Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Modelo murino del síndrome de dificultad respiratoria aguda inducido por ácido oleico

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63566
Automatic Translation
*1,2,5, *1,2,6, 1,3,4, 1,3, 1,2,4,5,6
1Laboratório de Imunofarmacologia, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2Laboratório de Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 4Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 5Programa de Pós-Graduação em Ciências e Biotecnologia, Universidade Federal Fluminense, 6Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal Fluminense
* These authors contributed equally

Summary

El presente protocolo describe un modelo de lesión pulmonar en ratones que utilizan ácido oleico para imitar el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Este modelo aumenta los mediadores inflamatorios en el edema y disminuye la distensibilidad pulmonar. El ácido oleico se utiliza en forma de sal (oleato) ya que esta forma fisiológica evita el riesgo de embolia.

Abstract

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una amenaza significativa para los pacientes en estado crítico con una alta tasa de mortalidad. La exposición a contaminantes, el humo del cigarrillo, los agentes infecciosos y los ácidos grasos pueden inducir el SDRA. Los modelos animales pueden imitar el complejo mecanismo patológico del SDRA. Sin embargo, cada uno de ellos tiene limitaciones. En particular, el ácido oleico (OA) aumenta en pacientes críticos con efectos nocivos en el pulmón. La artrosis puede inducir lesión pulmonar por émbolos, alterando el tejido, alterando el pH y perjudicando la eliminación del edema. El modelo de lesión pulmonar inducida por artrosis se asemeja a varias características del SDRA con lesión endotelial, aumento de la permeabilidad alveolar, inflamación, formación de membrana hialina y muerte celular. En este trabajo, la inducción de la lesión pulmonar se describe mediante la inyección de OA (en forma de sal) directamente en el pulmón y por vía intravenosa en un ratón, ya que es la forma fisiológica de OA a pH 7. Por lo tanto, la inyección de artrosis en forma de sal es un modelo animal útil para estudiar la lesión pulmonar/SDRA sin causar émbolos ni alterar el pH, acercándose así a lo que está sucediendo en pacientes críticos.

Introduction

Ashbaugh et al.1, en 1967, describieron por primera vez el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y desde entonces han pasado por múltiples revisiones. De acuerdo con la definición de Berlín, el SDRA es una inflamación pulmonar que conduce a una insuficiencia respiratoria aguda e hipoxemia (PaO 2/FiO 2 > 300 mm Hg) debido al desequilibrio en la relación ventilación/perfusión, daño alveolar bilateral difuso (DAD) e infiltrado, aumento del peso pulmonar y edema 2,3. El parénquima pulmonar es un entorno celular complejo compuesto por células epiteliales, endoteliales y de otro tipo. Estas células forman barreras y estructuras responsables del intercambio gaseoso y la homeostasis en los alvéolos3. Las células más abundantes dentro de la barrera epitelial son las células alveolares tipo I (AT1) con una mayor superficie para el intercambio gaseoso y la gestión de fluidos a través de Na/K-ATPasa. Además, las células alveolares tipo II (AT2) producen surfactante, reduciendo la tensión superficial en los alvéolos4. Por debajo, las células endoteliales forman una barrera semipermeable que separa la circulación pulmonar del intersticio. Sus funciones incluyen la detección de estímulos, la coordinación de respuestas inflamatorias y la transmigración celular5. Las células endoteliales también regulan el intercambio gaseoso, el tono vascular y la coagulación5. Por lo tanto, las alteraciones de la función endotelial y epitelial pueden exacerbar un fenotipo proinflamatorio, causando daño pulmonar que conduce al SDRA5.

