Summary
O presente protocolo descreve um modelo de lesão pulmonar em camundongos utilizando ácido oleico para mimetizar a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). Esse modelo aumenta os mediadores inflamatórios no edema e diminui a complacência pulmonar. O ácido oleico é usado na forma de sal (oleato), uma vez que esta forma fisiológica evita o risco de embolia.
Abstract
A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma ameaça significativa para pacientes gravemente enfermos com alta taxa de letalidade. Exposição a poluentes, fumaça de cigarro, agentes infecciosos e ácidos graxos podem induzir SDRA. Modelos animais podem mimetizar o complexo patomecanismo da SDRA. No entanto, cada um deles tem limitações. Notavelmente, o ácido oleico (OA) está aumentado em pacientes gravemente enfermos com efeitos nocivos no pulmão. A OA pode induzir lesão pulmonar por êmbolos, rompendo tecidos, alterando o pH e prejudicando a depuração do edema. O modelo de lesão pulmonar induzida por OA assemelha-se a várias características da SDRA com lesão endotelial, aumento da permeabilidade alveolar, inflamação, formação hialina da membrana e morte celular. Neste estudo, a indução de lesão pulmonar é descrita pela injeção de AO (na forma de sal) diretamente no pulmão e por via intravenosa em camundongos, uma vez que é a forma fisiológica da OA em pH 7. Assim, a injeção de AO na forma de sal é um modelo animal útil para estudar a lesão pulmonar/SDRA sem causar êmbolos ou alterar o pH, aproximando-se assim do que está acontecendo em pacientes criticamente enfermos.
Introduction
Ashbaugh et al.1, em 1967, descreveram pela primeira vez a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) e, desde então, passaram por múltiplas revisões. De acordo com a definição de Berlim, SDRA é uma inflamação pulmonar que leva a insuficiência respiratória aguda e hipoxemia (PaO 2/FiO 2 > 300 mmHg) devido a desequilíbrio na relação ventilação/perfusão, dano alveolar bilateral difuso (DAD) e infiltrado, aumento do peso pulmonar e edema 2,3. O parênquima pulmonar é um ambiente celular complexo composto por células epiteliais, endoteliais e outras. Essas células formam barreiras e estruturas responsáveis pelas trocas gasosas e homeostase nosalvéolos3. As células mais abundantes dentro da barreira epitelial são as células alveolares do tipo I (AT1) com maior área superficial para trocas gasosas e manejo de fluidos através da Na/K-ATPase. Além disso, as células alveolares tipo II (AT2) produzem surfactante, reduzindo a tensão superficial nosalvéolos4. Abaixo, as células endoteliais formam uma barreira semipermeável que separa a circulação pulmonar do interstício. Suas funções incluem detectar estímulos, coordenar respostas inflamatórias e transmigração celular5. As células endoteliais também regulam as trocas gasosas, o tônus vascular e a coagulação5. Portanto, distúrbios da função endotelial e epitelial podem exacerbar um fenótipo pró-inflamatório, causando dano pulmonar levando à SDRA5.
O desenvolvimento da SDRA está associado ao risco de pneumonia bacteriana e viral ou de fatores indiretos, como sepse não pulmonar, trauma, transfusões de sangue epancreatite6. Essas condições causam a liberação de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados a danos (DAMPs), induzindo citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-85. O TNF-α está ligado à degradação da caderina vásculo-endotelial (VE-caderina) na ruptura da barreira endotelial e infiltração leucocitária no parênquima pulmonar. Os neutrófilos são as primeiras células a migrar, atraídos por IL-8 e LTB4 5,7,8. Os neutrófilos aumentam ainda mais as citocinas pró-inflamatórias, as espécies reativas de oxigênio (EROs)9 e a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), gerando dano extra endotelial e epitelial10. O dano epitelial provoca inflamação e ativação de receptores Toll-like em células AT2 e macrófagos residentes, induzindo a liberação de quimiocinas que atraem células inflamatórias para os pulmões4. Além disso, a produção de citocinas como o interferon-β (INFβ) causa receptores indutores de apoptose relacionados ao TNF (TRAIL), levando as células ATII à apoptose, prejudicando a clarência de fluidos e íons4. A ruptura da estrutura da barreira endotelial e epitelial permite o influxo de fluidos, proteínas, hemácias e leucócitos para o espaço alveolar, causando edema. Com o edema estabelecido, o esforço pulmonar para manter a respiração e as trocas gasosas é alterado11. A hipercapnia e a hipoxemia induzem morte celular e distúrbio no transporte de sódio, agravando o edema alveolar devido à baixa capacidade de depuração10. A SDRA também apresenta níveis elevados de IL-17A, associados a disfunção orgânica, aumento da porcentagem de neutrófilos alveolares e permeabilidade alveolar9.
Nos últimos anos, houve avanços contínuos nas pesquisas sobre fisiopatologia, epidemiologia e tratamento da SDRA12,13. No entanto, a SDRA é uma síndrome heterogênea, apesar do progresso nas pesquisas terapêuticas, resultando em ventilação mecânica e otimização da fluidoterapia. Assim, um tratamento farmacológico direto mais efetivo ainda é necessário10, e estudos em animais podem ajudar a desvendar mecanismos e alvos de intervenção na SDRA.
Os modelos atuais de SDRA não são capazes de replicar completamente a patologia. Assim, os pesquisadores muitas vezes escolhem o modelo que melhor se adequa aos seus interesses. Por exemplo, o modelo de indução de lipopolissacarídeo (LPS) induz SDRA por choque endotóxico desencadeado principalmente por TLR414. A indução do HCl mimetiza a aspiração ácida, e o dano é neutrofílico-dependente14. Por outro lado, o atual modelo de oleato de sódio induz dano endotelial que aumenta a permeabilidade vascular e o edema. Além disso, o uso de oleato de sódio em substituição ao ácido oleico na forma líquida evita riscos de embolia e alteração do pH sanguíneo15.
Modelos animais para SDRA
Estudos pré-clínicos em modelos animais ajudam a entender a patologia e são essenciais para novas pesquisas de tratamentos da SDRA. O modelo animal ideal precisa ter características semelhantes à situação clínica e boa reprodutibilidade dos mecanismos da doença, com características fisiopatológicas relevantes de cada estágio, evolução e reparoda doença14. Vários modelos animais são utilizados para avaliar a lesão pulmonar aguda na SDRA pré-clinicamente. Entretanto, como todos os modelos apresentam limitações, não reproduzem completamente a patologia humana 6,14,16. A SDRA induzida pelo ácido oleico é utilizada em diferentes espécies animais17. Suínos18, ovinos19 e cães20 submetidos à injeção de AO apresentam inúmeras características clínicas da doença com disfunção de membrana alvéolo-capilar e aumento da permeabilidade com infiltração proteica e celular.
Por exemplo, a OA de 1,25 μM injetada por via intravenosa bloqueou o transporte transepitelial levando a edema alveolar15. Alternativamente, no modelo in vitro usando células A549, a OA na concentração de 10 μM não alterou o canal de sódio epitelial (eNAC) ou a expressão de Na/K-ATPase. No entanto, os AO parecem associar-se a ambos os canais, inibindo diretamente sua atividade21. A injeção intravenosa de OA na concentração de 0,1 mL/kg causou congestão e edema do tecido pulmonar, reduziu os espaços alveolares com septos alveolares espessados e aumentou a contagem de hemácias e inflamatórias22. Além disso, a OA induziu apoptose e necrose em células endoteliais e epiteliais do pulmão15. A injeção de uma solução de tris-oleato, intratraquealmente em camundongos, aumentou a infiltração neutrofílica e o edema já 6 h após a estimulação23. A injeção de AO em 24 h aumentou os níveis de citocinas pró-inflamatórias (isto é, TNF-α, IL-6 e IL-1β)23. Além disso, a injeção intravenosa (plexo orbital) de 10 μM de um tris-oleato inibe a atividade da Na/K-ATPase pulmonar, semelhante à ouabaína em 10-3 μM, um inibidor seletivo da enzima. Além disso, a OA induz inflamação com infiltração celular, formação de corpos lipídicos e produção de leucotrieno B4 (LTB4) e prostaglandina E2 (PGE2)22,24. Portanto, a SDRA induzida pelo ácido oleico gera edema, hemorragia, infiltração neutrofílica, aumento da atividade da mieloperoxidase (MPO) e ROS24. Assim, a administração de AO é um modelo bem estabelecido para lesão pulmonar22,25. Todos os resultados apresentados neste artigo que tem AO representa a forma salina, oleato de sódio.
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Protocol
Os procedimentos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Fundação Oswaldo Cruz (CEUA licenças n°002-08, 36/10 e 054/2015). Camundongos Swiss Webster machos, pesando entre 20-30 g, fornecidos pelo Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), foram utilizados para os experimentos. Os animais foram mantidos em isoladores ventilados no biotério do Pavilhão Ozório de Almeida e água e ração disponíveis ad libitum. Eles foram expostos a um ciclo claro e escuro de 12 h/12 h.
1. Preparação de solução de oleato de sódio
- Utilizar ácido oleico para preparar uma solução-mãe de oleato de sódio a 100 mmol/L em qualquer tubo estéril ou balão de vidro.
NOTA: Uma solução de 50 mL (volume final) foi preparada para o presente trabalho, mas o volume deve ser ajustado de acordo com a necessidade experimental. A solução deve ser sempre preparada em tubos estéreis ou recipientes de vidro.- Primeiro, adicione comprimidos ou solução de NaOH em água ultrapura para elevar o pH. Um valor de pH de 12-13 é recomendado para um volume de 25 mL.
NOTA: Alternativamente, a base de Tris pode ser usada para preparar a solução de Tris-oleato. - Adicionar o ácido oleico (ver Tabela de Materiais) muito lentamente, gota a gota, sob agitação constante num banho ultra-sónico a 37 °C.
NOTA: Se ocorrer precipitação de ácido oleico, comece tudo de novo desde o início. - Uma vez que o ácido oleico esteja completamente dissolvido, ajuste cuidadosamente o pH para 7,4, gota a gota sob agitação, com HCl diluído ultrapuro e, em seguida, ajuste para o volume final de 50 mL.
NOTA: Preparar recentemente as soluções de oleato de trabalho. Alternativamente, a solução pode ser aliquotada, armazenada e mantida a -20 °C num ambiente enriquecido com azoto para evitar a oxidação durante um período não superior a um mês. Evite ciclos congelados.
- Primeiro, adicione comprimidos ou solução de NaOH em água ultrapura para elevar o pH. Um valor de pH de 12-13 é recomendado para um volume de 25 mL.
2. Indução de lesão pulmonar pelo ácido oleico
- Realizar a administração intratraqueal de ácido oleico.
- Anestesiar os camundongos com isoflurano a 5% com 2 L/min de O2 empregando vaporizador de anestésico veterinário (Figura 1A). Retire o pelo na área da incisão com creme depilatório e desinfete a área com três rodadas alternadas de esfoliação de betadina e álcool usando gaze estéril. Confirme a profundidade da anestesia por pinça dos dedos.
OBS: Utilizar luvas e instrumentos estéreis durante o procedimento. Use um pano para cobrir o animal e expor apenas o local da incisão. Realizar o experimento em um gabinete de segurança biológica para evitar a fuga de isofluorano para o meio ambiente. Os analgésicos não são administrados, pois podem inibir a resposta inflamatória. - Após a anestesia, colocar o animal em decúbito dorsal e realizar uma incisão (0,5-1 cm) em V ao nível da tireoide. Deslocar suavemente a tireoide para expor a traqueia (Figura 1B) e injetar 50 μL da solução de oleato preparada (passo 1).
