساعة إلى زيادة مستويات السيتوكين المسببة للالتهابات (أي TNF-α و IL-6 و IL-1β)23. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحقن في الوريد (الضفيرة المدارية) ل 10 ميكرومتر من tris-oleate يثبط نشاط Na / K-ATPase الرئوي ، على غرار ouabain عند 10-3 μM ، وهو مثبط إنزيم انتقائي. أيضا ، يؤدي الزراعة العضوية إلى حدوث التهاب مع تسلل الخلايا ، وتشكيل الأجسام الدهنية ، وإنتاج الليكوترين B4 (LTB4) والبروستاجلاندين E2 (PGE2) 22،24. لذلك ، تولد متلازمة الضائقة التنفسية الحادة التي يسببها حمض الأوليك وذمة ، ونزيف ، وتسلل العدلات ، وزيادة نشاط الميلوبيروكسيديز (MPO) ، و ROS24. وبالتالي ، فإن إدارة الزراعة العضوية هي نموذج راسخ لإصابة الرئة22,25. جميع النتائج المقدمة في هذه المقالة التي تحتوي على الزراعة العضوية تمثل شكل الملح ، أوليات الصوديوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المعنية باستخدام الحيوانات التابعة لمؤسسة أوزوالدو كروز (تراخيص CEUA رقم 002-08 و 36/10 و 054/2015). تم استخدام ذكور فئران ويبستر السويسرية التي يتراوح وزنها بين 20-30 جم ، والتي قدمها معهد العلوم والتكنولوجيا في النماذج الحيوية (ICTB) التابع لمؤسسة أوزوالدو كروز (FIOCRUZ) ، في التجارب. تم الاحتفاظ بالحيوانات في عوازل جيدة التهوية في حظيرة Pavilhão Ozório de Almeida ، وكان الماء والطعام متاحين حسب الحاجة. لقد تعرضوا لدورة ضوء وظلام 12 ساعة / 12 ساعة.
1. إعداد محلول أوليات الصوديوم
- استخدم حمض الأوليك لتحضير 100 مليمول / لتر من محلول مرق أوليات الصوديوم في أي أنبوب معقم أو قارورة زجاجية.
ملاحظة: تم إعداد محلول 50 مل (الحجم النهائي) للعمل الحالي ، ولكن يجب تعديل الحجم وفقا للحاجة التجريبية. يجب تحضير المحلول دائما في أنابيب معقمة أو عبوات زجاجية.- أولا ، أضف أقراص NaOH أو محلول في ماء عالي النقاء لرفع درجة الحموضة. يوصى باستخدام قيمة الرقم الهيدروجيني من 12-13 لحجم 25 مل.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام قاعدة Tris لتحضير محلول Tris-oleate. - أضف حمض الأوليك (انظر جدول المواد) ببطء شديد ، قطرة قطرة ، تحت التحريك المستمر في حمام بالموجات فوق الصوتية عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: في حالة حدوث ترسيب حمض الأوليك ، ابدأ من البداية. - بمجرد إذابة حمض الأوليك تماما ، اضبط الرقم الهيدروجيني بعناية على 7.4 ، قطرة قطرة تحت التحريك ، مع حمض الهيدروكلوريك المخفف فائق النقاء ثم اضبط على الحجم النهائي البالغ 50 مل.
ملاحظة: قم بإعداد محاليل أوليات العمل حديثا. بدلا من ذلك ، يمكن تسعير المحلول وتخزينه وصيانته عند -20 درجة مئوية في بيئة غنية بالنيتروجين لتجنب الأكسدة لمدة لا تزيد عن شهر. تجنب الدورات المجمدة المعاد تجميدها.
- أولا ، أضف أقراص NaOH أو محلول في ماء عالي النقاء لرفع درجة الحموضة. يوصى باستخدام قيمة الرقم الهيدروجيني من 12-13 لحجم 25 مل.
2. تحريض إصابة الرئة بحمض الأوليك
- أداء الإدارة داخل القصبة الهوائية من حمض الأوليك.
- تخدير الفئران باستخدام 5٪ إيزوفلوران مع 2 لتر / دقيقة من O2 باستخدام مبخر مخدر بيطري (الشكل 1 أ). إزالة الفراء في منطقة شق مع كريم مزيل الشعر وتطهير المنطقة مع ثلاث جولات بالتناوب من فرك betadine والكحول باستخدام الشاش المعقم. تأكيد عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم.