El desarrollo de SDRA está asociado al riesgo de neumonía bacteriana y viral o a factores indirectos como sepsis no pulmonar, traumatismos, transfusiones de sangre y pancreatitis6. Estas condiciones provocan la liberación de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y patrones moleculares asociados al daño (DAMP), induciendo citocinas y quimiocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-85. El TNF-α está relacionado con la degradación de la cadherina vascular-endotelial (VE-cadherina) en la disrupción de la barrera endotelial y la infiltración de leucocitos en el parénquima pulmonar. Los neutrófilos son las primeras células en migrar, atraídas por IL-8 y LTB4 5,7,8. Los neutrófilos aumentan aún más las citocinas proinflamatorias, las especies reactivas de oxígeno (ROS)9 y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) generando daño endotelial y epitelial adicional10. El daño epitelial provoca la inflamación y la activación de los receptores tipo Toll en las células AT2 y los macrófagos residentes, induciendo la liberación de quimiocinas que atraen las células inflamatorias a los pulmones4. Además, la producción de citoquinas como el interferón-β (INFβ) provoca receptores inductores de apoptosis (TRAIL) relacionados con el TNF, lo que lleva a las células ATII a la apoptosis, afectando el líquido y la claridad iónica4. La alteración de la estructura de la barrera endotelial y epitelial permite la entrada de líquido, proteínas, glóbulos rojos y leucocitos en el espacio alveolar, causando edema. Con el edema establecido, se altera el esfuerzo pulmonar para mantener la respiración y el intercambio gaseoso11. La hipercapnia y la hipoxemia inducen la muerte celular y la alteración del transporte de sodio, agravando el edema alveolar debido a la escasa capacidad de aclaramiento10. El SDRA también tiene niveles elevados de IL-17A, asociada con disfunción orgánica, aumento del porcentaje de neutrófilos alveolares y permeabilidad alveolar9.

En los últimos años se han producido avances continuos en la investigación sobre la fisiopatología, la epidemiología y el tratamiento del SDRA12,13. Sin embargo, el SDRA es un síndrome heterogéneo a pesar de los avances en la investigación terapéutica que han dado lugar a la optimización de la ventilación mecánica y la fluidoterapia. Por lo tanto, todavía se necesita un tratamiento farmacológico directo más eficaz10, y los estudios en animales pueden ayudar a desvelar los mecanismos y las dianas de intervención del SDRA.

Los modelos actuales de SDRA no son capaces de replicar completamente la patología. Por lo tanto, los investigadores a menudo eligen el modelo que mejor se ajusta a sus intereses. Por ejemplo, el modelo de inducción de lipopolisacáridos (LPS) induce SDRA por shock endotóxico desencadenado principalmente por TLR414. La inducción de HCl imita la aspiración de ácido, y el daño es neutrofílico dependiente14. Por otro lado, el modelo actual de oleato de sodio induce daño endotelial que aumenta la permeabilidad vascular y el edema. Además, el uso de oleato de sodio en lugar de ácido oleico en forma líquida evita riesgos de embolia y alteración del pHsanguíneo 15.

Modelos animales para el SDRA
Los estudios preclínicos en modelos animales ayudan a comprender la patología y son esenciales para la investigación de nuevos tratamientos para el SDRA. El modelo animal ideal debe tener características que se asemejen a la situación clínica y una buena reproducibilidad de los mecanismos de la enfermedad con características fisiopatológicas relevantes de cada estadio, evolución y reparación de la enfermedad14. Se utilizan varios modelos animales para evaluar preclínicamente la lesión pulmonar aguda en el SDRA. Sin embargo, como todos los modelos tienen limitaciones, no reproducen completamente la patología humana 6,14,16. El SDRA inducido por ácido oleico se utiliza en diferentes especies animales17. Los cerdos18, ovejas19 y perros20 sometidos a inyección de artrosis presentan numerosas características clínicas de la enfermedad con disfunción de la membrana alveolar-capilar y aumento de la permeabilidad con infiltración de proteínas y células.

Por ejemplo, la artrosis inyectada por vía intravenosa a 1,25 μM bloqueó el transporte transepitelial que condujo a edema alveolar15. Por otra parte, en el modelo in vitro con células A549, la OA a una concentración de 10 μM no alteró el canal epitelial de sodio (eNAC) ni la expresión de Na/K-ATPasa. Sin embargo, la OA parece asociarse con ambos canales, inhibiendo directamente su actividad21. La inyección intravenosa de OA a 0,1 ml/kg causó congestión e hinchazón del tejido pulmonar, reducción de los espacios alveolares con tabiques alveolares engrosados y aumento del recuento de glóbulos rojos e inflamatorios22. Además, la artrosis indujo apoptosis y necrosis en células endoteliales y epiteliales del pulmón15. La inyección de una solución de tris-oleato, por vía intratraqueal en ratones, mejoró la infiltración de neutrófilos y el edema tan pronto como 6 h después de la estimulación23. La inyección de artrosis a las 24 h aumentó los niveles de citoquinas proinflamatorias (es decir, TNF-α, IL-6 e IL-1β)23. Además, la inyección intravenosa (plexo orbitario) de 10 μM de un tris-oleato inhibe la actividad pulmonar de la Na/K-ATPasa, similar a la ouabaína a 10-3 μM, un inhibidor selectivo de la enzima. Además, la artrosis induce inflamación con infiltración celular, formación de cuerpos lipídicos y producción de leucotrieno B4 (LTB4) y prostaglandina E2 (PGE2)22,24. Por lo tanto, el SDRA inducido por ácido oleico genera edema, hemorragia, infiltración de neutrófilos, aumento de la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) y ROS24. Por lo tanto, la administración de artrosis es un modelo bien establecido para la lesión pulmonar22,25. Todos los resultados presentados en este artículo que tiene OA representan la forma salina, oleato de sodio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Los procedimientos utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética en el Uso de Animales de la Fundación Oswaldo Cruz (licencias CEUA n°002-08, 36/10 y 054/2015). Para los experimentos se utilizaron ratones machos Swiss Webster de entre 20 y 30 g, proporcionados por el Instituto de Ciencia y Tecnología en Biomodelos (ICTB) de la Fundación Oswaldo Cruz (Fiocruz). Los animales fueron mantenidos en aisladores ventilados en el vivero del Pavilhão Ozório de Almeida, y el agua y el alimento estaban disponibles ad libitum. Fueron expuestos a un ciclo de luz y oscuridad de 12 h/12 h.

1. Preparación de la solución de oleato de sodio

  1. Utilice ácido oleico para preparar una solución madre de oleato de sodio de 100 mmol/L en cualquier tubo estéril o matraz de vidrio.
    NOTA: Se preparó una solución de 50 mL (volumen final) para el presente trabajo, pero el volumen debe ajustarse según la necesidad experimental. La solución debe prepararse siempre en tubos estériles o recipientes de vidrio.
    1. Primero, agregue tabletas o solución de NaOH en agua ultrapura para elevar el pH. Se recomienda un valor de pH de 12-13 para un volumen de 25 ml.
      NOTA: Alternativamente, se puede usar la base de Tris para preparar la solución de Tris-oleato.
    2. Añadir el ácido oleico (ver tabla de materiales) muy lentamente, gota a gota, bajo agitación constante en un baño ultrasónico a 37 °C.
      NOTA: Si se produce una precipitación de ácido oleico, comience de nuevo desde el principio.
    3. Una vez que el ácido oleico esté completamente disuelto, ajuste cuidadosamente el pH a 7.4, gota a gota bajo agitación, con HCl diluido ultrapuro y luego ajuste al volumen final de 50 mL.
      NOTA: Prepare las soluciones de oleato de trabajo recién hechas. Alternativamente, la solución puede ser alícuota, almacenada y mantenida a -20 °C en un ambiente enriquecido con nitrógeno para evitar la oxidación durante no más de un mes. Evite los ciclos de congelación y recongelación.

2. Inducción de lesión pulmonar por ácido oleico

  1. Realizar la administración intratraqueal de ácido oleico.
    1. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 5% con 2 L/min deO2 empleando un vaporizador anestésico veterinario (Figura 1A). Retire el pelaje en el área de la incisión con crema depilatoria y desinfecte el área con tres rondas alternas de exfoliante betadine y alcohol con gasa estéril. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en los dedos de los pies.
      NOTA: Utilice guantes e instrumentos estériles durante el procedimiento. Use una cortina para cubrir al animal y exponga solo el sitio de la incisión. Realice el experimento en una cabina de seguridad biológica para evitar que el isofluorano se escape al medio ambiente. No se administran analgésicos, ya que pueden inhibir la respuesta inflamatoria.
    2. Después de la anestesia, coloque al animal en decúbito dorsal y haga una incisión (0,5-1 cm) en forma de V a nivel de la tiroides. Desplazar suavemente la tiroides para exponer la tráquea (Figura 1B) e inyectar 50 μL de la solución de oleato preparada (paso 1).
      NOTA: Los ratones se dividieron en dos grupos, con ocho animales en cada grupo. El grupo de lesión pulmonar recibe una solución de oleato de sodio a 25 mM (1,25 μmol), y el grupo control recibe 50 μl de solución salina estéril mediante instilación en la tráquea de cada ratón con una jeringa de insulina (volumen 300 μL, 30 G) (Figura 1C).
    3. Suturar el sitio de la incisión de los ratones con una sutura sintética de monofilamento no absorbible, devolverla a su jaula y monitorearla hasta que se recupere por completo de la cirugía. Durante todos los procedimientos, mantenga a los animales sobre una almohadilla térmica a 37 °C.
      NOTA: Los ratones suelen tardar hasta 15 minutos en recuperarse de la cirugía.
  2. Realizar la administración intravenosa de ácido oleico.
    1. Después de la anestesia (paso 2.1.1, Figura 2A), inyectar por vía intravenosa en el plexo orbitario insertando la aguja ultrafina (ver Tabla de materiales) en el canto medial de la cuenca del ojo (Figura 2B).
      NOTA: Los ratones se dividieron en dos grupos, con ocho animales en cada grupo. Cada grupo recibe 100 μL de la solución de oleato de sodio a 10 μmol de OA por animal, mientras que el grupo control recibe 100 μL de solución salina estéril.
  3. Después de la cirugía, controle diariamente a los animales para detectar reacciones adversas. Los criterios de valoración humanitarios para la eutanasia incluyen reacciones adversas, convulsiones y coma.

3. Recolección de líquido de lavado broncoalveolar (BALF)

  1. Sacrificar a los ratones con una dosis letal intraperitoneal de ketamina (300 mg/Kg) y xilacina (30 mg/Kg) (ver Tabla de Materiales).
  2. Colocar al animal en decúbito dorsal, realizar una incisión de aproximadamente 1 cm con tijeras quirúrgicas en la región anterior del animal, exponer la tráquea y realizar una pequeña incisión para introducir un catéter intravenoso (20 G).
  3. Conecte el catéter a una jeringa estéril de 1 ml, inyecte lenta y gradualmente 0,5 ml de solución salina estéril en los pulmones y luego aspire el líquido del BALF con la misma jeringa. Repítelo de 3 a 5 veces y transfiérelo a un microtubo estéril, colocándolos en hielo.
    NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses.

4. Análisis celular total y diferencial en BALF

  1. Para el recuento total de células, diluya 20 μl de BALF en 180 μl (dilución 10x) de la solución de Turk (consulte la tabla de materiales). Realice el conteo utilizando una cámara de Neubauer bajo un microscopio óptico con un objetivo de 40x.
  2. Para el recuento diferencial, poner 100 μL de BALF en el embudo celular que contiene los portaobjetos y centrifugarlo a 22,86 x g durante 5 min a 4 °C en una citocentrífuga, y teñir con May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) (ver Tabla de Materiales). Proceda con el recuento de células en un microscopio óptico con objetivo de inmersión.

5. Determinación de la proteína total en BALF

  1. Determine la proteína sobrenadante BALF total mediante un kit comercial de cuantificación de proteínas y lea la absorbancia a 562 nm utilizando un espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).

6. Ensayos de inmunoadsorción enzimática

  1. Centrifugar BALF a 1.200 x g durante 10 min a 4 °C. A continuación, recoja el sobrenadante con una pipeta y guárdelo a -80 °C para ensayos de TNF-α, IL-1β, IL-6 y PGE215,23,25.
    NOTA: La centrifugación en el paso 6.1 hace que el BALF esté libre de celdas.
    1. Realice los ensayos de citocinas en BALF libre de células utilizando un kit ELISA comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realice el ensayo PGE2 utilizando un kit de inmunoensayo enzimático (EIA) siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).

7. Tinción y recuento de lípidos corporales

  1. Fijar los leucocitos en portaobjetos de citocentrifugado utilizando formaldehído al 3,7% en solución salina tamponada de Hank libre de Ca 2+, Mg2+ (HBSS, pH 7,4) y teñir con OsO4 al 1,5% mientras aún está húmedo3 (ver Tabla de Materiales). A continuación, se cuentan los cuerpos lipídicos por célula en 50 leucocitos consecutivos de cada portaobjetos utilizando la lente del objetivo de inmersión en aceite del microscopio.

8. Análisis estadístico

  1. Realizar análisis estadísticos utilizando software de gráficos y estadísticas (ver Tabla de Materiales). Exprese los resultados como media ± SEM y analícelos mediante Anova de un factor seguido de un test de Newman-Keuls-Student26. Considere que las diferencias son significativas cuando P < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En un pulmón no lesionado, el aclaramiento del líquido alveolar se produce por el transporte de iones a través de la capa epitelial alveolar intacta. El gradiente osmótico transporta líquido desde los alvéolos hasta el intersticio pulmonar, donde es drenado por los vasos linfáticos o reabsorbido. Na/K-ATPasa impulsa este transporte11. La artrosis es un inhibidor de la Na/K-ATPasa27 y del canal de sodio 21, lo que puede contribuir a la formación de edema, como ya hemos sugerido23. La respuesta inflamatoria exacerbada en el SDRA conduce a daño alveolar, aumento de la permeabilidad endotelial y epitelial, y acumulación de líquido alveolar rico en proteínas y células inflamatorias, causando edema. El edema hace que los pulmones aumenten la frecuencia respiratoria debido a la acumulación de líquido intersticial y al deterioro del intercambio gaseoso, lo que resulta en hipoxemia e insuficiencia respiratoria28. Las citocinas como el TNF-α y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) desestabilizan los enlaces VE-cadherina, contribuyendo al aumento de la permeabilidad endotelial y la acumulación de líquido alveolar7.

La inyección de artrosis aumentó los leucocitos totales en vía intratraqueal e intravenosa (Figura 3). Fue necesario inducir la artrosis para la lesión pulmonar por vía intravenosa en lugar de por vía intratraqueal. El presente trabajo mostró un aumento en los recuentos de neutrófilos en BALF a las 6 h, con el pico a las 24 h y disminuyendo a las 48 h y 72 h. Se observó una mayor concentración de IL-6, IL-1β y TNF-α en el BALF después de 24 h de instilación intratraqueal de OA23 (Figura 4). La artrosis impide el aclaramiento del edema y puede desencadenar la formación de edema rico en proteínas tanto por vía intravenosa como intratraqueal15,23. El edema pulmonar se evaluó mediante un ensayo de proteínas totales en BALF, mostrando que la administración de i.v. e i.t. aumentó la concentración de proteínas totales (Figura 5). Los cuerpos lipídicos son orgánulos intracelulares que contienen sustrato y enzimas para la producción de eicosanoides 8,29. La formación de cuerpos lipídicos mejora la producción de mediadores lipídicos y puede utilizarse para acceder a la activación celular. La inyección intratraqueal e intravenosa de artrosis mejoró la formación de cuerpos lipídicos y la concentración de PGE2 23 después de 24 h (Figura 6). La inyección de artrosis también indujo disrupción tisular, hemorragia e infiltración de leucocitos en vías intratraqueales e intravenosas, como se muestra en la histología de tinción de hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 7). Además, la artrosis provoca alteración de la función pulmonar19. Por lo tanto, la lesión pulmonar inducida por ácido oleico presenta numerosas características del SDRA.

Figure 1
Figura 1: Pasos individuales del protocolo de administración intratraqueal . (A) Se anestesia a un ratón con isofluorano al 5% y 2 L/min deO2. (B) Una incisión traqueal con una tijera quirúrgica en ratones en decúbito dorsal. (C) Instilación intratraqueal con una jeringa de insulina. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Pasos individuales del protocolo de administración intravenosa . (A) Se anestesia a un ratón con isofluorano al 5% y 2L/min de O2. (B) Inyección intravenosa con una jeringa de insulina por el canto medial. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La administración de OA induce la activación de leucocitos en el BALF de ratones. Los leucocitos totales en administración intravenosa (i.v) e intratraqueal (i.t) (A) y una fotomicrografía ilustrativa (aumento de 1000x) en administración intratraqueal (i.t.) teñida con May-Grünwald-Giemsa (B) se realizaron 24 h después de la provocación con artrosis. Barra de escala = 10 μm. El mismo volumen de suero fisiológico estéril se administró al grupo control. Cada barra representa la media ± SEM de al menos siete animales. *P < 0,05, en comparación con los controles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La administración intratraqueal (i.t) de OA induce la producción de mediadores inflamatorios en el pulmón de ratones. Se midieron TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) 24 h después de la provocación. Se administró suero fisiológico estéril al grupo control. Cada barra representa la media ± SEM para al menos seis animales. *P < 0,05, en comparación con los controles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Contenido total de proteínas en BALF 24 h después de la inyección de artrosis. La administración intratraqueal (i.t.) e intravenosa (i.v.) de OA aumenta la proteína total en el BALF de ratones. El grupo control recibió el mismo volumen de solución salina estéril. Los resultados son medias ± SEM de al menos seis animales diferentes. *P < 0,0001, en comparación con los controles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Formación de cuerpos lipídicos en leucocitos y producción dePGE2 en BALF de ratones tratados con OA. La administración intratraqueal (i.t) e intravenosa (i.v) de OA induce mediadores inflamatorios y acumulación de cuerpos lipídicos en el BALF de ratones (A) y (B), respectivamente. (C) Fotomicrografía ilustrativa de cuerpos lipídicos (aumento de 1000x) teñidos en los pulmones de los animales con tetróxido de osmio (OsO4) 24 h después de la exposición a OA. Las flechas apuntan a los cuerpos lipídicos. Barra de escala = 10 μm. Los controles recibieron el mismo volumen de solución salina. Los resultados son medias ± SEM de siete animales. *P < 0,05, en comparación con los controles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Histología pulmonar ilustrativa en ratones . (A) Ratones de control tratados con solución salina y sin signos de hemorragia. (B) Administración intravenosa de OA (i.v). (C) Administración intratraqueal (i.t) con alteraciones tisulares. Se realizó tinción de H&E. Ampliación, 1000x. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La selección del modelo correcto de SDRA es fundamental para la realización de los estudios preclínicos, y el evaluador debe considerar todas las variables posibles, como edad, sexo, métodos de administración, entre otras6. El modelo elegido debe reproducir la enfermedad en función de factores de riesgo como sepsis, embolia lipídica, isquemia-reperfusión de la vasculatura pulmonar y otros riesgos clínicos14. Sin embargo, ningún modelo animal utilizado para el SDRA puede recrear todas las características del síndrome humano. Los modelos de agentes dañinos múltiples incluyen LPS, OA, ácido clorhídrico, bacterias y virus6. Además, se utilizan diferentes métodos de administración, más comúnmente, intratraqueal, intranasal o intravenoso. El modelo de isquemia-reperfusión pulmonar provoca rotura capilar y acumulación de proteína intraalveolar6. La lesión pulmonar inducida por LPS se usa ampliamente y conduce a una lesión aguda de las barreras epiteliales y endoteliales. El LPS se une al receptor tipo Toll 4 (TLR-4) en el epitelio de las vías respiratorias, lo que desencadena la activación de NF-κB que mejora la producción de citocinas y quimiocinas, atrayendo a las células inflamatorias30, lo que conduce a una alveolitis neutrofílica robusta6. Sin embargo, el modelo muestra variaciones entre cepas y especies de animales, disminuyendo la reproducibilidad de los resultados en animales para pacientes humanos con SDRA30.

El modelo de lesión por HCl imita el SDRA por aspiración de contenido ácido. El pH bajo en los pulmones induce una respuesta inflamatoria aguda seguida de una lesión fibrótica tardía. El daño es dependiente de neutrófilos, causando hemorragia alveolar, edema y alteración de la eliminación de líquidos. Sin embargo, los seres humanos no aspiran solo HCl, sino un contenido gástrico complejo con un pH a menudo superior a 1,531. Estos y otros modelos de SDRA han sido ampliamente revisados en otros lugares31. De entre todos los modelos utilizados, el modelo de SDRA inducido por ácido oleico es el más idóneo14.

El modelo de oleato de sodio causa daño pulmonar, induce apoptosis y necrosis de las células alveolares y mejora la producción de citocinas como TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β y MIP-1α19. La artrosis también induce la expresión de proteasas y elastasas con hemorragias que causan lesiones pulmonares graves25. La artrosis reproduce la enfermedad debido a la embolia lipídica, al aumento de la permeabilidad vascular pulmonar y al líquido extravascular con infiltrados radiográficos32. Además, los pacientes con SDRA tienen mayor concentración plasmática de OA 15,22,24.

La administración intratraqueal de OA induce la producción de mediadores inflamatorios similar al SDRA clínico y disminuye la distensibilidad pulmonar y el intercambio gaseoso25,32. La inyección intravenosa de artrosis promueve los aspectos histomorfológicos y fisiológicos de la enfermedad32. La albúmina sérica es un potente ligando de la artrosis, lo que puede explicar por qué esta vía requiere una mayor cantidad de OA (10 μmol)15 que la intratraqueal (1,25 μmol)23 para inducir daño pulmonar. De hecho, nuestro grupo mostró una correlación entre el desequilibrio OA/albúmina y un mayor riesgo de muerte en pacientes con leptospirosis33.

Al igual que con cualquier otro modelo, hay algunas desventajas presentadas en el modelo. Cuando no se administra en forma de sal, el ácido oleico puede causar efectos tóxicos y variaciones debido a la emulsificación de la sangre. Como se ha demostrado en este artículo, el uso de su forma salina disminuye los efectos tóxicos y evita dos problemas: la formación de émbolos y la fluctuación del pH en la sangre y los pulmones. Además, asegura que la lesión pulmonar es causada por el oleato y no por un efecto secundario15. Además, la preparación de ácido oleico en forma de sal en este modelo no requiere conjugación con albúmina. Las investigaciones muestran los efectos beneficiosos de la albúmina en la reducción de la inflamación y la permeabilidad vascular. Además, la albúmina restaura la hemodinámica y la respiración en pacientes con lesiones pulmonares. Así, la conjugación de la albúmina con la OA podría perjudicar su impacto en el animal, reduciendo la viabilidad de los modelos33,34.

A nivel molecular, el oleato de sodio inhibe la ATPasa de sodio-potasio (NKA) y el canal de sodio (eNac), que perjudican el transporte de iones, aumentando la permeabilidad vascular y la formación de edemas15. Además, la OA puede unirse al receptor de ácidos grasos libres 1 (FFAR1), aumentando la concentración intracelular de Ca 2+ , lo que desencadena proteínas de señalización de quinasas como PI3K y MAPK, lo que conduce a la activación del factor nuclear kappa-potenciador de la cadena ligera de las células B activadas (NF-κB) y mejora la respuesta inflamatoria25.

En resumen, aunque ningún modelo puede reproducir completamente las características del SDRA, son herramientas valiosas para estudiar la enfermedad. La investigación preclínica es crucial para comprender la fisiopatología del SDRA y el desarrollo de nuevos tratamientos. La administración intratraqueal e intravenosa de la artrosis, en forma de sal, genera modelos de SDRA fiables y reproducibles, lo que lo convierte en un modelo de oro para el estudio del SDRA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada por el Instituto Oswaldo Cruz, la Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, el Programa de Biotecnología de la Universidad Federal Fluminense (UFF), la Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), la Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq). La Figura 1 y la Figura 2 se crean con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic vaporizer SurgiVet model 100
Braided slik thread with needle number 5 Shalon medical N/A
Cabinet vivarium Insight  Model EB273
Centrifuge Eppendorf 5430/5430R
Cytofunnel ThermoFisher 11-025-48
Drontal puppy Bayer N/A
Hank's balanced Salts Sigma-Aldrich H4981
Heatpad tkreprodução TK-500
Hydrocloric Acid Sigma-Aldrich 30721
Insulin syringe Ultrafine BD 328322
Isoforine 1mL/mL Cristália N/A
Ketamine Syntec N/A
May-Grunwald-Giemsa Sigma-Aldrich 205435
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23235
Microscope  PrimoStar Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA R&D system DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA R&D system DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA R&D system DY410
Neubauer chamber improved bright-line Global optics
Oleic Acid (99%) Sigma-Aldrich O1008
Osmium tetroxide solution (4%) Sigma-Aldrich 75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G BD Angiocath 388333
Prism 8 (graphic and statistic software) Graphpad N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal Cayman Chemical 514010
Shandon Cytospin 3 ThermoFisher N/A
Sodium hydroxide Merck 1,06,49,81,000
Spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice ICTB/FIOCRUZ N/A
Syringe 1 mL BD 990189
Tris-base Bio Rad 161-0719 Electrophoresis purity reagent
Türk's solution Sigma-Aldrich 93770
Xilazine Syntec N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E. Acute respiratory distress in adults. Lancet. 2 (7511), 319-323 (1967).
  2. The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  3. Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
  4. Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
  5. Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
  6. D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
  7. Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
  8. Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
  9. Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
  10. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 18 (2019).
  11. Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
  12. Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
  13. Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
  14. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
  15. Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
  16. Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
  17. Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
  18. Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
  19. Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
  20. Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
  21. Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
  22. Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
  23. Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
  24. Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
  25. Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
  26. McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
  27. Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
  28. Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
  29. Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
  30. Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
  31. Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
  32. Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
  33. Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
  34. Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).

Tags

Modelo de Ratón Inducido por Ácido Oleico Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda SDRA Exposición a Contaminantes Humo de Cigarrillo Agentes Infecciosos Ácidos Grasos Modelos Animales Patomecanismo Limitaciones Ácido Oleico (OA) Efectos Nocivos en el Pulmón Lesión Pulmonar Émbolos Alteración del Tejido Alteración del PH Alteración del Aclaramiento del Edema Lesión Endotelial Permeabilidad Alveolar Inflamación Formación Hialina de Membrana Muerte Celular Inyección de OA (en Forma de Sal) Forma Fisiológica de OA a PH 7
Modelo murino del síndrome de dificultad respiratoria aguda inducido por ácido oleico
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Oliveira Rodrigues, S., Patricio… More

de Oliveira Rodrigues, S., Patricio de Almeida, M. A., Castro-Faria-Neto, H. C., Silva, A. R., Felippe Gonçalves-de-Albuquerque, C. Mouse Model of Oleic Acid-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. J. Vis. Exp. (184), e63566, doi:10.3791/63566 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter