Summary
Het huidige protocol beschrijft een longletselmodel bij muizen die oliezuur gebruiken om acuut respiratoir distress syndroom (ARDS) na te bootsen. Dit model verhoogt de ontstekingsmediatoren op oedeem en vermindert de longcompliantie. Oliezuur wordt gebruikt in de zoutvorm (oleaat) omdat deze fysiologische vorm het risico op embolie vermijdt.
Abstract
Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een aanzienlijke bedreiging voor ernstig zieke patiënten met een hoog sterftecijfer. Blootstelling aan verontreinigende stoffen, sigarettenrook, infectieuze agentia en vetzuren kunnen ARDS veroorzaken. Diermodellen kunnen het complexe pathomechanisme van de ARDS nabootsen. Elk van hen heeft echter beperkingen. Met name oliezuur (OA) is verhoogd bij ernstig zieke patiënten met schadelijke effecten op de longen. Artrose kan longbeschadiging veroorzaken door embolie, waardoor weefsel wordt verstoord, de pH verandert en de oedeemklaring wordt aangetast. Het door artrose geïnduceerde longletselmodel lijkt op verschillende kenmerken van ARDS met endotheelletsel, verhoogde alveolaire permeabiliteit, ontsteking, membraanhyaliene vorming en celdood. Hierin wordt inductie van longletsel beschreven door artrose (in zoutvorm) rechtstreeks in de long en intraveneus in een muis te injecteren, aangezien dit de fysiologische vorm van artrose is bij pH 7. De injectie van artrose in de zoutvorm is dus een nuttig diermodel om longletsel/ARDS te bestuderen zonder embolieën te veroorzaken of de pH te veranderen, waardoor het dicht in de buurt komt van wat er gebeurt bij ernstig zieke patiënten.
Introduction
Ashbaugh et al.1 beschreven in 1967 voor het eerst het acute respiratory distress syndrome (ARDS) en hebben sindsdien meerdere herzieningen ondergaan. Volgens de Berlijnse definitie is ARDS een longontsteking die leidt tot acuut respiratoir falen en hypoxemie (PaO 2/FiO 2 > 300 mm Hg) als gevolg van onbalans in de verhouding tussen ventilatie en perfusie, diffuse bilaterale alveolaire schade (DAD) en infiltraat, verhoogd longgewicht en oedeem 2,3. Het pulmonale parenchym is een complexe cellulaire omgeving die wordt verergerd door epitheel-, endotheel- en andere cellen. Deze cellen vormen barrières en structuren die verantwoordelijk zijn voor gasuitwisseling en homeostase in de longblaasjes3. De meest voorkomende cellen binnen de epitheliale barrière zijn alveolaire type I-cellen (AT1) met een groter oppervlak voor gasuitwisseling en vloeistofbeheer via Na/K-ATPase. Ook produceren de alveolaire type II-cellen (AT2) oppervlakteactieve stof, waardoor de oppervlaktespanning in de longblaasjeswordt verlaagd 4. Daaronder vormen endotheelcellen een semipermeabele barrière die de longcirculatie scheidt van het interstitium. De functies omvatten het detecteren van stimuli, het coördineren van ontstekingsreacties en cellulaire transmigratie5. De endotheelcellen reguleren ook de gasuitwisseling, vasculaire tonus en coagulatie5. Daarom kunnen stoornissen in de endotheel- en epitheelfunctie een pro-inflammatoir fenotype verergeren, waardoor longschade ontstaat die leidt tot ARDS5.
De ontwikkeling van ARDS is risicogebonden aan bacteriële en virale pneumonie of indirecte factoren zoals niet-pulmonale sepsis, trauma, bloedtransfusies en pancreatitis. Deze omstandigheden veroorzaken het vrijkomen van pathogenen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) en schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMP's), waardoor pro-inflammatoire cytokines en chemokinen zoals TNF-α, IL-1β, IL-6 en IL-85 worden geïnduceerd. TNF-α is gekoppeld aan vasculair-endotheliale cadherine (VE-cadherine) afbraak bij verstoring van de endotheliale barrière en leukocyteninfiltratie in het longparenchym. Neutrofielen zijn de eerste cellen die migreren, aangetrokken door IL-8 en LTB4 5,7,8. Neutrofielen verhogen verder de vorming van pro-inflammatoire cytokines, reactieve zuurstofsoorten (ROS)9 en neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), waardoor extra endotheel- en epitheelschade wordtgegenereerd10. Epitheliale schade veroorzaakt ontsteking en activering van Toll-achtige receptoren in AT2-cellen en residente macrofagen, waardoor chemokines vrijkomen die ontstekingscellen naar de longen trekken4. Ook veroorzaakt de productie van cytokinen zoals interferon-β (INFβ) TNF-gerelateerde apoptose-inducerende receptoren (TRAIL), waardoor ATII-cellen tot apoptose leiden, waardoor vloeistof en ionenclarentie worden aangetast4. De verstoring van de endotheel- en epitheliale barrièrestructuur maakt de instroom van vloeistof, eiwitten, rode bloedcellen en leukocyten in de alveolaire ruimte mogelijk, waardoor oedeem ontstaat. Nu oedeem is vastgesteld, wordt de longinspanning om de ademhaling en gasuitwisseling op peil te houden veranderd11. Hypercapnie en hypoxemie induceren celdood en verstoring van het natriumtransport, waardoor alveolair oedeem verergert als gevolg van een slechte klaringscapaciteit10. ARDS heeft ook verhoogde niveaus van IL-17A, geassocieerd met orgaandisfunctie, verhoogd percentage alveolaire neutrofielen en alveolaire permeabiliteit9.
Er is de afgelopen jaren voortdurende vooruitgang geboekt in het onderzoek naar de pathofysiologie, epidemiologie en behandeling van ARDS12,13. ARDS is echter een heterogeen syndroom, ondanks de vooruitgang in therapeutisch onderzoek dat resulteert in mechanische beademing en optimalisatie van vloeistoftherapie. Er is dus nog steeds een effectievere directe farmacologische behandeling nodig10, en dierstudies kunnen helpen bij het onthullen van ARDS-mechanismen en doelen voor interventie.
De huidige ARDS-modellen zijn niet in staat om de pathologie volledig na te bootsen. Daarom kiezen onderzoekers vaak het model dat beter bij hun interesses past. Het lipopolysacharide (LPS)-inductiemodel induceert bijvoorbeeld ARDS door endotoxische shock die voornamelijk wordt veroorzaakt door TLR414. HCl-inductie bootst zuuraspiratie na en de schade is neutrofiel-afhankelijk14. Aan de andere kant induceert het huidige natriumoleaatmodel endotheelschade die de vasculaire permeabiliteit en oedeem verhoogt. Bovendien voorkomt het gebruik van natriumoleaat in plaats van oliezuur in vloeibare vorm het risico op embolie en verandering in de pH van het bloed15.
Diermodellen voor ARDS
Preklinische studies in diermodellen helpen de pathologie te begrijpen en zijn essentieel voor nieuw onderzoek naar ARDS-behandelingen. Het ideale diermodel moet kenmerken hebben die lijken op de klinische situatie en een goede reproduceerbaarheid van ziektemechanismen met relevante pathofysiologische kenmerken van elk ziektestadium, elke evolutie en elk herstel14. Verschillende diermodellen worden gebruikt om acuut longletsel bij ARDS preklinisch te beoordelen. Omdat alle modellen echter beperkingen hebben, reproduceren ze de menselijke pathologie niet volledig 6,14,16. Het door oliezuur geïnduceerde ARDS wordt gebruikt bij verschillende diersoorten17. Varkens18, schapen19 en honden20 die een artrose-injectie ondergingen, vertonen tal van klinische kenmerken van de ziekte met alveolaire-capillaire membraandisfunctie en verhoogde permeabiliteit met eiwit- en celinfiltratie.
