Summary
Det aktuella protokollet beskriver en lungskademodell hos möss som använder oljesyra för att efterlikna akut andnödssyndrom (ARDS). Denna modell ökar de inflammatoriska mediatorerna vid ödem och minskar lungornas följsamhet. Oljesyra används i saltform (oleat) eftersom denna fysiologiska form undviker risken för emboli.
Abstract
Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) är ett betydande hot mot kritiskt sjuka patienter med hög dödlighet. Exponering för föroreningar, cigarettrök, smittämnen och fettsyror kan framkalla ARDS. Djurmodeller kan efterlikna den komplexa patomekanismen hos ARDS. Var och en av dem har dock begränsningar. Noterbart är att oljesyra (OA) ökar hos kritiskt sjuka patienter med skadliga effekter på lungan. OA kan framkalla lungskada genom emboli, störa vävnad, ändra pH och försämra ödemrensningen. OA-inducerad lungskademodell liknar olika egenskaper hos ARDS med endotelskada, ökad alveolär permeabilitet, inflammation, membranhyalinbildning och celldöd. Här beskrivs induktion av lungskada genom att injicera OA (i saltform) direkt i lungan och intravenöst i en mus eftersom det är den fysiologiska formen av OA vid pH 7. Således är injektion av artros i saltform en användbar djurmodell för att studera lungskada/ARDS utan att orsaka emboli eller ändra pH, och därmed komma nära det som händer hos kritiskt sjuka patienter.
Introduction
Ashbaugh et al.1 beskrev 1967 för första gången akut andnödssyndrom (ARDS) och har sedan dess genomgått flera revideringar. Enligt Berlins definition är ARDS en lunginflammation som leder till akut andningssvikt och hypoxemi (PaO 2/FiO 2 > 300 mm Hg) på grund av obalans i förhållandet mellan ventilation och perfusion, diffus bilateral alveolär skada (DAD) och infiltrat, ökad lungvikt och ödem 2,3. Lungparenkymet är en komplex cellulär miljö som förvärras av epitelceller, endotel och andra celler. Dessa celler bildar barriärer och strukturer som är ansvariga för gasutbyte och homeostas i alveolerna3. De vanligaste cellerna inom epitelbarriären är alveolära typ I-celler (AT1) med en större yta för gasutbyte och vätskehantering genom Na/K-ATPas. Dessutom producerar de alveolära typ II-cellerna (AT2) ytaktivt ämne, vilket minskar ytspänningen i alveolerna4. Undertill bildar endotelceller en semipermeabel barriär som separerar lungcirkulationen från interstitium. Dess funktioner inkluderar att upptäcka stimuli, koordinera inflammatoriska svar och cellulär transmigration5. Endotelcellerna reglerar också gasutbyte, vaskulär tonus och koagulation5. Därför kan störningar i endotel- och epitelfunktionen förvärra en proinflammatorisk fenotyp och orsaka lungskador som leder till ARDS5.
ARDS-utveckling är riskförknippad med bakteriell och viral lunginflammation eller indirekta faktorer som icke-pulmonell sepsis, trauma, blodtransfusioner och pankreatit6. Dessa tillstånd orsakar frisättning av patogenassocierade molekylära mönster (PAMP) och skadeassocierade molekylära mönster (DAMP), vilket inducerar proinflammatoriska cytokiner och kemokiner såsom TNF-α, IL-1β, IL-6 och IL-85. TNF-α är kopplat till nedbrytning av vaskulärt endotelial cadherin (VE-cadherin) vid endotelbarriärstörning och leukocytinfiltration i lungparenkymet. Neutrofiler är de första cellerna som migrerar och attraheras av IL-8 och LTB4 5,7,8. Neutrofiler ökar ytterligare proinflammatoriska cytokiner, reaktiva syreradikaler (ROS)9 och bildandet av neutrofila extracellulära fällor (NET) som genererar extra endotel- och epitelskador10. Epitelskada föranleder inflammation och aktivering av Toll-liknande receptorer i AT2-celler och residenta makrofager, vilket inducerar frisättning av kemokiner som lockar inflammatoriska celler till lungorna4. Produktionen av cytokiner som interferon-β (INFβ) orsakar också TNF-relaterade apoptosinducerande receptorer (TRAIL), vilket leder till apoptos, vilket försämrar vätske- och jonklarhet4. Störningen av endotel- och epitelbarriärstrukturen möjliggör inflöde av vätska, proteiner, röda blodkroppar och leukocyter i det alveolära utrymmet, vilket orsakar ödem. När ödem har etablerats förändras lungansträngningen för att upprätthålla andning och gasutbyte11. Hyperkapni och hypoxemi inducerar celldöd och natriumtransportstörning, vilket förvärrar alveolärt ödem på grund av dålig clearancekapacitet10. ARDS har också förhöjda nivåer av IL-17A, associerat med organdysfunktion, ökad andel alveolära neutrofiler och alveolär permeabilitet9.
