Summary
该协议提出了大鼠深低温循环停搏的建立,可用于研究全身炎症反应综合征,缺血/再灌注损伤,氧化应激,神经炎症等。
Abstract
深度低温循环骤停(DHCA)常规应用于复杂先天性心脏病和主动脉弓疾病的手术。本研究旨在提供一种在大鼠中建立DHCA的方法。为了评估DHCA过程对生命体征的影响,使用没有循环停止的常温体外循环(CPB)大鼠模型作为对照。正如预期的那样,DHCA导致体温和平均动脉血压显着降低。血气分析表明,DHCA增加了乳酸水平,但不影响血液pH值和血红蛋白、血细胞比容、Na+、Cl−、K+和葡萄糖的浓度。此外,与常温CPB大鼠相比,透射电子显微镜结果显示DHCA大鼠海马自噬体轻度增加。
Introduction
自1953年以来,深低温循环骤停(DHCA)已用于心脏手术1。DHCA涉及将患者的核心温度降低到严重低温水平(15-22°C),然后全局中断流向身体的血液2。循环停滞可以提供相对不流血的操作场。深度低温会降低新陈代谢,特别是在大脑和心肌中,这是防止缺血的有效方法3。DHCA通常用于复杂先天性心脏病,主动脉弓疾病,甚至带有腔静脉血栓的肾脏或肾上腺肿瘤4,5的手术中。因此,建立DHCA动物模型为临床环境中程序的细化和并发症的预防提供了重要参考。
虽然可以用犬6、兔7和其他动物建立模型,但由于它们的可操作性和低成本,最好使用大鼠。DHCA大鼠模型于2006年由Jungwirth等人首次描述8。结果发现,循环停止的持续时间对神经系统结局有影响。从那时起,DHCA大鼠模型得到了广泛的研究。已经澄清,DHCA可能引发全身炎症反应综合征(SIRS)9。在随后的研究中,药理学家发现,由SIRS诱导的DHCA相关神经炎症可以通过白藜芦醇10和雷公藤内酯11减弱。我们的团队还发现,DHCA相关的神经炎症可以通过抑制冷诱导的RNA结合蛋白12来减弱。在心血管系统中,超氧化物歧化酶对DHCA13期间的缺血/再灌注(I / R)损伤具有心脏保护作用。这些结果扩大了对DHCA相关病理生理过程的理解,并为改善DHCA的结局提供了新的方向。然而,关于DHCA后内毒素血症,氧化应激和自噬的结果尚无定论。DHCA使用与体外循环(CPB)相同的操作技术14,但其管理策略不同,并且不同团队产生DHCA的步骤不同8,9,10,11。本研究旨在提供一种在大鼠中建立DHCA程序的方法。
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Protocol
该方案经过机构审查,并获得了中国医学科学院阜外医院机构动物护理和使用委员会的批准(FW-2021-0005)。所有实验程序均按照美国国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南进行。
注意:雄性Sprague-Dawley大鼠(重量:500-600克,年龄:12-14周)保持在标准实验室条件下,自由获取食物和水。将大鼠随机分为两组(n = 6,每组):DHCA组和常温CPB组(NtCPB组)。
1. 准备工作
- 实验前对手术器械(镊子,剪刀,微型镊子,电凝器,剃须刀等)进行消毒(图1)。
- 确保耗材的可用性,包括 2-0 丝、16 G 套管(气管内导管)、22 G 套管、自制 16 G 套管(多孔静脉导管)、注射器、纱布和胶带。
注意:对于自制的 16 G 套管,使用手术刀在套管尖端切开两个或三个直径为 2 毫米的孔,这将有助于使静脉引流更顺畅。 - 确保七氟醚、2% 利多卡因、生理盐水、肝素 (5 IU/mL、250 IU/mL)、肾上腺素 (40 μg/mL)、去甲肾上腺素 (20 μg/mL)、羟乙基淀粉和碳酸氢盐的可用性。
- 确保DHCA回路包含一个储液罐(由墨菲滴管修改而成),一个滚筒泵,一个热交换器,一个膜氧合器,连接管和一个水箱(图2)。连接电路,将 12 mL 羟乙基淀粉与 1 mL 肝素钠 (250 IU) 和 1 mL 生理盐水混合。用 14 mL 的灌注溶液灌注回路,辊泵轻轻旋转 (10-40 mL/min)。
注意:储液器由带有墨菲滴管的输血装置改造而成。滴管的静脉流入部分保持在10-15厘米,静脉出口部分保持在10厘米。
2.麻醉和插管
- 用2%-3%七氟烷麻醉大鼠,然后在大鼠失去意识后测试结膜反射和肌肉松弛的缺乏。
注意:结膜反射是指每当触摸角膜时眼睑立即闭合。用棉签轻轻触摸角膜。当麻醉深度足够时,眼睑不会闭合。 - 结膜反射消失且未观察到肌肉阻力后,使用 16 G 套管进行气管插管。将管子连接到呼吸机,并通过单击呼吸机上的按钮设置参数(潮气量:1.0-1.2 mL/100g,心率:每分钟 80 次 [bpm],I:E = 1:1,吸入氧分数:60%)。
- 在老鼠下面放一条电加热毯,用胶带固定老鼠。将眼药膏涂抹在眼睛上以防止干燥。用剃须刀剃除左腹股沟区域、右颈椎区域和尾巴的毛发。然后,用碘和酒精对皮肤进行三次消毒。
- 在进入后续步骤之前检查麻醉深度。如果呼吸频率高于呼吸机设定的呼吸频率(80 bpm),或者存在肌肉强直,则增加七氟醚的输出浓度。
注意:当麻醉深度足够时,呼吸节律应与呼吸机同步,肌肉应完全放松,不要紧张。每30分钟检查一次麻醉深度,以确保大鼠在整个过程中没有经历任何意识恢复。 - 用手术刀切开左腹股沟区域(约 1 厘米)的皮肤,然后轻轻解剖肌肉和组织,露出左股静脉和动脉。小心地分开动脉。
- 将 22 G 静脉导管插入左股动脉。用2-0丝绸结扎动脉和导管(在插管区域)。使用含生理盐水的肝素 (5 UI/mL) 冲洗套管以避免凝血。将导管与压力传感器连接以监测血压。
- 切开尾巴的皮肤(约1.5厘米),然后用手术刀切开尾动脉的浅筋膜,露出位于手术视野中间的尾动脉。
- 用 22 G 静脉导管插管尾动脉。用2-0丝绸结扎动脉和导管(在插管区域)。使用含生理盐水的肝素 (5 UI/mL) 冲洗导管以避免凝血。
注意:插管静脉导管时,左手用镊子握住动脉/静脉,右手用导管内的针刺穿动脉/静脉,然后将套管放入动脉。 - 切开右颈静脉(约 2 厘米)上的皮肤,然后将肌肉和组织分开以暴露静脉。将 16 G 自制多孔静脉导管插入右颈外静脉,并小心地将其放入右下腔静脉或右心房。
注意:左股静脉和动脉位于左腹股沟区域的表面下。静脉比动脉粗,动脉血色鲜红色。右颈静脉位于右颈椎区域的中间;当皮肤被切割并且肌肉被分离时,可以看到静脉(约0.3-0.4厘米宽)。当导管尖端接触右心房时,血压波会波动。然后,将导管向后拉一点后,导管的尖端将位于上腔静脉中。 - 通过右外静脉 给予 肝素钠(500 IU / kg)。用湿纱布覆盖每个空心区域,以避免污染。
注意:在手术台下放一个盒子,将其抬高约 40 厘米。
3. DHCA启动
- 首先将DHCA回路与尾动脉导管连接,并保持泵流量在1-2mL / min。然后,将储液器与右颈外静脉中的导管连接起来。确保储液槽中的血液水平始终约为 1 厘米。
- 打开水箱,先将水温设置为37°C。
- 血压稳定后,轻轻增加泵流量至80-100mL/kg/min,以泵血。
4. 冷却
- 将室温设置为20°C左右。 将冰块放入一次性手套中,然后将它们放在老鼠的头部和侧面。根据大鼠的直肠温度实时调节水箱的温度。
- 从股左动脉收集0.1毫升血液,并将其放在血气机上进行血气分析。根据血气分析结果(例如 PaCO2)适当更改呼吸机的相关参数。
注意:心率和血压可能会发生变化,应相应地调整泵流量。水箱和大鼠之间的温度梯度需要小于10°C。 确保温度可以在30分钟内降低到15-20°C。PaCO2 的正常范围为 35-45 mmHg。如果血气结果显示 PaCO2 较低,则可能会减少潮气量,反之亦然。
5.深低温循环停滞
- 当直肠温度降至15-20°C时,更换一次性手套(含冰),以确保在循环停滞期间维持深度低温。
- 停止滚筒泵,保持储液器与环境接触,并将血液从颈外静脉缓慢引流到储液器。
- 注意血压波形。当血压和心跳频率为0时,停止引流,并保持储液罐关闭。关闭呼吸机。
注意:循环停止的持续时间根据实验目的而变化。
6. 预热和再灌注
- 取下所有一次性手套,并将室温升高至25°C。 恢复膜氧合器通气,同时保持静脉引流管夹紧。打开滚轮泵,确保储液器中的血液慢慢回到大鼠体内。
- 打开呼吸机。一旦储液器中的血位保持在 1 cm,松开引流管,然后将血液从右心房缓慢引流到储液器。
- 打开加热灯、加热垫和水箱。首先将水箱的温度设置为25°C,然后根据大鼠的直肠温度及时调整其出口温度。
注意:加热灯应对准大鼠胸腔内的大血管,并应保持一定距离,以免烧伤组织。注意出口温度与大鼠直肠温度(<10°C)之间的温差。如有必要,测试血气,然后相应地调整呼吸机参数,并给予碳酸氢盐,电解质等。 - 直肠温度恢复到34°C后取下加热灯。
注意:作为快速复温过程的延续,此步骤应该很慢。在此阶段,七氟醚蒸发器,机械通风机和滚筒泵的设备参数可以恢复到CPB开始时的水平。
7. 戒断 CPB
- 缓慢逐渐降低滚筒泵的流速,并调整静脉引流速度,直到流速降低到1mL/min。
注意:每次流量调整应观察3-5分钟。 - 保持储液罐与环境接触(通过取下储液罐盖)。以 1 mL/min 的流速输注回路中的剩余血液。
- 停止膜氧合和滚筒泵。
- 在深度麻醉下进行一段时间的机械通气后对大鼠实施安乐死。
注意:这是一个终端过程。断奶CPB和安乐死之间的持续时间根据不同的研究方案而有所不同。记得用碘和酒精消毒伤口,然后用湿纱布覆盖每个空心区域,以避免安乐死前污染。增加七氟醚的输出浓度以增加麻醉深度。
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Representative Results
作为对照组,未发生循环骤停的常温CPB(NtCPB)大鼠在整个手术过程中平均动脉血压(MAP)和体温稳定,而DHCA大鼠心脏骤停期间的MAP下降(p <0.01, 图3A)。DHCA大鼠的温度在冷却阶段迅速下降,并在复温阶段逐渐恢复。当将大鼠从DHCA回路断奶时,DHCA大鼠的温度恢复正常(图3B)。
通过血气分析研究了DHCA过程对大鼠的影响。全血接触引发液后,两组血红蛋白(Hb)浓度均高于6 g / dL(图4A)。当将大鼠从DHCA回路中断奶时,由于CPB回路中的剩余血液输注到大鼠中,浓度增加到9g / dL。血细胞比容(HCT)显示出与Hb相似的倾向(图4B)。在CPB程序开始时,Hb和HCT的差异可能是由于大鼠的体重不同。DHCA大鼠的平均重量为571.1 g±7.254 g,而NtCPB组大鼠的平均重量分别为535.0 g±8.317 g(p = 0.075)。虽然Hb浓度的差异会导致血液运输氧气的能力差异,但两组的变化趋势相同,表明DHCA没有额外影响Hb浓度。在DHCA和再灌注后,乳酸水平迅速增加,这在DHCA组中更为明显(图4C)。DHCA手术后pH值下降,这很可能是乳酸积累的结果(图4D)。在整个实验过程中,Na+,Cl−,K +和葡萄糖的浓度在任何时间点都没有显示出显着差异(图5)。这些结果表明,DHCA仅引起乳酸增加,而不影响血液pH值和血红蛋白,血细胞比容,Na+,Cl−,K+和葡萄糖的浓度。
自噬是真核细胞使用溶酶体降解其细胞质蛋白和受损细胞器的过程15。在生理和一些病理条件下,轻度的自噬对于维持细胞稳态至关重要。然而,过度的自噬会导致代谢应激、细胞成分降解,甚至细胞死亡16。为了评估DHCA对神经自噬的影响,我们使用透射电子显微镜,令人惊讶的是,发现DHCA大鼠海马体中的自噬体数量增加(图6)。基于自噬体的双向功能,增加的自噬体在DHCA过程中是否起神经保护和代偿或病理作用仍需进一步研究。
图 1:DHCA 模型中使用的手术器械 。 (a) 碘,(b) 注射器,(c) 胶带,(d) 湿纱布,(e) 镊子,(f) 剪刀,(g,h) 微型镊子,(i) 电凝器,(j) 剃须刀和 (k) 丝绸。 请点击此处查看此图的大图。
图2:DHCA大鼠模型的体外循环回路。 (一) a:膜氧合器; b:热交换器; c:水库; d1:连接滚筒泵的管子(外径[外径],6毫米;内径[内径],4毫米;长度,15厘米); d2:连接热交换器和膜氧合器的管子(外径,6毫米;内径 4 毫米;长度,8厘米); d3:动脉出口线(外径,2.5毫米;内径,1.5毫米;长度,20厘米)。(二) a:水库; b:膜式氧合器; c:热交换器; d:滚筒泵。黄色箭头表示血流方向。 请点击此处查看此图的大图。
图3:DHCA大鼠和常温CPB大鼠的生命体征。 (A)在整个过程中持续监测平均动脉压和(B)直肠温度。数据以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示,每组n = 6。DHCA = 30 分钟。使用未配对的学生t检验比较两组在每个时间点的差异。缩写:DHCA = 深度低温循环停滞;NtCPB = 常温体外循环;MAP = 平均动脉血压。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; p > 0.05 未显示。请点击此处查看此图的大图。
图 4:大鼠血红蛋白、血细胞比容和乳酸的 pH 值和浓度。在三个时间点通过股动脉收集用于分析(A)血红蛋白,(B)血细胞比容,(C)乳酸,(D)和pH的动脉血样:CPB的开始,在DHCA之前,以及断奶CPB。DHCA = 30 分钟。数据以平均± SEM表示,每组n = 6。使用未配对的学生t检验比较两组在每个时间点的差异。缩写:DHCA = 深度低温循环停滞;NtCPB = 常温体外循环;Hb = 血红蛋白;Hct = 血细胞比她;紫胶=乳酸。* <0.05。请点击此处查看此图的大图。
图5:大鼠中Na +,Cl −,K +和葡萄糖的浓度。 用于分析(A)Na+,(B)Cl−,(C)K +和(D)葡萄糖的动脉血液样本通过股动脉 在 三个时间点收集:CPB的开始,在DHCA之前,以及断奶CPB。DHCA = 30 分钟。数据以平均± SEM表示,每组n = 6。使用未配对的学生 t检验比较两组在每个时间点的差异。缩写:DHCA = 深度低温循环停滞;NtCPB = 常温体外循环;Glu = 葡萄糖。 p > 0.05 未显示。 请点击此处查看此图的大图。
图6:大鼠海马体中的自噬体。 在断奶CPB回路30分钟后对大鼠实施安乐死,并立即收获海马体。然后,将海马体固定在戊二醛中,进一步透射电镜检查(A)NtCPB大鼠和(B)DHCA大鼠海马体中自噬体的表达。DHCA = 30 分钟。比例尺:1 μm 和 250 nm。箭头指向自噬体。缩写:DHCA = 深度低温循环停滞;NtCPB = 常温体外循环。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
插管是在大鼠中建立DHCA的最基本程序。插管前,用 0.5 mL 的 2% 利多卡因浸泡动脉将使其更容易插管。插管后,需要通过颈外静脉 用 500IU / kg肝素进行肝素化,以避免微血栓形成17。我们反复发现,这种剂量的肝素可以达到激活凝血时间(ACT)>480秒的目标。复温期是最困难的部分。在我们的实验中,温度从18°C上升到34°C需要60多分钟,而在其他一些实验中,复温期可以在30分钟或40分钟内完成18,19。Linardi等人报告说,较高的复温率(45分钟)增加了炎症反应,并可能影响DHCA20后的脑水肿。同时,胸外科医师协会、心血管麻醉医师协会和美国体外技术学会的指南分别指出,冷却或复温期间的温度梯度不应超过10°C,以避免产生气态栓子和释气,21。
在复温期间,由于心脏骤停期间氧气输送不足或酸中毒,心脏可能难以重新跳动。此外,心脏可能对 10-20 μg 肾上腺素没有反应。此时,应增加泵流量,并确保足够的灌注压力。如果在确定足够的血容量时仍然存在难治性低血压,则可以施用去甲肾上腺素(每次4μg)以收缩外周血管,改善舒张压,从而改善冠状动脉灌注22。
我们的实验存在一些局限性。没有进行开胸术,因此伤害性刺激与临床患者不同。其次,心脏停搏溶液不用于心肌麻痹。在我们的实验中,心脏骤停是由体温过低和低血压引起的。现有方法减少了开胸术的损害,这意味着它可用于研究体温过低和缺血对器官的影响。
该模型可用于研究DHCA诱导的SIRS、I/R损伤、氧化应激、神经炎症、神经行为改变等的病理生理机制和药物治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢张亮在实验过程中帮助收集视频数据。本研究得到了国家自然科学基金(批准号:82070479)和中央高校基本科研业务费(批准号:3332022128)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Heat Exchanger | Xi’an Xijing Medical Appliance Co., Ltd | Animal-M | |
Membrane Oxygenator | Dongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd. | Micro-M | |
Monitor | Chengdu Techman Co., Ltd | BL-420s | |
Roller Pump | Changzhou Prefluid Technology Co.,Ltd | BL100 | |
SD Rat | HFK Bioscience Co.,Ltd. | / | |
Sevoflurane | Maruishi Pharmaceutical Co. Ltd | H20150020 | |
Shaver | Hangzhou Huayuan Pet Products Co.,Ltd. | / | |
Vaporizer | SPACECABS | / | |
Ventilator | Shanghai Alcott Biotech Co., Ltd | ALC-V8S | |
Water Tank | Maquet Critical Care AB | Jostra HCU20-600 |
References
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