Zo blokkeerde artrose bij 1,25 μM intraveneus geïnjecteerd transepitheliaal transport, wat leidde tot alveolair oedeem15. In het in-vitromodel met A549-cellen veranderde artrose in een concentratie van 10 μM het epitheliale natriumkanaal (eNAC) of de expressie van Na/K-ATPase niet. OA lijkt zich echter met beide kanalen te associëren, waardoor hun activiteit direct wordt geremd21. OA intraveneuze injectie van 0,1 ml/kg veroorzaakte congestie en zwelling van het longweefsel, verminderde alveolaire ruimtes met verdikte alveolaire septa en verhoogde inflammatoire en rode bloedcellen22. Ook induceerde artrose apoptose en necrose in endotheel- en epitheelcellen in delongen 15. De injectie van een tris-oleaatoplossing, intratracheaal bij muizen, verbeterde neutrofieleninfiltratie en oedeem al 6 uur na stimulatie23. OA-injectie na 24 uur verhoogde pro-inflammatoire cytokinespiegels (d.w.z. TNF-α, IL-6 en IL-1β)23. Bovendien remt intraveneuze (orbitale plexus) injectie van 10 μM van een tris-oleaat de pulmonale Na/K-ATPase-activiteit, vergelijkbaar met ouabain bij 10-3 μM, een selectieve enzymremmer. Ook induceert artrose ontstekingen met celinfiltratie, vorming van lipidelichamen en productie van leukotrieen B4 (LTB4) en prostaglandine E2 (PGE2)22,24. Daarom genereert oliezuurgeïnduceerde ARDS oedeem, bloeding, neutrofieleninfiltratie, verhoogde myeloperoxidase (MPO)-activiteit en ROS24. Daarom is de toediening van artrose een goed ingeburgerd model voor longletsel22,25. Alle resultaten die in dit artikel worden gepresenteerd en die OA bevatten, vertegenwoordigen de zoutvorm, natriumoleaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedures die in deze studie zijn gebruikt, zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor het gebruik van dieren van de Oswaldo Cruz Foundation (CEUA-licenties nr. 002-08, 36/10 en 054/2015). Mannelijke Zwitserse Webster-muizen met een gewicht tussen de 20-30 g, geleverd door het Institute of Science and Technology in Biomodels (ICTB) van de Oswaldo Cruz Foundation (FIOCRUZ), werden gebruikt voor de experimenten. De dieren werden gehouden in geventileerde isolatoren in het vivarium van het Pavilhão Ozório de Almeida, en water en voedsel waren ad libitum beschikbaar. Ze werden blootgesteld aan een licht- en donkercyclus van 12 uur/12 uur.
1. Bereiding van natriumoleaatoplossing
- Gebruik oliezuur om een 100 mmol/L natriumoleaatoplossing te bereiden in een steriele buis of glazen kolf.
OPMERKING: Voor het huidige werk is een oplossing van 50 ml (eindvolume) bereid, maar het volume moet worden aangepast aan de experimentele behoefte. De oplossing moet altijd worden bereid in steriele buizen of glazen containers.- Voeg eerst NaOH-tabletten of -oplossing toe in ultrapuur water om de pH te verhogen. Een pH-waarde van 12-13 wordt aanbevolen voor een volume van 25 ml.
OPMERKING: Als alternatief kan Tris-base worden gebruikt om de Tris-oleaatoplossing te bereiden. - Voeg het oliezuur (zie materiaaltabel) heel langzaam, druppel voor druppel, onder constante beweging toe in een ultrasoonbad bij 37 °C.
OPMERKING: Als er oliezuurneerslag optreedt, begin dan helemaal opnieuw vanaf het begin. - Zodra het oliezuur volledig is opgelost, stelt u de pH voorzichtig in op 7,4, druppel voor druppel onder roeren, met ultrazuiver verdund HCl en past u vervolgens aan tot het uiteindelijke volume van 50 ml.
NOTITIE: Bereid de werkende oleaatoplossingen vers voor. Als alternatief kan de oplossing worden gealiquoteerd, opgeslagen en niet langer dan een maand bij -20 °C in een met stikstof verrijkte omgeving worden gehouden om oxidatie te voorkomen. Vermijd cycli van bevroren en opnieuw ingevroren.
- Voeg eerst NaOH-tabletten of -oplossing toe in ultrapuur water om de pH te verhogen. Een pH-waarde van 12-13 wordt aanbevolen voor een volume van 25 ml.
2. Inductie van longbeschadiging door oliezuur
- Voer de intratracheale toediening van oliezuur uit.
- Verdoof de muizen met 5% isofluraan met 2 l/min O2 met behulp van een veterinaire anesthesieverdamper (Figuur 1A). Verwijder de vacht bij de incisie met ontharingscrème en desinfecteer het gebied met drie afwisselende rondes betadinescrub en alcohol met steriel gaas. Bevestig de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen.
NOTITIE: Gebruik steriele handschoenen en instrumenten tijdens de procedure. Gebruik een laken om het dier te bedekken en leg alleen de incisieplaats bloot. Voer het experiment uit in een biologische veiligheidskast om te voorkomen dat isofluoraan in de omgeving terechtkomt. Pijnstillers worden niet toegediend omdat ze de ontstekingsreactie kunnen remmen. - Leg het dier na verdoving in een dorsale decubituspositie en maak een incisie (0,5-1 cm) in V-vorm ter hoogte van de schildklier. Verplaats de schildklier voorzichtig om de luchtpijp bloot te leggen (Figuur 1B) en injecteer 50 μL van de bereide oleaatoplossing (stap 1).
OPMERKING: De muizen werden verdeeld in twee groepen, met acht dieren in elke groep. De longletselgroep krijgt natriumoleaatoplossing van 25 mM (1,25 μmol) en de controlegroep krijgt 50 μL steriele zoutoplossing door indruppeling in de luchtpijp van elke muis met een insulinespuit (volume 300 μL, 30 G) (Figuur 1C). - Hecht de incisieplaats van de muizen met een synthetische, niet-resorbeerbare monofilamenthechting, plaats deze terug in hun kooi en controleer deze totdat deze volledig is hersteld van de operatie. Houd de dieren tijdens alle procedures op een verwarmingskussen bij 37 °C.
OPMERKING: Muizen hebben meestal tot 15 minuten nodig om te herstellen van een operatie.
- Verdoof de muizen met 5% isofluraan met 2 l/min O2 met behulp van een veterinaire anesthesieverdamper (Figuur 1A). Verwijder de vacht bij de incisie met ontharingscrème en desinfecteer het gebied met drie afwisselende rondes betadinescrub en alcohol met steriel gaas. Bevestig de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen.
- Voer intraveneuze toediening van oliezuur uit.
- Na anesthesie (stap 2.1.1, figuur 2A) intraveneus injecteren in de orbitale plexus door de ultrafijne naald (zie materiaaltabel) in de mediale canthus van de oogkas te steken (figuur 2B).
OPMERKING: De muizen werden verdeeld in twee groepen, met acht dieren in elke groep. Elke groep krijgt 100 μL natriumoleaatoplossing met 10 μmol artrose per dier, terwijl de controlegroep 100 μL steriele zoutoplossing krijgt.
- Na anesthesie (stap 2.1.1, figuur 2A) intraveneus injecteren in de orbitale plexus door de ultrafijne naald (zie materiaaltabel) in de mediale canthus van de oogkas te steken (figuur 2B).
- Controleer de dieren na de operatie dagelijks op bijwerkingen. Humane eindpunten voor euthanasie zijn bijwerkingen, convulsies en coma.
3. Bronchoalveolaire lavagevloeistofopvang (BALF)
- Euthanaseer de muizen met een intraperitoneale dodelijke dosis ketamine (300 mg/kg) en xylazine (30 mg/kg) (zie materiaaltabel).
- Leg het dier in de dorsale decubituspositie, maak met een chirurgische schaar een incisie van ongeveer 1 cm in het voorste deel van het dier, leg de luchtpijp bloot en maak een kleine snee om een intraveneuze katheter (20 G) in te brengen.
- Sluit de katheter aan op een steriele spuit van 1 ml, injecteer langzaam en geleidelijk 0,5 ml steriele zoutoplossing in de longen en zuig vervolgens de vloeistof uit de BALF op met dezelfde spuit. Herhaal het 3-5 keer en breng het over naar een steriele microbuis en plaats ze in ijs.
OPMERKING: De monsters kunnen maximaal 6 maanden bij -20 °C worden bewaard.
4. Totale en differentiële celanalyse in BALF
- Verdun voor het totale celgetal 20 μL BALF in 180 μL (10x verdunning) van de Turk's oplossing (zie Materiaaltabel). Voer de telling uit met behulp van een Neubauer-kamer onder een optische microscoop met een 40x objectief.
- Voor differentiële telling doet u 100 μL BALF in de cellulaire trechter met objectglaasjes en centrifugeert u deze bij 22,86 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een cytocentrifuge, en kleurt u deze met May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) (zie materiaaltabel). Ga verder met het tellen van cellen in een lichtmicroscoop met onderdompelingsobjectief.
5. Bepaling van het totale eiwit in BALF
- Bepaal het totale BALF-supernatanteiwit met behulp van een in de handel verkrijgbare eiwitkwantificeringskit en lees de extinctie bij 562 nm af met behulp van een spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
6. Enzym immunosorbens assays
- Centrifugeer BALF bij 1.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Vang vervolgens het supernatans op met een pipet en bewaar het bij -80 °C voor testen van TNF-α, IL-1β, IL-6 en PGE215,23,25.
OPMERKING: De centrifugatie in stap 6.1 maakt de BALF celvrij.- Voer de cytokinetests uit op celvrij BALF met behulp van een in de handel verkrijgbare ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant. Voer de PGE2-test uit met behulp van een enzymimmunoassay (EIA)-kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
7. Lipide lichaam kleuren en tellen
- Fixeer de leukocyten op cytospinglaasjes met 3,7% formaldehyde in Ca 2+, Mg2+ vrije Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS, pH 7,4) en kleur met 1,5% OsO4 terwijl ze nog vochtigzijn 3 (zie materiaaltabel). Tel vervolgens de lipidelichamen per cel in 50 opeenvolgende leukocyten van elk objectglaasje met behulp van de objectieflens met olie-onderdompeling van de microscoop.
8. Statistische analyse
- Voer statistische analyses uit met behulp van grafische en statistische software (zie Materiaaltabel). Druk de resultaten uit als gemiddelde ± SEM en analyseer ze door eenrichtings-Anova gevolgd door een post-test Newman-Keuls-Student26. Beschouw de verschillen als significant wanneer P < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een niet-gewonde long vindt alveolaire vochtklaring plaats door het transport van ionen door de intacte alveolaire epitheellaag. De osmotische gradiënt voert vloeistof van de longblaasjes naar het pulmonale interstitium, waar het wordt afgevoerd door lymfevaten of opnieuw wordt geabsorbeerd. Na/K-ATPase stuurt dit transport11 aan. Artrose is een remmer van Na/K-ATPase27 en natriumkanaal 21, die kunnen bijdragen aan de vorming van oedeem, zoals we al hebben gesuggereerd23. De verergerde ontstekingsreactie bij ARDS leidt tot alveolaire schade, verhoogde endotheel- en epitheelpermeabiliteit en ophoping van alveolaire vloeistof die rijk is aan eiwitten en ontstekingscellen, waardoor oedeem ontstaat. Het oedeem zorgt ervoor dat de longen de ademhalingsfrequentie verhogen als gevolg van de ophoping van interstitiële vloeistof en een verminderde gasuitwisseling, wat resulteert in hypoxemie en ademhalingsfalen28. Cytokinen zoals TNF-α en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) destabiliseren VE-cadherinebindingen en dragen bij aan een verhoogde endotheliale permeabiliteit en alveolaire vochtaccumulatie7.
Injectie met artrose verhoogde het totale aantal leukocyten in intratracheale en intraveneuze routes (figuur 3). Het was noodzakelijk om artrose voor longletsel te induceren via de intraveneuze route in plaats van de intratracheale route. Het huidige werk toonde een toename van het aantal neutrofielen in BALF na 6 uur, met de piek na 24 uur en afnemend na 48 uur en 72 uur. Een hogere concentratie van IL-6, IL-1β en TNF-α in de BALF werd waargenomen na 24 uur intratracheale intratracheale instillatie van artrose23 (figuur 4). OA voorkomt oedeemklaring en kan de vorming van oedeem dat rijk is aan eiwitten veroorzaken via zowel intraveneuze als intratracheale routes15,23. Het longoedeem werd beoordeeld door middel van een totale eiwittest in BALF, wat aantoont dat i.v. en i.t. toediening de totale eiwitconcentratie verhoogden (figuur 5). Lipidelichamen zijn intracellulaire organellen die substraat en enzymen bevatten voor de productie van eicosanoïden 8,29. De vorming van lipidelichamen verbetert de productie van lipidemediatoren en kan worden gebruikt om toegang te krijgen tot celactivering. Intratracheale en intraveneuze artrose-injectie verbeterde de vorming van lipidelichamen en PGE2-concentratie 23 na 24 uur (figuur 6). OA-injectie induceerde ook weefselverstoring, bloeding en leukocyteninfiltratie in intratracheale en intraveneuze routes, zoals weergegeven in de histologie van hematoxyline en eosine (H&E) (H&E) (Figuur 7). Ook veroorzaakt artrose een verandering in de longfunctie19. Door oliezuur geïnduceerd longletsel vertoont dus tal van ARDS-kenmerken.
Figuur 1: De afzonderlijke stappen in het intratracheale toedieningsprotocol . (A) Een muis wordt verdoofd met 5% isofluoraan en 2 L/min O2. (B) Een tracheale incisie met een chirurgische schaar bij muizen in dorsale decubituspositie. (C) Intratracheale instillatie met behulp van een insulinespuit. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De afzonderlijke stappen in het intraveneuze toedieningsprotocol . (A) Een muis wordt verdoofd met 5% isofluoraan en 2L/min O2. (B) Intraveneuze injectie met behulp van een insulinespuit door de mediale canthus. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Toediening van artrose induceert leukocytenactivatie in de BALF van muizen. Het totale aantal leukocyten bij intraveneuze (i.v) en intratracheale toediening (i.t) (A) en een illustratieve microfoto (1000x vergroting) bij intratracheale toediening (i.t.) gekleurd met May-Grünwald-Giemsa (B) werden 24 uur na de OA-provocatie uitgevoerd. Schaalbalk = 10 μm. Dezelfde hoeveelheid steriele zoutoplossing werd toegediend aan de controlegroep. Elke balk vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van ten minste zeven dieren. *P < 0,05, vergeleken met controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Intratracheale toediening (i.t.) van artrose induceert de productie van ontstekingsmediatoren in de longen van muizen. TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) werden 24 uur na de provocatie gemeten. Steriele zoutoplossing werd toegediend aan de controlegroep. Elke balk vertegenwoordigt de gemiddelde ± SEM voor ten minste zes dieren. *P < 0,05, vergeleken met controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Totaal eiwitgehalte in BALF 24 uur na injectie met artrose. Intratracheale (i.t.) en intraveneuze (i.v.) toediening van artrose verhoogt het totale eiwit in de BALF van muizen. De controlegroep kreeg dezelfde hoeveelheid steriele zoutoplossing. De resultaten zijn middelen ± SEM van ten minste zes verschillende dieren. *P < 0,0001, vergeleken met controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Vorming van lipidenlichaam in leukocyten en PGE2-productie in BALF van met artrose behandelde muizen. Intratracheale (i.t) en intraveneuze (i.v) toediening van artrose induceert ontstekingsmediatoren en accumulatie van lipidelichamen in respectievelijk de BALF van muizen (A) en (B). (C) Illustratieve microfoto van lipidelichamen (vergroting 1000x) die 24 uur na OA-provocatie in de longen van de dieren zijn gekleurd met osmiumtetroxide (OsO4). De pijlen wijzen naar de lipidelichamen. Schaalbalk = 10 μm. Controles kregen dezelfde hoeveelheid zoutoplossing. De resultaten zijn middelen ± SEM van zeven dieren. *P < 0,05, vergeleken met controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Illustratieve pulmonale histologie bij muizen . (A) Controlemuizen behandeld met zoutoplossing en geen tekenen van bloeding. (B) Intraveneuze toediening van artrose (i.v.). (C) Intratracheale toediening (i.t.) met weefselveranderingen. H&E-kleuring werd uitgevoerd. Vergroting, 1000x. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het selecteren van het juiste ARDS-model is essentieel om de preklinische studies uit te voeren, en de beoordelaar moet rekening houden met alle mogelijke variabelen, zoals leeftijd, geslacht, toedieningsmethoden en andere6. Het gekozen model moet de ziekte reproduceren op basis van risicofactoren zoals sepsis, lipide-embolie, ischemie-reperfusie van het longvaatstelsel en andere klinische risico's14. Geen enkel diermodel dat voor ARDS wordt gebruikt, kan echter alle kenmerken van het menselijk syndroom nabootsen. Meerdere modellen van verwondingsmiddelen omvatten LPS, OA, zoutzuur, bacteriën en virussen6. Ook worden verschillende toedieningsmethoden gebruikt, vaker intratracheaal, intranasaal of intraveneus. Het pulmonale ischemie-reperfusiemodel veroorzaakt capillaire ruptuur en accumulatie van intra-alveolair eiwit6. LPS-geïnduceerd longletsel wordt veel gebruikt en leidt tot acuut letsel van epitheel- en endotheelbarrières. LPS bindt zich aan de Toll-like receptor 4 (TLR-4) in het luchtwegepitheel, waardoor NF-KB-activering wordt geactiveerd, waardoor de productie van cytokines en chemokinen wordt versterkt, waardoor ontstekingscellen worden aangetrokken30, wat leidt tot een robuuste neutrofiele alveolitis6. Het model toont echter variaties tussen stammen en diersoorten, waardoor de reproduceerbaarheid van de resultaten bij dieren voor menselijke patiënten met ARDS30 afneemt.
Het HCl-letselmodel bootst ARDS na door aspiratie van het zuurgehalte. De lage pH in de longen veroorzaakt een acute ontstekingsreactie, gevolgd door een late fibrotische verwonding. De schade is neutrofiel-afhankelijk en veroorzaakt alveolaire bloeding, oedeem en verminderde vochtklaring. Mensen zuigen echter niet alleen HCl op, maar een complexe maaginhoud met een pH die vaak hoger is dan 1,531. Deze en andere ARDS-modellen zijn elders uitgebreid besproken31. Van alle gebruikte modellen is het door oliezuur geïnduceerde ARDS-model het meest ideale14.
Het natriumoleaatmodel veroorzaakt longschade, induceert apoptose en necrose van alveolaire cellen en verbetert de productie van cytokines zoals TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β en MIP-1α19. Artrose induceert ook proteasen en elastase-expressie met bloeding die ernstig longletsel veroorzaakt25. Artrose reproduceert de ziekte als gevolg van lipide-embolie, verhoogde pulmonale vasculaire permeabiliteit en extravasculaire vloeistof met radiografische infiltraten32. Ook hebben patiënten met ARDS een hogere plasma-artroseconcentratie 15,22,24.
Intratracheale toediening van artrose induceert de productie van ontstekingsmediatoren vergelijkbaar met klinische ARDS en vermindert de longcompliantie en gasuitwisseling25,32. Intraveneuze injectie met artrose bevordert de histomorfologische en fysiologische aspecten van de ziekte32. Serumalbumine is een krachtig OA-ligand, wat kan verklaren waarom deze route een hogere hoeveelheid artrose (10 μmol)15 vereist dan intratracheale (1,25 μmol)23 om longschade te veroorzaken. Onze groep toonde inderdaad een correlatie aan tussen artrose/albumine-disbalans en een hoger overlijdensrisico bij patiënten met leptospirose33.
Zoals bij elk ander model, zijn er enkele nadelen in het model. Wanneer het niet in zoutvorm wordt toegediend, kan oliezuur toxische effecten en variaties veroorzaken als gevolg van bloedemulgering. Zoals in dit artikel wordt aangetoond, vermindert het gebruik van de zoutvorm de toxische effecten en vermijdt het twee problemen: de vorming van embolieën en pH-schommelingen in het bloed en de longen. Het zorgt er ook voor dat het longletsel wordt veroorzaakt door het oleaat en niet door een secundair effect15. Bovendien vereist de bereiding van oliezuur in zoutvorm in dit model geen conjugatie met albumine. Onderzoek toont de gunstige effecten van albumine aan bij het verminderen van ontstekingen en vasculaire permeabiliteit. Bovendien herstelt albumine de hemodynamica en ademhaling bij patiënten met longletsel. Het conjugeren van albumine met artrose zou dus de impact ervan op het dier kunnen verminderen, waardoor de levensvatbaarheid van de modellen zou afnemen33,34.
Op moleculair niveau remt natriumoleaat natrium-kalium-ATPase (NKA) en natriumkanaal (eNac), die het ionentransport belemmeren, de vasculaire permeabiliteit en oedeemvorming verhogen15. Ook kan artrose zich binden aan vrije vetzuurreceptor 1 (FFAR1), waardoor de intracellulaire Ca 2+ -concentratie toeneemt, wat kinasen activeert die eiwitten zoals PI3K en MAPK signaleren, wat leidt tot activering van nucleaire factor kappa-light-chain-enhancer van geactiveerde B-cellen (NF-κB) en het versterken van de ontstekingsreactie25.
Samenvattend, hoewel geen enkel model ARDS-kenmerken volledig kan reproduceren, zijn het waardevolle hulpmiddelen om de ziekte te bestuderen. Preklinisch onderzoek is cruciaal voor het begrijpen van de pathofysiologie van ARDS en de ontwikkeling van nieuwe behandelingen. De intratracheale en intraveneuze toediening van artrose, in zoutvorm, genereert betrouwbare en reproduceerbare ARDS-modellen, waardoor het een gouden model is om ARDS te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), en de Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Figuur 1 en Figuur 2 zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
- Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E.
- The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
- Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
- D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
- Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
- Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
- Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
- Matthay, M. A., et al.
- Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
- Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
- Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
- Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
- Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
- Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
- Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
- Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
- Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
- Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
- McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
- Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
- Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
- Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
- Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
- Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
- Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
- Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
- Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).
