Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudig te gebruiken methode om substraatoxidatie te onderzoeken door 14CO2-productie in vitro te volgen.
Abstract
Mitochondriën herbergen de machines voor de tricarbonzuur (TCA) cyclus en elektronentransportketen (ETC), die adenosinetrifosfaat (ATP) genereren om de energiehomeostase te behouden. Glucose, vetzuren en aminozuren zijn de belangrijkste energiesubstraten die mitochondriale ademhaling in de meeste somatische cellen voeden. Er zijn aanwijzingen dat verschillende celtypen een duidelijke voorkeur kunnen hebben voor bepaalde substraten. Substraatgebruik door verschillende cellen in het skelet is echter niet in detail bestudeerd. Bovendien, aangezien het cellulaire metabolisme is afgestemd op fysiologische en pathofysiologische veranderingen, kunnen directe beoordelingen van substraatafhankelijkheid in skeletcellen belangrijke inzichten verschaffen in de pathogenese van botziekten.
Het volgende protocol is gebaseerd op het principe van kooldioxide-afgifte uit substraatmoleculen na oxidatieve fosforylering. Door substraten te gebruiken die radioactief gelabelde koolstofatomen (14C) bevatten, biedt de methode een gevoelige en eenvoudig te gebruiken test voor de snelheid van substraatoxidatie in celkweek. Een casestudy met primaire calvariale preosteoblasten versus beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) toont een verschillend gebruik van de belangrijkste substraten tussen de twee celtypen.
Introduction
Oxidatieve fosforylering (OXPHOS) in eukaryoten is het proces waarbij voedingsstoffen worden afgebroken in mitochondriën om chemische energie vrij te maken in de vorm van ATP door zuurstofverbruik. Katabolisme van verschillende substraten in mitochondriën via de tricarbonzuur (TCA) cyclus genereert weinig ATP-moleculen direct, maar slaat eerder energie op door reductie van de elektronendragers nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) en flavine adenine dinucleotide (FAD +). De gereduceerde dragers worden vervolgens geoxideerd door ETC op het binnenmembraan van mitochondriën om een protonconcentratiegradiënt over het membraan te genereren. De protonen stromen uiteindelijk hun gradiënt terug naar de mitochondriale matrix via ATP-synthase om ATP te produceren. OXPHOS is de meest efficiënte manier van ATP-productie uit energiesubstraten en heeft over het algemeen de voorkeur in aerobe omgevingen. Eerder werd gedacht dat aerobe glycolyse - productie van lactaat uit glucose terwijl zuurstof aanwezig is - pathofysiologisch was, vaak een kenmerk van kankercellen. Meer en meer wordt ontdekt dat sommige normale celtypen aerobe glycolyse gebruiken om redenen die nog niet volledig zijn ontcijferd.
Metabole flexibiliteit is het vermogen van cellen of organismen om zich aan te passen aan veranderende energiebehoeften en beschikbare brandstofbronnen. Aan de energetische vraag naar skeletspieren wordt bijvoorbeeld voornamelijk voldaan door OXPHOS in steady state, maar door anaerobe glycolyse tijdens intensieve training1. Naarmate de inspanningsduur toeneemt, dragen glucose- en vetzuuroxidatie meer bij aan de algehele energieproductie2. Substraatgebruik is echter niet alleen afhankelijk van beschikbaarheid, omdat substraten antagonistisch concurreren tijdens oxidatie. Met name is aangetoond dat vetzuuroxidatie het glucosegebruik door skeletspieren remt in een fenomeen dat bekend staat als het Randle-effect3. Een wederkerig effect werd aangetoond door latere studies 4,5. Bovendien worden veel ziekten geassocieerd met een verandering in substraatvoorkeur en de ontwikkeling van metabole inflexibiliteit in cellen. Vetzuuroxidatie is bijvoorbeeld verminderd in de skeletspieren van type II diabetespatiënten in vergelijking met normale controlepersonen6. De metabole veranderingen in ziekte-instellingen zijn een onderwerp van intensief onderzoek omdat ze kunnen bijdragen aan de pathogenese.
Het energiemetabolisme in skeletceltypen is relatief onderbelicht, maar heeft de laatste jaren aandacht gekregen7. Eerder werk heeft aangetoond dat aerobe glycolyse de dominante energieroute is in calvariale osteoblasten, terwijl glucose-oxidatie via de TCA-cyclus een rol speelt bij osteoclastenvorming 8,9. Anderen hebben bewijs geleverd voor vetzuren als energiebron voor osteoblasten10. Glutaminekatabolisme heeft ook aangetoond dat het osteoblastdifferentiatie van de voorlopersondersteunt 11,12. Een uitgebreid begrip van substraatgebruik door verschillende skeletceltypen ontbreekt echter nog steeds. Bovendien wordt verwacht dat veranderingen in het cellulaire metabolisme tijdens celdifferentiatie of als reactie op pathologische signalen het gebruik van brandstofsubstraat zullen veranderen. Hieronder wordt een eenvoudig te gebruiken protocol beschreven voor het testen van substraatoxidatie in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van radioactieve materialen (RAM) vereist voorafgaande goedkeuring door een aangewezen veiligheidscomité bij elke instelling. RAMs die in dit protocol worden gebruikt, zijn goedgekeurd door Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) aan de Universiteit van Pennsylvania. Het gebruik van dieren vereist voorafgaande goedkeuring door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in de thuisinstelling. De volgende studie werd goedgekeurd door IACUC in het Children's Hospital van Philadelphia.
1. Bereiding van stamoplossingen voor 14C-gelabelde substraten
- Maak 4 mM runderserumalbumine (BSA) stamoplossing door 11 g BSA en 33,1 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) te mengen en voorzichtig te schudden bij kamertemperatuur gedurende ~ 3 uur totdat BSA volledig is opgelost. Verwarm de BSA-stamoplossing voor gebruik in een waterbad van 70 °C.
- Droog 50 μCi 14C-oleaat (50 μCi/μmol in ethanol) aan de lucht in de injectieflacon met het deksel er gedurende 8 uur af in een speciale RAM-werkkap. Voeg 312,5 μl H2O en vervolgens 3,5 mg (11,5 μmol) natriumoleaat toe. Meng.
- Verwarm de resulterende oplossing tot 70 °C in een waterbad. Voeg 0,9375 ml van de voorgewarmde BSA-stamoplossing toe tot een 10 mM hot oleate stock-oplossing (met een verhouding van 1:11,5 van 14C-oleaat tot ongelabeld oleaat). Vul de stamoplossing toe en bewaar deze bij -20 °C voor langdurig gebruik.
- Gebruik 14C-glucose en 14C-glutamine direct na het ontdooien.
2. Bereiding van medium dat 14C-gelabelde substraten bevat
OPMERKING: Om betrouwbare concentraties van energiesubstraten in de media te garanderen, moeten op maat gemaakte media worden gebruikt met verse substraten die kort voor gebruik worden toegevoegd. Hier wordt een op maat gemaakt Minimum Essential Medium (MEMα) zonder glucose, pyruvaat, glutamine, fenolrood of natriumbicarbonaat gebruikt. Voor elk celtype moet echter een optimaal medium worden bepaald.
- Reconstitueer 8,67 g van het medium poeder in 1 L gezuiverd water. Voeg 2,2 g natriumbicarbonaat toe om een pH van 7,4 te bereiken en filtreer de oplossing met behulp van vacuümfiltratie van 0,22 μm.
- Voeg verse ingrediënten toe om het volledige medium (cMEMα) te verkrijgen met eindconcentraties van 5,5 mM glucose, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvaat en 10% foetaal runderserum (FBS). Verder supplement cMEMα met 100 mM L-carnitine en 10 μM HEPES om vetzuuroxidatie te vergemakkelijken.
- Voeg vlak voor gebruik 14C-gelabelde substraten toe aan vers bereide cMEMα om hete media te maken. Om het oleaathete medium te maken, voegt u de 10 mM hete oleaatvoorraadoplossing toe aan cMEMα voor een eindconcentratie van 100 μM oleaat (1:100 verdunning, uiteindelijke radioactiviteit 0,4 μCi/ml).
OPMERKING: De 10 mM hete oleaatvoorraad met een verhouding van 1:11,5 warm:koud oleaat (zie stap 1.3) wordt gebruikt om een fysiologisch niveau van 100 μM totaal oleaat in de media te bereiken en tegelijkertijd de hoeveelheid radioactief materiaal te minimaliseren. - Maak 10 mM ongelabelde oleaatbouillon door 24,36 mg natriumoleaat toe te voegen aan 2 ml H2O in een waterbad bij 70 °C gedurende ~ 20 minuten totdat het volledig is opgelost voordat het snel wordt gemengd met 6 ml van de 4 mM BSA-stamoplossing voorgewarmd tot 70 °C. Breng gedurende 1 uur over in een waterbad van 37 °C en filtreer door een filter van 0,22 μm. Aliquot en bewaren bij -20 °C voor langdurig gebruik.
- Om glucose heet medium te maken, voegt u 14C-glucose toe aan een eindconcentratie van 1,333 μM (1:4.125 verdunning, uiteindelijke radioactiviteit 0,4 μCi/ml). Om glutamine heet medium te maken, voegt u 14C-glutamine toe aan de eindconcentratie van 2 μM (1:1.000 verdunning, uiteindelijke radioactiviteit 0,4 μCi/ml).
- Vul het glucose- en glutaminehete medium aan met een 10 mM stockoplossing van ongelabeld oleaat uit stap 2.4 om de uiteindelijke concentratie van 100 μM oleaat te bereiken, dezelfde als die in het oleaathete medium.
3. Bereiding van cellen
OPMERKING: Calvariale preosteoblasten en beenmergmacrofagen worden hier als voorbeelden gebruikt. Gebruikers moeten hun celtype naar keuze voorbereiden volgens de juiste protocollen. Optimaliseer de concentratie van collagenase II voor gebruik voor de spijsvertering in proefexperimenten, omdat de enzymatische activiteit tussen verschillende partijen kan variëren.
- Isolatie en cultuur van calvariale preosteoblasten
- Offer postnatale dag 3-5 (P3-5) pups door onthoofding en breng ze over naar ijskoude DPBS met penicilline-streptomycine (P / S).
- Stel de calvaria bloot door de huid en het zachte weefsel te verwijderen. Verzamel het middelste gebied door de omliggende weefsels van achter naar voren weg te snijden in DPBS (figuur 1A). Kras de binnen- en buitenoppervlakken van de calvaria voorzichtig met een pincet om de cellen vrij te maken bij de daaropvolgende spijsvertering.
- Bereid een 2 mg/ml en een 4 mg/ml oplossing van Collagenase type II in DPBS en filtreer elke oplossing met een vers filter van 0,22 μm. Verteer de gereinigde calvaria eerst met de 2 mg/ml collagenase-oplossing gedurende 15 minuten en gooi de digestieoplossing weg. Verteer de gereinigde monsters in 4 mg / ml collagenase-oplossing 3 keer gedurende 15 minuten per keer, bundel en bewaar de verteringsoplossing.
- Filtreer de digestieoplossing door 70 μm cel strainers en centrifugeer het filtraat bij 300 × g gedurende 5 minuten. Resuspend de celkorrel in cMEMα (zie stap 2.2) met 10% FBS en P/S.
- Tel en zaai de cellen op 4 × 104 cellen/cm2 in 10 cm platen. Kweek de cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 dagen.
- Dissocieer de cellen bij 37 °C met 0,25% trypsine-EDTA. Tel en zaai de cellen in 24-well celkweekplaten met cMEMα die 10% FBS en P/S bevatten bij 7,5 × 105/cm2. Zaai ten minste 4 putjes per celtype per substraat en minstens drie extra putjes voor elk celtype voor celtelling vóór de test.
- Kweek de cellen bij 37 °C 's nachts vóór de oxidatietests van het substraat.
- Isolatie en cultuur van BMM's
OPMERKING: Cultuur van BMM's vereist macrofaag koloniestimulerende factor (M-CSF), die commercieel kan worden gekocht als een recombinant eiwit. Geconditioneerd medium uit de cellijn CMG14-12 ontworpen om M-CSF uit te drukken is een economisch alternatief dat hier wordt gebruikt13.- Verzamel dijbenen en tibia's van 8 weken oude muizen na het verwijderen van de spier en bindweefsels. Knip en gooi beide uiteinden van de botten weg met een scherpe schaar.
- Spoel het beenmerg uit één dijbeen en één scheenbeen in een petrischaaltje van 10 cm met een spuit voorzien van een naald van 23 G met 15 ml cMEMα met 10% FBS, P/S en 10% CMG14-12 geconditioneerd medium (BMM-medium). Kweek de cellen in de petrischaal in een incubator van 37 °C met 5% CO2.
- Gooi na 3 dagen de kweekmedia weg en spoel af met DPBS. Dissocieer de aangehechte cellen bij 37 °C met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten. Centrifugeer en resuspend de celkorrel in het BMM-medium.
- Tel en zaai de cellen in 24-well celkweekplaten op 7,5 × 105/cm2 op dezelfde manier als beschreven in 3.1.6. Kweek bij 37 °C 's nachts in het BMM-medium voordat met de testen wordt begonnen.
4. Substraatoxidatietest met CO2-val
OPMERKING: Voor elk celtype moet een geschikte zaaidichtheid worden bepaald om 80-90% samenvloeiing te bereiken vóór het begin van de test. Merk op dat celdichtheid de metabole toestand van de cellen kan beïnvloeden.
- Was de cellen in de extra putjes twee keer met DPBS. Dissociëer de cellen met 0,25% trypsine-EDTA en gemengde 20 μL cellen geresuspendeerd in DPBS met 20 μL acridine sinaasappel/propidiumjodide (AO/PI) kant-en-klare commerciële kleurstofoplossing. Bepaal het aantal levende cellen met een geautomatiseerde celteller en noteer het aantal voor de uiteindelijke berekeningen.
- Was de cellen in de testputten tweemaal met DPBS. Voeg 500 μL heet medium toe aan elke testput in de door RAM aangewezen weefselkweekkap. Sluit de platen af met parafilm en incubeer de cellen in een door RAM aangewezen incubator bij 37 °C gedurende 4 uur.
- Snijd tijdens de incubatie het filtreerpapier in cirkelvormige stukken die iets groter zijn dan het gebied in de dop van microcentrifugebuizen van 1,5 ml en steek het papier goed in de dop (figuur 1B). Voeg 200 μL 1 M perchloorzuur toe aan elke buis en 20 μL natriumhydroxide aan het filtreerpapier dat in de dop is aangebracht.
- Breng na incubatie van de cellen 400 μL kweekmedium van elke put over naar de voorbereide buizen en sluit de doppen onmiddellijk. Laat de buizen gedurende 1 uur in een buizenrek op kamertemperatuur.
- Stel tijdens de incubatie een scintillatieflacon in voor elke buis en vul deze met 4 ml scintillatievloeistof. Breng elk stuk filtreerpapier over in een injectieflacon met scintillatie en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voer veegtests uit op de weefselkweekkap, het waterbad (gebruikt voor 14C-oleaatbereiding), koelkast, incubator, gootsteen, grond en elk ander werkgebied voor mogelijke RAM-verontreiniging. Doe de papieren doekjes in scintillatieflacons met scintillatievloeistof.
- Meet 14C radioactiviteit in de scintillatieflacons met een scintillatieteller. Noteer de leesresultaten. Ontsmet de werkomgeving indien nodig volgens de richtlijnen voor stralingsveiligheid.
5. Data-analyse
OPMERKING: Ervan uitgaande dat elk substraat volledig is geoxideerd om CO2 vrij te maken, kan de oxidatiesnelheid van het substraat worden berekend op basis van de opgesloten CO2-radioactiviteit .
- Bereken de oxidatiesnelheid van het substraat met behulp van Eq (1) en de X-, Y- en Z-waarden in tabel 1 voor verschillende substraten.
Substraat oxidatiesnelheid (μmol/cel/h) =
(1)- Bereken de totale desintegraties per min (DPM) voor elke reactie goed. Gebruik voor X de DPM-waarde (scintillatietelleraflezing) van 0,4 ml van het reactiemedium dat wordt gebruikt voor CO2-opvang van 0,5 ml van het totale reactiemedium. Daarom is de totale DPM van elke reactieput X × 1,25.
- Deel de totale DPM door een factor 2.220.000 om te converteren naar μCi.
- Converteer de radioactiviteit in μCi naar het aantal van 14C-gelabelde moleculen. Deel de μCi-waarde door de specifieke activiteit (Y) van elk gelabeld substraat. Gebruik de volgende Y-waarden (tabel 1): 14C-glucose: 300 mCi/mmol; 14 C-glutamine: 200 mCi/mmol; 14 C-oleaat: 50 mCi/mmol.
- Bereken het totale aantal geoxideerde moleculen van de geoxideerde 14C-gelabelde moleculen door deze laatste te vermenigvuldigen met de hot-to-total verdunningsfactor (Z). Gebruik de volgende Z-waarden (tabel 1): Glucose: 4.125; glutamine: 1.000; oleaat: 12,5.
- Deel het resulterende product door het celnummer (cel#) en 4 (voor de reactietijd van 4 uur) om de oxidatiesnelheid van het substraat per cel te bepalen. Gebruik de cel# bepaald in de parallelle putjes aan het begin van de test.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit voorbeeld wordt de CO 2-vangmethode gebruikt om substraatoxidatie door primaire calvariale preosteoblasten te vergelijken met BMM's, die vaak worden gebruikt voor respectievelijk in vitro osteoblasten- of osteoclastendifferentiatie. Nadat de primaire cellen 's nachts in cMEMα zijn gepasseerd en gekweekt, bereiken ze meestal 80-90% van de samenvloeiing en vertonen ze hun karakteristieke morfologie. De calvariale preosteoblasten zijn opvallend groter dan BMM's (figuur 2). Elk celtype wordt onderworpen aan oxidatietests voor glucose, glutamine en oleaat door de stappen 4.1 tot en met 4.7 te volgen. De resultaten worden geanalyseerd met behulp van Eq (1).
De resultaten tonen aan dat de oxidatiesnelheid voor elk substraat significant hoger is in calvariale preosteoblasten dan BMM's, wat waarschijnlijk wijst op een grotere energieproductie door OXPHOS in de preosteoblasten (figuur 3). Eerdere studies met Seahorse-technologie hebben aangetoond dat OXPHOS verantwoordelijk is voor ~ 60% van de ATP-productie in preosteoblasten, maar duidelijk afneemt in volwassen osteoblasten, waar aerobe glycolyse verantwoordelijk is voor ~ 80% van de energie9. De huidige resultaten tonen aan dat alle drie de belangrijkste substraten bijdragen aan OXPHOS in preosteoblasten. Verder onderzoek is echter nodig om te bepalen of het gebruik van een of alle substraten in de volwassen osteoblasten wordt verminderd.
Figuur 1: Diagrammen voor CO 2-vangtest en calvariadissectie. (A) Het middelste gebied van de calvaria, aangegeven door de oranje driehoek, wordt geoogst voor celisolaton. (B) Microcentrifugebuizen van 1,5 ml worden gebruikt voor het opvangen van CO2 (stap 1). Filterpapier (blauw papier ter illustratie) wordt gesneden om in buisdoppen te passen (stap 2). Voeg 200 μL 1 M perchloorzuur toe aan 400 μL hete media uit de celcultuur in elke buis en 20 μL NaOH aan het filtreerpapier (stap 3) voordat u het deksel sluit (stap 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Typische morfologie van BMM's en calvariale preosteoblasten. (A, B) Representatieve beelden bij lagere vergroting. (C, D) Representatieve beelden bij hogere vergroting. Schaalbalken = 400 μm (A, B), 100 μm (C, D). Afkortingen: BMM's = van beenmerg afgeleide macrofagen; preOB's = preosteoblasten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Substraatoxidatiesnelheden in calvariale preosteoblasten en BMM's. (A) Glucose. (B) Glutamine. (C) Oleaat. De berekeningen gaan ervan uit dat elk substraatmolecuul volledig geoxideerd is. Afkortingen: BMM = beenmerg-afgeleide macrofaag; preOB = preosteoblast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Substraat | Radioactiviteit (X) | Specifieke activiteit (Y), mCi/mmol | Verdunningsfactor (Z) |
| Glucose | DPM1 | 300 | 4,125 |
| Glutamine | DPM2 | 200 | 1,000 |
| Oleaat | DPM3 | 50 | 12.5 |
Tabel 1: Parameters die worden gebruikt bij data-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol biedt een eenvoudig te gebruiken methode om de oxidatiesnelheid van belangrijke energiesubstraten te bepalen. Het is een eenvoudiger alternatief voor andere protocollen die kolven gebruiken die een centrale put bevatten en afgedekt zijn met rubberen stoppen 14,15,16. Hoewel de voorbeeldstudie hier wordt uitgevoerd met celkweek, kan de methode gemakkelijk worden aangepast voor weefselexplantaten of weefselhomogenaten die intacte mitochondriën bevatten, zoals eerder beschreven17.
Enkele belangrijke stappen om te overwegen in dit protocol zijn de voorbereiding van de reagentia en het instellen van de buizen voor 14CO2-opvang . Zorgen voor een juiste conjugatie van oleaat naar BSA is cruciaal om te voorkomen dat vrije vetzuren (FFA's) de celmembranen beschadigen en om een efficiënte opname door de cel voor het metabolisme mogelijk te maken. Incubeer de BSA-oplossing net lang genoeg voor volledige oplossing, omdat lange incubaties met BSA bij 70 °C leiden tot onomkeerbare stolling.
Voor elke experimentele opstelling moet verse cMEMα worden gemaakt vanwege de korte halfwaardetijd van substraten zoals L-glutamine. Ten slotte moet het filterpapier groot genoeg zijn om stevig in de dop te passen om onjuiste metingen te voorkomen. Een toevallige val van het filterpapier in de reactievloeistof zal leiden tot abnormaal hoge DPM-waarden, die uit verdere analyse moeten worden weggelaten. Vier tot vijf gerepliceerde putten kunnen worden ingesteld in geval van mogelijke besmetting. Als de uiteindelijke DPM-waarden te laag zijn, bijvoorbeeld minder dan 100, kan het verhogen van de hoeveelheid radioactief substraat of de incubatietijd nuttig zijn.
Er zijn kanttekeningen bij het gebruik van oleaat als surrogaatsubstraat voor vetzuuroxidatie. Oleaat is het meest voorkomende enkelvoudig onverzadigde, lange-keten vetzuur dat 32% van alle vetzuren in circulatie en weefsels vormt. Andere langeketenvetzuren, zoals palmitaat (28%) en linoleaat (14%), zijn echter ook belangrijke substraten in vivo18,19. Daarom kan suppletie van de celkweekmedia met oleaat alleen de oxidatiesnelheid van vetzuren niet nauwkeurig weergeven wanneer andere soorten ook aanwezig zijn. Bij het uitvoeren van de test kan deze zorg worden verbeterd door die andere vetzuren in de kweekmedia op te nemen.
Opgemerkt moet worden dat het celmetabolisme sterk contextafhankelijk is en een grote plasticiteit kan vertonen, afhankelijk van de beschikbaarheid van substraat en zuurstofspanning, naast andere factoren. Het is daarom belangrijk om in vitro resultaten te evalueren in de context van fysiologische omstandigheden. Niettemin wordt het steeds duidelijker dat cellen de neiging hebben om ten minste enkele aspecten van hun metabole kenmerken in vitro te behouden, waarschijnlijk als gevolg van de celspecifieke metabole programmering en het geheugen. Eenvoudige in vitro methoden, zoals deze, bieden dus een belangrijk hulpmiddel om inzicht te krijgen in niet alleen de metabole diversiteit tussen celtypen, maar ook in potentiële ontregeling bij ziekteomstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidie R01 AR060456 (FL). We bedanken Dr. Michael Robinson en Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) voor hun genereuze hulp bij de sprankelende teller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
