Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Musemodell av oljesyreindusert akutt respiratorisk nødsyndrom

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63566
Automatic Translation
*1,2,5, *1,2,6, 1,3,4, 1,3, 1,2,4,5,6
1Laboratório de Imunofarmacologia, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2Laboratório de Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 4Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 5Programa de Pós-Graduação em Ciências e Biotecnologia, Universidade Federal Fluminense, 6Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal Fluminense
* These authors contributed equally

Summary

Den foreliggende protokollen beskriver en lungeskademodell hos mus som bruker oljesyre for å etterligne akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS). Denne modellen øker de inflammatoriske mediatorene på ødem og reduserer lungeoverensstemmelse. Oljesyre brukes i saltformen (oleat), siden denne fysiologiske formen unngår risikoen for emboli.

Abstract

Akutt lungesviktsyndrom (ARDS) er en betydelig trussel mot kritisk syke pasienter med høy dødelighet. Eksponering av forurensende stoffer, sigarettrøyk, smittestoffer og fettsyrer kan indusere ARDS. Dyremodeller kan etterligne den komplekse patomekanismen til ARDS. Hver av dem har imidlertid begrensninger. Spesielt er oljesyre (OA) økt hos kritisk syke pasienter med skadelige effekter på lungene. OA kan indusere lungeskade ved emboli, forstyrre vev, endre pH og svekke ødemclearance. OA-indusert lungeskademodell ligner ulike trekk ved ARDS med endotelskade, økt alveolær permeabilitet, inflammasjon, membranhyalindannelse og celledød. Her beskrives induksjon av lungeskade ved å injisere OA (i saltform) direkte i lungen og intravenøst i en mus siden det er den fysiologiske formen for OA ved pH 7. Dermed er injeksjon av OA i saltform en nyttig dyremodell for å studere lungeskade / ARDS uten å forårsake emboli eller endre pH, og dermed komme nær det som skjer hos kritisk syke pasienter.

Introduction

Ashbaugh et al.1, i 1967, beskrev først akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS) og har siden da vært gjennom flere revisjoner. I henhold til Berlin-definisjonen er ARDS en lungebetennelse som fører til akutt respirasjonssvikt og hypoksemi (PaO 2/FiO 2 > 300 mm Hg) på grunn av ubalanse i forholdet mellom ventilasjon og perfusjon, diffus bilateral alveolær skade (DAD) og infiltrat, økt lungevekt og ødem 2,3. Pulmonal parenchyma er et komplekst cellulært miljø sammensatt av epitel-, endotel- og andre celler. Disse cellene danner barrierer og strukturer som er ansvarlige for gassutveksling og homeostase i alveolene3. De mest tallrike cellene i epitelbarrieren er alveolære type I-celler (AT1) med større overflateareal for gassutveksling og væskestyring gjennom Na / K-ATPase. De alveolære type II-cellene (AT2) produserer også overflateaktivt middel, noe som reduserer overflatespenningen i alveolene4. Under danner endotelceller en semipermeabel barriere som skiller lungesirkulasjonen fra interstitium. Funksjonene inkluderer å oppdage stimuli, koordinere inflammatoriske responser og cellulær transmigrasjon5. Endotelcellene regulerer også gassutveksling, vaskulær tonus og koagulasjon5. Derfor kan endotel- og epitelfunksjonsforstyrrelser forverre en proinflammatorisk fenotype og forårsake lungeskade som fører til ARDS5.

ARDS-utvikling er risikoforbundet med bakteriell og viral lungebetennelse eller indirekte faktorer som ikke-pulmonal sepsis, traumer, blodtransfusjoner og pankreatitt6. Disse forholdene forårsaker frigjøring av patogenassosierte molekylære mønstre (PAMP) og skadeassosierte molekylære mønstre (DAMPs), som induserer proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner som TNF-α, IL-1β, IL-6 og IL-85. TNF-α er knyttet til vaskulær-endotelial cadherin (VE-cadherin) nedbrytning ved forstyrrelse av endotelbarrieren og leukocyttinfiltrasjon i lungeparenkymet. Neutrofiler er de første cellene som migrerer, tiltrukket av IL-8 og LTB4 5,7,8. Nøytrofiler øker ytterligere proinflammatoriske cytokiner, reaktive oksygenarter (ROS)9 og dannelse av nøytrofile ekstracellulære feller (NET) som genererer ekstra endotel- og epitelskade10. Epitelskader ber om betennelse og aktivering av Toll-lignende reseptorer i AT2-celler og bosatt makrofager, indusere frigjøring av kjemokiner som tiltrekker inflammatoriske celler til lungene4. Også produksjonen av cytokiner som interferon-β (INFβ) forårsaker TNF-relaterte apoptoseinduserende reseptorer (TRAIL), som fører ATII-celler til apoptose, svekker væske og ionklarhet4. Forstyrrelsen av endotel- og epitelbarrierestrukturen tillater tilstrømning av væske, proteiner, røde blodlegemer og leukocytter inn i alveolarrommet og forårsaker ødem. Med edema etablert, er lungeinnsatsen for å opprettholde pust og gassutveksling endret11. Hyperkapni og hypoksemi induserer celledød og natriumtransportforstyrrelser, forverrende alveolær ødem på grunn av dårlig klaringskapasitet10. ARDS har også forhøyede nivåer av IL-17A, assosiert med organdysfunksjon, økt prosentandel av alveolære nøytrofiler og alveolær permeabilitet9.

Det har vært pågående fremskritt i forskning på patofysiologi, epidemiologi og behandling av ARDS de siste årene12,13. Imidlertid er ARDS et heterogent syndrom til tross for fremdriften i terapeutisk forskning som resulterer i mekanisk ventilasjon og optimalisering av væsketerapi. Dermed er det fortsatt behov for en mer effektiv direkte farmakologisk behandling10, og dyreforsøk kan bidra til å avdekke ARDS-mekanismer og mål for intervensjon.

Nåværende ARDS-modeller er ikke i stand til å replikere patologien fullt ut. Dermed velger forskere ofte den modellen som passer bedre til deres interesser. For eksempel induserer lipopolysakkarid (LPS) induksjonsmodellen ARDS ved endotoksisk sjokk utløst hovedsakelig av TLR414. HCl-induksjon etterligner syreaspirasjon, og skaden er nøytrofilavhengig14. På den annen side induserer den nåværende natriumoleatmodellen endotelskader som øker vaskulær permeabilitet og ødem. Videre unngår bruk av natriumoleat i stedet for oljesyre i flytende form embolirisiko og endring i blodets pH15.

Dyremodeller for ARDS
Prekliniske studier i dyremodeller bidrar til å forstå patologien og er avgjørende for ny ARDS-behandlingsforskning. Den ideelle dyremodellen må ha egenskaper som ligner den kliniske situasjonen og god reproduserbarhet av sykdomsmekanismer med relevante patofysiologiske trekk ved hvert sykdomsstadium, evolusjon og reparasjon14. Flere dyremodeller brukes til å vurdere akutt lungeskade i ARDS preklinisk. Men da alle modeller har begrensninger, reproduserer de ikke fullt ut den menneskelige patologien 6,14,16. Oljesyreindusert ARDS brukes i forskjellige dyrearter17. Gris18, sau19 og hunder20 sendt til OA-injeksjon presenterer mange kliniske trekk ved sykdommen med alveolar-kapillær membrandysfunksjon og økt permeabilitet med protein- og celleinfiltrasjon.

For eksempel injiserte OA ved 1,25 μM intravenøst blokkert transepitelial transport som førte til alveolær ødem15. Alternativt, i in vitro-modellen ved bruk av A549-celler, endret OA i en konsentrasjon på 10 μM ikke epitelial natriumkanal (eNAC) eller ekspresjonen av Na/K-ATPase. OA ser imidlertid ut til å assosiere seg med begge kanalene, noe som direkte hemmer deres aktivitet21. OA intravenøs injeksjon på 0,1 ml / kg forårsaket lungevevsbelastning og hevelse, reduserte alveolære rom med fortykket alveolær septa og økt inflammatorisk og rødt blodcelletall22. OA induserte også apoptose og nekrose i endotel- og epitelceller i lungen15. Injeksjon av en tris-oleatløsning, intratrakealt hos mus, forbedret nøytrofil infiltrasjon og ødem så tidlig som 6 timer etter stimulering23. OA-injeksjon ved 24 timer økte proinflammatoriske cytokinnivåer (dvs. TNF-α, IL-6 og IL-1β)23. I tillegg hemmer intravenøs (orbital plexus) injeksjon av 10 μM av et tris-oleat pulmonal Na / K-ATPase-aktivitet, lik ouabain ved 10-3 μM, en selektiv enzymhemmer. OA induserer også betennelse med celleinfiltrasjon, dannelse av lipidlegemer og produksjon av leukotrien B4 (LTB4) og prostaglandin E2 (PGE2) 22,24. Derfor genererer oljesyreindusert ARDS ødem, blødning, nøytrofil infiltrasjon, økt myeloperoksidase (MPO) aktivitet og ROS24. Derfor er OA-administrasjon en veletablert modell for lungeskade22,25. Alle resultatene som presenteres i denne artikkelen som har OA representerer saltformen, natriumoleat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrene som ble brukt i denne studien ble godkjent av den etiske komiteen for bruk av dyr fra Oswaldo Cruz Foundation (CEUA-lisenser nr. 002-08, 36/10 og 054/2015). Mannlige sveitsiske Webster-mus som veier mellom 20-30 g, levert av Institute of Science and Technology in Biomodels (ICTB) fra Oswaldo Cruz Foundation (FIOCRUZ), ble brukt til forsøkene. Dyrene ble holdt i ventilerte isolatorer i Pavilhão Ozório de Almeidas vivarium, og vann og mat var tilgjengelig ad libitum. De ble utsatt for en 12 timers lys og mørk syklus.

1. Fremstilling av natriumoleatoppløsning

  1. Bruk oljesyre til å fremstille en 100 mmol / l natriumoleatoppløsning i et sterilt rør eller glasskolbe.
    MERK: En 50 ml (endelig volum) løsning ble utarbeidet for det nåværende arbeidet, men volumet må justeres i henhold til eksperimentelt behov. Løsningen må alltid fremstilles i sterile rør eller glassbeholdere.
    1. Tilsett først NaOH-tabletter eller -oppløsning i ultrarent vann for å heve pH-verdien. En pH-verdi på 12-13 anbefales for et volum på 25 ml.
      MERK: Alternativt kan Tris-basen brukes til å forberede Tris-oleatløsningen.
    2. Tilsett oljesyren (se materialfortegnelse) veldig sakte, dråpe for dråpe, under konstant omrøring i et ultralydbad ved 37 ° C.
      MERK: Hvis oljesyreutfelling oppstår, start helt på nytt fra begynnelsen.
    3. Når oljesyren er fullstendig oppløst, juster pH forsiktig til 7,4, dråpe for dråpe under omrøring, med ultraren fortynnet HCl og juster deretter til det endelige volumet på 50 ml.
      NOTAT: Forbered de fungerende oleatløsningene på nytt. Alternativt kan oppløsningen alisiteres, lagres og vedlikeholdes ved -20 °C i et nitrogenberiket miljø for å unngå oksidering i ikke lenger enn en måned. Unngå frosne-gjenfrosne sykluser.

2. Induksjon av lungeskade med oljesyre

  1. Utfør intratrakeal administrering av oljesyre.
    1. Bedøv musene med 5 % isofluran med 2 l/minO2 ved bruk av en veterinærbedøvelsesfordamper (figur 1A). Fjern pelsen ved snittområdet med hårfjerningskrem og desinfiser området med tre alternerende runder med betadinskrubb og alkohol ved bruk av sterilt gasbind. Bekreft dybden av anestesi ved tåklemme.
      MERK: Bruk sterile hansker og instrumenter under prosedyren. Bruk en gardin for å dekke dyret og eksponere bare snittstedet. Utfør eksperimentet i et biologisk sikkerhetsskap for å unngå at isofluoran slipper ut i miljøet. Analgetika administreres ikke, da de kan hemme den inflammatoriske responsen.
    2. Etter anestesi, legg dyret i en dorsal decubitusstilling og gjør et snitt (0,5-1 cm) i V-form på skjoldbrusknivå. Fordel skjoldbruskkjertelen forsiktig for å eksponere luftrøret (figur 1B) og injiser 50 μl av den tilberedte oleatoppløsningen (trinn 1).
      MERK: Musene ble delt inn i to grupper, med åtte dyr i hver gruppe. Lungeskadegruppen får natrium-oleatoppløsning ved 25 mM (1,25 μmol), og kontrollgruppen får 50 μL sterilt saltvann ved drypping i luftrøret til hver mus med en insulinsprøyte (volum 300 μL, 30 G) (figur 1C).
    3. Sutur musens snittsted med en syntetisk, ikke-absorberbar monofilamentsutur, returner den til buret og overvåk den til fullstendig gjenoppretting fra operasjonen. Under alle prosedyrer, hold dyrene på en varmepute ved 37 °C.
      MERK: Mus tar vanligvis opptil 15 minutter å komme seg etter operasjonen.
  2. Utfør intravenøs administrering av oljesyre.
    1. Etter anestesi (trinn 2.1.1, figur 2A) injiseres intravenøst i plexus orbital ved å stikke den ultrafine nålen (se materialtabell) i den mediale kanturen i øyehulen (figur 2B).
      MERK: Musene ble delt inn i to grupper, med åtte dyr i hver gruppe. Hver gruppe mottar 100 μL natrium-oleatoppløsning ved 10 μmol OA per dyr, mens kontrollgruppen mottar 100 μL steril saltvann.
  3. Etter operasjonen, overvåke dyrene daglig for bivirkninger. Humane endepunkter for eutanasi inkluderer bivirkninger, kramper og koma.

3. Bronkoalveolær skyllevæskeoppsamling (BALF)

  1. Avlive musene med en intraperitoneal dødelig dose ketamin (300 mg/kg) og xylazin (30 mg/kg) (se materialtabell).
  2. Legg dyret i dorsal decubitus-stilling, gjør et snitt på ca. 1 cm med kirurgisk saks i dyrets fremre region, eksponer luftrøret og lag et lite kutt for å introdusere et intravenøst kateter (20 G).
  3. Koble kateteret til en 1 ml steril sprøyte, injiser sakte og gradvis 0,5 ml steril saltoppløsning i lungene, og aspirer deretter væsken fra BALF med samme sprøyte. Gjenta det 3-5 ganger, og overfør det til et sterilt mikrorør, plasser dem i is.
    MERK: Prøvene kan oppbevares ved -20 °C i opptil 6 måneder.

4. Total- og differensialcelleanalyse i BALF

  1. For totalt celletall, fortynn 20 μL BALF i 180 μL (10x fortynning) av Turks oppløsning (se materialfortegnelse). Utfør tellingen ved hjelp av et Neubauer-kammer under et optisk mikroskop med et 40x objektiv.
  2. For differensialtelling, legg 100 μL BALF i den cellulære trakten som inneholder lysbilder og sentrifuge den ved 22,86 x g i 5 minutter ved 4 ° C i en cytosentrifuge, og flekk med May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) (se materialtabell). Fortsett med celletall i et lysmikroskop med nedsenkingsmål.

5. Bestemmelse av totalt protein i BALF

  1. Bestem det totale BALF supernatantproteinet ved hjelp av et kommersielt proteinkvantifiseringssett og avles absorbansen ved 562 nm ved hjelp av et spektrofotometer i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).

6. Enzymimmunosorbentanalyser

  1. Sentrifuge BALF ved 1 200 x g i 10 minutter ved 4 °C. Deretter samles supernatanten med en pipette og oppbevares ved -80 °C for analyser av TNF-α, IL-1β, IL-6 og PGE215,23,25.
    MERK: Sentrifugeringen i trinn 6.1 gjør BALF cellefri.
    1. Utfør cytokinanalysene på cellefri BALF ved bruk av et kommersielt ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner. Utfør PGE2-analysen ved hjelp av et enzymimmunoassay (EIA) -sett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabellen).

7. Lipid kroppsfarging og telling

  1. Fest leukocyttene på cytospin-lysbilder med 3,7 % formaldehyd i Ca 2+, Mg2+ fri Hanks bufrede saltløsning (HBSS, pH 7,4) og beis med 1,5 % OsO4 mens den fortsatt er fuktig3 (se materialfortegnelse). Deretter teller lipidlegemene per celle i 50 påfølgende leukocytter fra hvert lysbilde ved hjelp av mikroskopets objektivlinse for olje-nedsenking.

8. Statistisk analyse

  1. Utfør statistisk analyse ved hjelp av grafisk og statistisk programvare (se Materialfortegnelse). Uttrykk resultatene som gjennomsnitt ± SEM og analyser med enveis Anova etterfulgt av en post-test Newman-Keuls-Student26. Vurder forskjellene signifikante når P < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en uskadd lunge oppstår alveolær væskeclearance ved transport av ioner gjennom det intakte alveolære epitellaget. Den osmotiske gradienten bærer væske fra alveolene inn i pulmonalt interstitium, hvor det dreneres av lymfekar eller reabsorberes. Na/K-ATPase driver denne transporten11. OA er en hemmer av Na/K-ATPase27 og natriumkanal21, noe som kan bidra til ødemdannelse, som vi allerede har foreslått23. Den forverrede inflammatoriske responsen i ARDS fører til alveolær skade, økt endotel- og epitelpermeabilitet og akkumulering av alveolær væske rik på protein og inflammatoriske celler, forårsaker ødem. Ødemet fører til at lungene øker pustefrekvensen på grunn av akkumulering av nedsatt interstitiell væske og gassutveksling, noe som resulterer i hypoksemi og respirasjonssvikt28. Cytokiner som TNF-α og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) destabiliserer VE-cadherinbindinger, noe som bidrar til økt endotelpermeabilitet og alveolær væskeakkumulering7.

OA-injeksjon økte totale leukocytter intratrakealt og intravenøst (figur 3). Det var nødvendig å indusere OA for lungeskade intravenøst i stedet for intratrakealt. Det nåværende arbeidet viste en økning i nøytrofiltall i BALF ved 6 timer, med toppen ved 24 timer og avtagende ved 48 timer og 72 timer. En høyere konsentrasjon av IL-6, IL-1β og TNF-α i BALF ble observert etter 24 timer OA intratrakeal instillasjon23 (figur 4). OA forhindrer ødemclearance og kan utløse dannelsen av ødem rik på protein ved både intravenøse og intratrakeale ruter15,23. Lungeødemet ble vurdert ved total proteinanalyse i BALF, som viste at intravenøs og i.t. administrering økte total proteinkonsentrasjon (figur 5). Lipidlegemer er intracellulære organeller som inneholder substrat og enzymer til eikosanoider produksjon 8,29. Dannelsen av lipidlegemer øker produksjonen av lipidmediatorer, og den kan brukes til å få tilgang til celleaktivering. Intratrakeal og intravenøs OA-injeksjon økte dannelsen av lipidlegemer og PGE2-konsentrasjon 23 etter 24 timer (figur 6). OA-injeksjon induserte også vevsforstyrrelser, blødning og leukocyttinfiltrasjon i intratrakeale og intravenøse ruter, som vist i hematoksylin- og eosinfargehistologi (H&E) (figur 7). Også OA forårsaker endring i lungefunksjon19. Dermed presenterer oljesyreindusert lungeskade mange ARDS-funksjoner.

Figure 1
Figur 1: De enkelte trinnene i intratrakeal administreringsprotokoll . (A) En mus bedøves ved bruk av 5% isofluoran og 2 l / min O2. (B) Et trakealt snitt med en kirurgisk saks hos mus i dorsal decubitusstilling. (C) Intratrakeal instillasjon ved bruk av en insulinsprøyte. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: De enkelte trinnene i intravenøs administrasjonsprotokoll. (A) En mus bedøves med 5% isofluoran og 2L / min O2. (B) Intravenøs injeksjon ved hjelp av en insulinsprøyte av den mediale canthus. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Administrering av OA induserer leukocyttaktivering i BALF hos mus. Totale leukocytter ved intravenøs (i.v) og intratrakeal administrering (i.t) (A) og illustrerende fotomikrograf (1000x forstørrelse) ved intratrakeal administrering (i.t.) farget med May-Grünwald-Giemsa (B) ble utført 24 timer etter OA-smitte. Skala bar = 10 μm. Samme volum sterilt saltvann ble gitt til kontrollgruppen. Hver bar representerer gjennomsnittlig ± SEM på minst syv dyr. *P < 0,05, sammenlignet med kontroller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Intratrakeal administrering (i.t) av OA induserer produksjon av inflammatoriske mediatorer i lungene hos mus. TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) ble målt 24 timer etter utfordringen. Sterilt saltvann ble gitt til kontrollgruppen. Hver bar representerer gjennomsnittet ± SEM for minst seks dyr. *P < 0,05, sammenlignet med kontroller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Totalt proteininnhold i BALF 24 timer etter OA-injeksjon. Intratrakeal (i.t.) og intravenøs (i.v.) administrering av OA øker totalt protein i BALF hos mus. Kontrollgruppen fikk samme volum sterilt saltvann. Resultatene er ± SEM fra minst seks forskjellige dyr. *P < 0,0001, sammenlignet med kontroller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Lipidkroppsdannelse i leukocytter og PGE2-produksjon i BALF hos OA-behandlede mus. Intratrakeal (i.t) og intravenøs (i.v) administrering av OA induserer inflammatoriske mediatorer og lipidlegemeakkumulering i BALF hos henholdsvis mus (A) og (B). (C) Illustrerende fotomikrografi av lipidlegemer (1000x forstørrelse) farget i lungene til dyrene med osmiumtetroxid (OsO4) 24 timer etter OA-utfordring. Pilene peker på lipidlegemene. Skala bar = 10 μm. Kontrollene fikk samme volum saltvann. Resultatene er midler ± SEM fra syv dyr. *P < 0,05, sammenlignet med kontroller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Illustrativ lungehistologi hos mus . (A) Kontrollmus behandlet med saltvann og ingen tegn til blødning. (B) Intravenøs administrering av OA (i.v). (C) Intratrakeal administrering (i.t) med vevsendringer. H&E-farging ble utført. Forstørrelse, 1000x. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Å velge riktig ARDS-modell er avgjørende for å gjennomføre de prekliniske studiene, og evaluatoren må vurdere alle mulige variabler, for eksempel alder, kjønn, administrasjonsmetoder og andre6. Den valgte modellen må reprodusere sykdommen basert på risikofaktorer som sepsis, lipidemboli, iskemi-reperfusjon av lungevaskulaturen og andre kliniske risikoer14. Imidlertid kan ingen dyremodell som brukes til ARDS gjenskape alle egenskapene til det menneskelige syndromet. Flere skademiddelmodeller inkluderer LPS, OA, saltsyre, bakterier og virus6. Også forskjellige administrasjonsmetoder brukes, mer vanlig, intratrakeal, intranasal eller intravenøs. Lungeiskemi-reperfusjonsmodellen forårsaker kapillærruptur og akkumulering av intra-alveolært protein6. LPS-indusert lungeskade er mye brukt og fører til akutt skade på epitel- og endotelbarrierer. LPS binder seg til den tolllignende reseptoren 4 (TLR-4) i luftveisepitelet og utløser NF-κB-aktivering som øker produksjonen av cytokiner og kjemokiner, og tiltrekker inflammatoriske celler30, noe som fører til en robust nøytrofil alveolitt6. Modellen viser imidlertid variasjoner mellom stammer og dyrearter, noe som reduserer reproduserbarheten av resultatene hos dyr for humane pasienter med ARDS30.

HCl-skademodellen etterligner ARDS ved sur innholdsaspirasjon. Den lave pH i lungene induserer en akutt inflammatorisk respons etterfulgt av en sen fibrotisk skade. Skaden er nøytrofilavhengig, forårsaker alveolær blødning, ødem og nedsatt væskeclearance. Imidlertid aspirerer mennesker ikke bare HCl, men et komplekst mageinnhold med en pH ofte høyere enn 1,531. Disse og andre ARDS-modeller har blitt grundig gjennomgått andre steder31. Blant alle modellene som brukes, er oljesyreindusert ARDS-modellen den mest ideelle14.

Natriumoleatmodellen forårsaker lungeskade, induserer apoptose og nekrose av alveolære celler, og forbedrer cytokinproduksjonen som TNFa, IL-8, IL-6, IL-1β og MIP-1α19. OA induserer også proteaser og elastaseuttrykk med blødning som forårsaker alvorlig lungeskade25. OA reproduserer sykdommen på grunn av lipidemboli, økt pulmonal vaskulær permeabilitet og ekstravaskulær væske med radiografiske infiltrater32. Også pasienter med ARDS har høyere plasmatisk OA-konsentrasjon 15,22,24.

OA intratrakeal administrasjon induserer inflammatorisk mediatorproduksjon som ligner på klinisk ARDS og reduserer lungecompliance og gassutveksling25,32. OA intravenøs injeksjon fremmer de histomorfologiske og fysiologiske aspektene av sykdommen32. Serumalbumin er en potent OA-ligand som kan forklare hvorfor denne ruten krever en høyere OA (10 μmol)15 mengde enn intratrakeal (1,25 μmol)23 for å indusere lungeskade. Vår gruppe viste faktisk en sammenheng mellom OA/albumin-ubalanse og høyere dødsrisiko hos pasienter med leptospirose33.

Som med alle andre modeller, er det noen ulemper presentert i modellen. Når det ikke administreres i saltform, kan oljesyre forårsake toksiske effekter og variasjoner på grunn av blodemulgering. Som vist i denne artikkelen, reduserer saltformen de toksiske effektene og unngår to problemer: embolidannelse og pH-svingninger i blod og lunger. Det sikrer også at lungeskaden er forårsaket av oleatet og ikke av en sekundær effekt15. I tillegg krever fremstillingen av oljesyre i saltform i denne modellen ikke konjugering med albumin. Forskning viser albumins gunstige effekter ved å redusere betennelse og vaskulær permeabilitet. Videre gjenoppretter albumin hemodynamisk og respirasjon hos lungeskadepasienter. Dermed kan konjugering av albumin med OA svekke dens innvirkning på dyret, og redusere modellenes levedyktighet33,34.

På molekylært nivå hemmer natriumoleat natrium-kalium-ATPase (NKA) og natriumkanal (eNac), noe som svekker ionetransport, øker vaskulær permeabilitet og ødemdannelse15. OA kan også binde seg til fri fettsyrereseptor 1 (FFAR1), øke intracellulær Ca 2+ -konsentrasjon, noe som utløser kinaser som signaliserer proteiner som PI3K og MAPK, noe som fører til nukleær faktor kappa-light-chain-enhancer av aktiverte B-celler (NF-κB) aktivering og forbedrer inflammatorisk respons25.

Oppsummert, selv om ingen modell fullt ut kan reprodusere ARDS-funksjoner, er de verdifulle verktøy for å studere sykdommen. Preklinisk forskning er avgjørende for å forstå patofysiologien til ARDS og utviklingen av nye behandlinger. Den intratrakeale og intravenøse administrasjonen av OA, i saltform, genererer pålitelige og reproduserbare ARDS-modeller, noe som gjør den til en gylden modell for å studere ARDS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Figur 1 og figur 2 er laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic vaporizer SurgiVet model 100
Braided slik thread with needle number 5 Shalon medical N/A
Cabinet vivarium Insight  Model EB273
Centrifuge Eppendorf 5430/5430R
Cytofunnel ThermoFisher 11-025-48
Drontal puppy Bayer N/A
Hank's balanced Salts Sigma-Aldrich H4981
Heatpad tkreprodução TK-500
Hydrocloric Acid Sigma-Aldrich 30721
Insulin syringe Ultrafine BD 328322
Isoforine 1mL/mL Cristália N/A
Ketamine Syntec N/A
May-Grunwald-Giemsa Sigma-Aldrich 205435
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23235
Microscope  PrimoStar Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA R&D system DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA R&D system DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA R&D system DY410
Neubauer chamber improved bright-line Global optics
Oleic Acid (99%) Sigma-Aldrich O1008
Osmium tetroxide solution (4%) Sigma-Aldrich 75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G BD Angiocath 388333
Prism 8 (graphic and statistic software) Graphpad N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal Cayman Chemical 514010
Shandon Cytospin 3 ThermoFisher N/A
Sodium hydroxide Merck 1,06,49,81,000
Spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice ICTB/FIOCRUZ N/A
Syringe 1 mL BD 990189
Tris-base Bio Rad 161-0719 Electrophoresis purity reagent
Türk's solution Sigma-Aldrich 93770
Xilazine Syntec N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E. Acute respiratory distress in adults. Lancet. 2 (7511), 319-323 (1967).
  2. The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  3. Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
  4. Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
  5. Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
  6. D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
  7. Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
  8. Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
  9. Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
  10. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 18 (2019).
  11. Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
  12. Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
  13. Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
  14. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
  15. Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
  16. Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
  17. Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
  18. Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
  19. Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
  20. Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
  21. Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
  22. Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
  23. Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
  24. Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
  25. Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
  26. McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
  27. Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
  28. Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
  29. Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
  30. Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
  31. Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
  32. Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
  33. Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
  34. Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).

Tags

Musemodell oljesyreindusert akutt lungesviktsyndrom ARDS eksponering av forurensende stoffer sigarettrøyk smittestoffer fettsyrer dyremodeller patomekanisme begrensninger oljesyre (OA) skadelige effekter på lungene lungeskade emboli forstyrrende vev endring av PH svekket ødemclearance endotelskade alveolær permeabilitet betennelse membranhyalindannelse celledød injeksjon av OA (i saltform) fysiologisk form av OA ved PH 7
Musemodell av oljesyreindusert akutt respiratorisk nødsyndrom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Oliveira Rodrigues, S., Patricio… More

de Oliveira Rodrigues, S., Patricio de Almeida, M. A., Castro-Faria-Neto, H. C., Silva, A. R., Felippe Gonçalves-de-Albuquerque, C. Mouse Model of Oleic Acid-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. J. Vis. Exp. (184), e63566, doi:10.3791/63566 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter