Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير متحدة البؤرة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية. تشمل أوضاع الاندماج هذه 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والتشغيل) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الانصهار ، 2) الاندماج ، الذي ينطوي على فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار الانكماشي ، الذي ينطوي على انكماش الحويصلة المنصهرة.
Abstract
يتوسط فتح وإغلاق المسام الانصهارية الديناميكية الإفرازات الخارجية وكثرة الخلايا الداخلية وتحديد حركياتها. هنا ، يتضح بالتفصيل كيف تم استخدام المجهر البؤري في تركيبة مع تسجيل المشبك الرقعة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية في الزراعة الأولية. تشمل أوضاع الاندماج الثلاثة 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والجري) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الاندماج ، 2) الاندماج المتبقي ، الذي يتضمن فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار المتقلص ، الذي ينطوي على انكماش ملف تعريف Ω الشكل المتولد عن الاندماج حتى يندمج تماما في غشاء البلازما.
للكشف عن أوضاع الاندماج هذه ، تم تسمية غشاء البلازما عن طريق الإفراط في التعبير عن mNeonGreen المرتبط بمجال الأس الهيدروجيني للفوسفوليباز C δ (PH-mNG) ، والذي يرتبط بالفوسفاتيديلينوسيتول-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) في النشرة المواجهة للسيتوسول من غشاء البلازما. تم تحميل الحويصلات بالناقل العصبي الكاذب الفلورسنت FFN511 للكشف عن إطلاق المحتوى الحويصلي. وتم تضمين Atto 655 في محلول الحمام للكشف عن إغلاق مسام الانصهار. تم تصوير هذه المجسات الفلورية الثلاثة في وقت واحد عند ~ 20-90 مللي ثانية لكل إطار في خلايا الكرومافين الحية للكشف عن فتح مسام الاندماج ، وإطلاق المحتوى ، وإغلاق مسام الاندماج ، وتغيرات حجم الحويصلة المنصهرة. تم وصف طريقة التحليل للتمييز بين ثلاثة أوضاع اندماج من قياسات التألق هذه. يمكن أن تنطبق الطريقة الموصوفة هنا ، من حيث المبدأ ، على العديد من الخلايا الإفرازية خارج خلايا الكرومافين.
Introduction
يتوسط الاندماج الغشائي العديد من الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك الانتقال المشبكي ، وتوازن الجلوكوز في الدم ، والاستجابة المناعية ، والدخول الفيروسي1،2،3. إفراز الخلايا الخارجية ، الذي ينطوي على اندماج الحويصلة في غشاء البلازما ، يطلق الناقلات العصبية والهرمونات لتحقيق العديد من الوظائف الهامة ، مثل أنشطة الشبكة العصبية. يفتح الانصهار مسام لإطلاق محتويات حويصلية ، وبعد ذلك قد تغلق المسام لاسترداد الحويصلة المنصهرة ، والتي تسمى قبلة وتشغيل 1,4. يمكن قياس كل من فتحة مسام الاندماج التي لا رجعة فيها وعكسها باستخدام تسجيلات السعة المرفقة بالخلايا جنبا إلى جنب مع تسجيلات توصيل مسام الاندماج لاندماج حويصلة واحدة.
غالبا ما يفسر هذا على أنه يعكس اندماج كامل الانهيار ، بما في ذلك تمدد الاندماج حتى تسطيح حويصلة الصمامات ، والتقبيل والتشغيل ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الاندماج ، على التوالي5،6،7،8،9،10،11،12،13 . لاحظت الدراسات التصويرية الحديثة لاستنفاد الانبعاثات البؤرية والمحفزة (STED) في خلايا الكرومافين مباشرة فتح وإغلاق مسام الاندماج (قبلة وتشغيل ، وتسمى أيضا الانصهار القريب) ، وفتح مسام الاندماج الذي يحافظ على شكل Ω مع مسام مفتوحة لفترة طويلة ، يسمى الاندماج المتبقي ، وتقلص حويصلة الصمامات حتى تكتمل مع غشاء البلازما ، الذي يحل محل الاندماج الكامل لدمج الحويصلات الاندماجية مع غشاء البلازما4 ، 8,14,15,16,17.
في الخلايا العصبية، تم الكشف عن فتح وإغلاق مسام الاندماج مع التصوير الذي يظهر إطلاق النقاط الكمومية المحملة مسبقا في الحويصلات التي هي أكبر من مسام الاندماج ومع قياسات توصيل مسام الاندماج في وجه إطلاق المحطات العصبية5،18،19. تستخدم خلايا الكرومافين الكظرية على نطاق واسع كنموذج لدراسة كثرة الخلايا الخارجية والداخلية20,21. على الرغم من أن خلايا الكرومافين تحتوي على حويصلات كبيرة كثيفة النواة ، في حين أن المشابك العصبية تحتوي على حويصلات متشابكة صغيرة ، فإن بروتينات الإفرازات الخارجية وكثرة الخلايا الداخلية في خلايا الكرومافين والمشابك العصبية متشابهة تماما 10,11,12,20,21,22,23.
هنا ، يتم وصف طريقة لقياس أوضاع الاندماج الثلاثة هذه باستخدام طريقة تصوير متحدة البؤرة جنبا إلى جنب مع الفيزيولوجيا الكهربية في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية (الشكل 1). تتضمن هذه الطريقة تحميل الناقلات العصبية الكاذبة الفلورية (FFN511) في الحويصلات للكشف عن الإفرازات الخارجية. إضافة Atto 655 (A655) في محلول الحمام لملء ملف تعريف Ω الشكل المتولد عن الانصهار ، ووضع علامات على غشاء البلازما مع مجال PH من δ الفوسفوليباز C (PH) ، والذي يرتبط ب PtdIns(4,5)P2 في غشاء البلازما 8,15,24. يمكن الكشف عن ديناميكيات المسام الانصهارية من خلال التغيرات في كثافة الفلورسنت المختلفة. على الرغم من وصفها لخلايا الكرومافين ، إلا أن مبدأ هذه الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقه على نطاق واسع على العديد من الخلايا الإفرازية خارج خلايا الكرومافين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: اتبع إجراء استخدام الحيوانات إرشادات المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المعاهد الوطنية للصحة.
