Summary
Mevcut protokol, akut solunum sıkıntısı sendromunu (ARDS) taklit etmek için oleik asit kullanan farelerde bir akciğer hasarı modelini açıklamaktadır. Bu model ödem üzerindeki inflamatuar mediyatörleri arttırır ve akciğer kompliyansını azaltır. Oleik asit, tuz formunda (oleat) kullanılır, çünkü bu fizyolojik form emboli riskini ortadan kaldırır.
Abstract
Akut respiratuar distres sendromu (ARDS), yüksek ölüm oranı ile kritik hastalar için önemli bir tehdittir. Kirletici maruziyeti, sigara dumanı, bulaşıcı ajanlar ve yağ asitleri ARDS'yi indükleyebilir. Hayvan modelleri, ARDS'nin karmaşık patomekanizmasını taklit edebilir. Ancak, her birinin sınırlamaları vardır. Özellikle, oleik asit (OA), akciğer üzerinde zararlı etkileri olan kritik hastalarda artar. OA, emboli ile akciğer hasarına neden olabilir, dokuyu bozabilir, pH'ı değiştirebilir ve ödem klirensini bozabilir. OA'ya bağlı akciğer hasarı modeli, endotel hasarı, artmış alveoler geçirgenlik, inflamasyon, membran hiyalin oluşumu ve hücre ölümü ile ARDS'nin çeşitli özelliklerine benzemektedir. Burada, akciğer hasarının indüksiyonu, OA'nın (tuz formunda) doğrudan akciğere enjekte edilmesiyle ve pH 7'de OA'nın fizyolojik formu olduğu için bir farede intravenöz olarak tanımlanmaktadır. Bu nedenle, OA'nın tuz formunda enjeksiyonu, emboliye neden olmadan veya pH'ı değiştirmeden akciğer hasarını / ARDS'yi incelemek ve böylece kritik hastalarda olanlara yaklaşmak için yararlı bir hayvan modelidir.
Introduction
Ashbaugh ve ark.1, 1967'de ilk olarak akut solunum sıkıntısı sendromunu (ARDS) tanımladılar ve o zamandan beri birçok revizyondan geçtiler. Berlin tanımına göre ARDS, ventilasyon-perfüzyon oranındaki dengesizlik, diffüz bilateral alveoler hasar (DAD) ve infiltrasyon, artmış akciğer ağırlığı veödem 2,3 nedeniyle akut solunum yetmezliği ve hipoksemiye (PaO 2/FiO2 > 300 mm Hg) yol açan bir akciğer inflamasyonudur. Pulmoner parankim, epitelyal, endotel ve diğer hücreler tarafından birleştirilen karmaşık bir hücresel ortamdır. Bu hücreler, alveollerde gaz değişimi ve homeostazdan sorumlu bariyerler ve yapılar oluşturur3. Epitel bariyeri içinde en bol bulunan hücreler, Na/K-ATPaz yoluyla gaz değişimi ve sıvı yönetimi için daha geniş bir yüzey alanına sahip alveolar tip I hücrelerdir (AT1). Ayrıca, alveolar tip II hücreler (AT2), alveoller4'teki yüzey gerilimini azaltarak yüzey aktif madde üretir. Altında, endotel hücreleri, pulmoner dolaşımı interstisyumdan ayıran yarı geçirgen bir bariyer oluşturur. İşlevleri arasında uyaranları tespit etmek, inflamatuar yanıtları koordine etmek ve hücresel transmigrasyonyer alır 5. Endotel hücreleri ayrıca gaz değişimini, vasküler tonusu ve pıhtılaşmayıdüzenler 5. Bu nedenle, endotelyal ve epitelyal fonksiyon bozuklukları proinflamatuar bir fenotipi şiddetlendirerek ARDS5'e yol açan akciğer hasarına neden olabilir.
ARDS gelişimi, bakteriyel ve viral pnömoni veya pulmoner olmayan sepsis, travma, kan transfüzyonu ve pankreatit gibi dolaylı faktörlerle ilişkili risklidir6. Bu koşullar, TNF-α, IL-1β, IL-6 ve IL-85 gibi proinflamatuar sitokinleri ve kemokinleri indükleyen patojenlerle ilişkili moleküler modellerin (PAMP'ler) ve hasarla ilişkili moleküler modellerin (DAMP'ler) salınmasına neden olur. TNF-α, endotel bariyeri bozulması ve akciğer parankimine lökosit infiltrasyonunda vasküler-endotelyal kaderin (VE-kaderin) bozulması ile bağlantılıdır. Nötrofiller, IL-8 ve LTB4 5,7,8 tarafından çekilen göç eden ilk hücrelerdir. Nötrofiller ayrıca proinflamatuar sitokinleri, reaktif oksijen türlerini (ROS)9 ve nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşumunu artırarak ekstra endotel ve epitelyal hasara neden olur10. Epitel hasarı, AT2 hücrelerinde ve yerleşik makrofajlarda Toll benzeri reseptörlerin iltihaplanmasına ve aktivasyonuna yol açarak, enflamatuar hücreleri akciğerlere çeken kemokinlerin salınmasına neden olur4. Ayrıca, interferon-β (INFβ) gibi sitokinlerin üretimi, TNF ile ilişkili apoptozu indükleyen reseptörlere (TRAIL) neden olarak ATII hücrelerini apoptoza götürür, sıvı ve iyon berraklığını bozar4. Endotel ve epitelyal bariyer yapısının bozulması, sıvının, proteinlerin, kırmızı kan hücrelerinin ve lökositlerin alveoler boşluğa akmasına izin vererek ödeme neden olur. Ödem oluştuğunda, solunum ve gaz değişimini sürdürmek için pulmoner çaba değişir11. Hiperkapni ve hipoksemi, hücre ölümüne ve sodyum taşıma bozukluğuna neden olarak, zayıf temizleme kapasitesi nedeniyle alveolar ödemi şiddetlendirir10. ARDS ayrıca organ disfonksiyonu, artmış alveoler nötrofil yüzdesi ve alveolar geçirgenlik9 ile ilişkili yüksek IL-17A seviyelerine sahiptir.
Son yıllarda ARDS'nin patofizyolojisi, epidemiyolojisi ve tedavisi ile ilgili araştırmalarda ilerlemeler olmuştur12,13. Bununla birlikte, ARDS, mekanik ventilasyon ve sıvı tedavisi optimizasyonu ile sonuçlanan terapötik araştırmalardaki ilerlemeye rağmen heterojen bir sendromdur. Bu nedenle, daha etkili bir doğrudan farmakolojik tedaviye hala ihtiyaç vardır10 ve hayvan çalışmaları, ARDS mekanizmalarının ve müdahale hedeflerinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir.
Mevcut ARDS modelleri patolojiyi tam olarak kopyalayamamaktadır. Bu nedenle, araştırmacılar genellikle ilgi alanlarına daha uygun modeli seçerler. Örneğin, lipopolisakkarit (LPS) indüksiyon modeli, esas olarak TLR414 tarafından tetiklenen endotoksik şokla ARDS'yi indükler. HCl indüksiyonu asit aspirasyonunu taklit eder ve hasar nötrofilik bağımlıdır14. Öte yandan, mevcut sodyum oleat modeli, vasküler geçirgenliği ve ödemi artıran endotel hasarına neden olur. Ayrıca, sıvı formda oleik asit yerine sodyum oleat kullanılması, emboli risklerini ve kan pH'ındaki değişiklikleriönler 15.
ARDS için hayvan modelleri
Hayvan modellerinde yapılan klinik öncesi çalışmalar, patolojinin anlaşılmasına yardımcı olur ve yeni ARDS tedavileri araştırmaları için gereklidir. İdeal hayvan modeli, klinik duruma benzeyen özelliklere ve her hastalık evresinin, evriminin ve onarımının ilgili patofizyolojik özellikleri ile hastalık mekanizmalarının iyi tekrarlanabilirliğine sahip olmalıdır14. ARDS'de akut akciğer hasarını klinik öncesi değerlendirmek için çeşitli hayvan modelleri kullanılmaktadır. Bununla birlikte, tüm modellerin sınırlamaları olduğundan, insan patolojisini tam olarak yeniden üretmezler 6,14,16. Oleik asit kaynaklı ARDS, farklı hayvan türlerindekullanılır 17. OA enjeksiyonuna tabi tutulan domuzlar18, koyunlar19 veköpekler 20, alveolar-kapiller membran disfonksiyonu ve protein ve hücre infiltrasyonu ile artmış geçirgenlik ile hastalığın çok sayıda klinik özelliğini gösterir.
Örneğin, 1.25 μM'de OA, intravenöz olarak enjekte edilen transepitelyal taşımayı bloke ederek alveolar ödem15'e yol açtı. Alternatif olarak, A549 hücreleri kullanan in vitro modelde, 10 μM konsantrasyondaki OA, epitelyal sodyum kanalını (eNAC) veya Na/K-ATPaz ekspresyonunu değiştirmedi. Bununla birlikte, OA her iki kanalla da ilişkili görünmektedir ve aktivitelerini doğrudan inhibe etmektedir21. 0.1 mL/kg'da OA intravenöz enjeksiyon, akciğer dokusu tıkanıklığına ve şişliğine, kalınlaşmış alveolar septa ile alveolar boşlukların azalmasına ve inflamatuar ve kırmızı kan hücresi sayımının artmasına neden oldu22. Ayrıca, OA, akciğerdeki endotel ve epitel hücrelerinde apoptoz ve nekroza neden oldu15. Farelerde intratrakeal olarak bir tris-oleat çözeltisinin enjeksiyonu, stimülasyondan 6 saat sonra nötrofil infiltrasyonunu ve ödemi arttırdı23. 24 saatte OA enjeksiyonu proinflamatuar sitokin düzeylerini arttırdı (ör., TNF-α, IL-6 ve IL-1β)23. Ek olarak, 10 μM'lik bir tris-oleatın intravenöz (orbital pleksus) enjeksiyonu, seçici bir enzim inhibitörü olan 10-3 μM'de ouabain'e benzer şekilde pulmoner Na / K-ATPaz aktivitesini inhibe eder. Ayrıca, OA, hücre infiltrasyonu, lipid cisimciklerinin oluşumu ve lökotrien B4 (LTB4) ve prostaglandin E2 (PGE2) üretimi ile inflamasyonu indükler22,24. Bu nedenle, oleik asit kaynaklı ARDS ödem, kanama, nötrofil infiltrasyonu, artmış miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi ve ROS24 üretir. Bu nedenle, OA uygulaması akciğer hasarı için iyi bilinen bir modeldir22,25. OA'ya sahip bu makalede sunulan tüm sonuçlar, tuz formu olan sodyum oleatı temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan prosedürler, Oswaldo Cruz Vakfı Hayvanların Kullanımına İlişkin Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (CEUA lisansları n°002-08, 36/10 ve 054/2015). Deneyler için Oswaldo Cruz Vakfı'nın (FIOCRUZ) Biyomodellerde Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (ICTB) tarafından sağlanan 20-30 g ağırlığındaki erkek İsviçre Webster fareleri kullanıldı. Hayvanlar, Pavilhão Ozório de Almeida'nın vivaryumunda havalandırmalı izolatörlerde tutuldu ve su ve yiyecek ad libitum olarak mevcuttu. 12 saat / 12 saat aydınlık ve karanlık döngüsüne maruz bırakıldılar.
1. Sodyum oleat çözeltisinin hazırlanması
- Herhangi bir steril tüp veya cam şişede 100 mmol / L sodyum oleat stok çözeltisi hazırlamak için oleik asit kullanın.
NOT: Bu çalışma için 50 mL'lik (son hacim) bir çözelti hazırlandı, ancak hacim deneysel ihtiyaca göre ayarlanmalıdır. Çözelti her zaman steril tüplerde veya cam kaplarda hazırlanmalıdır.- İlk olarak, pH'ı yükseltmek için ultra saf suya NaOH tabletleri veya çözeltisi ekleyin. 25 mL'lik bir hacim için 12-13'lük bir pH değeri önerilir.
NOT: Alternatif olarak, Tris-oleate çözeltisini hazırlamak için Tris bazı kullanılabilir. - Oleik asidi (Malzeme Tablosuna bakınız) çok yavaş, 37 ° C'de ultrasonik bir banyoda sürekli çalkalama altında damla damla ekleyin.
NOT: Oleik asit çökelmesi meydana gelirse, baştan başlayın. - Oleik asit tamamen çözüldüğünde, pH'ı dikkatlice 7.4'e ayarlayın, ultra saf seyreltilmiş HCl ile karıştırarak damla damla ayarlayın ve ardından 50 mL'lik son hacme ayarlayın.
NOT: Çalışma oleat çözeltilerini taze olarak hazırlayın. Alternatif olarak, çözelti bir aydan daha uzun süre oksidasyonu önlemek için nitrojenle zenginleştirilmiş bir ortamda -20 ° C'de tutulabilir, stoklanabilir ve muhafaza edilebilir. Dondurulmuş-yeniden dondurulmuş döngülerden kaçının.
- İlk olarak, pH'ı yükseltmek için ultra saf suya NaOH tabletleri veya çözeltisi ekleyin. 25 mL'lik bir hacim için 12-13'lük bir pH değeri önerilir.
2. Oleik asit ile akciğer hasarının indüksiyonu
- Oleik asidin intratrakeal uygulamasını gerçekleştirin.
- Bir veteriner anestezik buharlaştırıcı kullanarak fareleri 2 L / dakO2 ile% 5 izofluran kullanarak uyuşturun (Şekil 1A). Kesi bölgesindeki tüyleri tüy dökücü kremle çıkarın ve steril gazlı bez kullanarak bölgeyi üç alternatif betadin ovma ve alkol ile dezenfekte edin. Anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak onaylayın.
NOT: İşlem sırasında steril eldiven ve aletler kullanın. Hayvanı örtmek ve sadece kesi bölgesini ortaya çıkarmak için bir örtü kullanın. İzofloranın çevreye kaçmasını önlemek için deneyi biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirin. Analjezikler, inflamatuar yanıtı inhibe edebilecekleri için uygulanmaz. - Anesteziden sonra hayvanı dorsal dekübit pozisyonuna getirin ve tiroid seviyesinde V şeklinde bir kesi (0.5-1 cm) yapın. Trakeayı ortaya çıkarmak için tiroidi hafifçe değiştirin (Şekil 1B) ve hazırlanan oleat çözeltisinden 50 μL enjekte edin (adım 1).
NOT: Fareler, her grupta sekiz hayvan olacak şekilde iki gruba ayrıldı. Akciğer hasarı grubu 25 mM'de (1.25 μmol) sodyum-oleat çözeltisi alır ve kontrol grubu, her farenin trakeasına bir insülin şırıngası (hacim 300 μL, 30 G) ile damlatılarak 50 μL steril salin alır (Şekil 1C). - Farelerin kesi bölgesini sentetik, emilmeyen monofilament bir sütür ile dikin, kafeslerine geri koyun ve ameliyattan tamamen iyileşene kadar izleyin. Tüm prosedürler sırasında hayvanları 37 °C'de bir ısıtma yastığı üzerinde tutun.
NOT: Farelerin ameliyattan sonra iyileşmesi genellikle 15 dakika kadar sürer.
- Bir veteriner anestezik buharlaştırıcı kullanarak fareleri 2 L / dakO2 ile% 5 izofluran kullanarak uyuşturun (Şekil 1A). Kesi bölgesindeki tüyleri tüy dökücü kremle çıkarın ve steril gazlı bez kullanarak bölgeyi üç alternatif betadin ovma ve alkol ile dezenfekte edin. Anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak onaylayın.
- İntravenöz oleik asit uygulaması yapın.
- Anesteziden sonra (adım 2.1.1, Şekil 2A), ultra ince iğneyi (bkz. Malzeme Tablosu) göz yuvasının medial kantusuna sokarak orbital pleksusa intravenöz olarak enjekte edin (Şekil 2B).
NOT: Fareler, her grupta sekiz hayvan olacak şekilde iki gruba ayrıldı. Her grup, hayvan başına 10 μmol OA'da 100 μL sodyum-oleat çözeltisi alırken, kontrol grubu 100 μL steril salin alır.
- Anesteziden sonra (adım 2.1.1, Şekil 2A), ultra ince iğneyi (bkz. Malzeme Tablosu) göz yuvasının medial kantusuna sokarak orbital pleksusa intravenöz olarak enjekte edin (Şekil 2B).
- Ameliyattan sonra, olumsuz reaksiyonlar için hayvanları günlük olarak izleyin. Ötenazi için insancıl son noktalar arasında advers reaksiyonlar, konvülsiyonlar ve koma bulunur.
3. Bronkoalveoler lavaj sıvısı toplanması (BALF)
- Fareleri intraperitoneal öldürücü dozda ketamin (300 mg / Kg) ve ksilazin (30 mg / Kg) ile ötenazi yapın (bkz.
- Hayvanı dorsal dekübit pozisyonuna yatırın, hayvanların ön bölgesinde cerrahi makasla yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın, trakeayı ortaya çıkarın ve intravenöz kateter (20 G) yerleştirmek için küçük bir kesi yapın.
- Kateteri 1 mL'lik steril bir şırıngaya bağlayın, akciğerlere yavaşça ve kademeli olarak 0.5 mL steril salin enjekte edin ve ardından sıvıyı aynı şırınga ile BALV'den aspire edin. 3-5 kez tekrarlayın ve steril bir mikrotüpe aktarın ve buza yerleştirin.
NOT: Numuneler -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
4. BALBS'de toplam ve diferansiyel hücre analizi
- Toplam hücre sayımı için, 20 μL BALB'yi 180 μL (10x seyreltme) Turk çözeltisinde seyreltin (bkz. Sayımı, 40x objektifli optik mikroskop altında bir Neubauer odası kullanarak gerçekleştirin.
- Diferansiyel sayım için, slaytlar içeren hücresel huniye 100 μL BALF koyun ve bir sitosantrifüjde 4 ° C'de 5 dakika boyunca 22.86 x g'da santrifüjleyin ve May-Grunwald (% 15, pH 7.2) -Giemsa (1:10) ile boyayın (bkz. Daldırma objektifli bir ışık mikroskobunda hücre sayımına devam edin.
5. BALBS'de toplam protein tayini
- Ticari bir protein niceleme kiti ile toplam BALF süpernatan proteinini belirleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek bir spektrofotometre kullanarak 562 nm'de absorbansı okuyun (bkz.
6. Enzim immünosorbent testleri
- BALM'ı 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı bir pipetle toplayın ve TNF-α, IL-1β, IL-6 ve PGE2 15,23,25 testleri için -80 °C'de saklayın.
NOT: Adım 6.1'deki santrifüjleme, BALIF'ı hücresiz hale getirir.- Sitokin tahlillerini, üreticinin talimatlarına göre ticari bir ELISA kiti kullanarak hücresiz BALF üzerinde gerçekleştirin. PGE2 tahlilini, üreticinin talimatlarını izleyerek bir enzim immünoassay (EIA) kiti kullanarak gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
7. Lipid vücut boyama ve sayım
- Lökositleri Ca 2 +, Mg2 + serbest Hank tamponlu tuz çözeltisinde (HBSS, pH 7.4) %3.7 formaldehit kullanarak sitospin slaytlarına sabitleyin ve hala nemliyken %1.5 OsO4 ile boyayın3 (bkz. Ardından, mikroskobun yağa daldırma objektif lensini kullanarak her slayttan 50 ardışık lökositte hücre başına lipid gövdelerini sayın.
8. İstatistiksel analiz
- Grafik ve istatistik yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın (bkz. Sonuçları ortalama ± SEM olarak ifade edin ve tek yönlü Anova ve ardından son test Newman-Keuls-Student26 ile analiz edin. P < 0.05 olduğunda farkları önemli olarak düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yaralanmamış bir akciğerde, alveolar sıvı klirensi, iyonların sağlam alveolar epitel tabakasından taşınması ile meydana gelir. Ozmotik gradyan, sıvıyı alveollerden pulmoner interstisyuma taşır, burada lenfatik damarlar tarafından boşaltılır veya yeniden emilir. Na/K-ATPase bu taşımayıçalıştırır 11. OA, daha önce önerdiğimiz gibi ödem oluşumuna katkıda bulunabilecek bir Na/K-ATPaz27 ve sodyum kanalı 21 inhibitörüdür23. ARDS'de şiddetlenen inflamatuar yanıt, alveoler hasara, endotel ve epitelyal geçirgenliğin artmasına, protein ve inflamatuar hücrelerden zengin alveol sıvısının birikmesine yol açarak ödem oluşturur. Ödem, interstisyel sıvı birikimi ve gaz değişim bozukluğu nedeniyle akciğerlerin solunum hızını artırmasına neden olarak hipoksemi ve solunum yetmezliğine neden olur28. TNF-α ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) gibi sitokinler, VE-kaderin bağlarını destabilize ederek endotel geçirgenliğinin artmasına ve alveolar sıvı birikimine katkıda bulunur7.
OA enjeksiyonu intratrakeal ve intravenöz yollarda total lökositleri arttırdı (Şekil 3). Akciğer hasarı için intratrakeal yoldan ziyade intravenöz yolla OA'nın indüklenmesi gerekliydi. Bu çalışma, BALV'deki nötrofil sayılarında 6 saatte bir artış, 24 saatte zirve ve 48 saat ve 72 saatte azaldığını gösterdi. 24 saat OA intratrakeal damlatmadan sonra BALV'de daha yüksek bir IL-6, IL-1β ve TNF-α konsantrasyonu gözlenmiştir23 (Şekil 4). OA ödem klirensini önler ve hem intravenöz hem de intratrakeal yollarla proteinden zengin ödem oluşumunu tetikleyebilir15,23. Akciğer ödemi, BALF'de total protein testi ile değerlendirildi ve i.v. ve i.t. uygulamasının toplam protein konsantrasyonunu arttırdığını gösterdi (Şekil 5). Lipid cisimleri, eikosanoidlerin üretiminesubstrat ve enzimler içeren hücre içi organellerdir 8,29. Lipid cisimciklerinin oluşumu, lipid aracılarının üretimini arttırır ve hücre aktivasyonuna erişmek için kullanılabilir. İntratrakeal ve intravenöz OA enjeksiyonu, 24 saat sonra lipid cisimcikleri oluşumunu ve PGE2 konsantrasyonunu23 arttırdı (Şekil 6). OA enjeksiyonu ayrıca hematoksilen ve eozin (H&E) boyama histolojisinde gösterildiği gibi intratrakeal ve intravenöz yollarda doku bozulması, kanama ve lökosit infiltrasyonunu indükledi (Şekil 7). Ayrıca, OA akciğer fonksiyonunda değişikliğe neden olur19. Bu nedenle, oleik asit kaynaklı akciğer hasarı çok sayıda ARDS özelliği sunar.
Şekil 1: İntratrakeal uygulama protokolündeki bireysel adımlar . (A) Bir fare% 5 izofloran ve 2 L / dakO2 kullanılarak uyuşturulur. (B) Dorsal dekübit pozisyonundaki farelerde cerrahi makaslı trakeal kesi. (C) İnsülin şırıngası kullanılarak intratrakeal damlatma. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İntravenöz uygulama protokolündeki bireysel adımlar . (A) Bir fare% 5 izofloran ve 2L / dak O2 ile uyuşturulur. (B) Medial kantus tarafından bir insülin şırıngası kullanılarak intravenöz enjeksiyon. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OA uygulaması, farelerin BALF'sinde lökosit aktivasyonunu indükler. İntravenöz (i.v) ve intratrakeal uygulamada (i.t) (A) total lökositler ve intratrakeal uygulamada (i.t.) May-Grünwald-Giemsa (B) ile boyanmış açıklayıcı bir fotomikrograf (1000x büyütme) OA challenge'ından 24 saat sonra yapıldı. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kontrol grubuna aynı hacimde steril salin uygulandı. Her çubuk, en az yedi hayvanın ortalama ± SEM'ini temsil eder. *P < 0,05, kontrollerle karşılaştırıldığında. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: OA'nın intratrakeal uygulaması (i.t), farelerin akciğerinde inflamatuar mediatörlerin üretimini indükler. TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) meydan okumadan 24 saat sonra ölçüldü. Kontrol grubuna steril salin uygulandı. Her çubuk, en az altı hayvan için ortalama ± SEM'i temsil eder. *P < 0,05, kontrollerle karşılaştırıldığında. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: OA enjeksiyonundan 24 saat sonra BALB'deki toplam protein içeriği. OA'nın intratrakeal (i.t.) ve intravenöz (i.v.) uygulaması, farelerin BALF'sindeki toplam proteini arttırır. Kontrol grubuna aynı hacimde steril salin verildi. Sonuçlar, en az altı farklı hayvandan ± SEM anlamına gelir. *P < 0,0001, kontrollerle karşılaştırıldığında. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Lökositlerde lipid cisimciği oluşumu ve OA ile tedavi edilen farelerin BALV'sinde PGE2 üretimi. OA'nın intratrakeal (i.t) ve intravenöz (i.v) uygulaması, sırasıyla farelerin (A) ve (B) BALV'sinde inflamatuar mediatörleri ve lipid cisimcikleri birikimini indükler. (C) OA mücadelesinden 24 saat sonra hayvanların akciğerlerinde osmiyum tetroksit (OsO4) ile boyanmış lipid cisimlerinin (1000x büyütme) açıklayıcı fotomikrografı. Oklar lipit cisimciklerini gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kontroller aynı hacimde salin aldı. Sonuçlar, yedi hayvandan ± SEM anlamına gelir. *P < 0,05, kontrollerle karşılaştırıldığında. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Farelerde açıklayıcı pulmoner histoloji . (A) Tuzlu su ile tedavi edilen ve kanama belirtisi olmayan kontrol fareleri. (B) İntravenöz OA uygulaması (i.v). (C) Doku değişiklikleri ile intratrakeal uygulama (i.t). H&E boyaması yapıldı. Büyütme, 1000x. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klinik öncesi çalışmaları yürütmek için doğru ARDS modelinin seçilmesi esastır ve değerlendirici yaş, cinsiyet, uygulama yöntemleri ve diğerleri gibi tüm olası değişkenleri göz önünde bulundurmalıdır6. Seçilen model, sepsis, lipid embolisi, pulmoner vaskülatür iskemi-reperfüzyonu ve diğer klinik riskler gibi risk faktörlerine dayalı olarak hastalığı yeniden üretmelidir14. Bununla birlikte, ARDS için kullanılan hiçbir hayvan modeli, insan sendromunun tüm özelliklerini yeniden yaratamaz. Çoklu yaralayıcı ajan modelleri arasında LPS, OA, hidroklorik asit, bakteri ve virüslerbulunur 6. Ayrıca, daha yaygın olarak intratrakeal, intranazal veya intravenöz olmak üzere farklı uygulama yöntemleri kullanılır. Pulmoner iskemi-reperfüzyon modeli, kapiller rüptüre ve intra-alveoler proteinbirikimine neden olur 6. LPS'nin neden olduğu akciğer hasarı yaygın olarak kullanılmaktadır ve epitelyal ve endotelyal bariyerlerin akut yaralanmasına yol açar. LPS, hava yolu epitelinde Toll benzeri reseptör 4'e (TLR-4) bağlanır ve NF-κB aktivasyonunu tetikleyerek sitokinlerin ve kemokinlerin üretimini arttırır, enflamatuar hücreleri30 çeker ve bu da sağlam bir nötrofilik alveoliteyol açar 6. Bununla birlikte, model, suşlar ve hayvan türleri arasında farklılıklar göstermekte ve ARDS30'lu insan hastalar için sonuçların hayvanlarda tekrarlanabilirliğini azaltmaktadır.
HCl-yaralanma modeli, asidik içerik aspirasyonu ile ARDS'yi taklit eder. Akciğerlerdeki düşük pH, akut inflamatuar yanıtı ve ardından geç fibrotik hasarı indükler. Hasar nötrofil bağımlıdır ve alveolar kanamaya, ödem ve sıvı klirensinin bozulmasına neden olur. Bununla birlikte, insanlar sadece HCl'yi değil, pH'ı genellikle 1.531'den yüksek olan karmaşık bir mide içeriğini de aspire eder. Bu ve diğer ARDS modelleri başka yerlerde kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir31. Kullanılan tüm modeller arasında oleik asit kaynaklı ARDS modeli en idealolanıdır 14.
Sodyum oleat modeli akciğer hasarına neden olur, alveolar hücrelerin apoptozunu ve nekrozunu indükler ve TNFa, IL-8, IL-6, IL-1β ve MIP-1α19 gibi sitokinlerin üretimini arttırır. OA ayrıca ciddi akciğer hasarına neden olan kanama ile proteazları ve elastaz ekspresyonunu indükler25. OA, lipid embolisi, artmış pulmoner vasküler geçirgenlik ve radyografik infiltratlarla ekstravasküler sıvı nedeniyle hastalığı çoğaltır32. Ayrıca, ARDS'li hastalarda plazmatik OA konsantrasyonu daha yüksektir 15,22,24.
OA intratrakeal uygulama, klinik ARDS'ye benzer şekilde inflamatuar mediatörlerin üretimini indükler ve akciğer kompliyansını ve gaz değişimini azaltır25,32. OA intravenöz enjeksiyon, hastalığın histomorfolojik ve fizyolojik yönlerini destekler32. Serum albümini, akciğer hasarını indüklemek için bu yolun neden intratrakeal (1.25 μmol)23'ten daha yüksek bir OA (10 μmol)15 miktarı gerektirdiğini açıklayabilen güçlü bir OA ligandıdır. Gerçekten de, grubumuz leptospirozlu hastalarda OA/albümin dengesizliği ile daha yüksek ölüm riski arasında bir korelasyon gösterdi33.
Diğer tüm modellerde olduğu gibi, modelde sunulan bazı dezavantajlar vardır. Oleik asit, tuz formunda uygulanmadığında, kan emülsifikasyonuna bağlı toksik etkilere ve varyasyonlara neden olabilir. Bu makalede gösterildiği gibi, tuz formunun kullanılması toksik etkileri azaltır ve iki sorunu önler: kanda ve akciğerlerde emboli oluşumu ve pH dalgalanması. Ayrıca, pulmoner hasarın ikincil bir etkiden değil, oleattan kaynaklanmasını sağlar15. Ek olarak, bu modelde oleik asidin tuz formunda hazırlanması, albümin ile konjugasyon gerektirmez. Araştırmalar, albüminin inflamasyonu ve vasküler geçirgenliği azaltmadaki yararlı etkilerini göstermektedir. Ayrıca, albümin akciğer hasarı hastalarında hemodinamik ve solunumu geri kazandırır. Bu nedenle, albüminin OA ile konjuge edilmesi, hayvan üzerindeki etkisini bozabilir ve modellerin canlılığını azaltabilir33,34.
Moleküler düzeyde, sodyum oleat, iyonların taşınmasını bozan, vasküler geçirgenliği ve ödem oluşumunu artıran sodyum-potasyum ATPaz (NKA) ve sodyum kanalını (eNac) inhibe eder15. Ayrıca, OA, serbest yağ asidi reseptörü 1'e (FFAR1) bağlanabilir, hücre içiCa2+ konsantrasyonunu artırabilir, bu da PI3K ve MAPK gibi kinazları tetikleyerek aktive edilmiş B hücrelerinin nükleer faktör kappa-hafif zincir arttırıcısına yol açar (NF-κB) aktivasyonu ve inflamatuar yanıtı arttırır25.
Özetle, hiçbir model ARDS özelliklerini tam olarak üretemese de, hastalığı incelemek için değerli araçlardır. Klinik öncesi araştırmalar, ARDS'nin patofizyolojisinin anlaşılmasında ve yeni tedavilerin geliştirilmesinde çok önemlidir. OA'nın intratrakeal ve intravenöz uygulaması, tuz formunda, güvenilir ve tekrarlanabilir ARDS modelleri oluşturur ve bu da onu ARDS'yi incelemek için altın bir model haline getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu araştırma Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Şekil 1 ve Şekil 2 BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
- Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E.
- The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
- Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
- D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
- Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
- Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
- Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
- Matthay, M. A., et al.
- Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
- Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
- Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
- Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
- Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
- Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
- Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
- Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
- Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
- Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
- McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
- Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
- Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
- Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
- Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
- Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
- Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
- Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
- Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).
