Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מודל עכברי של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה הנגרמת על ידי חומצה אולאית

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63566
Automatic Translation
*1,2,5, *1,2,6, 1,3,4, 1,3, 1,2,4,5,6
1Laboratório de Imunofarmacologia, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2Laboratório de Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 4Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 5Programa de Pós-Graduação em Ciências e Biotecnologia, Universidade Federal Fluminense, 6Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal Fluminense
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל פגיעה ריאתית בעכברים המשתמש בחומצה אולאית כדי לחקות תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS). מודל זה מגביר את מתווכי הדלקת על בצקת ומקטין את היענות הריאות. חומצה אולאית משמשת בצורת מלח (oleate) שכן צורה פיזיולוגית זו מונעת את הסיכון של תסחיף.

Abstract

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) מהווה איום משמעותי על חולים במצב קריטי עם שיעור תמותה גבוה. חשיפה למזהמים, עשן סיגריות, גורמים זיהומיים וחומצות שומן יכולים לגרום ל- ARDS. מודלים של בעלי חיים יכולים לחקות את הפתומנגנון המורכב של ARDS. עם זאת, לכל אחד מהם יש מגבלות. יש לציין כי חומצה אולאית (OA) מוגברת בחולים במצב קריטי עם השפעות מזיקות על הריאה. OA יכול לגרום לפגיעה ריאתית על ידי אמבולי, לשבש רקמות, לשנות pH, ולפגוע בסילוק בצקת. מודל פגיעת ריאות הנגרמת על ידי OA דומה לתכונות שונות של ARDS עם פגיעה באנדותל, חדירות מוגברת של מכתשית, דלקת, היווצרות היאלין בקרום ומוות תאי. כאן, השראת פגיעה ריאתית מתוארת על ידי הזרקת OA (בצורת מלח) ישירות לתוך הריאה ותוך ורידי בעכבר שכן היא הצורה הפיזיולוגית של OA ב pH 7. לפיכך, הזרקת OA בצורת מלח היא מודל מועיל של בעלי חיים לחקר פגיעה ריאתית / ARDS מבלי לגרום לאמבולי או לשנות את ה- pH, ובכך להתקרב למה שקורה בחולים קריטיים.

Introduction

Ashbaugh et al.1, בשנת 1967, תיארו לראשונה את תסמונת המצוקה הנשימתית החריפה (ARDS) ומאז עברו תיקונים מרובים. על פי ההגדרה בברלין, ARDS היא דלקת ריאות המובילה לכשל נשימתי חריף והיפוקסמיה(PaO 2/FiO 2 > 300 מ"מ כספית) עקב חוסר איזון ביחס האוורור לזילוח, נזק מכתשי דו צדדי מפוזר (DAD) וחדירה, משקל ריאות מוגבר ובצקת 2,3. פרנכימה ריאתית היא סביבה תאית מורכבת המורכבת על ידי אפיתל, אנדותל ותאים אחרים. תאים אלה יוצרים מחסומים ומבנים האחראים על חילופי גזים והומאוסטזיס בנאדיות3. התאים הנפוצים ביותר בתוך מחסום האפיתל הם תאים מסוג I (AT1) עם שטח פנים גדול יותר לחילופי גזים וניהול נוזלים באמצעות Na/K-ATPase. כמו כן, תאים מסוג II (AT2) לייצר פעילי שטח, הפחתת מתח פני השטח alveoli4. מתחת, תאי אנדותל יוצרים מחסום חדיר למחצה המפריד בין מחזור הדם הריאתי לבין האינטרסטיציום. תפקידיו כוללים זיהוי גירויים, תיאום תגובות דלקתיות והעברה סלולרית5. תאי האנדותל מווסתים גם את חילוף הגזים, טונוס כלי הדם וקרישה5. לכן, הפרעות בתפקוד האנדותל והאפיתל עלולות להחמיר פנוטיפ פרו-דלקתי, ולגרום נזק לריאות המוביל ל-ARDS5.