1. زراعة خلايا الكرومافين البقرية
- قم بإعداد حل لوك (الجدول 1) وأدوات الأوتوكلاف قبل يوم واحد من زراعة خلايا الكرومافين.
- احصل على الغدد الكظرية البقرية من مسلخ محلي في يوم الثقافة ، واحتفظ بها مغمورة في محلول لوك البارد قبل تشريحها.
ملاحظة: الغدد الكظرية هي من 21-27 شهرا ، صحية ، أنجوس سوداء من أي من الجنسين (الذكور بشكل رئيسي) مع وزن الجسم حوالي 1400 رطل (~ 635 كجم). - تحضير 30 مل (ل 3 غدد كظرية) من محلول إنزيم طازج يحتوي على الكولاجيناز P ومثبط التربسين وألبومين مصل البقر (الجدول 1) قبل تشريحه والاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة.
- اختر 3 غدد سليمة دون جروح أو نزيف على السطح وقم بإزالة الأنسجة الدهنية بالمقص (الشكل 1A). اغسل الغدد عن طريق التروية بمحلول لوك حتى لا يخرج الدم. لتحقيق ذلك ، قم بتضخيم الغدة عبر الوريد الكظري (الشكل 1 ب) باستخدام حقنة 30 مل متصلة بمرشح 0.22 ميكرومتر عدة مرات حسب الحاجة25.
ملاحظة: عادة ما تكون هناك حاجة إلى حوالي 150 مل من محلول لوك لغسل 3 غدد. - للهضم ، حقن محلول الإنزيم من خلال الوريد الكظري باستخدام حقنة 30 مل متصلة بمرشح 0.22 ميكرومتر حتى تبدأ الغدة في الانتفاخ. ثم اترك الغدد عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حقن مرة أخرى وترك الغدد في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أخرى.
ملاحظة: هناك حاجة إلى حوالي 30 مل من محلول الإنزيم لهضم 3 غدد. - بعد الهضم ، اقطع الغدة طوليا من الوريد إلى الطرف الآخر باستخدام مقص لكشف الغدة (الشكل 1C). اعزل النخاع عن طريق إخراج النخاع الأبيض في طبق بتري بحجم 10 سم يحتوي على محلول لوك.
ملاحظة: تظهر مقارنة الجزء الداخلي من الغدة قبل وبعد الهضم في الشكل 1C. تم الإبلاغ عن تفاصيل عزل الهضم والنخاع سابقا23,25. - قطع النخاع وفرمه إلى قطع صغيرة بالمقص (الشكل 1D). قم بتصفية تعليق النخاع باستخدام شبكة نايلون 80-100 ميكرومتر في دورق. ثم انقل الترشيح إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل للطرد المركزي عند 48 × جم ، درجة حرارة الغرفة ، لمدة 3 دقائق مع تباطؤ 3.
ملاحظة: عادة ما يستغرق فرم النخاع حوالي 10 دقائق. للحصول على عائد جيد من الخلايا ، يجب أن تكون القطع المفرومة صغيرة جدا ، حتى لا يمكن ملاقطها. - بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant وأعد تعليق حبيبة الخلية بمحلول لوك عن طريق السحب. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة 80-100 ميكرومتر ، وأجهزة طرد مركزي عند 48 × جم ، درجة حرارة الغرفة ، لمدة 3 دقائق مع تباطؤ 3.
- قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 30 مل من وسط الثقافة (الجدول 1). أوجد رقم الخلية باستخدام غرف عد مقياس الدم25.
2. النقل مع الكهرباء
- نقل 2.8 × 106 خلايا إلى أنبوب 15 مل. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 48 × جم لمدة 2 دقيقة مع تباطؤ 3. أضف 100 ميكرولتر من مخزن النقل المؤقت (انظر جدول المواد) الذي توفره الشركة المصنعة إلى بيليه الخلية ، ثم أضف 2 ميكروغرام من بلازميد PH-mNG.
ملاحظة: تم إنشاء بلازميد PH-mNG عن طريق استبدال بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) ب mNG في PH-EGFP15 (انظر جدول المواد). - امزج التعليق بلطف عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل ، وانقل الخليط إلى كوفيت كهربائي دون تأخير (الشكل 1E). انقل الكوفيت على الفور إلى المسام الكهربائية (انظر جدول المواد) ، وحدد برنامج O-005 في قائمة الشاشة واضغط على Enter لإجراء الفحص الكهربائي.
ملاحظة: قم بإعداد تعليق الخلية للنقل في غطاء زراعة الخلية. لا تقم بإدخال فقاعات الهواء في التعليق أثناء خطوة الخلط. انتقل إلى الخطوة التالية دون تأخير. - بعد المعالجة الكهربائية ، أضف 1.8 مل من الوسط على الفور إلى الكوفيت واخلطه بلطف مع ماصة دقيقة مجهزة بطرف معقم. ثم أضف 300 ميكرولتر من تعليق الخلايا الكهربائية أعلى الغطاء (انظر جدول المواد) في كل طبق ، مع طلاء 5-6 أطباق في المجموع لتفاعل كهربائي واحد.
- انقل الأطباق بعناية إلى حاضنة مبللة عند 37 درجة مئوية مع 9٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة ، وأضف بلطف2 مل من الوسط المسخن مسبقا إلى كل طبق بعد 30 دقيقة.
- حافظ على الخلايا المنقولة في الحاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية مع 9٪ CO 2 لمدة2-3 أيام قبل التجربة.
ملاحظة: ستستمر الخلايا المستزرعة لمدة أسبوع. من الأفضل استخدام الخلايا المستزرعة في الأيام 2-3.
3. التحضير لتسجيل المشبك التصحيح والتصوير البؤري
ملاحظة: تم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر ومضخم صوت مشبك التصحيح مع تسجيل الجهد المشبك مع مضخم صوت قفل لتسجيل السعة. تم استخدام التصوير البؤري لمستوى XY في مستوى Z ثابت (المسحالضوئي الثابت XY / Z) لتصوير جميع إشارات الفلورسنت الثلاثة في وقت واحد. تم تركيز المستوى Z في قاع الخلية حيث كان غشاء البلازما ملتصقا بالغطاء.
- في يوم تجربة المشبك والتصحيح والتصوير ، راقب الخلايا تحت المجهر الفلوري. استخدم برايتفيلد للتأكد من أن مزرعة الخلايا غير ملوثة (الشكل 1F) والتألق اللاإرادي للتحقق من التعبير السليم عن البروتين الموسوم بالفلورسنت.
ملاحظة: على سبيل المثال ، يتم التعبير عن PH-mNG في غشاء البلازما ل ~ 20-30 ٪ من الخلايا. - تحضير ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات. للقيام بذلك ، اسحب الماصات باستخدام مجتذب ماصة ، وقم بتغطية نصائحها بالشمع السائل ، وقم بتلميعها باستخدام microforge (انظر جدول المواد).
- قم بتشغيل مضخم تسجيل مشبك التصحيح وابدأ تشغيل برنامج تسجيل مشبك التصحيح (انظر جدول المواد). قم بتعيين المعلمات المناسبة لتسجيل تيار الكالسيوم والسعة في البرنامج (انظر جدول المواد).
- قم بتعيين بروتوكول تسجيل لمدة 60 ثانية في المجموع ، حيث يبدأ التحفيز من 10 ثوان.
- اضبط إمكانات الاحتفاظ لتسجيل مشبك الجهد على -80 mV. اضبط إزالة الاستقطاب 1 ثانية من -80 mV إلى 10 mV كحافز للحث على تدفق الكالسيوم وقفزة السعة.
- بالنسبة لقياسات السعة، اضبط تردد التحفيز الجيبي على نطاق يتراوح بين 1000 و1500 هرتز مع جهد من الذروة إلى الذروة لا يزيد عن 50 مللي فولت.
- احفظ البروتوكول وأنشئ ملفا جديدا للتسجيل.
- قم بتشغيل نظام المجهر البؤري وتعيين المعلمات المناسبة في البرنامج (انظر جدول المواد).
- قم بتشغيل الليزر ، بما في ذلك 458 نانومتر و 514 نانومتر و 633 نانومتر ، واضبط نطاق جمع الانبعاثات لكل ليزر وفقا لكل مسبار فلوري كما في ما يلي. FFN511: الطول الموجي للإثارة (EX) ، 458 نانومتر ؛ الطول الموجي للانبعاثات (EM) ، 468-500 نانومتر. mNG: EX ، 514 نانومتر ؛ EM ، 524-560 نانومتر. A655: EX، 633 نانومتر؛ EM ، 650-700 نانومتر.
- استخدم التصوير المتسلسل ل FFN511 و mNG لتجنب التداخل بين هذين المسبارين. قم بتعيين فاصل زمني مدته دقيقة واحدة لتسجيل الصور (الشكل 1G).
4. تسجيل المشبك التصحيح والتصوير البؤري
- اختر طبقا ذا حالة خلية جيدة وتعبيرا مناسبا وأضف 2 ميكرولتر من الناقل العصبي الكاذب الفلورسنت FFN511 (مخزون 10 mM ، محلول عمل 1: 1000) إلى الوسط. ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. بدلا من ذلك، قم بتحميل FFN511 بعد الخطوة 3.2 وقم بتنفيذ الخطوات 3.3-3.5 أثناء الانتظار لتوفير الوقت.
- بعد الانتهاء من تحميل FFN511 ، قم بإعداد غرفة التسجيل وإضافة 2 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت A655 إلى 500 ميكرولتر من محلول الحمام (الشكل 2A والجدول 1). انقل الغطاء من الطبق إلى غرفة التسجيل (انظر جدول المواد) باستخدام ملاقط ، وأضف على الفور محلول الحمام المحتوي على A655 (الشكل 2B).
ملاحظة: يتم الاحتفاظ ب A655 في -20 درجة مئوية بتركيز 10 mM وتركيز العمل هو 40 μM.
تنبيه: ارتد قفازات لتجنب ملامسة الجلد مباشرة ل FFN511 أو A655. - ضع قطرة من الزيت (معامل الانكسار: 1.518؛ انظر جدول المواد) على هدف غمر الزيت 100x (الفتحة العددية = 1.4). قم بتركيب الغرفة في المجهر واستخدم مقبض الضبط لجعل الزيت يتصل فقط بالجزء السفلي من الغطاء ، ثم اغمر طرف السلك الأرضي في محلول الحمام (الشكل 2C ، D).
ملاحظة: اختر زيت الغمر المناسب للعمل في درجة حرارة الغرفة. التبديل بين عدسة التكبير المنخفض والعالي غير ضروري. يتم الحفاظ على درجة حرارة الغرفة حوالي 20-22 درجة مئوية أثناء التسجيل. - ضع الخلايا في بؤرة التركيز واستخدم التصوير الساطع والتصوير البؤري للعثور على خلية جيدة مع تعبير mNG. قم بتكبير الخلية المحددة وضبطها على مركز العرض لتقليل المناطق الفارغة.
ملاحظة: الرسم التخطيطي لوضع العلامات الفلورية مبين في الشكل 3A. عادة ما يكون للخلية الجيدة غشاء أملس وحافة نظيفة (الشكل 3B). مع التألق أو التصوير البؤري ، يبدو أن الخلية الجيدة لها قاع كبير ومسطح مع تعبير mNG مشرق (الشكل 3C).
حجم البكسل هو ~ 50 نانومتر ، ضمن نطاق ~ 40-80 نانومتر وفقا لحجم الخلية المختلفة وعامل التكبير/التصغير. - قم بإعداد معلمات للتصوير البؤري لمستوى XY عند مستوى Z ثابت (مسح ضوئيثابت XY/Z) ل FFN511 وPH-mNG وA655، مع فاصل زمني مصغر. اضبط التركيز البؤري على الجزء السفلي من الخلية باستخدام مقبض الضبط الدقيق.
ملاحظة: يشير PH-mNG إلى محيط غشاء بلازما الخلية عند المقطع العرضي XY-level البؤري (باستثناء قاع الخلية). بالقرب من قاع غشاء الخلية ، يمكن ملاحظة بقع A655 ، والتي تعكس غزوات الغشاء على شكل Ω أو Λ. إذا كان المستوى البؤري Z أقل من قاع الخلية ، فستصبح شدة كل التألق أضعف. - اضبط طاقة ليزر الإثارة في البرنامج للعثور على إعداد للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء وتجنب التبييض الفلوري الكبير. للقيام بذلك ، ابدأ بقيمة اختبار أولية تبلغ 2.5 ميجاوات طاقة FFN511 متحمسة عند 458 نانومتر و 1 ميجاوات ل mNG متحمسة عند 514 نانومتر. بالنسبة ل A655 متحمس عند 633 نانومتر باستخدام ليزر HeNe ، استخدم طاقة ليزر عالية ، ~ 12-15 mW (أي 70٪ -80٪ من الحد الأقصى) ، والتي ، عند الإثارة المستمرة ، يمكنها تبييض جميع A655 الفلورسنت داخل ملف تعريف Ω الشكل عند إغلاق مسامها.
ملاحظة: إذا كانت طاقة الليزر عالية جدا ، تبييض التألق PH-mNG و FFN511 بسرعة. إذا كانت طاقة الليزر منخفضة جدا ، فستكون الإشارات ضعيفة جدا أو صاخبة بحيث لا يمكن تحليلها. - أضف 9 ميكرولتر من المحلول الداخلي (الجدول 1) إلى ماصة التصحيح وقم بتوصيل الماصة بالحامل في مرحلة مضخم التصحيح المشبك (انظر جدول المواد).
- ضع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي باستخدام حقنة وحرك طرف الماصة للمس محلول الحمام باستخدام جهاز مناور دقيق. تأكد من أن مكبر الصوت يظهر أن مقاومة الماصة هي ~ 2-4 MΩ مع اختبار نبض الجهد. اضغط على LJ/Auto لإلغاء الوصلة السائلة.
- حرك الماصة باتجاه الخلية المحددة باستخدام المتلاعب الدقيق. لتشكيل وضع متصل بالخلية ، حرك طرف الماصة للمس الخلية (ستزداد المقاومة) ؛ تطبيق الضغط السلبي بلطف مع المحقنة (ستزداد المقاومة إلى أكثر من 1 GΩ) ، وتغيير إمكانات الاحتفاظ من 0 إلى -80 mV.
- بمجرد أن تمر المقاومة ب 1 GΩ ، انتظر ~ 30 ثانية حتى يستقر التكوين. اضغط على C-fast/Auto للتعويض عن السعة السريعة.
- لتشكيل وضع خلية كاملة ، قم بتطبيق ضغط سلبي قصير وقوي مع المحقنة لتمزيق الغشاء (يتغير شكل النبضة الحالية باستخدام مكثف غشاء مشحون ومفرغ). اضغط على C-slow/Auto للتعويض عن السعة البطيئة.
- اضبط تركيز التصوير قليلا للتركيز على قاع الخلية. ابدأ التصوير بالفاصل الزمني البؤري وتسجيل مشبك التصحيح في وقت واحد بالنقر فوق الزرين " ابدأ" في تطبيقي البرامج المختلفين في نفس الوقت.
ملاحظة: يقوم برنامج التصوير البؤري بعمل فيلم بمعدل ~ 20-90 مللي ثانية / إطار. يتضمن تسجيل المشبك التصحيحي حالة الراحة لمدة 10 ثوان ، وتحفيز إزالة الاستقطاب 1 ثانية ، و 49 ثانية إضافية بعد التحفيز. يسمح تكوين المشبك الرقعة بتسجيل تيار الكالسيوم ، وقفزة السعة ، والاضمحلال الناجم عن إزالة الاستقطاب 1 s من -80 إلى +10 mV (الشكل 3D). - بمجرد الانتهاء من التسجيل ، تأكد من حفظ البيانات. قم بتغيير إمكانات الكبح إلى 0 mV. حرك الماصة خارج محلول الحمام وتخلص منها.
- كرر الخطوات من 4.7 إلى 4.13 لتسجيل خلية أخرى في الطبق. بعد 1 ساعة من التسجيل ، قم بالتغيير إلى طبق آخر للتسجيل.
ملاحظة: بعد 1 ساعة من التسجيل ، ينخفض معدل نجاح تسجيل مشبك التصحيح بشكل ملحوظ. لزيادة كفاءة جمع البيانات ، يوصى بالتسجيل لمدة 1 ساعة فقط في كل طبق.
5. تحليل بيانات المشبك التصحيحي
- افتح البرنامج المناسب (انظر جدول المواد) لتحليل البيانات. انقر فوق | PPT تحميل ملف PULSE | أزرار الملفات لتحميل ملف .dat. انقر فوق Do it وسيتم رسم أربعة آثار في رسم بياني واحد تلقائيا بما في ذلك تيار الكالسيوم وآثار السعة.
- انقر فوق | Windows أزرار رسم بياني جديدة ، اختر Pulse_1_1_1، الموجة الأولى في موجة (موجات) Y، وانقر فوق Do it لرسم الرسم البياني لتيار الكالسيوم. انقر فوق | Windows أزرار جدول جديدة، اختر Pulse_1_1_1، وانقر فوق Do it لإظهار البيانات الخام لتيار الكالسيوم، والتي يمكن استخدامها لرسم متوسط تتبع خلايا متعددة.
- ارسم مربعا وفقا لذلك في الرسم البياني لتيار الكالسيوم ، وانقر بزر الماوس الأيمن ووسع الإشارة الحالية لتشمل خط الأساس وذروة تيار الكالسيوم. انقر على الرسم البياني | إظهار المعلومات لإظهار المؤشرين A وB ونقلهما إلى خط الأساس والذروة على التوالي. سيتم عرض معلومات الرسم البياني في الأسفل ويمكن تقدير المعلمات.
- كرر الخطوة 5.2، ولكن اختر Pulse_1_1_1_Cm، الموجة الثانية في Y Wave(s)، لرسم تتبع السعة. كرر الخطوة 5.3 وضع المؤشرات A وB في الموضع المناسب لقياس معلمات السعة، مثل خط الأساس والسعة ومعدل الاضمحلال.
- انسخ البيانات الخام في الخطوة 5.2 إلى جدول بيانات، واحسب متوسط الخطأ المعياري للمتوسط لمجموعة من الخلايا المسجلة، وارسم متوسط آثار تيار الكالسيوم وسعة الغشاء (الشكل 3E) في برنامج مناسب.
6. تحليل بيانات التصوير البؤري
- افتح ملفات التصوير الخام باستخدام أي برنامج توفره الشركة المصنعة (راجع جدول المواد).
ملاحظة: يمكن استخدام بعض البرامج المجانية الأخرى ، مثل ImageJ أو Fiji ، لمعالجة البيانات وتحديد كمية الصور التي تم الحصول عليها في القسم 4. - انقر على معالجة | ProcessTools واستخدام الأدوات لإنشاء ملفات متوسطة متداولة (على سبيل المثال ، المتوسط المتداول لكل 4 صور) لكل صورة بفاصل زمني وحفظ تلك الملفات.
ملاحظة: بعد المتوسط المتداول ، يمكن إجراء تعديل مناسب للسطوع والخلفية لإظهار تغيرات التألق لثلاث قنوات بشكل أفضل ، مما قد يساعد في تحديد أحداث الاندماج. قد يساعد التحقق من كثافة الفلورسنت في بعض المناطق بدون حدث اندماج على التمييز بين إشارة الفلورسنت لأحداث الاندماج وإشارات الخلفية. - انقر فوق الأزرار تحديد كمي | أدوات | ملف تعريف المكدس ، تحقق من النقاط الزمنية قبل وبعد التحفيز لتحديد تغيرات التألق في كل قناة. انقر فوق الزر رسم القطع الناقص لوضع دائرة حول مناطق الاهتمام (ROIs) لأحداث الاندماج. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وانقر فوق حفظ عائد الاستثمار لحفظ عائد الاستثمار.
ملاحظة: كان حجم عائد الاستثمار ، الذي يغطي جميع إشارات الفلورسنت الثلاثة ، مشابها لحجم الحويصلة في خلايا الكرومافين24. واستخدمت البيانات الأولية للتحليل، في حين تم توفير بيانات المتوسط المتداولة التي تزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء لإظهار الإشارات الثلاث بوضوح. - انقر فوق فتح المشاريع لتحديد موقع الملف الخام ، وانقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وانقر فوق تحميل عائد الاستثمار لتحميل ملف عائد الاستثمار في ملفات التصوير الخام لقياس كثافة التألق.
ملاحظة: سيتم استخدام إشارة الفلورسنت الخام لرسم آثار القنوات المختلفة. لكل عائد استثمار ، يتم تعريف خط الأساس على أنه الكثافة قبل التحفيز ، ويمكن تطبيع آثار الكثافة إلى خط الأساس. - انقر على أدوات | فرز عائد الاستثمار في البرنامج ورسم الآثار لجميع القنوات الثلاث لكل عائد على الاستثمار. انقر فوق تقرير لحفظ بيانات عائد الاستثمار، بما في ذلك كل من البيانات الرقمية وعمليات تتبع التصوير لكل عائد استثمار في مجلد ملفات.
- حدد حدث الاندماج من خلال الزيادة المتزامنة في شدة التألق الموضعي PH-mNG (FPH) و A655 (F655) (داخل إطار واحد) ، مصحوبا بانخفاض في التألق الموضعي FFN511 (FFFN).
- ابحث عن مظهر FPH و F655 ، مما يشير إلى تكوين بقعة PH-mNG / A655 بسبب ملف تعريف Ω الناتج عن الاندماج ، مما يسمح بنشر PH-mNG من غشاء البلازما والانتشار المستمر ل A655 من الحمام.
- ابحث عن انخفاض FFFN ، مما يشير إلى إطلاقه من حويصلة بسبب فتح مسام الانصهار ويستبعد احتمال أن يكون مظهر FPH و F655 ناتجا عن غزو الغشاء الناجم عن داء الخلايا الداخلية.
- افحص الصورالثابتة XY/Z ذات الفاصل الزمني التي تظهر أحداث الاندماج التي تحدث في قاع الخلية. تحليل ثلاثة أنماط من أحداث الانصهار: 1) الاندماج الوثيق ، 2) الاندماج الدائمين ، و 3) الانصهار المتقلص.
ملاحظة: نادرا ما لوحظت أحداث الاندماج قبل إزالة الاستقطاب ، في حين يمكن ملاحظة عشرات أحداث الاندماج بعد إزالة الاستقطاب. بعد الانصهار ، قد يغلق ملف تعريف Ω مسامه ، أو يحافظ على مسامه المفتوحة ، أو يتقلص ليندمج في غشاء البلازما.- لتحديد الانصهار القريب ، ابحث عن تعتيم F655 لأن إغلاق مسام الاندماج يمنع تبادل الحمام A655 ، بينما يحافظ F PH ، مما يعكس التحويل المستمر ل PtdIns(4,5)P2 إلى PtdIns(4)P ، أو FPH يتحلل مع تأخير ، مما يعكس قرصة الحويصلة (الانصهار القريب ، الشكل 4A ، B).
- ابحث عن FPH و F655 المستدامين لتحديد الاندماج البقي (الشكل 4C).
- ابحث عن انخفاضات متوازية ل FPH و F655 ، مما يشير إلى انكماش Ω لتحديد اندماج الانكماش (الشكل 4D).
ملاحظة: تحقق من ملفات التصوير الأصلية لفحص آثار التصوير إذا لم يكن متأكدا من نوع الحدث. قد يساعد التحقق من كثافة الفلورسنت في بعض المناطق بدون حدث اندماج على التمييز بين إشارة الفلورسنت لأحداث الاندماج وإشارات الخلفية.
- آثار تمثيلية للرسم لتغيرات الكثافة لهذه القنوات الثلاث: FFN511 و PH-mNG و A655. حدد النسبة المئوية لأوضاع الاندماج المختلفة في كل خلية وأرقام المخطط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وباتباع الإجراءات التجريبية المبينة في الشكل 1 والشكل 2، تم نقل خلايا الكرومافين من الغدد الكظرية البقرية باستخدام PH-mNG لوضع علامة على غشاء البلازما؛ تمت إضافة A655 إلى محلول الحمام للكشف عن إغلاق مسام الانصهار. وتم تحميل الناقل العصبي الكاذب الفلورسنت FFN511 في الحويصلات للكشف عن الإطلاق. بعد ذلك ، تم إجراء تصوير الفاصل الزمني البؤري XY-plane ل FFN511 و PH-mNG و A655 كل 20-90 مللي ثانية في قاع الخلية (المستوى البؤري Z ~ 100-200 نانومتر فوق غشاء الخلية). تم إجراء تسجيل مشبك رقعة الخلية الكاملة وتطبيق إزالة الاستقطاب 1 ثانية من -80 إلى +10 mV لاستحضار الإكسو وكثرة الخلايا الداخلية (الشكل 3A-C). أدى هذا الاستقطاب إلى تيار الكالسيوم الداخلي ، وقفزة السعة التي تشير إلى إفرازات الخلايا الخارجية ، واضمحلال السعة بعد القفزة التي تشير إلى كثرة الخلايا الداخلية (الشكل 3D ، E).
مع التصويرالثابت XY / Z في قاع الخلية ، لوحظت العديد من أحداث الاندماج الفردية 8,24 بعد إزالة الاستقطاب (الشكل 4A) ، في حين لوحظت أحداث الاندماج النادرة قبل إزالة الاستقطاب. تم تحديد أحداث الاندماج الناجمة عن بروتوكول إزالة الاستقطاب 1 s على أنها انخفاض التألق الموضعي FFN511 (FFFN) الذي يعكس إطلاق FFN511 ، مصحوبا بزيادة التألق الموضعي FPH وA655 (F 655) التي تعكس انتشار PH-mNG و A655 من غشاء البلازما ومحلول الحمام إلى حويصلة الاندماج (ملف تعريف Ω المتولد عن الانصهار) 15.
بعد الانصهار ، قد يغلق ملف تعريف Ω الناتج عن اندماج الحويصلة مع غشاء البلازما 1) مسامه ، ويسمى الانصهار القريب ، 2) يحافظ على مسام اندماج مفتوحة ، تسمى اندماج البقاء ، أو 3) يتقلص للاندماج في غشاء البلازما ، ويسمى الانصهار المتقلص. تم تحديد الاندماج القريب على أنه تعتيم F655 بينما استمر FPH أو تحلل مع تأخير (الشكل 4B). تم الكشف عن الاندماج المتبقي كوجود مستدام لكل من بقع PH-mNG و A655 (الشكل 4C). تم الكشف عن الانصهار المتقلص على أنه اضمحلال متوازي FPH و F 655 مصحوبا بانخفاض مواز في حجم بقعة PH-mNG وبقعة A655 (الشكل 4D) 8,15,16,24.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول التجريبي (أ ، ب) يتم تقليم الغدد الكظرية البقرية بمقص لإزالة الأنسجة الدهنية (أ) ، وتنظيفها بمحلول لوك ، وهضمها من خلال الوريد الكظري (ب). (ج) الجزء الداخلي من الغدة الكظرية دون هضم (يسار) أو بعد الهضم السليم (يمين). (د) بعد غسلها وهضمها ، يتم عزل النخاع وفرمه إلى قطع صغيرة ، ويتم فصل خلايا الكرومافين عن النخاع المفروم بعد التصفية والطرد المركزي. (ه) خلايا الكرومافين كهربائية ومطلية على أغطية للحضانة. (F) في الأيام 2-3 ، تحقق من خلايا الكرومافين تحت المجهر قبل التجريب. (ز) يتم تضمين عينة الخلية في الغرفة لتسجيل المشبك الرقعة والتصوير البؤري. يتم تسجيل تيار الكالسيوم وتغيرات السعة وتضخيمها وعرضها على الشاشة. يتم الكشف عن تغيرات التألق عند التحفيز وعرضها على الشاشة. قضبان المقياس = 40 مم (A) ، 20 مم (B-D) ، 20 ميكرومتر (F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مشبك التصحيح والإعداد البؤري . (أ) في يوم التجريب ، يتم احتضان خلايا الكرومافين المزروعة على أغطية مع FFN511 لمدة 20 دقيقة. تضاف الصبغة A655 إلى محلول الحمام. (ب) يتم نقل خلايا الكرومافين الموجودة على الغطاء إلى غرفة تسجيل ، ويضاف محلول الحمام مع A655 إلى الغرفة. (ج) بعد إضافة قطرة من الزيت على هدف غمر الزيت 100x ، يتم تثبيت الغرفة على مسرح المجهر البؤري المقلوب. يتم غمر طرف السلك الأرضي في محلول الحمام. يتم إحضار الماصة إلى موضعها بعد التحميل بمحلول ماصة ويتم الاحتفاظ بها بواسطة حامل ماصة ، متصل بمنصة الرأس. يتم التحكم في المنصة بواسطة مناور دقيق بمحرك. (D) بعد العثور على خلية جيدة ، حرك طرف الماصة إلى محلول الحمام باستخدام المتلاعب الدقيق لبدء تسجيل مشبك رقعة الخلية الكاملة والتصوير البؤري. قضبان الميزان = 10 مم (A)، 5 مم (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تسجيلات الجهد المشبك للخلية الكاملة لتيارات الكالسيوم وتغيرات السعة الناجمة عن إزالة الاستقطاب . (أ) إعداد رسم خلايا الكرومافين أثناء تسجيل مشبك الجهد الكامل للخلية. يتم غمر خلية الكرومافين في محلول حمام يحتوي على A655 (أحمر) ، ويتم تسمية غشاء الخلية والحويصلات ب PH-mNG (أخضر) و FFN511 (سماوي) ، على التوالي. تم تعديل هذه الصورة بإذن من 24. (ب) صورة تمثيلية لخلية كرومافين مثبتة بالرقعة لاحظها برايتفيلد. (ج) صور تمثيلية ل PH-mNG (أخضر) و A655 (أحمر) و FFN511 (سماوي) في خلية ذات تركيز جيد على بصمة الخلية. (د) مثال على تغيرات تيار الكالسيوم والسعة الناجمة عن إزالة الاستقطاب بمقدار 1 ثانية من -80 إلى +10 مللي فولت. (ه) متوسط آثار تيارات الكالسيوم (ICa) وتغيرات السعة (سم) التي تم جمعها من 20 خلية كرومافين. تم تعديل هذه الصورة بإذن من 26. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر (B، C). الاختصارات: ICa = تيار الكالسيوم; سم = السعة. Depol = إزالة الاستقطاب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصور أحداث الاندماج تحت المجهر البؤري. (أ) يمكن الكشف عن العديد من بقع الاندماج باستخدام التصوير البؤري على مستوى XY ل PH-mNG (أخضر) و A655 (أحمر) و FFN511 (سماوي) في قاع الخلية. تم استحضار الانصهار من خلال إزالة الاستقطاب 1 ثانية من -80 إلى +10 mV (depol1s). خضعت بقع FFN للإطلاق والاندماج الوثيق (الدوائر). يتم عرض الصور قبل (-1 ثانية) وبعد (+1 ثانية و+10 ثانية) إزالة الاستقطاب. (ب) مثال على الانصهار الوثيق. (ج) مثال على الاندماج في الإقامة. (د) مثال على الانصهار المتقلص. تم تعديل هذه الصورة بإذن من 24. أشرطة المقياس = 1 ميكرومتر (A)، 0.5 ميكرومتر (B-D). الاختصارات: Depol = إزالة الاستقطاب; F = كثافة الفلورسنت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| متوسطة / الحل | وصف | ||
| حل لوك | 145 ملليمتر كلوريد الصوديوم، 5.4 ملم KCl، 2.2 ملليمتر Na 2HPO 4، 0.9 ملليمتر NaH2PO4، 5.6 ملليمتر جلوكوز، و 10 ملليمتر HEPES، الرقم الهيدروجيني 7.3، معدلة باستخدام NaOH | ||
| محلول الإنزيم | 1.5 ملغم/مل كولاجيناز P، 0.325 ملغم/مل مثبط التربسين، و5 ملغم/مل ألبومين مصل البقر في محلول لوك | ||
| الوسط الثقافي | DMEM متوسط مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ | ||
| الحل الداخلي | 130 ملليمتر Cs-glutamate، 0.5 mM Cs-EGTA، 12 mM NaCl، 30 mM HEPES، 1 mM MgCl 2، 2 mM ATP، و 0.5 mM GTP، الرقم الهيدروجيني7.2، المعدل باستخدام CsOH | ||
| حل الحمام | 125 ملليمتر كلوريد الصوديوم، 10 ملليمتر جلوكوز، 10 ملليمتر هيبس، 5 ملليمتر لكل كلوريد الصوديوم 2، 1 ملم مج كل2، 4.5 ملم كيه.إل، و20 ملم شاي، درجة الحموضة 7.3، معدلة باستخدام NaOH | ||
الجدول 1: التفاصيل المتعلقة بتكوين الوسط الثقافي والحلول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم وصف طريقة التصوير المجهري البؤري للكشف عن ديناميكيات مسام الاندماج وإطلاق جهاز الإرسال ، بالإضافة إلى ثلاثة أوضاع اندماج ، اندماج وثيق ، اندماج البقاء ، وانكماش الانصهار في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية 4,24. يتم وصف طريقة الفيزيولوجيا الكهربية لإزالة استقطاب الخلية وبالتالي إثارة الإكسو وكثرة الخلايا الداخلية. توفر المعالجة المنهجية للصور متحدة البؤرة معلومات حول أنماط مختلفة من سلوكيات المسام لأحداث الاندماج والانشطار.
توفر المراقبة المتزامنة لتيار الكالسيوم وتغيرات السعة في نفس الخلية مع تكوين الخلية بأكملها معلومات إضافية حول داء الخلايا الخارجية والخلايا الداخلية ، مما يعني ضمنا نسبة فتح المسام وإغلاقها على مستوى الخلية بأكملها في أي وقت من الأوقات. هذه الطرق ، من حيث المبدأ ، قابلة للتطبيق على الخلايا الأخرى القابلة للإثارة والخلايا غير القابلة للإثارة كهربائيا في الثقافة الأولية أو في خطوط الخلايا التي تحتوي على حويصلات من ~ 200-1600 نانومتر15. بالإضافة إلى خلايا الكرومافين ، تم تطبيق الطريقة الموضحة هنا على خط خلايا بيتا البنكرياس الفئران ، خلايا INS-14.
من حيث المبدأ ، يمكن أيضا تطبيق الطريقة على الخلايا الإفرازية التي تحتوي على حويصلات أصغر من 200 نانومتر. ومع ذلك ، مع انخفاض حجم الحويصلة ، قد تكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة للغاية بحيث لا يمكن اكتشافها بشكل موثوق. قد يصبح التصوير فائق الدقة بدلا من التصوير البؤري ضروريا. حتى الآن ، لم يتم تطبيق الطرق الموضحة هنا على نقاط الاشتباك العصبي التي تحتوي على حويصلات متشابكة ~ 40 نانومتر.
يعتمد التنفيذ الناجح للطريقة الموضحة هنا بشكل حاسم على العديد من الخطوات العامة ، مثل جودة خلية الزرع ، وكفاءة نقل البلازميد ، ومعدل نجاح التسجيل الكهروفسيولوجي. أولا ، الخلايا السليمة حيوية لكل من تسجيل المشبك الرقعة والتصوير البؤري. لا ينصح باستخدام عوامل مضادة للبكتيريا أو مضادة للفطريات أثناء الزراعة لأن هذه المواد الكيميائية قد تؤثر على استثارة خلايا الكرومافين. وبالتالي ، فإن الممارسة الدؤوبة للتقنية المعقمة واستخدام الوسائط المعدة حديثا أمر مهم. على الرغم من أن خلايا الكرومافين المستزرعة الأولية يمكن أن تعيش في الأطباق لمدة أسبوع واحد على الأقل25 ، فمن المهم للمستخدمين الجدد استخدام الخلايا في الأيام من 2 إلى 3 للتجارب. مع نمو الخلايا الليفية تدريجيا ، يصبح من الصعب إنشاء تكوين مشبك التصحيح للخلية بأكملها. ثانيا ، تبلغ كفاءة البلازميدات الكهربائية في خلايا الكرومافين حوالي 20-30٪. يجب تحسين كفاءة الكهربية إذا كانت منخفضة جدا أو كان تألق PH-mNG قاتما للغاية. ثالثا ، تم تصوير الخلايا في قيعانها بهدف نفطي 100x للحصول على أحداث جوهرية تشير إليها التغييرات في ثلاثة مجسات فلورسنت: FFN511 و PH-mNG و A655. على الرغم من أن DIC يوفر رؤية أوضح من التصوير الميداني الساطع أو العين المجردة عند إنشاء تكوين الخلية بأكملها ، إلا أن أي تقنية تصور تسمح للمستخدم بإنشاء التكوين كافية.
تعد قوة طاقة الليزر المناسبة أمرا حيويا للتصوير البؤري في الخلايا الحية. نظرا لأن FFN511 و mNG قد يتم تبييضهما بواسطة طاقة ليزر عالية ، فمن الأفضل البحث عن خلية جيدة ذات تألق فوق الفلور قبل التصور باستخدام الليزر متحد البؤرة. بالنسبة ل A655 ، هناك حاجة إلى إثارة ليزر عالية الطاقة لتبييض الصبغة داخل الحويصلات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن السبب الأكثر شيوعا لعدم نجاح هذه التجربة هو فشل تسجيل مشبك التصحيح. يعد طرف ماصة نظيف ومصقول بالحجم المناسب والممارسة التي تولد تكوين الخلية الكاملة على خلايا الكرومافين من العوامل الرئيسية. على الرغم من أن الأمر قد يستغرق بعض الوقت والجهد لتحقيق النجاح ، إلا أنه بمجرد إنشائها ، توفر هذه التجارب بيانات كبيرة فيما يتعلق بكل من أحداث الاندماج والانشطار ، مما يشير إلى فتح وإغلاق مسام الغشاء على مستوى حدث واحد.
يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا مع بعض التعديلات لتعزيز الأهداف التجريبية المختلفة. ومع ذلك ، بغض النظر عن الأهداف التجريبية ، فمن المستحسن أولا استخدام محلول البوتاسيوم العالي (مثل 70 mM KCl) كحافز لرؤية التغييرات التي يمر بها الغشاء عند إزالة الاستقطاب ، مما يضمن إمكانية تصور تغييرات الكثافة في هذه الأصباغ الثلاثة ، FFN و PH و A655. يمكن تسمية غشاء البلازما بفلوروفورات أخرى ملزمة بالغشاء ، مثل mCLING (مجموعة فلوروفور - سيستين - ليسين - بالميتويل المرتبطة بالغشاء) 4،27 أو CAAX (زخارف بروتينية تستهدف غشاء البلازما الذي يواجه السيتوسول عن طريق إيزوبرينيشن بقايا السيستين) 4،28. يمكن استبدال A655 بأصباغ أخرى ذات أطياف مختلفة ، مثل Atto 532 (A532) ، اعتمادا على مزيج من جزيئات الفلورسنت المستخدمة في بعض التجارب15. يمكن استخدام Neuropeptide Y بدلا من الناقلات العصبية الكاذبة الفلورية16.
كان FFN511 متحمسا عند 458 نانومتر بدلا من 405 نانومتر في هذه التجربة على الرغم من أن طيف الإثارة الذروة ل FFN511 يبلغ حوالي 405 نانومتر. أظهرت الدراسة مع تسجيل السعة عدم وجود فرق كبير في خلايا الكرومافين مع أو بدون PH-mNG ، مما يشير إلى أن الإفراط في التعبير عن PH-mNG لا يؤثر على الإفرازات الخارجية وكثرة الخلايا الداخلية15,24. تم التحقق من نسب مماثلة لأحداث الاندماج في خلايا الكرومافين الموسومة ب PH-mNG و A532 فقط أو مع FFN511 ، مما يدل على أن تحميل FFN511 في حويصلات الكرومافين لا يؤثر على إطلاق المحتوى وأوضاع الاندماج المختلفة16. يمكن استبدال تحفيز إزالة الاستقطاب 1 s بمحلول عالي البوتاسيوم أو غيرها من أنواع إزالة الاستقطاب. يمكن استخدام هذه التعديلات للتكيف مع الأهداف التجريبية المختلفة.
على الرغم من مزايا هذه الطريقة القوية ، إلا أن لديها بعض القيود. يرتبط أكبر قيد بدقة محدودة الحيود (~ 230 نانومتر) للمجهر البؤري ، والذي يمكن التغلب عليه بواسطة تقنيات الفحص المجهري فائق الدقة الأكثر تقدما29. يبلغ قطر الحبيبات في خلايا الكرومافين البقرية حوالي 300 نانومتر6 ، مما يجعل من الممكن مراقبة فتح وإغلاق مسام الغشاء ضمن الدقة المكانية للمجهر البؤري. ومع ذلك ، فإن الحويصلات المشبكية هي ~ 30-60 نانومتر30 ، وهو ما يتجاوز الدقة البؤرية. إن توسيع قياسات التصوير بالخلايا الحية هذه إلى الحويصلات المشبكية الصغيرة يثبت أنه صعب مع التصوير البؤري.
تم تطوير تقنيات تصوير الخلايا الحية ذات الدقة الزمنية و / أو المكانية الأفضل ، مثل المجهر STED ، ومجهر إعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، ومجهر التوطين المنشط ضوئيا (PALM) ، والمجهر الفلوري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) ، والحد الأدنى من تدفقات الفوتون (MINFLUX) النانوية ويمكن تطبيقها على هذه الطريقة 31،32،33،34 . في الواقع ، تم استخدام المجهر STED للكشف عن ديناميكيات مسام الاندماج في خلايا الكرومافين. يمكن التحقق من الأنماط المختلفة لأحداث الاندماج وإغلاق ملف تعريف Ω المشكل مسبقا باستخدام الفحص المجهري فائق الدقة مثل المجهر STED24. وتشمل القيود الأخرى التبييض الضوئي والسمية الخلوية للبروتينات الفلورية والأصباغ.
يمكن تطبيق هذا المزيج من الفيزيولوجيا الكهربية والمجهر البؤري على نطاق واسع على العديد من الخلايا الإفرازية. سيكون الجمع بين الفحص المجهري فائق الدقة والطرق الموضحة هنا أداة قيمة لقياس ديناميكيات مسام الاندماج في الدوائر العصبية في المستقبل ، شريطة أن يتطور الفحص المجهري فائق الدقة إلى حد يمكنه من حل مسام الاندماج في المحطات العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
نشكر برامج البحوث الداخلية NINDS (ZIA NS003009-13 و ZIA NS003105-08) على دعم هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C.
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al.
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O'Connor, D. T., et al.
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al.
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