Under de senaste åren har det gjorts framsteg inom forskningen om patofysiologi, epidemiologi och behandling av ARDS12,13. ARDS är dock ett heterogent syndrom trots framstegen inom terapeutisk forskning som resulterat i mekanisk ventilation och optimering av vätsketerapi. Således behövs fortfarande en mer effektiv direkt farmakologisk behandling10, och djurstudier kan hjälpa till att avslöja ARDS-mekanismer och mål för intervention.
Nuvarande ARDS-modeller kan inte replikera patologin fullt ut. Därför väljer forskare ofta den modell som bäst passar deras intressen. Till exempel inducerar induktionsmodellen för lipopolysackarid (LPS) ARDS genom endotoxisk chock som huvudsakligen utlöses av TLR414. HCl-induktion efterliknar syraaspiration, och skadan är neutrofil-beroende14. Å andra sidan inducerar den nuvarande natriumoleatmodellen endotelskador som ökar vaskulär permeabilitet och ödem. Genom att använda natriumoleat istället för oljesyra i flytande form undviker man dessutom risker för emboli och förändring av blodets pH15.
Djurmodeller för ARDS
Prekliniska studier i djurmodeller hjälper till att förstå patologin och är avgörande för ny forskning om ARDS-behandlingar. Den ideala djurmodellen måste ha egenskaper som liknar den kliniska situationen och god reproducerbarhet av sjukdomsmekanismer med relevanta patofysiologiska egenskaper för varje sjukdomsstadium, evolution och reparation14. Flera djurmodeller används för att prekliniskt bedöma akut lungskada vid ARDS. Men eftersom alla modeller har begränsningar återger de inte fullt ut den mänskliga patologin 6,14,16. Oljesyrainducerad ARDS används på olika djurarter17. Grisar18, får19 och hundar20 som genomgått injektion med artros uppvisar flera kliniska tecken på sjukdomen med dysfunktion i alveolar-kapillärmembranet och ökad permeabilitet med protein- och cellinfiltration.
Till exempel blockerade OA vid 1,25 μM intravenöst injicerad transepiteltransport som ledde till alveolärt ödem15. Alternativt, i in vitro-modellen med A549-celler, förändrade OA vid en koncentration av 10 μM inte epitelnatriumkanalen (eNAC) eller uttrycket av Na/K-ATPas. OA verkar dock associera med båda kanalerna, vilket direkt hämmar deras aktivitet21. Intravenös injektion med 0,1 ml/kg orsakade lungvävnadsträngsel och svullnad, minskade alveolära utrymmen med förtjockade alveolära skiljeväggar och ökade antalet inflammatoriska och röda blodkroppar22. Dessutom inducerade OA apoptos och nekros i endotel- och epitelceller i lungan15. Injektion av en tris-oleatlösning, intratrakealt hos möss, ökade neutrofilinfiltrationen och ödem så tidigt som 6 timmar efter stimulering23. OA-injektion vid 24 timmar ökade proinflammatoriska cytokinnivåer (dvs. TNF-α, IL-6 och IL-1β)23. Dessutom hämmar intravenös injektion (orbital plexus) av 10 μM av ett tris-oleat pulmonell Na/K-ATPasaktivitet, liknande ouabain vid 10-3 μM, en selektiv enzymhämmare. Artros inducerar också inflammation med cellinfiltration, bildning av lipidkroppar och produktion av leukotrien B4 (LTB4) och prostaglandin E2 (PGE2)22,24. Därför genererar oljesyrainducerad ARDS ödem, blödning, neutrofilinfiltration, ökad myeloperoxidasaktivitet (MPO) och ROS24. Därmed är artrosadministrering en väletablerad modell för lungskada22,25. Alla resultat som presenteras i den här artikeln som har OA representerar saltformen, natriumoleat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerna som används i denna studie har godkänts av Oswaldo Cruz Foundations etiska kommitté för användning av djur (CEUA-licenser nr 002-08, 36/10 och 054/2015). Schweiziska Webster-möss av hankön som väger mellan 20-30 g, tillhandahållna av Institute of Science and Technology in Biomodels (ICTB) vid Oswaldo Cruz Foundation (FIOCRUZ), användes för experimenten. Djuren hölls i ventilerade isolatorer i Pavilhão Ozório de Almeidas vivarium, och vatten och mat fanns tillgängliga ad libitum. De utsattes för en ljus- och mörkercykel på 12 timmar/12 timmar.
1. Beredning av natriumoleatlösning
- Använd oljesyra för att bereda en stamlösning av 100 mmol/l natriumoleat i ett sterilt rör eller en glaskolv.
OBS: En 50 ml (slutlig volym) lösning förbereddes för detta arbete, men volymen måste justeras enligt det experimentella behovet. Lösningen måste alltid beredas i sterila rör eller glasbehållare.- Tillsätt först NaOH-tabletter eller lösning i ultrarent vatten för att höja pH-värdet. Ett pH-värde på 12-13 rekommenderas för en volym på 25 ml.
OBS: Alternativt kan Tris-bas användas för att bereda Tris-oleatlösningen. - Tillsätt oljesyran (se materialtabell) mycket långsamt, droppe för droppe, under konstant omrörning i ett ultraljudsbad vid 37 °C.
OBS: Om oljesyrautfällning inträffar, börja om från början. - När oljesyran är helt upplöst, justera försiktigt pH-värdet till 7,4, droppe för droppe under omrörning, med ultraren utspädd HCl och justera sedan till den slutliga volymen på 50 ml.
OBS: Förbered arbetsoleatlösningarna på nytt. Alternativt kan lösningen alikvoteras, lagras och hållas vid -20 °C i en kväveberikad miljö för att undvika oxidation i högst en månad. Undvik frysta-frysta cykler.
- Tillsätt först NaOH-tabletter eller lösning i ultrarent vatten för att höja pH-värdet. Ett pH-värde på 12-13 rekommenderas för en volym på 25 ml.
2. Induktion av lungskada med oljesyra
- Utför intratrakeal administrering av oljesyra.
- Bedöva mössen med 5 % isofluran med 2 l/min O2 med hjälp av en veterinär anestesiförångare (Figur 1A). Ta bort pälsen vid snittområdet med hårborttagningskräm och desinficera området med tre omväxlande omgångar betadinskrubb och alkohol med steril gasbinda. Bekräfta anestesidjupet genom att nypa ihop tårna.
OBS: Använd sterila handskar och instrument under proceduren. Använd ett draperi för att täcka djuret och exponera endast snittstället. Utför experimentet i ett biologiskt säkerhetsskåp för att undvika att isofluoran läcker ut i miljön. Analgetika administreras inte eftersom de kan hämma det inflammatoriska svaret. - Efter bedövning lägger du djuret i ryggläge och gör ett snitt (0,5-1 cm) i V-form på sköldkörtelnivå. Flytta försiktigt sköldkörteln för att exponera luftstrupen (Figur 1B) och injicera 50 μL av den beredda oleatlösningen (steg 1).
OBS: Mössen delades in i två grupper, med åtta djur i varje grupp. Lungskadegruppen får natrium-oleatlösning vid 25 mM (1,25 μmol) och kontrollgruppen får 50 μl steril koksaltlösning genom tillförsel i luftstrupen på varje mus med en insulinspruta (volym 300 μL, 30 G) (Figur 1C). - Suturera mössens snittställe med en syntetisk icke-absorberbar monofilamentsutur, sätt tillbaka den i deras bur och övervaka den tills den är helt återställd från operationen. Under alla procedurer ska djuren hållas på en värmedyna vid 37 °C.
OBS: Möss tar vanligtvis upp till 15 minuter att återhämta sig från operationen.
- Bedöva mössen med 5 % isofluran med 2 l/min O2 med hjälp av en veterinär anestesiförångare (Figur 1A). Ta bort pälsen vid snittområdet med hårborttagningskräm och desinficera området med tre omväxlande omgångar betadinskrubb och alkohol med steril gasbinda. Bekräfta anestesidjupet genom att nypa ihop tårna.
- Utför intravenös administrering av oljesyra.
- Efter anestesi (steg 2.1.1, figur 2A), injiceras intravenöst i orbital plexus genom att föra in den ultrafina nålen (se materialtabell) i ögonhålans mediala kantus (figur 2B).
OBS: Mössen delades in i två grupper, med åtta djur i varje grupp. Varje grupp får 100 μl natriumoleatlösning med 10 μmol OA per djur, medan kontrollgruppen får 100 μl steril koksaltlösning.
- Efter anestesi (steg 2.1.1, figur 2A), injiceras intravenöst i orbital plexus genom att föra in den ultrafina nålen (se materialtabell) i ögonhålans mediala kantus (figur 2B).
- Efter operationen ska djuren övervakas dagligen för biverkningar. Humana effektmått för avlivning inkluderar biverkningar, kramper och koma.
3. Uppsamling av bronkoalveolär sköljvätska (BALF)
- Avliva mössen med en intraperitoneal dödlig dos av ketamin (300 mg/kg) och xylazin (30 mg/kg) (se materialförteckning).
- Lägg djuret i dorsal decubitus, gör ett snitt på cirka 1 cm med en kirurgisk sax i djurets främre region, exponera luftstrupen och gör ett litet snitt för att införa en intravenös kateter (20 G).
- Anslut katetern till en 1 ml steril spruta, injicera långsamt och gradvis 0,5 ml steril koksaltlösning i lungorna och aspirera sedan vätskan från BALF med samma spruta. Upprepa det 3-5 gånger och överför det till ett sterilt mikrorör och lägg dem i is.
OBS: Proverna kan förvaras vid -20 °C i upp till 6 månader.
4. Total och differentiell cellanalys i BALF
- För totalt celltal, späd 20 μL BALF i 180 μL (10x spädning) av Turks lösning (se Materialtabell). Utför räkningen med hjälp av en Neubauer-kammare under ett optiskt mikroskop med ett 40x objektiv.
- För differentialräkning, lägg 100 μL BALF i celltratten som innehåller objektglas och centrifugera den vid 22,86 x g i 5 minuter vid 4 °C i en cytocentrifug och färga med May-Grunwald (15 %, pH 7,2)-Giemsa (1:10) (se materialtabell). Fortsätt med cellräkning i ett ljusmikroskop med nedsänkningsobjektiv.
5. Bestämning av totalt protein i BALF
- Bestäm det totala BALF-supernatantproteinet med hjälp av ett kommersiellt proteinkvantifieringskit och läs av absorbansen vid 562 nm med hjälp av en spektrofotometer enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
6. Enzym immunadsorberande analyser
- Centrifugera BALF vid 1 200 x g i 10 minuter vid 4 °C. Samla sedan upp supernatanten med en pipett och förvara den vid -80 °C för bestämning av TNF-α, IL-1β, IL-6 och PGE215,23,25.
OBS: Centrifugeringen i steg 6.1 gör BALF cellfri.- Utför cytokinanalyserna på cellfri BALF med hjälp av ett kommersiellt ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner. Utför PGE2-analysen med ett enzymimmunanalyskit (EIA) enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
7. Lipidkroppsfärgning och räkning
- Fixera leukocyterna på cytospinglasen med 3,7 % formaldehyd i Ca 2+, Mg2+ fri Hanks buffrade saltlösning (HBSS, pH 7,4) och färga med 1,5 % OsO4 medan den fortfarande är fuktig3 (se materialförteckning). Räkna sedan lipidkropparna per cell i 50 på varandra följande leukocyter från varje objektglas med hjälp av mikroskopets lins.
8. Statistisk analys
- Utför statistisk analys med hjälp av graf- och statistikprogram (se Materialförteckning). Uttryck resultaten som medelvärde ± SEM och analysera med envägs Anova följt av en Newman-Keuls-Student26 efter testet. Tänk på skillnaderna som är signifikanta när P < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en oskadad lunga sker alveolär vätskeclearance genom transport av joner genom det intakta alveolära epitelskiktet. Den osmotiska gradienten transporterar vätska från alveolerna till lunginterstitium, där den dräneras av lymfkärl eller återabsorberas. Na/K-ATPase driver denna transport11. OA är en hämmare av Na/K-ATPas27 och natriumkanal 21, vilket kan bidra till ödembildning, som vi redan har föreslagit23. Det förvärrade inflammatoriska svaret vid ARDS leder till alveolär skada, ökad endotel- och epitelpermeabilitet och ackumulering av alveolär vätska rik på protein och inflammatoriska celler, vilket orsakar ödem. Ödemet gör att lungorna ökar andningsfrekvensen på grund av ackumulering av interstitiell vätska och nedsatt gasutbyte, vilket resulterar i hypoxemi och andningssvikt28. Cytokiner såsom TNF-α och vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) destabiliserar VE-cadherinbindningar, vilket bidrar till ökad endotelpermeabilitet och ackumulering av alveolär vätska7.
Injektion av artros ökade det totala antalet leukocyter i intratrakeal och intravenös administrering (Figur 3). Det var nödvändigt att inducera artros för lungskada intravenöst i stället för intratrakealt. Det aktuella arbetet visade en ökning av antalet neutrofila granulocyter i BALF efter 6 timmar, med en topp efter 24 timmar och en minskning efter 48 timmar och 72 timmar. En högre koncentration av IL-6, IL-1β och TNF-α i BALF observerades efter 24 timmars intratrakeal instillation av artros23 (figur 4). OA förhindrar eliminering av ödem och kan utlösa bildandet av proteinrikt ödem både intravenöst och intratrakealt15,23. Lungödemet bedömdes med totalproteinanalys i BALF, vilket visade att intravenödem och intravenödem ökade den totala proteinkoncentrationen (Figur 5). Lipidkroppar är intracellulära organeller som innehåller substrat och enzymer för produktionav eikosanoider 8,29. Bildandet av lipidkroppar ökar produktionen av lipidmediatorer, och det kan användas för att komma åt cellaktivering. Intratrakeal och intravenös OA-injektion ökade bildningen av lipidkroppar och PGE2-koncentrationen 23 efter 24 timmar (figur 6). OA-injektion inducerade också vävnadsstörning, blödning och leukocytinfiltration intratrakealt och intravenöst, vilket visas i hematoxylin- och eosinfärgningshistologin (H&E) (Figur 7). Artros orsakar också förändringar i lungfunktionen19. Oljesyrainducerad lungskada uppvisar således många ARDS-egenskaper.
Figur 1: De enskilda stegen i det intratrakeala administreringsprotokollet . A) En mus bedövas med 5 % isofluoran och 2 l/minO2. B) Ett trakealsnitt med en kirurgisk sax hos möss i dorsal decubitusposition. C) Intratrakeal instillation med hjälp av en insulinspruta. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: De enskilda stegen i protokollet för intravenös administrering. (A) En mus bedövas med 5 % isofluoran och 2 L/min O2. B) Intravenös injektion med insulinspruta av den mediala kantusen. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Administrering av artros inducerar leukocytaktivering i BALF hos möss. Totalt antal leukocyter i intravenös (i.v) och intratrakeal administrering (i.t) (A) och en illustrativ mikromikrobild (1000x förstoring) vid intratrakeal administrering (i.t.) färgad med May-Grünwald-Giemsa (B) utfördes 24 timmar efter OA-provokationen. Skalstapel = 10 μm. Samma volym steril koksaltlösning administrerades till kontrollgruppen. Varje stapel representerar medelvärdet ± SEM för minst sju djur. *P < 0,05 jämfört med kontroller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Intratrakeal administrering (i.t) av artros inducerar produktion av inflammatoriska mediatorer i lungan hos möss. TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) mättes 24 timmar efter provokationen. Steril koksaltlösning administrerades till kontrollgruppen. Varje stapel representerar medelvärdet ± SEM för minst sex djur. *P < 0,05 jämfört med kontroller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Total proteinhalt i BALF 24 timmar efter injektion av artros. Intratrakeal (i.t.) och intravenös (i.v.) administrering av artros ökar det totala proteinet i BALF hos möss. Kontrollgruppen fick samma volym steril koksaltlösning. Resultaten är medel ± SEM från minst sex olika djur. *P < 0,0001, jämfört med kontroller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Lipidkroppsbildning i leukocyter och PGE2-produktion i BALF hos OA-behandlade möss. Intratrakeal (i.t) och intravenös (i.v) administrering av artros inducerar ackumulering av inflammatoriska mediatorer och lipidkroppar i BALF hos möss (A) respektive (B). (C) Illustrativ mikrofotografi av lipidkroppar (1000x förstoring) färgade i djurens lungor med osmiumtetroxid (OsO4) 24 timmar efter OA-provokation. Pilarna pekar på lipidkropparna. Skalstapel = 10 μm. Kontrollerna fick samma mängd saltlösning. Resultaten är medel ± SEM från sju djur. *P < 0,05 jämfört med kontroller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Illustrativ lunghistologi hos möss . (A) Kontrollmöss behandlade med koksaltlösning och inga tecken på blödning. (B) Intravenös administrering av artros (i.v). (C) Intratrakeal administrering (i.t) med vävnadsförändringar. H&E färgning utfördes. Förstoring, 1000x. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att välja rätt ARDS-modell är avgörande för att genomföra de prekliniska studierna, och utvärderaren måste ta hänsyn till alla möjliga variabler, såsom ålder, kön, administreringsmetoder och andra6. Den valda modellen måste reproducera sjukdomen baserat på riskfaktorer som sepsis, lipidemboli, ischemi-reperfusion av lungkärlen och andra kliniska risker14. Ingen djurmodell som används för ARDS kan dock återskapa alla det mänskliga syndromets egenskaper. Flera modeller av skademedel inkluderar LPS, OA, saltsyra, bakterier och virus6. Olika administreringsmetoder används också, oftare intratrakealt, intranasalt eller intravenöst. Lungischemi-reperfusionsmodellen orsakar kapillärruptur och ackumulering av intraalveolärt protein6. LPS-inducerad lungskada används i stor utsträckning och leder till akut skada på epitel- och endotelbarriärer. LPS binder till den Toll-liknande receptorn 4 (TLR-4) i luftvägsepitelet som utlöser NF-κB-aktivering, vilket ökar produktionen av cytokiner och kemokiner, vilket attraherar inflammatoriska celler30, vilket leder till en robust neutrofil alveolit6. Modellen visar dock variationer mellan stammar och djurarter, vilket minskar reproducerbarheten av resultaten i djur för mänskliga patienter med ARDS30.
HCl-skademodellen efterliknar ARDS genom aspiration av surt innehåll. Det låga pH-värdet i lungorna inducerar en akut inflammatorisk reaktion följt av en sen fibrotisk skada. Skadan är beroende av neutrofila granulocyter och orsakar alveolär blödning, ödem och försämrat vätskeclearance. Människor aspirerar dock inte bara HCl utan ett komplext maginnehåll med ett pH som ofta är högre än 1,531. Dessa och andra ARDS-modeller har granskats utförligt på andra håll31. Bland alla modeller som används är den oljesyrainducerade ARDS-modellen den mest idealiska14.
Natriumoleatmodellen orsakar lungskador, inducerar apoptos och nekros av alveolära celler och ökar cytokinproduktionen såsom TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β och MIP-1α19. OA inducerar också proteaser och elastasuttryck med blödning som orsakar allvarlig lungskada25. OA reproducerar sjukdomen på grund av lipidemboli, ökad pulmonell vaskulär permeabilitet och extravaskulär vätska med radiografiska infiltrat32. Patienter med ARDS har också högre plasmatisk OA-koncentration 15,22,24.
Administrering av intratrakeal artros inducerar produktion av inflammatoriska mediatorer som liknar klinisk ARDS och minskar lungornas följsamhet och gasutbyte25,32. Intravenös injektion med artros främjar de histomorfologiska och fysiologiska aspekterna av sjukdomen32. Serumalbumin är en potent OA-ligand som kan förklara varför denna väg kräver en högre mängd OA (10 μmol)15 än intratrakeal (1,25 μmol)23 för att inducera lungskada. Vår grupp visade ett samband mellan obalans i artros/albumin och högre risk för dödsfall hos patienter med leptospiros33.
Som med alla andra modeller finns det vissa nackdelar i modellen. När oljesyra inte administreras i saltform kan den orsaka toxiska effekter och variationer på grund av blodemulgering. Som visats i den här artikeln minskar användningen av dess saltform de toxiska effekterna och undviker två problem: embolibildning och pH-fluktuationer i blod och lungor. Det säkerställer också att lungskadan orsakas av oleatet och inte av en sekundär effekt15. Dessutom kräver beredningen av oljesyra i saltform i denna modell inte konjugering med albumin. Forskning visar albuminets positiva effekter för att minska inflammation och vaskulär permeabilitet. Dessutom återställer albumin hemodynamik och andning hos patienter med lungskador. Således kan konjugering av albumin med OA försämra dess inverkan på djuret, vilket minskar modellernas livsduglighet33,34.
På molekylär nivå hämmar natriumoleat natrium-kalium-ATPas (NKA) och natriumkanal (eNac), vilket försämrar jontransporten, ökar vaskulär permeabilitet och ödembildning15. OA kan också binda till fri fettsyrareceptor 1 (FFAR1), vilket ökar den intracellulära Ca 2+ -koncentrationen, vilket utlöser kinassignalerande proteiner som PI3K och MAPK, vilket leder till aktivering av kärnfaktor kappa-light-chain-enhancer av aktiverade B-celler (NF-κB) och förstärker det inflammatoriska svaret25.
Sammanfattningsvis, även om ingen modell helt kan reproducera ARDS-egenskaper, är de värdefulla verktyg för att studera sjukdomen. Preklinisk forskning är avgörande för att förstå patofysiologin vid ARDS och utvecklingen av nya behandlingar. Den intratrakeala och intravenösa administreringen av OA, i saltform, genererar tillförlitliga och reproducerbara ARDS-modeller, vilket gör det till en gyllene modell för att studera ARDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Figur 1 och bild 2 skapas med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
- Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E.
- The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
- Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
- D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
- Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
- Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
- Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
- Matthay, M. A., et al.
- Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
- Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
- Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
- Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
- Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
- Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
- Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
- Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
- Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
- Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
- McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
- Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
- Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
- Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
- Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
- Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
- Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
- Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
- Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).