התפתחות ARDS קשורה בסיכון לדלקת ריאות חיידקית ונגיפית או לגורמים עקיפים כגון אלח דם לא ריאתי, טראומה, עירויי דם ודלקת לבלב6. תנאים אלה גורמים לשחרור של דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגנים (PAMPs) ודפוסים מולקולריים הקשורים לנזק (DAMPs), וגורמים לציטוקינים וכימוקינים מעודדי דלקת כגון TNF-α, IL-1β, IL-6 ו- IL-85. TNF-α קשור לירידה בקדהרין של כלי הדם-אנדותל (VE-cadherin) בהפרעה במחסום האנדותל ובחדירת לויקוציטים לפרנכימת הריאות. נויטרופילים הם התאים הראשונים שנודדים, נמשכים על ידי IL-8 ו- LTB4 5,7,8. נויטרופילים מגבירים עוד יותר את היווצרותם של ציטוקינים מעודדי דלקת, מיני חמצן תגובתי (ROS)9 ומלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs), מה שיוצר נזק נוסף לאנדותל ולאפיתל10. נזק לאפיתל גורם לדלקת ולהפעלה של קולטנים דמויי טול בתאי AT2 ובמקרופאגים תושבים, מה שגורם לשחרור של כימוקינים המושכים תאים דלקתיים לריאות4. כמו כן, ייצור ציטוקינים כמו אינטרפרון-β (INFβ) גורם לקולטנים הגורמים לאפופטוזיס הקשורים ל-TNF (TRAIL), מה שמוביל תאי ATII לאפופטוזיס, מה שפוגע בנוזל וביוניםקלרנס 4. השיבוש במבנה מחסום האנדותל והאפיתל מאפשר זרימה של נוזלים, חלבונים, תאי דם אדומים ולויקוציטים לחלל הנאדיות, וגורם לבצקת. עם בצקת הוקמה, המאמץ הריאתי לשמור על נשימה חילופי גזים משתנה11. היפרקפניה והיפוקסמיה, גורמות למוות תאים ולהפרעה בהובלת נתרן, ומחמירות בצקת בנאדיות עקב יכולת פינוי ירודה10. ל-ARDS יש גם רמות גבוהות של IL-17A, הקשורות לתפקוד לקוי של איברים, אחוז מוגבר של נויטרופילים בנאדיות וחדירות מכתשית9.

בשנים האחרונות חלה התקדמות מתמשכת במחקר על הפתופיזיולוגיה, האפידמיולוגיה והטיפול ב- ARDSבשנים האחרונות 12,13. עם זאת, ARDS היא תסמונת הטרוגנית למרות ההתקדמות במחקר הטיפולי וכתוצאה מכך אוורור מכני ואופטימיזציה של טיפול בנוזלים. לפיכך, עדיין יש צורך בטיפול תרופתי ישיר יעיל יותר10, ומחקרים בבעלי חיים עשויים לסייע בחשיפת מנגנוני ARDS ויעדים להתערבות.

מודלים נוכחיים של ARDS אינם מסוגלים לשכפל באופן מלא את הפתולוגיה. לכן, חוקרים בוחרים לעתים קרובות את המודל שיכול להתאים יותר לאינטרסים שלהם. לדוגמה, מודל השראת ליפופוליסכריד (LPS) משרה ARDS על ידי הלם אנדוטוקסי המופעל בעיקר על ידי TLR414. השראת HCl מחקה שאיפת חומצה, והנזק תלוי נויטרופיל14. מצד שני, מודל הנתרן אולאט הנוכחי גורם נזק לאנדותל המגביר את חדירות כלי הדם ובצקת. יתר על כן, שימוש בנתרן אולאט במקום חומצה אולאית בצורה נוזלית מונע סיכוני תסחיף ושינוי ב- pH15 בדם.

מודלים של בעלי חיים עבור ARDS
מחקרים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים מסייעים להבין את הפתולוגיה והם חיוניים למחקר חדש בטיפולי ARDS. המודל החייתי האידיאלי צריך להיות בעל מאפיינים הדומים למצב הקליני ויכולת שחזור טובה של מנגנוני מחלה עם מאפיינים פתופיזיולוגיים רלוונטיים של כל שלב מחלה, אבולוציה ותיקון14. מספר מודלים של בעלי חיים משמשים להערכת פגיעה ריאתית חריפה ב- ARDS באופן טרום קליני. עם זאת, כמו כל המודלים יש מגבלות, הם לא לשחזר באופן מלא את הפתולוגיה האנושית 6,14,16. ARDS המושרה על ידי חומצה אולאית משמש במינים שונים של בעלי חיים17. חזירים18, כבשים19 וכלבים20 שנמסרו לזריקת OA מציגים מאפיינים קליניים רבים של המחלה עם תפקוד לקוי של קרום הנאדיות-נימיות וחדירות מוגברת עם חדירת חלבונים ותאים.

לדוגמה, OA ב 1.25 מיקרומטר מוזרק תוך ורידי חסם תחבורה transepithelial המוביל בצקת alveolarבצקת 15. לחלופין, במודל במבחנה באמצעות תאי A549, OA בריכוז של 10 מיקרומטר לא שינה את תעלת הנתרן אפיתל (eNAC) או את הביטוי של Na/K-ATPase. עם זאת, נראה כי OA מתחבר לשני הערוצים, מעכב ישירות את פעילותם21 . הזרקת OA תוך ורידית במינון 0.1 מ"ל/ק"ג גרמה לגודש ונפיחות ברקמת הריאה, הפחיתה את רווחי הנאדיות עם מחיצת מכתשית מעובה והגדילה את ספירת תאי הדם הדלקתיים והאדומים22. כמו כן, OA גרם אפופטוזיס ונמק בתאי אנדותל ואפיתל בריאה15. הזרקת תמיסת טריס-אולאט, תוך טרכלית בעכברים, הגבירה את חדירת הנויטרופילים והבצקת כבר 6 שעות לאחר גירוי23. הזרקת OA לאחר 24 שעות העלתה את רמות הציטוקינים מעודדי דלקת (כלומר, TNF-α, IL-6 ו- IL-1β)23. בנוסף, הזרקה תוך ורידית (מקלעת מסלולית) של 10 מיקרומטר של טריס-אולאט מעכבת פעילות ריאתית Na/K-ATPase, בדומה לאואבין ב-10-3 מיקרומטר, מעכב אנזים סלקטיבי. כמו כן, OA גורם לדלקת עם חדירת תאים, היווצרות גופי שומנים וייצור לויקוטרין B4 (LTB4) ופרוסטגלנדין E2 (PGE2)22,24. לכן, ARDS המושרה על ידי חומצה אולאית יוצר בצקת, דימום, חדירת נויטרופילים, פעילות מוגברת של מיאלופוקסידז (MPO) ו- ROS24. לפיכך, ניהול OA הוא מודל מבוסס היטב לפגיעה ריאתית22,25. כל התוצאות המוצגות במאמר זה כי יש OA מייצג את צורת מלח, נתרן oleate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הנהלים בהם נעשה שימוש במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים של קרן אוסוולדו קרוז (רישיונות CEUA מס' 002-08, 36/10 ו-054/2015). עכברי וובסטר שוויצרים זכרים במשקל של בין 20-30 גרם, שסופקו על ידי המכון למדע וטכנולוגיה בביומודלים (ICTB) של קרן אוסוולדו קרוז (FIOCRUZ), שימשו לניסויים. בעלי החיים הוחזקו במבודדים מאווררים בוויבריום של פאביליאו אוזוריו דה אלמיידה, ומים ומזון היו זמינים עד לליביטום. הם נחשפו למחזור אור וחושך של 12 שעות/12 שעות.

1. הכנת תמיסת נתרן אולאט

  1. השתמש בחומצה אולאית להכנת 100 mmol / L של תמיסת מלאי נתרן אולאט בכל צינור סטרילי או בקבוק זכוכית.
    הערה: פתרון של 50 מ"ל (נפח סופי) הוכן לעבודה הנוכחית, אך יש להתאים את הנפח בהתאם לצורך הניסויי. הפתרון חייב להיות מוכן תמיד צינורות סטריליים או מיכלי זכוכית.
    1. ראשית, הוסף טבליות NaOH או תמיסה במים טהורים במיוחד כדי להעלות את ה- pH. ערך pH של 12-13 מומלץ עבור נפח של 25 מ"ל.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בבסיס Tris להכנת תמיסת Tris-oleate.
    2. מוסיפים את החומצה האולאית (ראו טבלת חומרים) לאט מאוד, טיפה אחר טיפה, תחת תסיסה מתמדת באמבטיה קולית ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם משקעים חומצה אולאית מתרחשים, להתחיל הכל מחדש מההתחלה.
    3. לאחר שהחומצה האולאית מומסת לחלוטין, כוונן בזהירות את ה- pH ל- 7.4, טיפה אחר טיפה תחת ערבוב, עם HCl מדולל טהור במיוחד ולאחר מכן התאם לנפח הסופי של 50 מ"ל.
      הערה: הכן מחדש את פתרונות ה- oleate העובדים. לחלופין, ניתן לאזר, לאגור ולשמור על התמיסה בטמפרטורה של -20°C בסביבה מועשרת בחנקן כדי למנוע חמצון למשך לא יותר מחודש. הימנעו ממחזורים קפואים-מוקפאים.

2. השראת פגיעה ריאתית על ידי חומצה אולאית

  1. בצע את הממשל intratracheal של חומצה אולאית.
    1. הרדימו את העכברים באמצעות איזופלורן 5% עם 2 ליטר/דקה של O2 באמצעות וופורזר הרדמה וטרינרית (איור 1A). הסר את הפרווה באזור החתך עם קרם depilatory ולחטא את האזור עם שלושה סיבובים לסירוגין של פילינג betadine ואלכוהול באמצעות גזה סטרילית. לאשר את עומק ההרדמה על ידי צביטת הבוהן.
      הערה: יש להשתמש בכפפות ובמכשירים סטריליים במהלך ההליך. השתמש בוילון כדי לכסות את בעל החיים ולחשוף רק את מקום החתך. בצע את הניסוי בארון בטיחות ביולוגי כדי למנוע בריחת איזופלואור לסביבה. משככי כאבים אינם ניתנים מכיוון שהם עלולים לעכב את התגובה הדלקתית.
    2. לאחר ההרדמה, הניחו את בעל החיים במצב דקוביטוס גבי ובצעו חתך (0.5-1 ס"מ) בצורת V ברמת בלוטת התריס. עקרו בעדינות את בלוטת התריס כדי לחשוף את קנה הנשימה (איור 1B) והזריקו 50 מיקרוליטר של תמיסת האולאטים המוכנה (שלב 1).
      הערה: העכברים חולקו לשתי קבוצות, עם שמונה בעלי חיים בכל קבוצה. קבוצת פגועי הריאות מקבלת תמיסת נתרן-אולאט ב-25 מילימטר (1.25 מיקרומול), וקבוצת הביקורת מקבלת 50 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים על-ידי החדרה לקנה הנשימה של כל עכבר עם מזרק אינסולין (נפח 300 μL, 30 גרם) (איור 1C).
    3. תפרו את אזור החתך של העכברים בתפר מונופילמנט סינתטי שאינו נספג, החזירו אותו לכלוב ועקבו אחריו עד להחלמה מלאה מהניתוח. במהלך כל ההליכים, לשמור על בעלי החיים על כרית חימום ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: לעכברים לוקח בדרך כלל עד 15 דקות להתאושש מהניתוח.
  2. בצע ניהול תוך ורידי של חומצה אולאית.
    1. לאחר הרדמה (שלב 2.1.1, איור 2A), הזריקו תוך ורידי לתוך מקלעת המסלול על-ידי החדרת המחט האולטרה-עדינה (ראו טבלת חומרים) לקנטוס המדיאלי של ארובת העין (איור 2B).
      הערה: העכברים חולקו לשתי קבוצות, עם שמונה בעלי חיים בכל קבוצה. כל קבוצה מקבלת 100 μL של תמיסת נתרן-אולאט ב-10 μmol של OA לכל חיה, בעוד קבוצת הביקורת מקבלת 100 μL של מלוחים סטריליים.
  3. לאחר הניתוח, לפקח על בעלי החיים מדי יום עבור תגובות שליליות. נקודות קצה אנושיות להמתת חסד כוללות תגובות שליליות, עוויתות ותרדמת.

3. אוסף נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי (BALF)

  1. הרדימו את העכברים במינון קטלני תוך צפקי של קטמין (300 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (30 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים).
  2. הניחו את בעל החיים במצב דקוביטוס גבי, בצעו חתך של כ -1 ס"מ עם מספריים כירורגיים באזור הקדמי של בעלי החיים, חשפו את קנה הנשימה ובצעו חתך קטן כדי להכניס קטטר תוך ורידי (20 גרם).
  3. מחברים את הצנתר למזרק סטרילי בנפח 1 מ"ל, מזריקים לאט ובהדרגה 0.5 מ"ל מלח סטרילי לריאות, ואז שואפים את הנוזל מה-BALF עם אותו מזרק. חזור על זה 3-5 פעמים, ולהעביר אותו microtube סטרילי, הצבת אותם בקרח.
    הערה: ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.

4. ניתוח תאים כולל ודיפרנציאלי ב- BALF

  1. עבור ספירת תאים כוללת, לדלל 20 μL של BALF ב 180 μL (דילול 10x) של תמיסה של Turk (ראה טבלה של חומרים). בצעו את הספירה באמצעות תא נויבאואר תחת מיקרוסקופ אופטי בעל מטרה של פי 40.
  2. לספירה דיפרנציאלית, לשים 100 μL של BALF במשפך התאי המכיל שקופיות וצנטריפוגה אותו ב 22.86 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C ב cytocentrifuge, וכתם עם May-Grunwald (15%, pH 7.2)-Giemsa (1:10) (ראה טבלת חומרים). המשך עם ספירת תאים במיקרוסקופ אור עם מטרת טבילה.

5. קביעת סך החלבון ב-BALF

  1. קבע את החלבון הסופרנאטנטי הכולל של BALF על ידי ערכת כימות חלבון מסחרית וקרא את הספיגה ב- 562 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

6. אנזים immunosorbent assays

  1. צנטריפוגה BALF ב 1,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן אספו את הסופרנאטנט עם פיפטה ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80°C לבדיקות של TNF-α, IL-1β, IL-6 ו-PGE215,23,25.
    הערה: הצנטריפוגה בשלב 6.1 הופכת את BALF ללא תאים.
    1. בצע את בדיקות הציטוקינים על BALF ללא תאים באמצעות ערכת ELISA מסחרית בהתאם להוראות היצרן. בצע את בדיקת PGE2 באמצעות ערכת אנזים אימונואסאי (EIA) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

7. צביעת גוף שומנים וספירה

  1. תקן את הלויקוציטים בשקופיות ציטוספין באמצעות 3.7% פורמלדהיד ב- Ca 2+, Mg2+ ללא תמיסת מלח חוצצת של האנק (HBSS, pH 7.4) והכתים עם 1.5% OsO4 בעודו עדיין לח3 (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, ספרו את גופי השומנים בכל תא ב-50 לויקוציטים רצופים מכל שקופית באמצעות עדשת האובייקט טבילת השמן של המיקרוסקופ.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. ביצוע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת גרפים וסטטיסטיקה (ראה טבלת חומרים). להביע את התוצאות כממוצע ± SEM ולנתח על ידי חד-כיווני Anova ואחריו Newman-Keuls-Student26 לאחר המבחן. שקול את ההבדלים משמעותיים כאשר P < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בריאה שלא נפגעה, פינוי נוזל הנאדיות מתרחש על ידי הובלת יונים דרך שכבת אפיתל מכתשית שלמה. השיפוע האוסמוטי נושא נוזל מן alveoli לתוך interstitium ריאתי, שם הוא מנוקז על ידי כלי הלימפה או נספג מחדש. Na/K-ATPase נוהג בתחבורה זו11. OA הוא מעכב של Na/K-ATPase27 ונתרןערוץ 21, אשר עשוי לתרום להיווצרות בצקת, כפי שכבר הצענו23. התגובה הדלקתית המחמירה ב- ARDS מובילה לנזק בנאדיות, חדירות אנדותל ואפיתל מוגברת, והצטברות נוזל מכתשית עשיר בחלבון ובתאים דלקתיים, הגורמים לבצקת. הבצקת גורמת לריאות להגביר את קצב הנשימה עקב הצטברות של נוזל אינטרסטיציאלי ופגיעה בחילופי גזים, וכתוצאה מכך היפוקסמיה וכשל נשימתי28. ציטוקינים כגון TNF-α וגורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) מערערים את יציבות קשרי VE-cadherin, ותורמים לחדירות אנדותל מוגברת ולהצטברות נוזל מכתשית7.

הזרקת OA הגדילה את סך כל הלויקוציטים בנתיבים תוך-טרכאליים ותוך-ורידיים (איור 3). היה צורך לגרום ל-OA לפגיעה ריאתית במסלול התוך-ורידי ולא במסלול התוך-טרכאלי. העבודה הנוכחית הראתה עלייה בספירת הנויטרופילים ב-BALF ב-6 שעות, כאשר השיא ב-24 שעות וירידה ב-48 שעות ו-72 שעות. ריכוז גבוה יותר של IL-6, IL-1β ו-TNF-α ב-BALF נצפה לאחר 24 שעות של החדרה תוך-טרכאלית של OA23 (איור 4). OA מונע פינוי בצקת ויכול לגרום להיווצרות בצקת עשירה בחלבון הן על ידי נתיבים תוך ורידי והן תוך טרכאלי15,23. בצקת הריאה הוערכה על-ידי בדיקת חלבון כוללת ב-BALF, והראתה כי מתן i.v. ו-i.t. הגדיל את ריכוז החלבון הכולל (איור 5). גופי שומנים הם אברונים תוך-תאיים המכילים סובסטרט ואנזימים לייצור איקוסנואידים 8,29. היווצרות של גופים שומנים משפר את הייצור של מתווכי שומנים, וזה יכול לשמש כדי לגשת להפעלת התא. הזרקת OA תוך טרכאלית ותוך ורידית שיפרה את היווצרות גופי השומנים ואת ריכוז PGE2 23 לאחר 24 שעות (איור 6). הזרקת OA גרמה גם להפרעה ברקמות, לדימום ולהסננת לויקוציטים בנתיבים תוך-טרכיאליים ותוך-ורידיים, כפי שניתן לראות בהיסטולוגיה של צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) (איור 7). כמו כן, OA גורם לשינוי בתפקוד הריאות19. לפיכך, פגיעה ריאתית הנגרמת על ידי חומצה אולאית מציגה תכונות רבות של ARDS.

Figure 1
איור 1: השלבים הבודדים בפרוטוקול הניהול התוך-טרכאלי . (A) עכבר מורדם באמצעות 5% איזופלואורן ו-2 ליטר/דקה של O2. (B) חתך בקנה הנשימה עם מספריים כירורגיים בעכברים במצב דקוביטוס גבי. (C) החדרה תוך טרכאלית באמצעות מזרק אינסולין. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השלבים הבודדים בפרוטוקול מתן תוך ורידי . (A) עכבר מורדם עם 5% איזופלואורן ו-2L/min של O2. (B) הזרקה תוך ורידית באמצעות מזרק אינסולין על ידי הקנטוס המדיאלי. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מתן OA גורם להפעלת לויקוציטים ב-BALF של עכברים. סך כל הלויקוציטים במתן תוך-ורידי (i.v) ותוך-טרכאלי (i.t) (A) ופוטומיקרוגרף להמחשה (הגדלה של 1000x) במתן תוך-טרכאלי (i.t.) המוכתמים במאי-גרינוולד-גימסה (B) בוצעו 24 שעות לאחר אתגר OA. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אותו נפח של מי מלח סטריליים ניתן לקבוצת הביקורת. כל סרגל מייצג את הממוצע ± SEM של לפחות שבעה בעלי חיים. *P < 0.05, בהשוואה לבקרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מתן תוך-טרכאלי (i.t) של OA גורם לייצור מתווכי דלקת בריאה של עכברים. TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) נמדדו 24 שעות לאחר האתגר. מי מלח סטריליים ניתנו לקבוצת הביקורת. כל סרגל מייצג את הממוצע ± SEM עבור שישה בעלי חיים לפחות. *P < 0.05, בהשוואה לבקרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תכולת החלבון הכוללת ב-BALF 24 שעות לאחר הזרקת OA. מתן תוך-טרכאלי (i.t.) ותוך-ורידי (i.v.) של OA מגדיל את סך החלבון ב-BALF של עכברים. קבוצת הביקורת קיבלה את אותו נפח של מי מלח סטריליים. התוצאות הן ± SEM מלפחות שישה בעלי חיים שונים. *P < 0.0001, בהשוואה לבקרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: היווצרות גופי שומנים בלויקוציטים וייצור PGE2 ב-BALF של עכברים שטופלו ב-OA. מתן תוך-טרכאלי (i.t) ותוך-ורידי (i.v) של OA גורם למתווכי דלקת ולהצטברות גופי שומנים ב-BALF של עכברים (A) ו-(B), בהתאמה. (C) פוטומיקרוגרף להמחשה של גופי שומנים (הגדלה של 1000x) מוכתמים בריאות החיות עם אוסמיום טטרוקסיד (OsO4) 24 שעות לאחר אתגר OA. החצים מצביעים על גופי השומנים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. פקדים קיבלו את אותו נפח של מלוחים. התוצאות הן ± SEM משבעה בעלי חיים. *P < 0.05, בהשוואה לבקרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: היסטולוגיה ריאתית להמחשה בעכברים . (A) עכברי ביקורת שטופלו במי מלח וללא סימן לדימום. (B) מתן תוך ורידי של OA (i.v). (C) מתן תוך קנה הנשימה (i.t) עם שינויים ברקמות. בוצע צביעת H&E. הגדלה, פי 1000. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בחירת מודל ARDS הנכון חיונית לביצוע המחקרים הפרה-קליניים, ועל המעריך לשקול את כל המשתנים האפשריים, כגון גיל, מין, שיטות ניהול ואחרים6. המודל שנבחר חייב לשחזר את המחלה בהתבסס על גורמי סיכון כגון אלח דם, תסחיף שומנים, איסכמיה-רפרפוזיה של כלי הדם הריאתיים וסיכונים קליניים אחרים14. עם זאת, שום מודל של בעלי חיים המשמש ל- ARDS אינו יכול לשחזר את כל המאפיינים של התסמונת האנושית. מודלים מרובים של חומרים פוגעים כוללים LPS, OA, חומצה הידרוכלורית, חיידקים ווירוסים6. כמו כן, שיטות ניהול שונות משמשים, נפוץ יותר, intratracheal, intranasal, או תוך ורידי. מודל איסכמיה-רפרפוזיה ריאתית גורם לקרע נימי והצטברות של חלבון תוך מכתשי6. פגיעה ריאתית הנגרמת על ידי LPS נמצאת בשימוש נרחב ומובילה לפגיעה חריפה של מחסומי אפיתל ואנדותל. LPS נקשר לקולטן דמוי אגרה 4 (TLR-4) באפיתל דרכי הנשימה ומפעיל הפעלת NF-κB המגביר את ייצור הציטוקינים והכימוקינים, ומושך תאים דלקתיים30, מה שמוביל לנאדיות נויטרופיליות חזקות6. עם זאת, המודל מראה שינויים בין זנים ומינים של בעלי חיים, מה שמקטין את יכולת השחזור של התוצאות בבעלי חיים עבור חולים אנושיים עם ARDS30.

מודל פגיעת HCl מחקה ARDS על ידי שאיפת תוכן חומצי. רמת החומציות הנמוכה בריאות גורמת לתגובה דלקתית חריפה ואחריה פגיעה פיברוטית מאוחרת. הנזק תלוי נויטרופילים, גורם לדימום בנאדיות, בצקת ופגיעה בפינוי נוזלים. עם זאת, בני אדם אינם שואפים רק HCl אלא תוכן קיבה מורכב עם pH לעתים קרובות גבוה מ 1.531. מודלים אלה ואחרים של ARDS נסקרו בהרחבה במקומות אחרים31. בין כל המודלים המשמשים, מודל ARDS המושרה על ידי חומצה אולאית הואהאידיאלי ביותר 14.

מודל נתרן אולאט גורם נזק לריאות, גורם לאפופטוזיס ונמק של תאי נאדיות, ומגביר את ייצור הציטוקינים כגון TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β ו-MIP-1α19. OA גם גורם לפרוטאזות וביטוי אלסטאז עם דימום הגורם לפגיעה ריאתית חמורה25. OA משחזר את המחלה עקב תסחיף שומנים, חדירות כלי דם ריאתית מוגברת, ונוזל חוץ כלי דם עם חדירות רדיוגרפיות32. כמו כן, לחולים עם ARDS יש ריכוז OA פלסמטי גבוה יותר 15,22,24.

מתן תוך-טרכאלי OA גורם לייצור מתווכי דלקת בדומה ל-ARDS קליני ומקטין את היענות הריאות ואת חילוף הגזים25,32. הזרקת OA תוך ורידית מקדמת את ההיבטים ההיסטומורפולוגיים והפיזיולוגיים של המחלה32. אלבומין בסרום הוא ליגנד OA רב-עוצמה, מה שיכול להסביר מדוע מסלול זה דורש כמות OA גבוהה יותר (10 μmol)15 מאשר intratracheal (1.25 μmol)23 כדי לגרום נזק לריאות. ואכן, הקבוצה שלנו הראתה מתאם בין חוסר איזון OA/אלבומין לבין סיכון גבוה יותר לתמותה בחולים עם לפטוספירוזיס33.

כמו בכל מודל אחר, ישנם כמה חסרונות המוצגים במודל. כאשר חומצה אולאית אינה ניתנת בצורת מלח, היא עלולה לגרום להשפעות רעילות ולשינויים עקב תחליב הדם. כפי שהוכח במאמר זה, שימוש בצורת מלח שלה מקטין את ההשפעות הרעילות ומונע שתי בעיות: היווצרות אמבולי ותנודות pH בדם ובריאות. כמו כן, הוא מבטיח כי הפגיעה הריאתית נגרמת על ידי oleate ולא על ידי השפעה משנית15. בנוסף, הכנת חומצה אולאית בצורת מלח במודל זה אינה דורשת הצמדה עם אלבומין. מחקרים מראים את ההשפעות המועילות של אלבומין בהפחתת דלקת וחדירות כלי הדם. כמו כן, אלבומין משחזר המודינמיות ונשימה בחולי פגיעה ריאתית. לפיכך, הצמדת אלבומין עם OA עלולה לפגוע בהשפעתו על החיה, ולהפחית את יכולת הקיום של הדגמים33,34.

ברמה המולקולרית, נתרן אולאט מעכב נתרן-אשלגן ATPase (NKA) ותעלות נתרן (eNac), אשר פוגעים בהעברת יונים, מגבירים את חדירות כלי הדם ואת היווצרות בצקת15. כמו כן, OA יכול להיקשר לקולטן חומצות שומן חופשיות 1 (FFAR1), להגדיל את ריכוז Ca2+ תוך תאי, אשר מפעיל קינאזות איתות חלבונים כגון PI3K ו- MAPK, מה שמוביל לגורם גרעיני קאפה - משפר שרשרת אור של תאי B פעילים (NF-κB) ומשפר את התגובה הדלקתית25.

לסיכום, למרות שאף מודל אינו יכול לשחזר באופן מלא תכונות ARDS, הם כלים יקרי ערך לחקר המחלה. מחקר פרה-קליני חיוני להבנת הפתופיזיולוגיה של ARDS ולפיתוח טיפולים חדשים. הניהול התוך-טרכאלי והתוך-ורידי של OA, בצורת מלח, מייצר מודלים אמינים וניתנים לשחזור של ARDS, מה שהופך אותו למודל זהב לחקר ARDS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי המכון אוסוולדו קרוז, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), וה-Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). איור 1 ואיור 2 נוצרים באמצעות BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic vaporizer SurgiVet model 100
Braided slik thread with needle number 5 Shalon medical N/A
Cabinet vivarium Insight  Model EB273
Centrifuge Eppendorf 5430/5430R
Cytofunnel ThermoFisher 11-025-48
Drontal puppy Bayer N/A
Hank's balanced Salts Sigma-Aldrich H4981
Heatpad tkreprodução TK-500
Hydrocloric Acid Sigma-Aldrich 30721
Insulin syringe Ultrafine BD 328322
Isoforine 1mL/mL Cristália N/A
Ketamine Syntec N/A
May-Grunwald-Giemsa Sigma-Aldrich 205435
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23235
Microscope  PrimoStar Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA R&D system DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA R&D system DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA R&D system DY410
Neubauer chamber improved bright-line Global optics
Oleic Acid (99%) Sigma-Aldrich O1008
Osmium tetroxide solution (4%) Sigma-Aldrich 75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G BD Angiocath 388333
Prism 8 (graphic and statistic software) Graphpad N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal Cayman Chemical 514010
Shandon Cytospin 3 ThermoFisher N/A
Sodium hydroxide Merck 1,06,49,81,000
Spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice ICTB/FIOCRUZ N/A
Syringe 1 mL BD 990189
Tris-base Bio Rad 161-0719 Electrophoresis purity reagent
Türk's solution Sigma-Aldrich 93770
Xilazine Syntec N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E. Acute respiratory distress in adults. Lancet. 2 (7511), 319-323 (1967).
  2. The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  3. Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
  4. Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
  5. Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
  6. D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
  7. Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
  8. Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
  9. Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
  10. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 18 (2019).
  11. Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
  12. Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
  13. Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
  14. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
  15. Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
  16. Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
  17. Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
  18. Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
  19. Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
  20. Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
  21. Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
  22. Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
  23. Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
  24. Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
  25. Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
  26. McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
  27. Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
  28. Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
  29. Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
  30. Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
  31. Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
  32. Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
  33. Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
  34. Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).

Tags

מודל עכבר חומצה אולאית תסמונת מצוקה נשימתית חריפה ARDS חשיפה למזהמים עשן סיגריות גורמים זיהומיים חומצות שומן מודלים של בעלי חיים פתומנגנון מגבלות חומצה אולאית (OA) השפעות מזיקות על הריאה פגיעה בריאות אמבולי שיבוש רקמות שינוי PH פגיעה בסילוק בצקת פגיעה באנדותל חדירות מכתשית דלקת היווצרות היאלין הממברנה מוות תאי הזרקת OA (בצורת מלח) צורה פיזיולוגית של OA ב PH 7
מודל עכברי של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה הנגרמת על ידי חומצה אולאית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Oliveira Rodrigues, S., Patricio… More

de Oliveira Rodrigues, S., Patricio de Almeida, M. A., Castro-Faria-Neto, H. C., Silva, A. R., Felippe Gonçalves-de-Albuquerque, C. Mouse Model of Oleic Acid-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. J. Vis. Exp. (184), e63566, doi:10.3791/63566 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter