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Immunology and Infection

올레산 유도 급성 호흡곤란 증후군의 마우스 모델

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63566
Automatic Translation
*1,2,5, *1,2,6, 1,3,4, 1,3, 1,2,4,5,6
1Laboratório de Imunofarmacologia, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2Laboratório de Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 4Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 5Programa de Pós-Graduação em Ciências e Biotecnologia, Universidade Federal Fluminense, 6Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal Fluminense
* These authors contributed equally

Summary

본 프로토콜은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 모방하기 위해 올레산을 사용하는 마우스의 폐 손상 모델을 설명합니다. 이 모델은 부종에 대한 염증 매개체를 증가시키고 폐 순응도를 감소시킵니다. 올레산은 소금 형태(올레산염)로 사용되는데, 이 생리학적 형태가 색전증의 위험을 피하기 때문입니다.

Abstract

급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 치사율이 높은 중환자에게 심각한 위협이 됩니다. 오염 물질 노출, 담배 연기, 감염원, 지방산 등이 ARDS를 유발할 수 있습니다. 동물 모델은 ARDS의 복잡한 병리기전을 모방할 수 있습니다. 그러나 각각에는 한계가 있습니다. 특히 올레산(OA)은 중증 환자에서 증가하여 폐에 해로운 영향을 미칩니다. 골관절염은 색전, 조직 파괴, pH 변화, 부종 제거 손상 등을 통해 폐 손상을 유발할 수 있습니다. OA 유발 폐 손상 모델은 내피 손상, 폐포 투과성 증가, 염증, 막 유리질 형성 및 세포 사멸을 동반한 ARDS의 다양한 특징과 유사합니다. 본원에서, 폐 손상의 유도는 pH 7에서 OA의 생리학적 형태이기 때문에 OA(염 형태)를 폐에 직접 주입하고 마우스에 정맥 주사함으로써 설명된다. 따라서 소금 형태의 OA 주입은 색전을 유발하거나 pH를 변경하지 않고 폐 손상/ARDS를 연구하는 데 유용한 동물 모델이며, 이를 통해 중증 환자에서 일어나는 일에 근접할 수 있습니다.

Introduction

Ashbaugh et al.1은 1967년에 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 처음 기술했으며 그 이후로 여러 차례 개정되었습니다. 베를린의 정의에 따르면, ARDS는 환기 대 관류 비율의 불균형, 미만성 양측 폐포 손상(DAD) 및 침윤, 폐 무게 증가, 부종 2,3으로 인해 급성 호흡 부전 및 저산소혈증(PaO2/FiO2 > 300mmHg)을 유발하는 폐 염증입니다. 폐 실질은 상피, 내피 및 기타 세포가 복합된 복잡한 세포 환경입니다. 이 세포들은 허파꽈리에서 가스 교환과 항상성을 담당하는 장벽과 구조를 형성한다3. 상피 장벽 내에서 가장 풍부한 세포는 Na/K-ATPase를 통한 가스 교환 및 체액 관리를 위한 더 큰 표면적을 가진 폐포 유형 I 세포(AT1)입니다. 또한, 폐포 II형 세포(AT2)는 계면활성제를 생산하여 허파꽈리의 표면장력을 감소시킨다4. 그 아래에는 내피 세포가 반투과성 장벽을 형성하여 폐 순환과 간질을 분리합니다. 그 기능에는 자극 감지, 염증 반응 조정, 세포 이동이 포함됩니다5. 내피세포는 또한 가스 교환, 혈관 긴장도, 응고를 조절한다5. 따라서 내피 및 상피 기능 장애는 전염증성 표현형을 악화시켜 폐 손상을 일으켜 ARDS를 유발할 수있다 5.

ARDS의 발병은 세균성 및 바이러스성 폐렴 또는 비폐패혈증, 외상, 수혈, 췌장염과 같은 간접적인 요인과 관련이 있다6. 이러한 조건은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 및 손상 관련 분자 패턴(DAMP)의 방출을 유발하여 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-8과 같은 전염증성 사이토카인 및 케모카인을 유도합니다5. TNF-α는 내피 장벽 파괴 및 폐 실질로의 백혈구 침윤에서 혈관-내피 카데린(VE-cadherin) 분해와 관련이 있습니다. 호중구는 IL-8 및 LTB4 5,7,8에 의해 유도되어 이동하는 첫 번째 세포입니다. 호중구는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine), 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)9 및 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular trap, NET) 형성을 증가시켜 추가적인 내피 및 상피 손상을 발생시킨다10. 상피 손상은 AT2 세포와 상주 대식세포에서 염증과 톨 유사 수용체의 활성화를 촉진하여 염증 세포를 폐로 끌어들이는 케모카인의 방출을 유도한다4. 또한 인터페론-β(INFβ)과 같은 사이토카인의 생성은 TNF 관련 세포사멸 유도 수용체(TRAIL)를 유발하여 ATII 세포를 세포사멸로 유도하여 체액 및 이온 클라렌스를 손상시킵니다4. 내피 및 상피 장벽 구조의 파괴로 인해 체액, 단백질, 적혈구 및 백혈구가 폐포 공간으로 유입되어 부종을 유발합니다. 부종이 생기면 호흡과 가스 교환을 유지하려는 폐의 노력이 바뀐다11. 고탄산혈증과 저산소혈증은 세포 사멸과 나트륨 수송 장애를 유발하여 불량한 제거 능력으로 인한 폐포 부종을 악화시킨다10. ARDS는 또한 장기 기능 장애, 폐포 호중구 비율 증가, 폐포 투과성과 관련된 IL-17A 수치 상승을 나타낸다9.

최근 몇 년 동안 ARDS의 병태생리학, 역학 및 치료에 대한 연구가 지속적으로 발전하고 있습니다12,13. 그러나 ARDS는 기계적 환기 및 수액 치료 최적화를 초래하는 치료 연구의 진전에도 불구하고 이질적인 증후군입니다. 따라서 보다 효과적인 직접 약물 치료가 여전히 필요하며10 동물 연구는 ARDS 메커니즘과 중재 대상을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

현재의 ARDS 모델은 병리학을 완전히 복제할 수 없습니다. 따라서 연구자들은 종종 자신의 관심사에 더 잘 맞을 수 있는 모델을 선택합니다. 예를 들어, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 유도 모델은 주로 TLR4에 의해 유발되는 내독성 쇼크에 의해 ARDS를 유도한다14. HCl 유도는 산 흡인을 모방하며, 손상은 호중구에 의존한다14. 한편, 현재의 올레산나트륨 모델은 혈관 투과성과 부종을 증가시키는 내피 손상을 유발합니다. 또한 액체 형태의 올레산 대신 올레산 나트륨을 사용하면 색전증 위험과 혈액 pH15의 변화를 피할 수 있습니다.

ARDS용 동물 모델
동물 모델을 이용한 전임상 연구는 병리학을 이해하는 데 도움이 되며 새로운 ARDS 치료 연구에 필수적입니다. 이상적인 동물모델은 임상적 상황과 유사한 특성과 각 질병 단계, 진화 및 복구의 관련 병태생리학적 특징과 함께 질병 기전의 우수한 재현성을 가져야 한다14. ARDS의 급성 폐 손상을 전임상적으로 평가하기 위해 여러 동물 모델이 사용됩니다. 그러나 모든 모델에는 한계가 있기 때문에 인간 병리학 6,14,16을 완전히 재현하지는 못한다. 올레산-유도 ARDS는 다른 동물 종에서 사용된다17. 골관절염 주사를 맞은 돼지18, 양19, 개20은 폐포-모세혈관막 기능 장애, 단백질 및 세포 침윤으로 인한 투과성 증가 등 질병의 다양한 임상적 특징을 나타낸다.

예를 들어, 1.25μM의 OA를 정맥 주사하면 경상피 수송이 차단되어 폐포 부종이발생한다 15. 대안적으로, A549 세포를 사용한 시험관 내 모델에서, 10μM 농도의 OA는 상피 나트륨 채널(eNAC) 또는 Na/K-ATPase의 발현을 변화시키지 않았다. 그러나, OA는 두 채널 모두와 연관되어 그들의 활동을 직접적으로 억제하는 것으로 보인다21. 0.1mL/kg의 OA 정맥 주사는 폐 조직의 울혈과 부종을 유발하고, 폐포 중격이 두꺼워지면서 폐포 공간이 줄어들고, 염증성 및 적혈구 수가 증가했다22. 또한, OA는 폐의 내피 및 상피 세포에서 세포 사멸과 괴사를 유도했다15. 생쥐에서 기관내로 트리스-올레이트 용액을 주입하면 자극 후 6시간 이내에 호중구 침윤 및 부종이 증가한다23. 24시간 OA 주사는 전염증성 사이토카인 수치(즉, TNF-α, IL-6 및 IL-1β)를 증가시켰습니다23. 또한 트리스-올레에이트 10μM의 정맥 주사(안와신경총)는 선택적 효소 억제제인 10-3μM의 우아바인과 유사한 폐 Na/K-ATPase 활성을 억제합니다. 또한 OA는 세포 침투, 지질체 형성, 류코트리엔 B4(LTB4) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성으로 염증을 유발합니다.22,24. 따라서 올레산 유도 ARDS는 부종, 출혈, 호중구 침윤, 골수화효소(MPO) 활성 증가 및 ROS24를 생성합니다. 따라서 OA 투여는 폐 손상에 대한 잘 확립된 모델입니다22,25. OA가 있는 이 기사에 제시된 모든 결과는 소금 형태인 올레산나트륨을 나타냅니다.

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Protocol

이 연구에 사용된 절차는 Oswaldo Cruz Foundation의 동물 사용에 관한 윤리 위원회(CEUA 라이선스 n°002-08, 36/10 및 054/2015)의 승인을 받았습니다. 오스왈도 크루즈 재단(FIOCRUZ)의 생체모델 과학기술연구소(ICTB)에서 제공한 20-30g 무게의 수컷 스위스 웹스터 마우스를 실험에 사용했다. 동물들은 Pavilhão Ozório de Almeida의 vivarium에 있는 환기가 잘 되는 격리 장치에 보관되었으며 물과 음식은 즉시 사용할 수 있었습니다. 그들은 12시간/12시간의 빛과 어둠 주기에 노출되었습니다.

1. 올레산 나트륨 용액의 제조

  1. 올레산을 사용하여 멸균 튜브 또는 유리 플라스크에 100mmol/L의 올레산나트륨 원액을 준비합니다.
    참고: 본 작업을 위해 50mL(최종 부피) 용액을 준비했지만 실험적 필요에 따라 부피를 조정해야 합니다. 용액은 항상 멸균 튜브 또는 유리 용기에 준비해야 합니다.
    1. 먼저 초순수에 NaOH 정제 또는 용액을 첨가하여 pH를 높입니다. 25mL 용량에 대해 12-13의 pH 값이 권장됩니다.
      알림: 또는 Tris 베이스를 사용하여 Tris-oleate 용액을 준비할 수 있습니다.
    2. 올레산( 재료 표 참조)을 37°C의 초음파 수조에서 일정한 교반 하에 한 방울씩 매우 천천히 첨가합니다.
      알림: 올레산 침전이 발생하면 처음부터 다시 시작하십시오.
    3. 올레산이 완전히 용해되면 pH를 7.4로 조심스럽게 조정하고 초순수 희석된 HCl을 사용하여 교반하면서 한 방울씩 떨어뜨린 다음 최종 부피인 50mL로 조정합니다.
      알림: 작업 올레이트 용액을 새로 준비하십시오. 대안적으로, 용액은 질소가 풍부한 환경에서 -20°C에서 분취, 비축 및 유지되어 한 달 이상 산화를 피할 수 없습니다. 냉동-재냉동 주기를 피하십시오.

2. 올레산에 의한 폐 손상 유도

  1. 올레산의 기관내 투여를 수행합니다.
    1. 수의학 마취 기화기를 사용하여O2 2 L/min으로 5% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다(그림 1A). 절개 부위의 털을 제모 크림으로 제거하고 멸균 거즈를 사용하여 베타딘 스크럽과 알코올을 번갈아 3회 번갈아 가며 소독합니다. 발가락 꼬집으로 마취 깊이를 확인합니다.
      알림: 시술 중에는 멸균 장갑과 기구를 사용하십시오. 드레이프를 사용하여 동물을 덮고 절개 부위만 노출시킵니다. 이소불소가 환경으로 빠져나가는 것을 방지하기 위해 생물 안전 작업대에서 실험을 수행합니다. 진통제는 염증 반응을 억제할 수 있으므로 투여하지 않습니다.
    2. 마취 후 동물을 등쪽 욕창 자세로 눕히고 갑상선 수준에서 V자 모양으로 절개(0.5-1cm)합니다. 갑상선을 부드럽게 옮겨 기관을 노출시키고(그림 1B) 준비된 올레이트 용액 50μL를 주입합니다(1단계).
      참고: 쥐는 두 그룹으로 나뉘었고 각 그룹에는 8마리의 동물이 있었습니다. 폐 손상 그룹은 25mM(1.25μmol)의 나트륨-올레산염 용액을 투여받고, 대조군은 인슐린 주사기(부피 300μL, 30G)로 각 마우스의 기관에 점안하여 50μL의 멸균 식염수를 투여합니다(그림 1C).
    3. 합성 비흡수성 모노필라멘트 봉합사로 생쥐의 절개 부위를 봉합하고 케이지로 되돌려 놓고 수술에서 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 모든 절차 동안 동물을 37°C의 가열 패드에 유지하십시오.
      참고: 마우스는 일반적으로 수술 후 회복하는 데 최대 15분이 걸립니다.
  2. 올레산의 정맥 투여를 수행합니다.
    1. 마취 후(단계 2.1.1, 그림 2A) 안와(eye socket)의 내측 안각(medial canthus)에 초미세 바늘(재료 표 참조)을 삽입하여 안와신경총에 정맥 주사합니다(그림 2B).
      참고: 쥐는 두 그룹으로 나뉘었고 각 그룹에는 8마리의 동물이 있었습니다. 각 그룹은 동물당 10μmol의 OA로 100μL의 나트륨-올레에이트 용액을 투여받는 반면, 대조군은 100μL의 멸균 식염수를 투여받습니다.
  3. 수술 후에는 매일 동물의 부작용을 모니터링하십시오. 안락사에 대한 인도적 종점에는 부작용, 경련 및 혼수 상태가 포함됩니다.

3. 기관지 폐포 세척액 수집(BALF)

  1. 케타민(300mg/Kg)과 자일라진(30mg/Kg)의 복강내 치사량으로 마우스를 안락사시킨다( 자료표 참조).
  2. 동물을 등쪽 욕창 위치에 눕히고 동물의 앞쪽 부위에 수술용 가위로 약 1cm를 절개하고 기관을 노출시키고 정맥 카테터(20G)를 삽입하기 위해 작게 자릅니다.
  3. 카테터를 1mL 멸균 주사기에 연결하고 0.5mL의 멸균 식염수를 폐에 천천히 점차적으로 주입한 다음 동일한 주사기로 BALF의 액체를 흡인합니다. 3-5회 반복하고 멸균 마이크로튜브에 옮겨 얼음에 넣습니다.
    참고: 샘플은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

4. BALF의 전체 세포 및 차등 세포 분석

  1. 총 세포 수를 위해 20μL의 BALF를 180μL(10배 희석)의 Turk's 용액에 희석합니다( 재료 표 참조). 40x 대물렌즈가 있는 광학 현미경 아래의 Neubauer 챔버를 사용하여 계수를 수행합니다.
  2. 차등 계수를 위해 슬라이드가 포함된 세포 깔때기에 100μL의 BALF를 넣고 세포 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 22.86 x g 으로 원심분리하고 May-Grunwald(15%, pH 7.2)-Giemsa(1:10)로 염색합니다( 재료 표 참조). 이멀젼 대물렌즈가 있는 광학 현미경에서 세포 계수를 진행합니다.

5. BALF의 총 단백질 측정

  1. 상용 단백질 정량 분석 키트로 총 BALF 상층액 단백질을 측정하고 제조업체의 지침에 따라 분광 광도계를 사용하여 562nm에서 흡광도를 판독합니다( 재료 표 참조).

6. 효소 면역흡착 분석

  1. BALF를 1,200 x g에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 피펫으로 상층액을 수집하고 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2 15,23,25 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.
    참고: 6.1단계의 원심분리는 BALF를 cell-free로 만듭니다.
    1. 제조업체의 지침에 따라 상용 ELISA 키트를 사용하여 cell-free BALF에 대한 사이토카인 분석을 수행합니다. 제조업체의 지침에 따라 효소 면역분석(EIA) 키트를 사용하여 PGE2 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).

7. 지질 체내 염색 및 계산

  1. Ca 2+, Mg2+ free Hank의 완충염 용액(HBSS, pH 7.4)에서 3.7% 포름알데히드를 사용하여 cytospin 슬라이드에 백혈구를 고정하고 아직 촉촉한 상태에서 1.5% OsO4로 염색합니다.3(재료 표 참조). 그런 다음 현미경의 오일 이멀젼 대물 렌즈를 사용하여 각 슬라이드에서 50개의 연속된 백혈구에서 세포당 지질체를 계산합니다.

8. 통계 분석

  1. 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 결과를 평균 ± SEM으로 표현하고 일원 분산 분석으로 분석한 후 사후 검정 Newman-Keuls-Student26으로 분석합니다. P 가 0.05일 때 유의< 차이를 고려하십시오.

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Representative Results

손상되지 않은 폐에서 폐포액 청소는 온전한 폐포 상피층을 통한 이온의 이동에 의해 발생합니다. 삼투압 구배는 허파꽈리에서 폐간질로 체액을 운반하여 림프관에 의해 배출되거나 재흡수됩니다. Na/K-ATPase는 이 수송11을 구동한다. OA는 Na/K-ATPase27 및 나트륨 채널 21의 억제제이며, 이는 이미 제안한 바와 같이 부종 형성에 기여할 수 있습니다23. ARDS의 염증 반응이 악화되면 폐포 손상, 내피 및 상피 투과성 증가, 단백질과 염증 세포가 풍부한 폐포액 축적으로 부종을 유발합니다. 부종은 간질액의 축적과 가스 교환 장애로 인해 폐의 호흡수를 증가시켜 저산소혈증과 호흡부전을 초래한다28. TNF-α 및 혈관내피성장인자(VEGF)와 같은 사이토카인은 VE-cadherin 결합을 불안정하게 하여 내피 투과성 및 폐포액 축적 증가에 기여한다7.

OA 주입은 기관 내 및 정맥 내 경로에서 총 백혈구를 증가시켰습니다(그림 3). 기관내 경로가 아닌 정맥 내 경로로 폐 손상에 대한 OA를 유도해야 했습니다. 본 연구는 BALF의 호중구 수가 6시간에 증가하고, 24시간에 최고조에 달하고, 48시간 및 72시간에 감소하는 것을 보여주었다. BALF에서 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 농도가 더 높은 것은 OA 기관내 점안 24시간 후에 관찰되었습니다23 (그림 4). 골관절염은 부종 제거를 방지하고 정맥 및 기관 내 경로 모두에 의해 단백질이 풍부한 부종의 형성을 유발할 수 있다15,23. 폐부종은 BALF의 총 단백질 분석으로 평가되었으며, IV 및 IT 투여가 총 단백질 농도를 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 5). 지질체는 에이코사노이드 생산 8,29에 대한 기질과 효소를 포함하는 세포 내 소기관입니다. 지질체의 형성은 지질 매개체의 생산을 향상시키고 세포 활성화에 접근하는 데 사용할 수 있습니다. 기관 내 및 정맥 OA 주입은 24시간 후 지질체 형성 및 PGE2 농도23을 향상시켰습니다(그림 6). OA 주입은 또한 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 조직학에서 볼 수 있듯이 기관 내 및 정맥 내 경로에서 조직 파괴, 출혈 및 백혈구 침윤을 유도했습니다(그림 7). 또한, 골관절염은 폐 기능에 변화를 일으킨다19. 따라서 올레산에 의한 폐 손상은 수많은 ARDS 특징을 나타냅니다.

Figure 1
그림 1: 기관 내 투여 프로토콜의 개별 단계 . (A) 마우스는 5 % 이소 플루오란과 2 L / min의 O2 를 사용하여 마취됩니다. (B) 등쪽 욕창 자세를 취한 쥐에서 수술용 가위로 기관 절개. (C) 인슐린 주사기를 사용한 기관 내 점안. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 정맥 투여 프로토콜의 개별 단계 . (A) 마우스를 5% 이소플루오란과 2L/min의 O2로 마취합니다. (B) 내측 안각에 인슐린 주사기를 사용하여 정맥 주사. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: OA의 투여는 마우스의 BALF에서 백혈구 활성화를 유도합니다. 정맥 투여(i.v) 및 기관내 투여(i.t)(A)의 총 백혈구 및 May-Grünwald-Giemsa(B)로 염색된 기관내 투여(i.t.)의 예시적인 현미경 사진(1000x 확대)은 OA 챌린지 후 24시간 후에 수행되었습니다. 눈금 막대 = 10μm. 동일한 부피의 멸균 식염수를 대조군에 투여하였다. 각 막대는 최소 7마리의 평균 ± SEM을 나타냅니다. *P < 0.05, 대조군과 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: OA의 기관내 투여(i.t)는 생쥐의 폐에서 염증 매개체의 생성을 유도합니다. TNF-α(A), IL-6(B), IL-1β(C)는 챌린지 24시간 후에 측정되었습니다. 멸균 식염수를 대조군에 투여하였다. 각 막대는 최소 6마리의 동물에 대한 평균 ± SEM을 나타냅니다. *P < 0.05, 대조군과 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: OA 주입 후 24시간 동안 BALF의 총 단백질 함량. OA의 기관내(i.t.) 및 정맥 투여(i.v.) 투여는 마우스의 BALF에서 총 단백질을 증가시킵니다. 대조군은 동일한 양의 멸균 식염수를 투여받았습니다. 그 결과는 적어도 6 개의 다른 동물로부터 SEM을 ± 수단입니다. *P < 0.0001, 대조군과 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 백혈구의 지질체 형성 및 OA 처리 마우스의 BALF에서 PGE2 생산. OA의 기관내(i.t) 및 정맥내(i.v) 투여는 각각 마우스의 BALF에 염증 매개체와 지질체 축적을 유도합니다. (C) OA 챌린지 24시간 후 사산화오스뮴(OsO4)으로 동물의 폐에서 염색된 지질체(1000배 확대)의 예시 현미경 사진. 화살표는 지질체를 가리킵니다. 눈금 막대 = 10μm. 대조군은 동일한 양의 식염수를 받았습니다. 결과는 7 마리의 동물에서 SEM± 평균입니다. *P < 0.05, 대조군과 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 생쥐의 예시적인 폐 조직학 . (A) 생리식염수로 처리하고 출혈의 징후가 없는 대조군 마우스. (B) OA(i.v)의 정맥 투여. (C) 조직 변형을 동반한 기관내 투여(i.t). H&E 염색을 실시하였다. 배율, 1000x. 눈금 막대 = 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

전임상 연구를 수행하기 위해서는 올바른 ARDS 모델을 선택하는 것이 필수적이며, 평가자는 연령, 성별, 투여 방법 등과 같은 가능한 모든 변수를 고려해야 한다6. 선택한 모델은 패혈증, 지질 색전증, 폐혈관 허혈 재관류 및 기타 임상적 위험과 같은 위험 요인에 따라 질병을 재현해야 한다14. 그러나 ARDS에 사용된 동물 모델은 인간 증후군의 모든 특징을 재현할 수 없습니다. LPS, OA, 염산, 박테리아 및 바이러스를 포함한 다중 손상 물질 모델6. 또한, 상이한 투여 방법, 보다 일반적으로는 기관내, 비강 내 또는 정맥 투여가 사용된다. 폐허혈-재관류 모델은 모세혈관 파열과 폐포내 단백질의 축적을 유발한다6. LPS로 인한 폐 손상은 널리 사용되며 상피 및 내피 장벽의 급성 손상을 초래합니다. LPS는 기도 상피의 톨 유사 수용체 4(TLR-4)에 결합하여 NF-κB 활성화를 유발하여 사이토카인과 케모카인의 생성을 촉진하고 염증 세포(30)를 끌어당겨 강력한 호중구성 폐포염을 유발한다6. 그러나 이 모델은 균주와 동물 종 간의 차이를 보여주며, ARDS30을 앓고 있는 인간 환자에 대한 동물 결과의 재현성을 감소시킨다.

HCl 손상 모델은 산성 함량 흡인에 의해 ARDS를 모방합니다. 폐의 낮은 pH는 급성 염증 반응을 유발하고 후기 섬유화 손상을 유발합니다. 손상은 호중구에 따라 다르며 폐포 출혈, 부종 및 체액 청소 장애를 유발합니다. 그러나 인간은 HCl만 흡인하는 것이 아니라 종종 pH가 1.531보다 높은 복잡한 위 함량을 흡인합니다. 이들 및 다른 ARDS 모델들은 다른 곳들에서 광범위하게 검토되었다31. 사용된 모든 모델 중에서 올레산 유도 ARDS 모델이 가장 이상적입니다14.

올레산나트륨 모델은 폐 손상을 일으키고, 폐포 세포의 세포 사멸 및 괴사를 유도하며, TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β 및 MIP-1α 19와 같은 사이토카인 생성을 향상시킵니다19. OA는 또한 출혈과 함께 프로테아제와 엘라스타아제 발현을 유도하여 심각한 폐 손상을 일으킨다25. 골관절염은 지질 색전증, 폐혈관 투과성 증가, 방사선 침윤을 동반한 혈관외액으로 인해 질병을 재현한다32. 또한 ARDS 환자는 혈장 OA 농도가 더 높습니다 15,22,24.

OA 기관 내 투여는 임상 ARDS와 유사한 염증 매개체의 생성을 유도하고 폐 순응도 및 가스 교환을 감소시킵니다25,32. 골관절염 정맥 주사는 질병의 조직형학적 및 생리학적 측면을 촉진한다32. 혈청 알부민은 강력한 골관절염 리간드로, 폐 손상을 유도하기 위해 기관내(1.25μmol)23보다 OA(10μmol)15 양이 더 많은 OA(15μmol)15 양을 필요로 하는 이유를 설명할 수 있습니다. 실제로 우리 그룹은 렙토스피라증 환자에서 OA/알부민 불균형과 높은 사망 위험 사이의 상관관계를 보여주었다33.

다른 모든 모델과 마찬가지로 모델에는 몇 가지 단점이 있습니다. 올레산을 소금 형태로 투여하지 않으면 혈액 유화로 인해 독성 효과와 변이를 일으킬 수 있습니다. 이 기사에서 설명했듯이 소금 형태를 사용하면 독성 효과가 감소하고 색전 형성과 혈액 및 폐의 pH 변동이라는 두 가지 문제를 피할 수 있습니다. 또한, 폐 손상이 2차 효과(15)에 의한 것이 아니라 올레에이트(oleate)에 의해 발생한다는 것을 확인한다. 또한, 이 모델에서 염 형태의 올레산의 제조는 알부민과의 접합을 필요로 하지 않는다. 연구에 따르면 알부민은 염증과 혈관 투과성을 줄이는 데 유익한 효과가 있습니다. 또한 알부민은 폐 손상 환자의 혈류역학 및 호흡을 회복시킵니다. 따라서, 알부민과 OA를 결합하면 동물에 대한 알부민의 영향이 손상되어 모델의 생존력이 감소할 수 있습니다33,34.

분자 수준에서 올레산나트륨은 나트륨-칼륨 ATPase(NKA)와 나트륨 채널(eNac)을 억제하여 이온 수송을 방해하고 혈관 투과성과 부종 형성을 증가시킨다15. 또한 OA는 유리 지방산 수용체 1 (FFAR1)에 결합하여 세포 내 Ca 2+ 농도를 증가시켜 PI3K 및 MAPK와 같은 단백질 신호 전달 효소를 유발하여 활성화 된 B 세포 (NF-κB)의 핵 인자 kappa-light-chain-enhancer를 유도하고 염증 반응을 향상시킬 수 있습니다25.

요약하자면, 어떤 모델도 ARDS의 특징을 완전히 재현할 수는 없지만, ARDS는 질병을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 전임상 연구는 ARDS의 병태생리학을 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다. 염 형태의 OA를 기관 내 및 정맥 투여하면 신뢰할 수 있고 재현 가능한 ARDS 모델이 생성되어 ARDS를 연구하는 데 있어 황금 모델이 됩니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

이 연구는 Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)의 지원을 받았습니다. 그리고 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). 그림 1과 그림 2는 BioRender.com 사용하여 작성되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic vaporizer SurgiVet model 100
Braided slik thread with needle number 5 Shalon medical N/A
Cabinet vivarium Insight  Model EB273
Centrifuge Eppendorf 5430/5430R
Cytofunnel ThermoFisher 11-025-48
Drontal puppy Bayer N/A
Hank's balanced Salts Sigma-Aldrich H4981
Heatpad tkreprodução TK-500
Hydrocloric Acid Sigma-Aldrich 30721
Insulin syringe Ultrafine BD 328322
Isoforine 1mL/mL Cristália N/A
Ketamine Syntec N/A
May-Grunwald-Giemsa Sigma-Aldrich 205435
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23235
Microscope  PrimoStar Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA R&D system DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA R&D system DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA R&D system DY410
Neubauer chamber improved bright-line Global optics
Oleic Acid (99%) Sigma-Aldrich O1008
Osmium tetroxide solution (4%) Sigma-Aldrich 75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G BD Angiocath 388333
Prism 8 (graphic and statistic software) Graphpad N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal Cayman Chemical 514010
Shandon Cytospin 3 ThermoFisher N/A
Sodium hydroxide Merck 1,06,49,81,000
Spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice ICTB/FIOCRUZ N/A
Syringe 1 mL BD 990189
Tris-base Bio Rad 161-0719 Electrophoresis purity reagent
Türk's solution Sigma-Aldrich 93770
Xilazine Syntec N/A

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References

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de Oliveira Rodrigues, S., Patricio de Almeida, M. A., Castro-Faria-Neto, H. C., Silva, A. R., Felippe Gonçalves-de-Albuquerque, C. Mouse Model of Oleic Acid-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. J. Vis. Exp. (184), e63566, doi:10.3791/63566 (2022).

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