OBS: Os camundongos foram divididos em dois grupos, com oito animais em cada grupo. O grupo lesão pulmonar recebe solução de sódio-oleato a 25 mM (1,25 μmol), e o grupo controle recebe 50 μL de solução salina estéril por instilação na traqueia de cada camundongo com uma seringa de insulina (volume 300 μL, 30 G) (Figura 1C). - Sutura o local da incisão dos camundongos com uma sutura sintética monofilamentar não absorvível, devolvê-lo à gaiola e monitorá-lo até a recuperação completa da cirurgia. Durante todos os procedimentos, manter os animais numa almofada de aquecimento a 37 °C.
NOTA: Os ratos geralmente levam até 15 minutos para se recuperar da cirurgia.
- Anestesiar os camundongos com isoflurano a 5% com 2 L/min de O2 empregando vaporizador de anestésico veterinário (Figura 1A). Retire o pelo na área da incisão com creme depilatório e desinfete a área com três rodadas alternadas de esfoliação de betadina e álcool usando gaze estéril. Confirme a profundidade da anestesia por pinça dos dedos.
- Realizar a administração intravenosa de ácido oleico.
- Após a anestesia (passo 2.1.1, Figura 2A), injetar por via intravenosa no plexo orbitário inserindo a agulha ultrafina (ver Tabela de Materiais) no canto medial da cavidade ocular (Figura 2B).
OBS: Os camundongos foram divididos em dois grupos, com oito animais em cada grupo. Cada grupo recebe 100 μL da solução de sódio-oleato a 10 μmol de AO por animal, enquanto o grupo controle recebe 100 μL de solução salina estéril.
- Após a anestesia (passo 2.1.1, Figura 2A), injetar por via intravenosa no plexo orbitário inserindo a agulha ultrafina (ver Tabela de Materiais) no canto medial da cavidade ocular (Figura 2B).
- Após a cirurgia, monitorar os animais diariamente quanto a reações adversas. Os desfechos humanos para a eutanásia incluem reações adversas, convulsões e coma.
3. Coleta de lavado broncoalveolar (lavado broncoalveolar)
- Eutanásia dos ratinhos com uma dose letal intraperitoneal de cetamina (300 mg/Kg) e xilazina (30 mg/Kg) (ver Tabela de Materiais).
- Deitar o animal em decúbito dorsal, fazer uma incisão de aproximadamente 1 cm com tesoura cirúrgica na região anterior do animal, expor a traqueia e fazer um pequeno corte para introduzir um cateter intravenoso (20 G).
- Conecte o cateter a uma seringa estéril de 1 mL, injete lenta e gradualmente 0,5 mL de solução salina estéril nos pulmões e, em seguida, aspirar o líquido do lavado broncoalveolar com a mesma seringa. Repita de 3 a 5 vezes e transfira para um microtubo estéril, colocando-os no gelo.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -20 °C por até 6 meses.
4. Análise celular total e diferencial em lavado broncoalveolar
- Para a contagem total de células, diluir 20 μL de lavado em 180 μL (diluição de 10x) da solução de Turk (ver Tabela de Materiais). Realizar a contagem utilizando câmara de Neubauer sob microscópio óptico com objetiva de 40x.
- Para contagem diferencial, colocar 100 μL de lavado no funil celular contendo lâminas e centrifugar a 22,86 x g por 5 min a 4 °C em citocentrífuga e corar com May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) (ver Tabela de Materiais). Prossiga com a contagem de células em um microscópio de luz com objetiva de imersão.
5. Determinação de proteína total em lavado broncoalveolar
- Determinar a proteína sobrenadante total do lavado broncoalteado por um kit comercial de quantificação de proteínas e ler a absorbância a 562 nm utilizando um espectrofotómetro seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
6. Ensaios imunoenzimáticos
- Centrifugar BALF a 1.200 x g por 10 min a 4 °C. Em seguida, coletar o sobrenadante com pipeta e armazená-lo a -80 °C para dosagem de TNF-α, IL-1β, IL-6 e PGE215,23,25.
NOTA: A centrifugação na etapa 6.1 torna o BALF livre de células.- Realizar os ensaios de citocinas em lavado broncoalveolar livre de células usando um kit ELISA comercial de acordo com as instruções do fabricante. Realizar o ensaio PGE2 utilizando um kit de ensaio imunoenzimático (EIA) seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
7. Coloração e contagem do corpo lipídico
- Fixar os leucócitos em lâminas de cytospin usando formaldeído a 3,7% em solução tamponada de Hank Ca 2+, Mg2+ (HBSS, pH 7,4) e corar com OsO4 a 1,5% ainda húmido3 (ver Tabela de Materiais). Em seguida, conte os corpos lipídicos por célula em 50 leucócitos consecutivos de cada lâmina usando a lente objetiva de imersão em óleo do microscópio.
8. Análise estatística
- Realizar análise estatística utilizando softwares gráficos e estatísticos (vide Tabela de Materiais). Expresse os resultados como média ± MEV e analise por Anova one-Way seguida de um pós-teste Newman-Keuls-Student26. Considere-se as diferenças significativas quando P < 0,05.
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Representative Results
Em um pulmão não lesado, a depuração do líquido alveolar ocorre pelo transporte de íons através da camada epitelial alveolar intacta. O gradiente osmótico transporta o líquido dos alvéolos para o interstício pulmonar, onde é drenado pelos vasos linfáticos ou reabsorvido. Na/K-ATPase conduz esse transporte11. A OA é um inibidor da Na/K-ATPase27 e do canalde sódio 21, o que pode contribuir para a formação de edema, como já sugerimos23. A resposta inflamatória exacerbada na SDRA leva a dano alveolar, aumento da permeabilidade endotelial e epitelial e acúmulo de líquido alveolar rico em proteínas e células inflamatórias, causando edema. O edema faz com que os pulmões aumentem a frequência respiratória devido ao acúmulo de líquido intersticial e comprometimento das trocas gasosas, resultando em hipoxemia e insuficiência respiratória28. Citocinas como o TNF-α e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) desestabilizam as ligações VE-caderina, contribuindo para o aumento da permeabilidade endotelial e acúmulo de líquido alveolar7.
A injeção de AO aumentou os leucócitos totais nas vias intratraqueal e intravenosa (Figura 3). Foi necessária a indução de OA para lesão pulmonar por via intravenosa e não intratraqueal. O presente trabalho mostrou um aumento na contagem de neutrófilos no lavado broncoalveolar em 6 h, com pico em 24 h e diminuindo em 48 h e 72 h. Maior concentração de IL-6, IL-1β e TNF-α no lavado broncoalveolar foi observada após 24 h de instilação intratraqueal da OA23 (Figura 4). A OA previne a eliminação do edema e pode desencadear a formação de edema rico em proteínas por via intravenosa e intratraqueal15,23. O edema pulmonar foi avaliado pela dosagem de proteínas totais no lavado broncoalveolar, mostrando que a administração i.v. e i.t. aumentou a concentração de proteínas totais (Figura 5). Os corpos lipídicos são organelas intracelulares contendo substrato e enzimas para a produção de eicosanoides 8,29. A formação de corpos lipídicos aumenta a produção de mediadores lipídicos, e pode ser usada para acessar a ativação celular. A injeção intratraqueal e intravenosa de AO aumentou a formação de corpos lipídicos e a concentração de PGE2 23 após 24 h (Figura 6). A injeção de AO também induziu ruptura tecidual, hemorragia e infiltração leucocitária nas vias intratraqueal e intravenosa, como demonstrado na histologia corada para hematoxilina e eosina (H&E) (Figura 7). Além disso, a OA causa alteração na função pulmonar19. Assim, a lesão pulmonar induzida pelo ácido oleico apresenta inúmeras características da SDRA.
Figura 1: Etapas individuais do protocolo de administração intratraqueal . (A) Um camundongo é anestesiado com isofluorano a 5% e 2 L/min de O2. (B) Incisão traqueal com tesoura cirúrgica em camundongos em decúbito dorsal. (C) Instilação intratraqueal com seringa de insulina. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Etapas individuais do protocolo de administração intravenosa . (A) Um camundongo é anestesiado com isofluorano a 5% e 2L/min de O2. (B) Injeção intravenosa com seringa de insulina pelo canto medial. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A administração de AO induz ativação leucocitária no lavado broncoalveolar de camundongos. Leucócitos totais em administração intravenosa (i.v.) e intratraqueal (i.t) (A) e fotomicrografia ilustrativa (aumento de 1000x) em administração intratraqueal (i.t.) corados com May-Grünwald-Giemsa (B) foram realizados 24 h após o desafio com OA. Barra de escala = 10 μm. O mesmo volume de solução salina estéril foi administrado ao grupo controle. Cada barra representa a média ± EPM de pelo menos sete animais. *P < 0,05, em comparação com os controles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A administração intratraqueal (i.t.) de AO induz a produção de mediadores inflamatórios no pulmão de camundongos. TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) foram dosados 24 h após o desafio. Solução salina estéril foi administrada ao grupo controle. Cada barra representa a média ± EPM para pelo menos seis animais. *P < 0,05, em comparação com os controles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Teor de proteína total no lavado broncoalveolar 24 h após a injeção de AO. A administração intratraqueal (i.t.) e intravenosa (i.v.) de AO aumenta a proteína total no lavado broncoalveolar de camundongos. O grupo Controle recebeu o mesmo volume de solução salina estéril. Os resultados são médias ± MEV de pelo menos seis animais diferentes. *P < 0,0001, em comparação com os controles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Formação do corpo lipídico em leucócitos e produção de PGE2 no lavado broncoalveolar de camundongos tratados com OA. A administração intratraqueal (i.t) e intravenosa (i.v) de OA induz mediadores inflamatórios e acúmulo de corpos lipídicos no lavado broncoalveolar de camundongos (A) e (B), respectivamente. (C) Fotomicrografia ilustrativa dos corpos lipídicos (aumento de 1000x) corados nos pulmões dos animais com tetróxido de ósmio (OsO4) 24 h após desafio com OA. As setas apontam para os corpos lipídicos. Barra de escala = 10 μm. Os controles receberam o mesmo volume de solução salina. Os resultados são médias ± MEV de sete animais. *P < 0,05, em comparação com os controles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Histologia pulmonar ilustrativa em camundongos . (A) Camundongos controle tratados com soro fisiológico e sem sinais de hemorragia. (B) Administração intravenosa de AO (i.v). (C) Administração intratraqueal (i.t) com alterações teciduais. Foi realizada coloração de H&E. Ampliação, 1000x. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A seleção do modelo correto de SDRA é essencial para a realização dos estudos pré-clínicos, e o avaliador deve considerar todas as variáveis possíveis, como idade, sexo, métodos de administração, entreoutras6. O modelo escolhido deve reproduzir a doença baseado em fatores de risco como sepse, embolia lipídica, isquemia-reperfusão da vasculatura pulmonar e outros riscosclínicos14. No entanto, nenhum modelo animal usado para SDRA pode recriar todas as características da síndrome humana. Modelos de múltiplos agentes lesivos incluem LPS, OA, ácido clorídrico, bactérias e vírus6. Além disso, diferentes métodos de administração são usados, mais comumente, intratraqueal, intranasal ou intravenoso. O modelo de isquemia-reperfusão pulmonar provoca ruptura capilar e acúmulo de proteína intra-alveolar6. A lesão pulmonar induzida por LPS é amplamente utilizada e leva à lesão aguda das barreiras epiteliais e endoteliais. O LPS liga-se ao receptor Toll-like 4 (TLR-4) no epitélio das vias aéreas, desencadeando a ativação do NF-κB, aumentando a produção de citocinas e quimiocinas, atraindo células inflamatórias30, o que leva a uma alveolite neutrofílica robusta6. Entretanto, o modelo apresenta variações entre cepas e espécies de animais, diminuindo a reprodutibilidade dos resultados em animais para pacientes humanos com SDRA30.
O modelo de lesão por HCl mimetiza a SDRA por aspiração de conteúdo ácido. O pH baixo nos pulmões induz uma resposta inflamatória aguda seguida de uma lesão fibrótica tardia. O dano é neutrofílico-dependente, causando hemorragia alveolar, edema e depuração de líquido prejudicada. No entanto, os seres humanos não aspiram apenas HCl, mas um conteúdo gástrico complexo com pH frequentemente superior a 1,531. Esses e outros modelos de SDRA foram extensivamente revisados em outros periódicos31. Dentre todos os modelos utilizados, o modelo de SDRA induzida pelo ácido oleico é o maisideal14.
O modelo de oleato de sódio causa dano pulmonar, induz apoptose e necrose das células alveolares e aumenta a produção de citocinas como TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β e MIP-1α19. A OA também induz a expressão de proteases e elastases com hemorragia causando grave lesão pulmonar25. A OA reproduz a doença devido à embolia lipídica, aumento da permeabilidade vascular pulmonar e líquido extravascular com infiltrados radiográficos32. Além disso, pacientes com SDRA apresentam maior concentração plasmática de AO 15,22,24.
A administração intratraqueal de AO induz a produção de mediadores inflamatórios semelhante à SDRA clínica e diminui a complacência pulmonar e as trocas gasosas25,32. A injeção intravenosa de AO promove os aspectos histomorfológicos e fisiológicos da doença32. A albumina sérica é um potente ligante da OA que pode explicar por que essa via requer uma quantidade maior de AO (10 μmol)15 do que a intratraqueal (1,25 μmol)23 para induzir dano pulmonar. De fato, nosso grupo mostrou correlação entre desequilíbrio OA/albumina e maior risco de óbito em pacientes com leptospirose33.
Como em qualquer outro modelo, existem algumas desvantagens apresentadas no modelo. Quando não administrado na forma de sal, o ácido oleico pode causar efeitos tóxicos e variações devido à emulsificação do sangue. Como demonstrado neste artigo, o uso de sua forma salina diminui os efeitos tóxicos e evita dois problemas: formação de êmbolos e flutuação do pH no sangue e nos pulmões. Além disso, garante que a lesão pulmonar seja causada pelo oleato e não por um efeito secundário15. Além disso, a preparação do ácido oleico na forma de sal neste modelo não requer conjugação com albumina. Pesquisas mostram efeitos benéficos da albumina na redução da inflamação e permeabilidade vascular. Além disso, a albumina restaura a hemodinâmica e a respiração em pacientes com lesão pulmonar. Assim, a conjugação da albumina com a OA poderia prejudicar seu impacto no animal, reduzindo a viabilidade dos modelos33,34.
Em nível molecular, o oleato de sódio inibe a ATPase sódica-potássica (NKA) e o canal de sódio (eNac), o que prejudica o transporte de íons, aumentando a permeabilidade vascular e a formação de edema15. Além disso, os AO podem se ligar ao receptor de ácidos graxos livres 1 (FFAR1), aumentando a concentração intracelular de Ca 2+ , o que desencadeia proteínas sinalizadoras de quinases como PI3K e MAPK, levando à ativação do fator nuclear kappa-light-chain-enhancer de células B ativadas (NF-κB) e aumentando a resposta inflamatória25.
Em resumo, embora nenhum modelo possa reproduzir completamente as características da SDRA, eles são ferramentas valiosas para o estudo da doença. A pesquisa pré-clínica é crucial para o entendimento da fisiopatologia da SDRA e para o desenvolvimento de novos tratamentos. A administração intratraqueal e intravenosa de OA, na forma de sal, gera modelos confiáveis e reprodutíveis de SDRA, tornando-se um modelo de ouro para o estudo da SDRA.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Pesquisa financiada pelo Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Processo 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). A Figura 1 e a Figura 2 são criadas com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
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