Summary
Denne protokol beskriver en lungeskademodel hos mus, der bruger oliesyre til at efterligne akut respiratorisk distress syndrom (ARDS). Denne model øger de inflammatoriske mediatorer på ødem og nedsætter lungekomplians. Oliesyre anvendes i saltform (oleat), da denne fysiologiske form undgår risikoen for emboli.
Abstract
Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) er en betydelig trussel mod kritisk syge patienter med en høj dødelighed. Forurenende eksponering, cigaretrøg, smitsomme stoffer og fedtsyrer kan fremkalde ARDS. Dyremodeller kan efterligne ARDS's komplekse patomekanisme. Men hver af dem har begrænsninger. Især øges oliesyre (OA) hos kritisk syge patienter med skadelige virkninger på lungen. OA kan fremkalde lungeskade ved emboli, forstyrre væv, ændre pH og forringe ødemclearance. OA-induceret lungeskademodel ligner forskellige træk ved ARDS med endotelskade, øget alveolær permeabilitet, betændelse, membranhyalindannelse og celledød. Heri beskrives induktion af lungeskade ved at injicere OA (i saltform) direkte i lungen og intravenøst i en mus, da det er den fysiologiske form for OA ved pH 7. Således er injektion af OA i saltform en nyttig dyremodel til at studere lungeskade / ARDS uden at forårsage emboli eller ændre pH og derved komme tæt på, hvad der sker hos kritisk syge patienter.
Introduction
Ashbaugh et al.1 beskrev i 1967 først det akutte respiratoriske distress syndrom (ARDS) og har siden da været igennem flere revisioner. Ifølge Berlin-definitionen er ARDS en lungebetændelse, der fører til akut respirationssvigt og hypoxæmi (PaO 2 / FiO 2 > 300 mm Hg) på grund af ubalance i forholdet mellem ventilation og perfusion, diffus bilateral alveolær skade (DAD) og infiltrat, øget lungevægt og ødem 2,3. Lungeparenchymen er et komplekst cellulært miljø sammensat af epitel-, endotel- og andre celler. Disse celler danner barrierer og strukturer, der er ansvarlige for gasudveksling og homeostase i alveolerne3. De mest rigelige celler inden for epitelbarrieren er alveolære type I-celler (AT1) med et større overfladeareal til gasudveksling og væskestyring gennem Na / K-ATPase. De alveolære type II-celler (AT2) producerer også overfladeaktivt middel, hvilket reducerer overfladespændingen i alveolerne4. Nedenunder danner endotelceller en semipermeabel barriere, der adskiller lungecirkulationen fra interstitium. Dens funktioner omfatter detektering af stimuli, koordinering af inflammatoriske reaktioner og cellulær transmigration5. Endotelcellerne regulerer også gasudveksling, vaskulær tonus og koagulation5. Derfor kan endotel- og epitelfunktionsforstyrrelser forværre en proinflammatorisk fænotype, hvilket forårsager lungeskade, der fører til ARDS5.
ARDS-udvikling er risikoforbundet med bakteriel og viral lungebetændelse eller indirekte faktorer såsom ikke-lungesepsis, traumer, blodtransfusioner og pancreatitis6. Disse tilstande forårsager frigivelse af patogenassocierede molekylære mønstre (PAMP'er) og skadeassocierede molekylære mønstre (DAMP'er), hvilket inducerer proinflammatoriske cytokiner og kemokiner såsom TNF-α, IL-1β, IL-6 og IL-85. TNF-α er forbundet med vaskulær-endotel-cadherin (VE-cadherin) nedbrydning i endotelbarriereforstyrrelse og leukocytinfiltration i lungeparenchymen. Neutrofiler er de første celler, der migrerer, tiltrukket af IL-8 og LTB4 5,7,8. Neutrofiler øger yderligere proinflammatoriske cytokiner, reaktive iltarter (ROS)9 og dannelse af neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er), der genererer ekstra endotel- og epitelskader10. Epitelskader fremkalder betændelse og aktivering af tolllignende receptorer i AT2-celler og residente makrofager, hvilket inducerer frigivelse af kemokiner, der tiltrækker inflammatoriske celler til lungerne4. Produktionen af cytokiner som interferon-β (INFβ) forårsager også TNF-relaterede apoptose-inducerende receptorer (TRAIL), hvilket fører ATII-celler til apoptose, forringer væske og ionclarence4. Forstyrrelsen af endotel- og epitelbarrierestrukturen tillader tilstrømning af væske, proteiner, røde blodlegemer og leukocytter ind i det alveolære rum, hvilket forårsager ødem. Når ødem er etableret, ændres lungeindsatsen for at opretholde vejrtrækning og gasudveksling11. Hyperkapni og hypoxæmi inducerer celledød og natriumtransportforstyrrelse, forværrer alveolært ødem på grund af dårlig clearancekapacitet 10. ARDS har også forhøjede niveauer af IL-17A, forbundet med organdysfunktion, øget procentdel af alveolære neutrofiler og alveolær permeabilitet9.
Der har været løbende fremskridt inden for forskning i patofysiologi, epidemiologi og behandling af ARDS i de senere år12,13. ARDS er imidlertid et heterogent syndrom på trods af fremskridt inden for terapeutisk forskning, hvilket resulterer i optimering af mekanisk ventilation og væsketerapi. Der er således stadig behov for en mere effektiv direkte farmakologisk behandling10, og dyreforsøg kan hjælpe med at afsløre ARDS-mekanismer og mål for intervention.
Nuværende ARDS-modeller er ikke i stand til fuldt ud at replikere patologien. Således vælger forskere ofte den model, der bedre passer til deres interesser. For eksempel inducerer lipopolysaccharidinduktionsmodellen (LPS) ARDS ved endotoksisk chok, der hovedsageligt udløses af TLR414. HCI induktion efterligner syre aspiration, og skaden er neutrofil-afhængig14. På den anden side inducerer den nuværende natriumoleatmodel endotelskader, der øger vaskulær permeabilitet og ødem. Desuden undgår brug af natriumoleat i stedet for oliesyre i flydende form embolirisici og ændring i blodets pH15.
Dyr modeller til ARDS
Prækliniske undersøgelser i dyremodeller hjælper med at forstå patologien og er afgørende for ny ARDS-behandlingsforskning. Den ideelle dyremodel skal have egenskaber, der ligner den kliniske situation, og god reproducerbarhed af sygdomsmekanismer med relevante patofysiologiske træk ved hvert sygdomsstadium, evolution og reparation14. Flere dyremodeller bruges til at vurdere akut lungeskade i ARDS præklinisk. Men da alle modeller har begrænsninger, reproducerer de ikke fuldt ud den menneskelige patologi 6,14,16. Den oliesyreinducerede ARDS anvendes i forskellige dyrearter17. Svin18, får19 og hunde20 indsendt til OA-injektion præsenterer adskillige kliniske træk ved sygdommen med alveolær kapillærmembrandysfunktion og øget permeabilitet med protein- og celleinfiltration.
For eksempel blokerede OA ved 1,25 μM intravenøst injiceret transepiteltransport, hvilket førte til alveolært ødem15. Alternativt ændrede OA i in vitro-modellen med A549-celler i en koncentration på 10 μM ikke epitelnatriumkanalen (eNAC) eller ekspressionen af Na/K-ATPase. OA synes imidlertid at associere sig med begge kanaler og direkte hæmme deres aktivitet21. OA intravenøs injektion ved 0,1 ml / kg forårsagede lungevævsoverbelastning og hævelse, reducerede alveolære rum med fortykket alveolær septa og øgede inflammatoriske og røde blodlegemer22. OA inducerede også apoptose og nekrose i endotel- og epitelceller i lungen15. Injektionen af en tris-oleatopløsning, intratrachealt hos mus, forbedrede neutrofilinfiltration og ødem så tidligt som 6 timer efter stimulering23. OA-injektion ved 24 timer øgede proinflammatoriske cytokinniveauer (dvs. TNF-α, IL-6 og IL-1β)23. Derudover hæmmer intravenøs (orbital plexus) injektion af 10 μM af et tris-oleat pulmonal Na/K-ATPaseaktivitet, svarende til ouabain ved 10-3 μM, en selektiv enzymhæmmer. OA inducerer også betændelse med celleinfiltration, dannelse af lipidlegemer og produktion af leukotrien B4 (LTB4) og prostaglandin E2 (PGE2) 22,24. Derfor genererer oliesyre-induceret ARDS ødem, blødning, neutrofil infiltration, øget myeloperoxidase (MPO) aktivitet og ROS24. Derfor er OA-administration en veletableret model for lungeskade22,25. Alle resultaterne præsenteret i denne artikel, der har OA, repræsenterer saltformen, natriumoleat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedurer, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev godkendt af Oswaldo Cruz Foundations etiske komité for brug af dyr (CEUA-licenser nr. 002-08, 36/10 og 054/2015). Mandlige schweiziske Webster-mus, der vejer mellem 20-30 g, leveret af Institute of Science and Technology in Biomodels (ICTB) fra Oswaldo Cruz Foundation (FIOCRUZ), blev brugt til eksperimenterne. Dyrene blev holdt i ventilerede isolatorer i Pavilhão Ozório de Almeidas vivarium, og vand og mad var tilgængelige ad libitum. De blev udsat for en 12 timer / 12 timers lys og mørk cyklus.
1. Fremstilling af natriumoleatopløsning
- Der anvendes oliesyre til fremstilling af en 100 mmol/l natriumoleatstamopløsning i ethvert sterilt rør eller glaskolbe.
BEMÆRK: En 50 ml (endelig volumen) opløsning blev forberedt til det nuværende arbejde, men lydstyrken skal justeres efter det eksperimentelle behov. Opløsningen skal altid fremstilles i sterile rør eller glasbeholdere.- Tilsæt først NaOH-tabletter eller opløsning i ultrarent vand for at hæve pH-værdien. En pH-værdi på 12-13 anbefales til et volumen på 25 ml.
BEMÆRK: Alternativt kan Tris-basen bruges til at fremstille Tris-oleatopløsningen. - Tilsæt oliesyren (se materialetabellen) meget langsomt, dråbe for dråbe, under konstant omrøring i et ultralydbad ved 37 °C.
BEMÆRK: Hvis der opstår oliesyreudfældning, skal du starte forfra. - Når oliesyren er helt opløst, justeres pH-værdien forsigtigt til 7,4, dråbe for dråbe under omrøring med ultraren fortyndet HCI og justeres derefter til det endelige volumen på 50 ml.
BEMÆRK: Forbered de arbejdende oleatopløsninger frisk. Alternativt kan opløsningen alikvoteres, opbevares og opbevares ved -20 °C i et nitrogenberiget miljø for at undgå oxidation i højst en måned. Undgå frosne og genfrosne cyklusser.
- Tilsæt først NaOH-tabletter eller opløsning i ultrarent vand for at hæve pH-værdien. En pH-værdi på 12-13 anbefales til et volumen på 25 ml.
2. Induktion af lungeskade med oliesyre
- Udfør intratracheal administration af oliesyre.
- Bedøv musene ved hjælp af 5% isofluran med 2 l / minO2 ved hjælp af en veterinærbedøvelsesfordamper (figur 1A). Fjern pelsen i snitområdet med hårfjerningscreme og desinficer området med tre skiftende runder betadinskrubbe og alkohol ved hjælp af sterilt gaze. Bekræft dybden af anæstesi ved tåspids.
BEMÆRK: Brug sterile handsker og instrumenter under proceduren. Brug en drapering til at dække dyret og udsæt kun snitstedet. Udfør forsøget i et biologisk sikkerhedsskab for at undgå udslip af isofluoran til miljøet. Analgetika administreres ikke, da de kan hæmme det inflammatoriske respons. - Efter anæstesi skal du lægge dyret i en dorsal decubitusposition og lave et snit (0,5-1 cm) i V-form på skjoldbruskkirtelniveauet. Fortræng forsigtigt skjoldbruskkirtlen for at udsætte luftrøret (figur 1B) og injicer 50 μL af den fremstillede oleatopløsning (trin 1).
BEMÆRK: Musene blev opdelt i to grupper med otte dyr i hver gruppe. Lungeskadegruppen modtager natriumoleatopløsning ved 25 mM (1,25 μmol), og kontrolgruppen modtager 50 μL sterilt saltvand ved instillation i luftrøret hos hver mus med en insulinsprøjte (volumen 300 μL, 30 G) (figur 1C). - Sutur musenes snitsted med en syntetisk ikke-absorberbar monofilamentsutur, returner den til deres bur og overvåg den, indtil den er fuldstændig bedring efter operationen. Under alle procedurer skal dyrene holdes på en varmepude ved 37 °C.
BEMÆRK: Mus tager normalt op til 15 minutter at komme sig efter operationen.
- Bedøv musene ved hjælp af 5% isofluran med 2 l / minO2 ved hjælp af en veterinærbedøvelsesfordamper (figur 1A). Fjern pelsen i snitområdet med hårfjerningscreme og desinficer området med tre skiftende runder betadinskrubbe og alkohol ved hjælp af sterilt gaze. Bekræft dybden af anæstesi ved tåspids.
- Udfør intravenøs administration af oliesyre.
- Efter anæstesi (trin 2.1.1, figur 2A) injiceres intravenøst i plexusorbital ved at indsætte den ultrafine nål (se materialetabel) i øjenhulens mediale canthus (figur 2B).
BEMÆRK: Musene blev opdelt i to grupper med otte dyr i hver gruppe. Hver gruppe modtager 100 μL natriumoleatopløsningen ved 10 μmol OA pr. dyr, mens kontrolgruppen modtager 100 μL sterilt saltvand.
- Efter anæstesi (trin 2.1.1, figur 2A) injiceres intravenøst i plexusorbital ved at indsætte den ultrafine nål (se materialetabel) i øjenhulens mediale canthus (figur 2B).
- Efter operationen skal dyrene overvåges dagligt for bivirkninger. Humane endepunkter for eutanasi omfatter bivirkninger, kramper og koma.
3. Bronchoalveolær opsamling af skyllevæske (BALF)
- Aflive musene med en intraperitoneal dødelig dosis ketamin (300 mg / kg) og xylazin (30 mg / kg) (se materialetabel).
- Læg dyret i dorsal decubitusposition, lav et snit på ca. 1 cm med kirurgisk saks i dyrenes forreste region, udsæt luftrøret og lav et lille snit for at indføre et intravenøst kateter (20 G).
- Tilslut kateteret til en 1 ml steril sprøjte, injicer langsomt og gradvist 0,5 ml sterilt saltvand i lungerne, og aspirer derefter væsken fra BALF med den samme sprøjte. Gentag det 3-5 gange, og overfør det til et sterilt mikrorør, læg dem i is.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
4. Total og differentiel celleanalyse i BALF
- For totalt celletal fortyndes 20 μL BALF i 180 μL (10x fortynding) af Turks opløsning (se materialetabel). Udfør tællingen ved hjælp af et Neubauer-kammer under et optisk mikroskop med et 40x mål.
- Til differentialtælling anbringes 100 μL BALF i celletragten indeholdende dias og centrifugeres ved 22,86 x g i 5 minutter ved 4 °C i en cytocentrifuge og plettes med May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) (se materialetabel). Fortsæt med celletal i et lysmikroskop med nedsænkningsmål.
5. Bestemmelse af total protein i BALF
- Det samlede BALF-supernatantprotein bestemmes ved hjælp af et kommercielt proteinkvantificeringssæt, og absorbansen aflæses ved 562 nm ved hjælp af et spektrofotometer efter fabrikantens anvisninger (se materialetabellen).
6. Enzymimmunosorbentassays
- BALF centrifugeres ved 1.200 x g i 10 minutter ved 4 °C. Derefter opsamles supernatanten med en pipette og opbevares ved -80 °C til analyser af TNF-α, IL-1β, IL-6 og PGE215,23,25.
BEMÆRK: Centrifugeringen i trin 6.1 gør BALF-cellefri.- Udfør cytokinanalyserne på cellefri BALF ved hjælp af et kommercielt ELISA-sæt i henhold til producentens anvisninger. Udfør PGE2-analysen ved hjælp af et enzymimmunoassay (EIA) kit efter producentens anvisninger (se materialetabellen).
7. Lipid kropsfarvning og tælling
- Fastgør leukocytterne på cytospinglas ved hjælp af 3,7% formaldehyd i Ca 2+, Mg2+ fri Hanks bufferede saltopløsning (HBSS, pH 7,4) og plet med 1,5% OsO4, mens den stadig er fugtig3 (se materialetabel). Tæl derefter lipidlegemerne pr. celle i 50 på hinanden følgende leukocytter fra hvert dias ved hjælp af mikroskopets olienedsænkningsobjektivlinse.
8. Statistisk analyse
- Udfør statistisk analyse ved hjælp af graf- og statistiksoftware (se materialetabel). Udtryk resultaterne som middel ± SEM og analyser ved envejs Anova efterfulgt af en post-test Newman-Keuls-Student26. Overvej forskellene signifikante, når P < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en uskadet lunge forekommer alveolær væskeclearance ved transport af ioner gennem det intakte alveolære epitellag. Den osmotiske gradient bærer væske fra alveolerne ind i lungeinterstitium, hvor det drænes af lymfekar eller reabsorberes. Na/K-ATPase driver denne transport11. OA er en hæmmer af Na/K-ATPase27 og natriumkanal 21, hvilket kan bidrage til ødemdannelse, som vi allerede har foreslået23. Det forværrede inflammatoriske respons i ARDS fører til alveolær skade, øget endotel- og epitelpermeabilitet og akkumulering af alveolær væske rig på protein og inflammatoriske celler, hvilket forårsager ødem. Ødemet får lungerne til at øge vejrtrækningen på grund af akkumulering af interstitiel væske- og gasudvekslingsforringelse, hvilket resulterer i hypoxæmi og respirationssvigt28. Cytokiner såsom TNF-α og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) destabiliserer VE-cadherinbindinger, hvilket bidrager til øget endotelpermeabilitet og alveolær væskeakkumulering7.
OA-injektion øgede de samlede leukocytter i intratrakeale og intravenøse ruter (figur 3). Det var nødvendigt at inducere OA for lungeskade intravenøs vej snarere end intratrakeal. Det nuværende arbejde viste en stigning i neutrofiltal i BALF ved 6 timer, med toppen ved 24 timer og faldende ved 48 timer og 72 timer. En højere koncentration af IL-6, IL-1β og TNF-α i BALF blev observeret efter 24 timers OA intratrakeal instillation23 (figur 4). OA forhindrer ødemclearance og kan udløse dannelsen af ødem rig på protein ved både intravenøse og intratrakeale ruter 15,23. Lungeødemet blev vurderet ved total proteinanalyse i BALF, hvilket viste, at i.v. og i.t. administration øgede total proteinkoncentration (figur 5). Lipidlegemer er intracellulære organeller indeholdende substrat og enzymer til eicosanoidproduktion 8,29. Dannelsen af lipidlegemer forbedrer produktionen af lipidmediatorer, og det kan bruges til at få adgang til celleaktivering. Intratrakeal og intravenøs OA-injektion forbedrede dannelsen af lipidlegemer og PGE2-koncentration 23 efter 24 timer (figur 6). OA-injektion inducerede også vævsforstyrrelse, blødning og leukocytinfiltration i intratrakeale og intravenøse ruter, som vist i hæmatoxylin og eosin (H&E) farvningshistologi (figur 7). OA forårsager også ændring i lungefunktion19. Således præsenterer oliesyre-induceret lungeskade adskillige ARDS-funktioner.
Figur 1: De enkelte trin i den intratrakeale administrationsprotokol . (A) En mus bedøves med 5% isofluoran og 2 l / minO2. (B) Et trakealsnit med en kirurgisk saks hos mus i dorsal decubitusposition. (C) Intratrakeal instillation ved hjælp af en insulinsprøjte. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: De enkelte trin i den intravenøse administrationsprotokol . (A) En mus bedøves med 5% isofluoran og 2L / min O2. (B) Intravenøs injektion med en insulinsprøjte af medial canthus. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Administration af OA inducerer leukocytaktivering i BALF hos mus. Total leukocytter i intravenøs (i.v) og intratracheal administration (i.t) (A) og en illustrativ fotomikrografi (1000x forstørrelse) i intratrakeal administration (it) farvet med May-Grünwald-Giemsa (B) blev udført 24 timer efter OA-udfordringen. Skalabjælke = 10 μm. Det samme volumen sterilt saltvand blev administreret til kontrolgruppen. Hver søjle repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for mindst syv dyr. *P < 0,05 sammenlignet med kontroller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Intratrakeal administration (i.t) af OA inducerer produktionen af inflammatoriske mediatorer i musens lunge. TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) blev målt 24 timer efter udfordringen. Sterilt saltvand blev administreret til kontrolgruppen. Hver søjle repræsenterer gennemsnittet ± SEM for mindst seks dyr. *P < 0,05 sammenlignet med kontroller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Samlet proteinindhold i BALF 24 timer efter OA-injektion. Intratracheal (i.t.) og intravenøs (i.v.) administration af OA øger total protein i BALF hos mus. Kontrolgruppen modtog samme mængde sterilt saltvand. Resultaterne er middelværdier ± SEM fra mindst seks forskellige dyr. *P < 0,0001 sammenlignet med kontroller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Lipidkropsdannelse i leukocytter og PGE2-produktion i BALF hos OA-behandlede mus. Intratracheal (it) og intravenøs (i.v) administration af OA inducerer inflammatoriske mediatorer og lipidlegemer akkumulering i BALF hos mus (A) og (B), henholdsvis. (C) Illustrativ fotomikrografi af lipidlegemer (1000x forstørrelse) farvet i lungerne hos dyrene med osmiumtetroxid (OsO4) 24 timer efter OA-provokation. Pilene peger på lipidlegemerne. Skalabjælke = 10 μm. Kontrollerne modtog samme mængde saltvand. Resultaterne er middelværdier ± SEM fra syv dyr. *P < 0,05 sammenlignet med kontroller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Illustrativ lungehistologi hos mus . (A) Kontrolmus behandlet med saltvand og ingen tegn på blødning. (B) Intravenøs administration af OA (i.v). (C) Intratrakeal administration (i.t) med vævsændringer. H&E-farvning blev udført. Forstørrelse, 1000x. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Valg af den korrekte ARDS-model er afgørende for at udføre de prækliniske undersøgelser, og evaluatoren skal overveje alle mulige variabler, såsom alder, køn, administrationsmetoder og andre6. Den valgte model skal reproducere sygdommen baseret på risikofaktorer som sepsis, lipidemboli, iskæmi-reperfusion af lungevaskulaturen og andre kliniske risici14. Imidlertid kan ingen dyremodel, der anvendes til ARDS, genskabe alle det menneskelige syndroms egenskaber. Flere skadevoldende agentmodeller inkluderer LPS, OA, saltsyre, bakterier og vira6. Der anvendes også forskellige administrationsmetoder, mere almindeligt, intratrakeal, intranasal eller intravenøs. Den pulmonale iskæmi-reperfusionsmodel forårsager kapillærbrud og akkumulering af intra-alveolært protein6. LPS-induceret lungeskade anvendes i vid udstrækning og fører til akut skade på epitel- og endotelbarrierer. LPS binder sig til den tolllignende receptor 4 (TLR-4) i luftvejsepitelet, der udløser NF-κB-aktivering, hvilket øger produktionen af cytokiner og kemokiner og tiltrækker inflammatoriske celler30, hvilket fører til en robust neutrofil alveolitis6. Modellen viser imidlertid variationer mellem stammer og dyrearter, hvilket reducerer reproducerbarheden af resultaterne hos dyr for humane patienter med ARDS30.
HCI-skademodellen efterligner ARDS ved aspiration af surt indhold. Den lave pH i lungerne inducerer en akut inflammatorisk reaktion efterfulgt af en sen fibrotisk skade. Skaden er neutrofilafhængig, hvilket forårsager alveolær blødning, ødem og nedsat væskeclearance. Mennesker aspirerer dog ikke kun HCI, men et komplekst gastrisk indhold med en pH-værdi, der ofte er højere end 1,531. Disse og andre ARDS-modeller er blevet grundigt gennemgået andetsteds31. Blandt alle de anvendte modeller er den oliesyreinducerede ARDS-model den mest ideelle14.
Natriumoleatmodellen forårsager lungeskader, inducerer apoptose og nekrose af alveolære celler og forbedrer cytokinproduktionen såsom TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β og MIP-1α19. OA inducerer også proteaser og elastaseekspression med blødning, der forårsager alvorlig lungeskade25. OA reproducerer sygdommen på grund af lipidemboli, øget pulmonal vaskulær permeabilitet og ekstravaskulær væske med radiografiske infiltrater32. Også patienter med ARDS har højere plasmatisk OA-koncentration 15,22,24.
OA intratracheal administration inducerer inflammatoriske mediatorers produktion svarende til klinisk ARDS og reducerer lungekomplians og gasudveksling25,32. OA intravenøs injektion fremmer de histomorfologiske og fysiologiske aspekter af sygdommen32. Serumalbumin er en potent OA-ligand, som kan forklare, hvorfor denne vej kræver en højere OA (10 μmol)15 mængde end intratrakeal (1,25 μmol)23 for at fremkalde lungeskade. Faktisk viste vores gruppe en sammenhæng mellem OA / albumin ubalance og højere dødsrisiko hos patienter med leptospirose33.
Som med alle andre modeller er der nogle ulemper præsenteret i modellen. Når det ikke administreres i saltform, kan oliesyre forårsage toksiske virkninger og variationer på grund af blodemulgering. Som påvist i denne artikel reducerer brugen af saltformen de toksiske virkninger og undgår to problemer: embolidannelse og pH-udsving i blod og lunger. Det sikrer også, at lungeskaden er forårsaget af oleatet og ikke af en sekundær effekt15. Desuden kræver fremstillingen af oliesyre i saltform i denne model ikke konjugering med albumin. Undersøgelser viser albumins gavnlige virkninger ved at reducere inflammation og vaskulær permeabilitet. Desuden genopretter albumin hæmodynamisk og åndedræt hos lungeskadepatienter. Således kan konjugering af albumin med OA forringe dets indvirkning på dyret og reducere modellernes levedygtighed33,34.
På molekylært niveau hæmmer natriumoleat natrium-kalium-ATPase (NKA) og natriumkanal (eNac), hvilket forringer iontransport, øger vaskulær permeabilitet og ødemdannelse15. OA kan også binde til fri fedtsyrereceptor 1 (FFAR1), hvilket øger intracellulær Ca 2+ koncentration, hvilket udløser kinaser, der signalerer proteiner såsom PI3K og MAPK, hvilket fører til nuklear faktor kappa-lyskædeforstærker af aktiverede B-celler (NF-κB) aktivering og forbedring af det inflammatoriske respons25.
Sammenfattende, selvom ingen model fuldt ud kan reproducere ARDS-funktioner, er de værdifulde værktøjer til at studere sygdommen. Præklinisk forskning er afgørende for forståelsen af ARDS' patofysiologi og udviklingen af nye behandlinger. Den intratrakeale og intravenøse administration af OA i saltform genererer pålidelige og reproducerbare ARDS-modeller, hvilket gør det til en gylden model til at studere ARDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Figur 1 og Figur 2 oprettes med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
- Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E.
- The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
- Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
- D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
- Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
- Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
- Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
- Matthay, M. A., et al.
- Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
- Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
- Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
- Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
- Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
- Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
- Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
- Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
- Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
- Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
- McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
- Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
- Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
- Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
- Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
- Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
- Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
- Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
- Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).