ملاحظة: استخدم قفازات وأدوات معقمة أثناء العملية. استخدم ستارة لتغطية الحيوان وفضح موقع الشق فقط. قم بإجراء التجربة في خزانة السلامة البيولوجية لتجنب هروب الأيزوفلوران إلى البيئة. لا تدار المسكنات لأنها قد تمنع الاستجابة الالتهابية. - بعد التخدير ، ضع الحيوان في وضع الاستلقاء الظهري وقم بعمل شق (0.5-1 سم) على شكل حرف V على مستوى الغدة الدرقية. قم بإزاحة الغدة الدرقية برفق لكشف القصبة الهوائية (الشكل 1 ب) وحقن 50 ميكرولتر من محلول الأوليت المحضر (الخطوة 1).
ملاحظة: تم تقسيم الفئران إلى مجموعتين ، مع ثمانية في كل مجموعة. تتلقى مجموعة إصابات الرئة محلول أوليات الصوديوم عند 25 مللي مول (1.25 ميكرولتر) ، وتتلقى المجموعة الضابطة 50 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم عن طريق التقطير في القصبة الهوائية لكل فأر باستخدام حقنة أنسولين (حجم 300 ميكرولتر ، 30 جم) (الشكل 1 ج). - قم بخياطة موقع شق الفئران بخيط أحادي الشعيرات الاصطناعية غير القابلة للامتصاص ، وإعادته إلى قفصهم ، ومراقبته حتى الشفاء التام من الجراحة. خلال جميع الإجراءات ، حافظ على الحيوانات على وسادة تدفئة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تستغرق الفئران عادة ما يصل إلى 15 دقيقة للتعافي من الجراحة.
- تخدير الفئران باستخدام 5٪ إيزوفلوران مع 2 لتر / دقيقة من O2 باستخدام مبخر مخدر بيطري (الشكل 1 أ). إزالة الفراء في منطقة شق مع كريم مزيل الشعر وتطهير المنطقة مع ثلاث جولات بالتناوب من فرك betadine والكحول باستخدام الشاش المعقم. تأكيد عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم.
- أداء الإدارة عن طريق الوريد من حمض الأوليك.
- بعد التخدير (الخطوة 2.1.1 ، الشكل 2 أ) ، احقن عن طريق الوريد في الضفيرة المدارية عن طريق إدخال الإبرة متناهية الصغر (انظر جدول المواد) في العلبة الإنسية لمقبس العين (الشكل 2 ب).
ملاحظة: تم تقسيم الفئران إلى مجموعتين ، مع ثمانية حيوانات في كل مجموعة. تتلقى كل مجموعة 100 ميكرولتر من محلول أوليات الصوديوم عند 10 ميكرومول من الزراعة العضوية لكل ، بينما تتلقى المجموعة الضابطة 100 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم.
- بعد التخدير (الخطوة 2.1.1 ، الشكل 2 أ) ، احقن عن طريق الوريد في الضفيرة المدارية عن طريق إدخال الإبرة متناهية الصغر (انظر جدول المواد) في العلبة الإنسية لمقبس العين (الشكل 2 ب).
- بعد الجراحة ، راقب الحيوانات يوميا بحثا عن ردود الفعل السلبية. تشمل نقاط النهاية الإنسانية للقتل الرحيم ردود الفعل السلبية والتشنجات والغيبوبة.
3. جمع سائل غسل القصبات الهوائية (BALF)
- القتل الرحيم للفئران بجرعة قاتلة داخل الصفاق من الكيتامين (300 مجم / كجم) والزيلازين (30 مجم / كجم) (انظر جدول المواد).
- ضع الحيوان في وضع الاستلقاء الظهري ، وقم بعمل شق يبلغ حوالي 1 سم باستخدام مقص جراحي في المنطقة الأمامية للحيوانات ، وفضح القصبة الهوائية وقم بعمل قطع صغير لإدخال قسطرة في الوريد (20 جم).
- قم بتوصيل القسطرة بحقنة معقمة سعة 1 مل ، وقم بحقن 0.5 مل من المحلول الملحي المعقم ببطء وتدريجيا في الرئتين ، ثم قم بشفط السائل من BALF بنفس المحقنة. كرر ذلك 3-5 مرات ، وانقله إلى أنبوب دقيق معقم ، وضعه في الجليد.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
4. تحليل الخلايا الكلي والتفاضلي في BALF
- بالنسبة لعدد الخلايا الكلي ، قم بتخفيف 20 ميكرولتر من BALF في 180 ميكرولتر (تخفيف 10x) من محلول Turk (انظر جدول المواد). قم بإجراء العد باستخدام غرفة نيوباور تحت المجهر الضوئي بهدف 40x.
- للعد التفاضلي ، ضع 100 ميكرولتر من BALF في القمع الخلوي الذي يحتوي على شرائح وأجهزة طرد مركزي عند 22.86 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي خلوي ، وقم بتلطيخه باستخدام May-Grunwald (15٪ ، درجة الحموضة 7.2) -Giemsa (1:10) (انظر جدول المواد). المضي قدما في عدد الخلايا في المجهر الضوئي مع هدف الغمر.
5. تحديد البروتين الكلي في BALF
- حدد إجمالي البروتين الطافي BALF بواسطة مجموعة تقدير كمية البروتين التجارية واقرأ الامتصاص عند 562 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
6. مقايسات الممتز المناعي الإنزيم
- جهاز طرد مركزي BALF عند 1200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم اجمع المادة الطافية باستخدام ماصة وقم بتخزينها في -80 درجة مئوية لمقايسات TNF-α و IL-1β و IL-6 و PGE215،23،25.
ملاحظة: الطرد المركزي في الخطوة 6.1 يجعل خلية BALF خالية.- قم بإجراء مقايسات السيتوكينات على BALF الخالي من الخلايا باستخدام مجموعة ELISA التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإجراء اختبار PGE2 باستخدام مجموعة المقايسة المناعية للإنزيم (EIA) باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
7. تلطيخ الجسم الدهون والعد
- ثبت الكريات البيض على شرائح cytospin باستخدام 3.7٪ فورمالديهايد في Ca 2+ ، Mg2+ محلول ملح هانك المخزن (HBSS ، درجة الحموضة 7.4) وصمة عار بنسبة 1.5٪ OsO4 بينما لا تزال رطبة3 (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، احسب الأجسام الدهنية لكل خلية في 50 كرية بيضاء متتالية من كل شريحة باستخدام عدسة هدف الغمر بالزيت في المجهر.
8. التحليل الإحصائي
- إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برامج الرسوم البيانية والإحصاء (انظر جدول المواد). عبر عن النتائج كمتوسط ± SEM وقم بتحليلها بواسطة One-Way Anova متبوعا باختبار ما بعد اختبار Newman-Keuls-Student26. ضع في اعتبارك الاختلافات المهمة عندما < P 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الرئة غير المصابة ، يحدث تطهير السائل السنخي عن طريق نقل الأيونات عبر الطبقة الظهارية السنخية السليمة. ينقل التدرج الأسموزي السائل من الحويصلات الهوائية إلى النسيج الخلالي الرئوي، حيث يتم تصريفه بواسطة الأوعية اللمفاوية أو إعادة امتصاصه. Na / K-ATPase يقود هذا النقل11. الزراعة العضوية هي مثبط ل Na / K-ATPase27 وقناة الصوديوم21 ، والتي قد تسهم في تكوين الوذمة ، كما اقترحنا بالفعل23. تؤدي الاستجابة الالتهابية المتفاقمة في متلازمة الضائقة التنفسية الحادة إلى تلف السنخية ، وزيادة نفاذية البطانة والظهارة ، وتراكم السائل السنخي الغني بالبروتين والخلايا الالتهابية ، مما يسبب الوذمة. تتسبب الوذمة في زيادة معدل التنفس للرئتين بسبب تراكم السائل الخلالي وضعف تبادل الغازات ، مما يؤدي إلى نقص الأكسجة في الدم وفشل الجهاز التنفسي28. تعمل السيتوكينات مثل TNF-α وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) على زعزعة استقرار روابط VE-cadherin ، مما يساهم في زيادة نفاذية البطانة وتراكم السوائل السنخية7.
أدى حقن الزراعة العضوية إلى زيادة إجمالي كريات الدم البيضاء في الطرق داخل القصبة الهوائية والوريدية (الشكل 3). كان من الضروري إحداث OA لإصابة الرئة عن طريق الوريد بدلا من الطريق داخل القصبة الهوائية. أظهر العمل الحالي زيادة في عدد العدلات في BALF عند 6 ساعات ، مع الذروة عند 24 ساعة وتناقص عند 48 ساعة و 72 ساعة. لوحظ تركيز أعلى من IL-6 و IL-1β و TNF-α في BALF بعد 24 ساعة من تقطير القصبة الهوائية OA23 (الشكل 4). يمنع الزراعة العضوية إزالة الوذمة ويمكن أن يؤدي إلى تكوين وذمة غنية بالبروتين عن طريق كل من الطرق الوريدية والقصبة الهوائية15,23. تم تقييم وذمة الرئة من خلال مقايسة البروتين الكلي في BALF ، مما يدل على أن إعطاء IV و IT زاد من تركيز البروتين الكلي (الشكل 5). الأجسام الدهنية هي عضيات داخل الخلايا تحتوي على الركيزة والإنزيمات لإنتاجeicosanoids 8,29. يعزز تكوين الأجسام الدهنية إنتاج وسطاء الدهون ، ويمكن استخدامه للوصول إلى تنشيط الخلية. عزز حقن الزراعة العضوية داخل القصبة الهوائية والوريدية تكوين الأجسام الدهنية وتركيز PGE2 23 بعد 24 ساعة (الشكل 6). تسبب حقن الزراعة العضوية أيضا في اضطراب الأنسجة والنزيف وتسلل كريات الدم البيضاء في الطرق داخل القصبة الهوائية والوريدية ، كما هو موضح في أنسجة تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) (الشكل 7). أيضا ، الزراعة العضوية يسبب تغيير في وظائف الرئة19. وبالتالي ، فإن إصابة الرئة التي يسببها حمض الأوليك تقدم العديد من ميزات متلازمة الضائقة التنفسية الحادة.
الشكل 1: الخطوات الفردية في بروتوكول الإدارة داخل القصبة الهوائية . (أ) يتم تخدير الفأر باستخدام 5٪ إيزوفلوران و 2 لتر / دقيقة من O2. ب: شق القصبة الهوائية بمقص جراحي في الفئران في وضع الاستلقاء الظهري. ج: التقطير داخل القصبة الهوائية باستخدام حقنة الإنسولين. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخطوات الفردية في بروتوكول الإعطاء عن طريق الوريد. (أ) يتم تخدير الفأر بنسبة 5٪ إيزوفلوران و 2 لتر / دقيقة من O2. ب: الحقن في الوريد باستخدام حقنة الإنسولين بواسطة الكانثوس الإنسي. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يؤدي إعطاء الزراعة العضوية إلى تنشيط الكريات البيض في BALF للفئران. تم إجراء إجمالي الكريات البيض في الحقن الوريدي (i.v) والإدارة داخل القصبة الهوائية (i.t) (A) وصورة مجهرية توضيحية (تكبير 1000x) في الإدارة داخل القصبة الهوائية (i.t.) ملطخة ب May-Grünwald-Giemsa (B) بعد 24 ساعة من تحدي الزراعة العضوية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. تم إعطاء نفس الحجم من المحلول الملحي المعقم للمجموعة الضابطة. يمثل كل شريط متوسط SEM لسبعة على الأقل ±. *P < 0.05، مقارنة بالضوابط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يحفز إعطاء الزراعة العضوية داخل القصبة الهوائية (i.t) إنتاج وسطاء التهابيين في رئة الفئران. تم قياس TNF-α (A) و IL-6 (B) و IL-1β (C) بعد 24 ساعة من التحدي. تم إعطاء محلول ملحي معقم للمجموعة الضابطة. يمثل كل شريط متوسط ± SEM لستة على الأقل. *P < 0.05، مقارنة بالضوابط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: إجمالي محتوى البروتين في BALF بعد 24 ساعة من حقن الزراعة العضوية. يزيد إعطاء الزراعة العضوية داخل القصبة الهوائية (i.t.) والوريد (IV) من البروتين الكلي في BALF للفئران. تلقت المجموعة الضابطة نفس الحجم من المياه المالحة المعقمة. النتائج هي وسائل ± SEM من ستة مختلفة على الأقل. * P < 0.0001 ، مقارنة بالضوابط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تكوين الجسم الدهني في كريات الدم البيضاء وإنتاج PGE2 في BALF للفئران المعالجة بالزراعة العضوية. يؤدي إعطاء القصبة الهوائية (i.t) والوريد (i.v) ل OA إلى وسطاء التهابيين وتراكم أجسام دهنية في BALF للفئران (A) و (B) ، على التوالي. (ج) صورة مجهرية توضيحية للأجسام الدهنية (تكبير 1000x) ملطخة في رئتي الحيوانات باستخدام رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4) بعد 24 ساعة من تحدي الزراعة العضوية. تشير الأسهم إلى الأجسام الدهنية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. تلقت الضوابط نفس الحجم من المياه المالحة. النتائج هي وسائل ± SEM من سبعة. *P < 0.05، مقارنة بالضوابط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الأنسجة الرئوية التوضيحية في الفئران. أ: الفئران الضابطة المعالجة بالمحلول الملحي وعدم وجود علامة على النزيف. (ب) إعطاء الزراعة العضوية عن طريق الوريد. (ج) الإدارة داخل القصبة الهوائية (i.t) مع تغيرات الأنسجة. تم إجراء تلطيخ H& E. التكبير ، 1000x. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد اختيار نموذج متلازمة الضائقة التنفسية الحادة الصحيح أمرا ضروريا لإجراء الدراسات قبل السريرية ، ويجب على المقيم مراعاة جميع المتغيرات المحتملة ، مثل العمر والجنس وطرق الإدارة وغيرها6. يجب أن يقوم النموذج المختار بإعادة إنتاج المرض بناء على عوامل الخطر مثل الإنتان ، وانسداد الدهون ، ونقص تروية الأوعية الدموية الرئوية ، والمخاطر السريرية الأخرى14. ومع ذلك ، لا يمكن لأي نموذج حيواني يستخدم لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة إعادة إنشاء جميع ميزات المتلازمة البشرية. تشمل نماذج عوامل الإصابة المتعددة LPS و OA وحمض الهيدروكلوريك والبكتيريا والفيروسات6. أيضا ، يتم استخدام طرق إدارة مختلفة ، أكثر شيوعا ، داخل القصبة الهوائية ، داخل الأنف ، أو في الوريد. يتسبب نموذج نقص التروية الرئوية في تمزق الشعيرات الدموية وتراكم البروتين داخل السنخية6. تستخدم إصابة الرئة التي يسببها LPS على نطاق واسع وتؤدي إلى إصابة حادة للحواجز الظهارية والبطانية. يرتبط LPS بالمستقبل الشبيه ب Toll-like 4 (TLR-4) في ظهارة مجرى الهواء مما يؤدي إلى تنشيط NF-κB مما يعزز إنتاج السيتوكينات والكيموكينات ، ويجذب الخلايا الالتهابية30 ، مما يؤدي إلى التهاب الأسناخ العدلاتالقوي 6. ومع ذلك ، يظهر النموذج اختلافات بين سلالات وأنواع الحيوانات ، مما يقلل من قابلية استنساخ النتائج في الحيوانات للمرضى من البشر المصابين بمتلازمة الضائقةالتنفسية الحادة 30.
يحاكي نموذج إصابة حمض الهيدروكلوريك متلازمة الضائقة التنفسية الحادة عن طريق شفط المحتوى الحمضي. يؤدي انخفاض درجة الحموضة في الرئتين إلى استجابة التهابية حادة تليها إصابة ليفية متأخرة. يعتمد الضرر على العدلات ، مما يسبب نزيفا سنخيا وذمة وضعف إزالة السوائل. ومع ذلك ، فإن البشر لا يستنشقون حمض الهيدروكلوريك فقط ولكن محتوى معدي معقد مع درجة حموضة غالبا ما تكون أعلى من 1.531. تمت مراجعة هذه النماذج وغيرها من نماذج متلازمة الضائقة التنفسية الحادة على نطاق واسع في مكان آخر31. من بين جميع النماذج المستخدمة ، فإن نموذج ARDS الناجم عن حمض الأوليك هو الأكثر مثالية14.
يتسبب نموذج أوليات الصوديوم في تلف الرئة ، ويحفز موت الخلايا المبرمج ونخر الخلايا السنخية ، ويعزز إنتاج السيتوكينات مثل TNFα و IL-8 و IL-6 و IL-1β و MIP-1α19. كما يحفز الزراعة العضوية البروتياز وتعبير الإيلاستاز مع نزيف يسبب إصابة رئوية شديدة25. الزراعة العضوية تستنسخ المرض بسبب انسداد الدهون ، وزيادة نفاذية الأوعية الدموية الرئوية ، والسائل خارج الأوعية الدموية مع تسلل التصوير الشعاعي32. أيضا ، المرضى الذين يعانون من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة لديهم تركيز أعلى من OA البلازمي15،22،24.
تحفز الإدارة داخل القصبة الهوائية OA إنتاج وسطاء التهابيين مشابه لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة السريرية وتقلل من امتثال الرئة وتبادل الغازات25,32. الحقن في الوريد OA يعزز الجوانب النسيجية والفسيولوجية للمرض32. ألبومين المصل هو ليجند OA قوي يمكن أن يفسر لماذا يتطلب هذا الطريق كمية OA (10 μmol) 15 أعلى من القصبة الهوائية (1.25 μmol) 23 للحث على تلف الرئة. في الواقع ، أظهرت مجموعتنا وجود علاقة بين عدم توازن OA / الألبومين وارتفاع خطر الوفاة في مرضى داء البريميات33.
كما هو الحال مع كل نموذج آخر ، هناك بعض العيوب المعروضة في النموذج. عندما لا تدار في شكل ملح ، قد يسبب حمض الأوليك تأثيرات سامة واختلافات بسبب استحلاب الدم. كما هو موضح في هذه المقالة ، فإن استخدام شكل الملح يقلل من التأثيرات السامة ويتجنب مشكلتين: تكوين الصمات وتقلب درجة الحموضة في الدم والرئتين. كما أنه يضمن أن الإصابة الرئوية ناتجة عن الأوليت وليس بسبب تأثير ثانوي15. بالإضافة إلى ذلك ، لا يتطلب تحضير حمض الأوليك في شكل ملح في هذا النموذج الاقتران مع الألبومين. تظهر الأبحاث الآثار المفيدة للألبومين في تقليل الالتهاب ونفاذية الأوعية الدموية. علاوة على ذلك ، يعيد الألبومين الدورة الدموية والتنفس لدى مرضى إصابات الرئة. وبالتالي ، فإن اقتران الألبومين مع الزراعة العضوية يمكن أن يضعف تأثيره على الحيوان ، مما يقلل من صلاحية النماذج33,34.
على المستوى الجزيئي ، يثبط أوليات الصوديوم ATPase الصوديوم والبوتاسيوم (NKA) وقناة الصوديوم (eNac) ، مما يضعف نقل الأيونات ، ويزيد من نفاذية الأوعية الدموية وتكوين الوذمة15. أيضا ، يمكن أن يرتبط الزراعة العضوية بمستقبلات الأحماض الدهنية الحرة 1 (FFAR1) ، مما يزيد من تركيز Ca 2+ داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى بروتينات إشارات كينازات مثل PI3K و MAPK ، مما يؤدي إلى تنشيط العامل النووي kappa-light-chain محسن الخلايا البائية المنشطة (NF-κB) وتعزيز الاستجابة الالتهابية25.
باختصار ، على الرغم من أنه لا يوجد نموذج يمكنه إعادة إنتاج ميزات متلازمة الضائقة التنفسية الحادة بشكل كامل ، إلا أنها أدوات قيمة لدراسة المرض. البحث قبل السريري أمر بالغ الأهمية في فهم الفيزيولوجيا المرضية لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة وتطوير علاجات جديدة. إن إعطاء الزراعة العضوية داخل القصبة الهوائية والوريدية ، في شكل ملح ، يولد نماذج ARDS موثوقة وقابلة للتكرار ، مما يجعله نموذجا ذهبيا لدراسة متلازمة الضائقة التنفسية الحادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل معهد أوزوالدو كروز ، ومؤسسة أوزوالدو كروز (FIOCRUZ) ، ومنحة Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ، وبرنامج التكنولوجيا الحيوية للجامعة الاتحادية للفلومينينس (UFF) ، والجامعة الفيدرالية للدولة في ريو دي جانيرو (UNIRIO) ، ومؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لإنفاذ الحقوق الدستورية (Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) ، والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq). يتم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 باستخدام BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
- Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E.
- The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
- Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
- D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
- Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
- Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
- Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
- Matthay, M. A., et al.
- Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
- Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
- Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
- Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
- Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
- Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
- Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
- Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
- Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
- Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
- McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
- Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
- Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
- Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
- Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
- Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
- Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
- Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
- Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).
