Summary
本方案描述了使用油酸模拟急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的小鼠肺损伤模型。该模型增加了水肿的炎症介质并降低了肺顺应性。油酸以盐形式（油酸盐）使用，因为这种生理形式避免了栓塞的风险。
Abstract
急性呼吸窘迫综合征 （ARDS） 对病死率高的危重患者构成重大威胁。污染物暴露、香烟烟雾、传染性病原体和脂肪酸可诱发急性呼吸窘迫综合征。动物模型可以模拟ARDS的复杂病理机制。但是，它们中的每一个都有局限性。值得注意的是，油酸 （OA） 在危重患者中升高，对肺部有害。OA可通过栓子、破坏组织、改变pH值和损害水肿清除来诱发肺损伤。OA 诱导的肺损伤模型类似于 ARDS 的各种特征，包括内皮损伤、肺泡通透性增加、炎症、膜透明形成和细胞死亡。本文，通过将OA（盐形式）直接注射到肺中并在小鼠中静脉注射来描述肺损伤的诱导，因为它是pH 7时OA的生理形式。因此，以盐形式注射 OA 是一种有用的动物模型，可以在不引起栓子或改变 pH 值的情况下研究肺损伤/ARDS，从而接近危重患者的情况。
Introduction
Ashbaugh 等人 1967 年首次描述了急性呼吸窘迫综合征 （ARDS），此后经历了多次修订。根据柏林的定义，急性呼吸窘迫综合征是一种肺部炎症，由于通气灌注比失衡、弥漫性双侧肺泡损伤 （DAD） 和浸润、肺重量增加和水肿导致急性呼吸衰竭和低氧血症 （PaO 2/FiO2 > 300 mm Hg） 2,3。肺实质是由上皮细胞、内皮细胞和其他细胞复合而成的复杂细胞环境。这些细胞形成屏障和结构，负责肺泡中的气体交换和稳态3.上皮屏障内最丰富的细胞是肺泡 I 型细胞 （AT1），具有更大的表面积，可通过 Na/K-ATP 酶进行气体交换和液体管理。此外，肺泡 II 型细胞 （AT2） 产生表面活性剂，降低肺泡4 的表面张力。在下面，内皮细胞形成半透性屏障，将肺循环与间质隔开。其功能包括检测刺激、协调炎症反应和细胞迁移5。内皮细胞还调节气体交换、血管张力和凝血5。因此，内皮和上皮功能紊乱可能会加剧促炎表型，导致肺损伤，导致 ARDS5。
急性呼吸窘迫综合征的发生与细菌性和病毒性肺炎或间接因素（如非肺脓毒症、创伤、输血和胰腺炎）相关6。这些条件导致病原体相关分子模式 （PAMP） 和损伤相关分子模式 （DAMP） 的释放，诱导促炎细胞因子和趋化因子，如 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-85。TNF-α 与内皮屏障破坏和白细胞浸润肺实质中的血管内皮钙粘蛋白 （VE-cadherin） 降解有关。中性粒细胞是最早迁移的细胞，被 IL-8 和 LTB4 5,7,8 吸引。中性粒细胞进一步增加促炎细胞因子、活性氧 （ROS）9 和中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 的形成，从而产生额外的内皮和上皮损伤10。上皮损伤促使 AT2 细胞和驻留巨噬细胞中 Toll 样受体的炎症和激活，诱导趋化因子的释放，将炎症细胞吸引到肺部4.此外，干扰素-β （INFβ） 等细胞因子的产生会导致 TNF 相关细胞凋亡诱导受体 （TRAIL），导致 ATII 细胞凋亡，损害液体和离子clarence 4。内皮和上皮屏障结构的破坏使液体、蛋白质、红细胞和白细胞流入肺泡间隙，引起水肿。随着水肿的建立，维持呼吸和气体交换的肺部努力会改变11.高碳酸血症和低氧血症可诱导细胞死亡和钠转运紊乱，由于清除能力差，加重肺泡水肿10。急性呼吸窘迫综合征还具有 IL-17A 水平升高，与器官功能障碍、肺泡中性粒细胞百分比增加和肺泡通透性9 有关。
近年来，ARDS 的病理生理学、流行病学和治疗研究不断取得进展12,13。然而，ARDS 是一种异质性综合征，尽管治疗研究取得了进展，从而优化了机械通气和液体治疗。因此，仍然需要更有效的直接药物治疗10，动物研究可能有助于揭示ARDS的机制和干预目标。
目前的 ARDS 模型无法完全复制病理学。因此，研究人员通常会选择更符合他们兴趣的模型。例如，脂多糖 （LPS） 诱导模型通过主要由 TLR414 触发的内毒性休克诱导 ARDS。HCl 诱导类似于酸抽吸，损伤呈中性粒细胞依赖性14。另一方面，目前的油酸钠模型会诱发内皮损伤，从而增加血管通透性和水肿。此外，使用油酸钠代替液体形式的油酸可以避免栓塞风险和血液 pH值 15 的改变。
急性呼吸窘迫综合征的动物模型
动物模型的临床前研究有助于了解病理学，对于新的ARDS治疗研究至关重要。理想的动物模型需要具有与临床情况相似的特征和疾病机制的良好可重复性，并具有每个疾病分期、演变和修复的相关病理生理特征14。几种动物模型用于临床前评估 ARDS 的急性肺损伤。然而，由于所有模型都有局限性，它们不能完全再现人类病理学6,14,16。油酸诱导的 ARDS 用于不同的动物物种17。接受OA注射的猪18、绵羊19和狗20表现出该病的许多临床特征，伴有肺泡-毛细血管膜功能障碍和蛋白质和细胞浸润的通透性增加。
例如，静脉注射 1.25 μM 的 OA 阻断了经上皮转运，导致肺泡水肿15。或者，在使用 A549 细胞的体外模型中，浓度为 10 μM 的 OA 不会改变上皮钠通道 （eNAC） 或 Na/K-ATP 酶的表达。然而，OA似乎与这两个通道相关联，直接抑制了它们的活动21。0.1 mL/kg 的 OA 静脉注射引起肺组织充血和肿胀，肺泡间隙缩小，肺泡隔增厚，炎症和红细胞计数增加22。此外，OA 诱导肺内皮细胞和上皮细胞凋亡和坏死15.在小鼠气管内注射三油酸酯溶液，增强中性粒细胞浸润和水肿，最早在刺激后6小时23。24 小时 OA 注射增加促炎细胞因子水平（即 TNF-α、IL-6 和 IL-1β）23。此外，静脉内（眼眶丛）注射10μM三油酸酯抑制肺Na / K-ATP酶活性，类似于10-3μM的ouabain，一种选择性酶抑制剂。此外，OA 会通过细胞浸润、脂质体的形成以及白三烯 B4 （LTB4） 和前列腺素 E2 （PGE2） 的产生来诱导炎症22,24。因此，油酸诱导的 ARDS 会产生水肿、出血、中性粒细胞浸润、髓过氧化物酶 （MPO） 活性增加和 ROS24。因此，OA 给药是肺损伤的成熟模型22,25。本文中介绍的所有具有 OA 的结果都代表盐形式油酸钠。
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Protocol
本研究中使用的程序已获得奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会动物使用伦理委员会的批准（CEUA 许可证编号 002-08、36/10 和 054/2015）。由奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（FIOCRUZ）的生物模型科学与技术研究所（ICTB）提供的体重在20-30克之间的雄性瑞士韦伯斯特小鼠用于实验。这些动物被饲养在Pavilhão Ozório de Almeida动物饲养室的通风隔离器中，可以 随意获得水和食物。它们暴露于12小时/12小时的光暗循环中。
1.油酸钠溶液的制备
- 使用油酸在任何无菌管或玻璃烧瓶中制备 100 mmol/L 油酸钠储备溶液。
注：为本工作制备了50 mL（最终体积）溶液，但必须根据实验需要调整体积。溶液必须始终在无菌管或玻璃容器中制备。- 首先，加入NaOH片剂或超纯水中的溶液以升高pH值。对于 25 mL 体积，建议 pH 值为 12-13。
注：或者，Tris碱可用于制备Tris-油酸酯溶液。 - 在37°C的超声波浴中不断搅拌，非常缓慢地逐滴加入油酸（见 材料表）。
注意：如果发生油酸沉淀，请从头开始。 - 油酸完全溶解后，小心地将pH调节至7.4，在搅拌下逐滴，用超纯稀释的HCl，然后调节至最终体积50mL。
注意：新鲜制备工作油酸酯溶液。或者，可以将溶液等分，储存，并在-20°C下在富含氮的环境中保持，以避免氧化不超过一个月。避免冷冻-重新冷冻循环。
- 首先，加入NaOH片剂或超纯水中的溶液以升高pH值。对于 25 mL 体积，建议 pH 值为 12-13。
2.油酸诱导肺损伤
- 进行油酸的气管内给药。
- 使用兽用麻醉剂汽化器使用5%异氟醚和2L / min的O2 麻醉小鼠（图1A）。用脱毛膏去除切口处的毛发，并使用无菌纱布交替使用三轮倍他丁磨砂膏和酒精对该区域进行消毒。通过捏脚趾确认麻醉深度。
注意： 在手术过程中使用无菌手套和器械。使用窗帘覆盖动物并仅暴露切口部位。在生物安全柜中进行实验，以避免异氟烷逃逸到环境中。不使用镇痛药，因为它们可能会抑制炎症反应。 - 麻醉后，将动物置于褥疮背侧位置，并在甲状腺水平上做一个V形切口（0.5-1厘米）。轻轻地移位甲状腺以暴露气管（图1B）并注射50μL制备的油酸溶液（步骤1）。
注：将小鼠分为两组，每组8只动物。肺损伤组接受25mM（1.25μmol）的油酸钠溶液，对照组接受50μL无菌生理盐水，用胰岛素注射器（体积300μL，30G）滴入每只小鼠的气管中（图1C）。 - 用合成的不可吸收的单丝缝合线缝合小鼠的切口部位，将其放回笼子中，并监测它直到从手术中完全恢复。在所有过程中，将动物保持在37°C的加热垫上。
注意：小鼠通常需要长达15分钟才能从手术中恢复。
- 使用兽用麻醉剂汽化器使用5%异氟醚和2L / min的O2 麻醉小鼠（图1A）。用脱毛膏去除切口处的毛发，并使用无菌纱布交替使用三轮倍他丁磨砂膏和酒精对该区域进行消毒。通过捏脚趾确认麻醉深度。
- 进行油酸静脉内给药。
- 麻醉后（步骤2.1.1， 图2A），通过将超细针（参见 材料表）插入眼窝内眦（图2B）静脉注射到眼丛中。
注：将小鼠分为两组，每组8只动物。每组接受100μL油酸钠溶液，每只动物接受10μmolOA，而对照组接受100μL无菌盐水。
- 麻醉后（步骤2.1.1， 图2A），通过将超细针（参见 材料表）插入眼窝内眦（图2B）静脉注射到眼丛中。
- 手术后，每天监测动物的不良反应。安乐死的人道终点包括不良反应、抽搐和昏迷。
3.支气管肺泡灌洗液收集（BALF）
- 用腹膜内致死剂量的氯胺酮（300mg / Kg）和甲苯噻嗪（30mg / Kg）对小鼠实施安乐死（参见 材料表）。
- 将动物置于褥疮背侧位置，用手术剪刀在动物的前部区域切开约1厘米的切口，暴露气管并做一个小切口以引入静脉导管（20G）。
- 将导管连接到 1 mL 无菌注射器，缓慢逐渐将 0.5 mL 无菌生理盐水注入肺部，然后用同一注射器从 BALF 中吸出液体。重复3-5次，并将其转移到无菌微管中，将它们置于冰中。
注意：样品可以在-20°C下储存长达6个月。
4. BALF中的总细胞和差异细胞分析
- 对于总细胞计数，在 180 μL（10 倍稀释）的 Turk 溶液中稀释 20 μL BALF（参见 材料表）。在具有40倍物镜的光学显微镜下使用Neubauer室进行计数。
- 为了进行差异计数，将100μL的BALF放入含有载玻片的细胞漏斗中，并在4°C的细胞离心机中以22.86× g 离心5分钟，并用May-Grunwald（15%，pH 7.2）-Giemsa（1：10）染色（参见 材料表）。在带有浸没物镜的光学显微镜中进行细胞计数。
5. BALF中总蛋白的测定
- 通过商业蛋白质定量试剂盒测定总BALF上清蛋白，并按照制造商的说明使用分光光度计读取562nm处的吸光度（参见 材料表）。
6. 酶免疫吸附试验
- 将BALF在4°C下以1,200×g离心10分钟。 然后用移液管收集上清液并将其储存在-80°C下，用于测定TNF-α，IL-1β，IL-6和PGE2 15,23,25。
注意：步骤6.1中的离心使BALF无细胞。- 根据制造商的说明，使用商业ELISA试剂盒对无细胞BALF进行细胞因子测定。按照制造商的说明使用酶免疫测定（EIA）试剂盒进行PGE2测定（参见 材料表）。
7. 脂质体染色和计数
- 使用3.7%甲醛在Ca 2+，Mg2+游离Hank缓冲盐溶液（HBSS，pH 7.4）中固定白细胞在细胞离心载玻片上，并在仍然湿润的情况下用1.5%OsO4染色3（参见材料表）。然后，使用显微镜的油浸物镜从每个载玻片中计数50个连续白细胞中每个细胞的脂质体。
8. 统计分析
- 使用绘图和统计软件进行统计分析（参见 材料表）。将结果表示为SEM±平均值，并通过单因素方差分析进行分析，然后进行后测Newman-Keuls-Student26。考虑 当 P < 0.05 时差异显著。
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Representative Results
在未受伤的肺中，肺泡液通过完整的肺泡上皮层的运输而发生。渗透梯度将液体从肺泡输送到肺间质，在那里被淋巴管引流或重新吸收。Na/K-ATP 酶驱动这种转运11.OA 是 Na/K-ATP 酶 27 和钠通道21 的抑制剂，这可能有助于水肿的形成，正如我们已经建议的那样23。急性呼吸窘迫综合征中炎症反应的加剧导致肺泡损伤，内皮和上皮通透性增加，以及富含蛋白质和炎症细胞的肺泡液积聚，引起水肿。由于间质液的积聚和气体交换障碍，水肿导致肺部呼吸频率增加，导致低氧血症和呼吸衰竭28.TNF-α 和血管内皮生长因子 （VEGF） 等细胞因子会破坏 VE-钙粘蛋白键的稳定性，导致内皮通透性和肺泡液积聚增加7。
OA注射增加了气管内和静脉途径中的总白细胞（图3）。有必要通过静脉途径而不是气管内途径诱导肺损伤的OA。本研究显示，BALF中性粒细胞计数在6 h时增加，在24 h达到峰值，在48 h和72 h时减少。在OA气管内滴注24小时后，观察到BALF中IL-6，IL-1β和TNF-α浓度较高23（图4）。OA可防止水肿清除，并可通过静脉内和气管内途径引发富含蛋白质的水肿形成15,23。在BALF中通过总蛋白测定评估肺水肿，表明静脉注射和注射增加了总蛋白浓度（图5）。脂质体是细胞内细胞器，含有产生类花生酸的底物和酶8,29。脂质体的形成增强了脂质介质的产生，可用于细胞活化。气管内和静脉内OA注射增强了脂质体的形成和PGE2浓度24小时后23（图6）。OA注射还诱导气管内和静脉途径中的组织破坏，出血和白细胞浸润，如苏木精和伊红（H&E）染色组织学所示（图7）。此外，OA会导致肺功能改变19。因此，油酸诱导的肺损伤具有许多 ARDS 特征。
图 1：气管内给药方案中的各个步骤 。 （A）使用5%异氟烷和2L / min的O2麻醉小鼠。（B）褥疮背侧小鼠用手术剪刀进行气管切口。（C） 使用胰岛素注射器进行气管内滴注。使用 BioRender.com 创建。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：静脉内给药方案中的各个步骤 。 （A） 用 5% 异氟烷和 2L/min 的 O2 麻醉小鼠。（B） 内眦使用胰岛素注射器静脉注射。使用 BioRender.com 创建。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：OA 的给药诱导小鼠 BALF 中的白细胞活化。 静脉内 （i.v） 和气管内给药 （i.t） （A） 中的总白细胞和气管内给药 （i.t.） 中的说明性显微照片（1000 倍放大倍率）用 May-Grünwald-Giemsa （B） 染色后 24 小时进行OA攻击后。比例尺 = 10 μm。对照组给予相同体积的无菌生理盐水。每个条形代表至少七只动物的平均值± SEM。*P <0.05，与对照组相比。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：OA 的气管内给药 （i.t） 诱导小鼠肺中炎症介质的产生。 在攻击后 24 小时测量 TNF-α （A）、IL-6 （B）、IL-1β （C）。对照组给予无菌生理盐水。每个条形代表至少六只动物的平均值± SEM。*P <0.05，与对照组相比。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：OA 注射后 24 小时 BALF 中的总蛋白含量。 气管内（i.t.）和静脉内（i.v.）给药OA增加小鼠BALF中的总蛋白。对照组接受相同体积的无菌生理盐水。结果是来自至少六±不同动物的SEM平均值。*P <0.0001，与对照组相比。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：OA 处理小鼠白细胞中脂质体的形成和 BALF 中 PGE2 的产生。 气管内 （i.t） 和静脉内 （i.v） 给药 OA 分别诱导小鼠 （A） 和 （B） 的 BALF 中的炎症介质和脂质体积累。（C）OA攻击后24小时用四氧化锇（OsO4）在动物肺部染色的脂质体（1000倍放大倍率）的说明性显微照片。箭头指向脂质体。比例尺 = 10 μm。对照组接受相同体积的盐水。结果是来自七±动物的SEM平均值。*P <0.05，与对照组相比。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：小鼠的肺组织学说明 。 （A）用生理盐水处理且无出血迹象的对照小鼠。（B） 静脉注射 OA （i.v）。（C） 气管内给药 （i.t） 与组织改变。进行H&E染色。放大倍率，1000倍。比例尺 = 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
选择正确的 ARDS 模型对于进行临床前研究至关重要，评估者必须考虑所有可能的变量，例如年龄、性别、给药方法等6.所选模型必须根据脓毒症、脂质栓塞、肺血管缺血再灌注和其他临床风险等危险因素重现疾病14.然而，没有用于ARDS的动物模型可以重现人类综合征的所有特征。多种损伤剂模型包括LPS、OA、盐酸、细菌和病毒6。此外，使用不同的给药方法，更常见的是气管内、鼻内或静脉内。肺缺血再灌注模型导致毛细血管破裂和肺泡内蛋白6 的积聚。LPS诱导的肺损伤被广泛使用，并导致上皮和内皮屏障的急性损伤。LPS 与气道上皮细胞中的 Toll 样受体 4 （TLR-4） 结合，触发 NF-κB 激活，增强细胞因子和趋化因子的产生，吸引炎症细胞30，从而导致强大的中性粒细胞肺泡炎6。然而，该模型显示了菌株和动物物种之间的差异，降低了人类 ARDS30 患者在动物中结果的可重复性。
HCl损伤模型通过酸性物质吸入模拟ARDS。肺部的低pH值会引起急性炎症反应，随后是晚期纤维化损伤。该损害呈中性粒细胞依赖性，可引起肺泡出血、水肿和液体清除障碍。然而，人类不仅吸食 HCl，还吸食 pH 值通常高于 1.531 的复杂胃内容物。这些模型和其他 ARDS 模型已在其他地方进行了广泛审查31.在所有使用的模型中，油酸诱导的ARDS模型是最理想的14。
油酸钠模型引起肺损伤，诱导肺泡细胞凋亡和坏死，并增强细胞因子的产生，如TNFα、IL-8、IL-6、IL-1β和MIP-1α19。OA 还诱导蛋白酶和弹性蛋白酶表达，出血导致严重肺损伤25。OA 由于脂质栓塞、肺血管通透性增加和血管外积液伴影像学浸润而重现该疾病32。此外，ARDS 患者的血浆 OA 浓度较高 15,22,24。
OA气管内给药诱导炎症介质的产生，类似于临床ARDS，并降低肺顺应性和气体交换25,32。OA静脉注射促进了疾病的组织形态学和生理学方面32。血清白蛋白是一种有效的 OA 配体，这可以解释为什么该途径需要比气管内 （1.25 μmol）23 更高的 OA （10 μmol）15 量来诱发肺损伤。事实上，我们小组显示钩端螺旋体病患者的 OA/白蛋白失衡与较高的死亡风险之间存在相关性33。
与所有其他模型一样，该模型也存在一些缺点。当不以盐形式给药时，油酸可能会因血液乳化而引起毒性作用和变化。如本文所示，使用其盐形式可以降低毒性作用并避免两个问题：栓子形成以及血液和肺部的pH值波动。此外，它还确保肺损伤是由油酸盐引起的，而不是由继发效应引起的15。此外，在该模型中以盐形式制备油酸不需要与白蛋白结合。研究表明，白蛋白在减少炎症和血管通透性方面具有有益作用。此外，白蛋白可恢复肺损伤患者的血流动力学和呼吸。因此，白蛋白与OA结合可能会损害其对动物的影响，从而降低模型的活力33,34。
在分子水平上，油酸钠抑制钠钾 ATP 酶 （NKA） 和钠通道 （eNac），从而损害离子运输，增加血管通透性和水肿形成15。此外，OA 可以与游离脂肪酸受体 1 （FFAR1） 结合，增加细胞内 Ca 2+ 浓度，从而触发激酶信号蛋白，如 PI3K 和 MAPK，导致活化 B 细胞的核因子 κ 轻链增强子 （NF-κB） 激活并增强炎症反应25。
总之，虽然没有模型可以完全重现ARDS特征，但它们是研究该疾病的宝贵工具。临床前研究对于了解急性呼吸窘迫综合征的病理生理学和开发新疗法至关重要。气管内和静脉内以盐形式给药 OA 可生成可靠且可重复的 ARDS 模型，使其成为研究 ARDS 的黄金模型。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由奥斯瓦尔多克鲁兹研究所、奥斯瓦尔多克鲁兹基金会 （FIOCRUZ）、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior （CAPES） Grant 001、弗鲁米嫩塞联邦生物技术计划 （UFF）、里约热内卢联邦国家大学 （UNIRIO）、卡洛斯·查加斯 Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro 基金会 （FAPERJ）、 以及国家科学技术发展委员会（CNPq）。图 1 和图 2 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
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