Immunology and Infection

चूहों में गहरी हाइपोथर्मिक परिसंचरण गिरफ्तारी की स्थापना

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/63571

¹Department of Cardiopulmonary Bypass, National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, State Key Laboratory of Cardiovascular Medicine, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों में गहरी हाइपोथर्मिक परिसंचरण गिरफ्तारी की स्थापना प्रस्तुत करता है, जिसे प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया सिंड्रोम, इस्किमिया / रीपरफ्यूजन चोट, ऑक्सीडेटिव तनाव, न्यूरोइन्फ्लेमेशन आदि की जांच के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

डीप हाइपोथर्मिक सर्कुलेटरी अरेस्ट (डीएचसीए) को नियमित रूप से जटिल जन्मजात हृदय रोग और महाधमनी आर्क रोग के लिए सर्जरी के दौरान लागू किया जाता है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य चूहों में डीएचसीए स्थापित करने के लिए एक विधि प्रदान करना है। महत्वपूर्ण संकेतों पर डीएचसीए प्रक्रिया के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, संचार गिरफ्तारी के बिना एक सामान्य तापमान कार्डियोपल्मोनरी बाईपास (सीपीबी) चूहे मॉडल का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, डीएचसीए ने शरीर के तापमान और औसत धमनी रक्तचाप में महत्वपूर्ण कमी की। रक्त गैस विश्लेषण ने संकेत दिया कि डीएचसीए ने लैक्टिक एसिड के स्तर में वृद्धि की, लेकिन रक्त पीएच और हीमोग्लोबिन, हेमटोक्रिट, एनए ⁺, सीएल^-, के ⁺, और ग्लूकोज की सांद्रता को प्रभावित नहीं किया। इसके अलावा, सामान्य तापमान सीपीबी चूहों की तुलना में, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के परिणामों ने डीएचसीए चूहों में हिप्पोकैम्पल ऑटोफैगोसोम में हल्की वृद्धि दिखाई।

Introduction

डीप हाइपोथर्मिक सर्कुलेटरी अरेस्ट (डीएचसीए) का उपयोग 1953 से कार्डियक सर्जरी में किया गया^है_। डीएचसीए^{में शरीर में} रक्त के प्रवाह को बाधित करने से पहले रोगी के मुख्य तापमान को गहराई से हाइपोथर्मिक स्तर (15-22 डिग्री सेल्सियस) तक कम करना शामिल है। संचार गिरफ्तारी अपेक्षाकृत रक्तहीन ऑपरेटिंग क्षेत्र प्रदान कर सकती है। डीप हाइपोथर्मिया चयापचय को कम करता है, विशेष रूप से मस्तिष्क और मायोकार्डियम में, जो इस्किमिया³ के खिलाफ सुरक्षा का एक प्रभावी तरीका है। डीएचसीए आमतौर पर जटिल जन्मजात हृदय रोग, महाधमनी आर्क रोग, और यहां तक कि वेना कावा थ्रोम्बस ^4,5 के साथ गुर्दे या अधिवृक्क ट्यूमर के लिए सर्जरी के दौरान लागू होता ^है। इसलिए, डीएचसीए पशु मॉडल की स्थापना प्रक्रिया के शोधन और नैदानिक सेटिंग्स में जटिलताओं की रोकथाम के लिए एक महत्वपूर्ण संदर्भ प्रदान करती है।

यद्यपि मॉडल कैनाइन⁶, खरगोश⁷ और अन्य जानवरों के साथ स्थापित किए जा सकते हैं, लेकिन उनकी संचालन क्षमता और कम लागत के कारण चूहों का उपयोग करना बेहतर है। DHCA चूहे मॉडल को पहली बार 2006 में जंगविर्थ एट ^अल.8 द्वारा वर्णित किया गया था। यह पाया गया कि संचार गिरफ्तारी की अवधि का न्यूरोलॉजिकल परिणामों पर प्रभाव पड़ा। तब से, डीएचसीए चूहे मॉडल की व्यापक रूप से जांच की गई है। यह स्पष्ट किया गया है कि डीएचसीए प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया सिंड्रोम (एसआईआरएस) 9 को उकसा सकता ^है। बाद के अध्ययनों में, फार्माकोलॉजिस्ट ने पाया कि एसआईआरएस द्वारा प्रेरित डीएचसीए से संबंधित न्यूरोइन्फ्लेमेशन रेस्वेराट्रोल¹⁰ और ट्रिप्टोलाइड¹¹ द्वारा क्षीण हो सकता है। हमारी टीम ने यह भी पाया कि डीएचसीए से संबंधित न्यूरोइन्फ्लेमेशन को कोल्ड-इंड्यूसेबल आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन^{12 को रोककर} क्षीण किया जा सकता है। कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम में, सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज का डीएचसीए¹³ के दौरान इस्किमिया / रीपरफ्यूजन (आई / आर) चोटों पर कार्डियोप्रोटेक्टिव प्रभाव पड़ता है। इन परिणामों ने डीएचसीए से संबंधित पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं की समझ का विस्तार किया और डीएचसीए के परिणामों में सुधार के लिए नई दिशाओं की पेशकश की। हालांकि, डीएचसीए के बाद एंडोटॉक्सिमिया, ऑक्सीडेटिव तनाव और ऑटोफैगी के बारे में परिणाम अनिश्चित हैं। डीएचसीए कार्डियोपल्मोनरी बाईपास (सीपीबी) ¹⁴ के समान परिचालन तकनीक का उपयोग करता है, लेकिन इसकी प्रबंधन रणनीति अलग है, और डीएचसीए उत्पन्न करने के कदम विभिन्न टीमों ^8,9,10,11 में भिन्न होते ^हैं। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य चूहों में डीएचसीए प्रक्रिया स्थापित करने के लिए एक विधि प्रदान करना है।

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Protocol

प्रोटोकॉल की संस्थागत समीक्षा की गई और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, फुवाई अस्पताल, चीनी चिकित्सा विज्ञान अकादमी (एफडब्ल्यू-2021-0005) से अनुमोदन प्राप्त हुआ। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया गया था।

नोट: नर स्प्राग-डॉवले चूहों (वजन: 500-600 ग्राम, आयु: 12-14 सप्ताह) को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ मानक प्रयोगशाला स्थितियों के तहत रखा गया था। चूहों को यादृच्छिक रूप से दो समूहों (एन = 6, प्रत्येक समूह) में आवंटित किया गया था: डीएचसीए समूह, और सामान्य तापमान सीपीबी समूह (एनटीसीपीबी समूह)।

1. प्रारंभिक कार्य

प्रयोग से पहले सर्जिकल उपकरणों (फोर्सप्स, कैंची, माइक्रो-फोर्सप्स, एक इलेक्ट्रोकोआगुलेटर, एक शेवर, आदि) को निष्फल करें (चित्रा 1)।
उपभोग्य सामग्रियों की उपलब्धता सुनिश्चित करें, जिसमें 2-0 रेशम, 16 ग्राम कैनुला (एंडोट्राचेल कैथेटर), एक 22 जी कैनुला, एक घर का बना 16-जी कैनुला (बहु-छिद्र अंतःशिरा कैथेटर), इंजेक्शन सिरिंज, धुंध और टेप शामिल हैं।
नोट: घर का बना 16 जी कैनुला के लिए, कैनुला की नोक पर 2 मिमी व्यास के दो या तीन छिद्रों को काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें, जो शिरापरक जल निकासी को चिकना बनाने में मदद करेगा।
सेवोफ्लुरेन, 2% लिडोकेन, खारा, हेपरिन (5 आईयू / एमएल, 250 आईयू / एमएल), एपिनेफ्रीन (40 μg / mL), नॉरपेनेफ्रिन (20 μg / mL), हाइड्रॉक्सीइथाइल स्टार्च और बाइकार्बोनेट की उपलब्धता सुनिश्चित करें।
सुनिश्चित करें कि डीएचसीए सर्किट में एक जलाशय (मर्फी के ड्रॉपर से संशोधित), एक रोलर पंप, एक हीट एक्सचेंजर, एक झिल्ली ऑक्सीजनेटर, कनेक्टिंग ट्यूब और एक पानी की टंकी (चित्रा 2) शामिल है। सर्किट को कनेक्ट करें, और 1 एमएल हेपरिन सोडियम (250 आईयू) और 1 एमएल खारा के साथ 12 एमएल हाइड्रॉक्सीइथाइल स्टार्च मिलाएं। रोलर पंप के साथ 14 एमएल प्राइमिंग समाधान के साथ सर्किट को धीरे से घुमाते हुए (10-40 एमएल / मिनट) प्राइमिंग करें।
नोट: जलाशय को मर्फी के ड्रॉपर के साथ रक्त आधान उपकरण से फिर से ढाला जाता है। ड्रॉपर का शिरापरक प्रवाह भाग 10-15 सेमी पर रहता है, और शिरापरक आउटलेट भाग 10 सेमी पर रहता है।

2. एनेस्थीसिया और कैनुलाशन

चूहों को 2% -3% सेवोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें, और फिर चूहे के चेतना खोने के बाद नेत्रश्लेष्मला रिफ्लेक्स और मांसपेशियों में छूट की कमी के लिए परीक्षण करें।
नोट: नेत्रश्लेष्मला रिफ्लेक्स पलक के तत्काल बंद होने को संदर्भित करता है जब भी कॉर्निया को छुआ जाता है। कॉर्निया को थोड़ा सा छूने के लिए कपास के फाहे का उपयोग करें। जब संज्ञाहरण की गहराई पर्याप्त होती है, तो पलकें बंद नहीं होंगी।
नेत्रश्लेष्मला रिफ्लेक्स गायब होने और कोई मांसपेशियों का प्रतिरोध नहीं देखे जाने के बाद 16 ग्राम कैनुला के साथ एंडोट्राचेल इंटुबैशन करें। ट्यूब को वेंटिलेटर से कनेक्ट करें, और वेंटिलेटर पर बटन पर क्लिक करके पैरामीटर सेट करें (ज्वारीय मात्रा: 1.0-1.2 एमएल / 100 ग्राम, हृदय गति: 80 बीट्स प्रति मिनट [बीपीएम], आई: ई = 1: 1, प्रेरित ऑक्सीजन अंश: 60%)।
चूहे के नीचे एक इलेक्ट्रिक हीटिंग कंबल डालें, और चूहे को टेप से ठीक करें। सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मलहम लगाएं। बालों को बाएं इनगुइनल क्षेत्र, दाएं ग्रीवा क्षेत्र और पूंछ पर एक शेवर के साथ शेव करें। फिर, आयोडीन और शराब के साथ त्वचा को तीन बार कीटाणुरहित करें।
अगले चरणों में जाने से पहले संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। यदि श्वसन दर वेंटिलेटर (80 बीपीएम) द्वारा निर्धारित से अधिक है, या यदि मांसपेशियों की कठोरता है, तो सेवोफ्लुरेन की आउटपुट एकाग्रता में वृद्धि करें।
नोट: जब संज्ञाहरण की गहराई पर्याप्त होती है, तो श्वसन ताल को वेंटिलेटर के साथ सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए, और मांसपेशियों को तनाव के बिना पूरी तरह से आराम दिया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए हर 30 मिनट में संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें कि चूहा पूरी प्रक्रिया में चेतना की वापसी का अनुभव नहीं कर रहा है।
बाएं इंगुइनल क्षेत्र (लगभग 1 सेमी) पर त्वचा को काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें, और बाईं ऊरु नस और धमनी को उजागर करने के लिए मांसपेशियों और ऊतक को धीरे से विच्छेदित करें। धमनी को सावधानी से अलग करें।
बाईं ऊरु धमनी में 22 जी अंतःशिरा कैथेटर को कैनुला करें। धमनी और कैथेटर को 2-0 रेशम (कैनुलाशन के क्षेत्र में) के साथ लपेटें। क्लॉटिंग से बचने के लिए कैनुला को फ्लश करने के लिए नमकीन युक्त हेपरिन (5 यूआई / एमएल) का उपयोग करें। रक्तचाप की निगरानी के लिए कैथेटर को दबाव सेंसर से कनेक्ट करें।
पूंछ की त्वचा (लगभग 1.5 सेमी) को काटें, और फिर पूंछ धमनी को उजागर करने के लिए पूंछ धमनी की सतही प्रावरणी को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, जो सर्जिकल क्षेत्र के बीच में है।
22 जी अंतःशिरा कैथेटर के साथ पूंछ धमनी को कैनुलाट करें। धमनी और कैथेटर को 2-0 रेशम (कैनुलाशन के क्षेत्र में) के साथ लपेटें। थक्के से बचने के लिए कैथेटर को फ्लश करने के लिए नमकीन युक्त हेपरिन (5 यूआई / एमएल) का उपयोग करें।
नोट: अंतःशिरा कैथेटर को नष्ट करते समय, बायां हाथ धमनी / नस को बल के साथ पकड़ता है, और दायां हाथ कैथेटर के अंदर सुई के साथ धमनी / नस को छेदता है और फिर प्रवेशनी को धमनी में डालता है।
त्वचा को दाहिने जुगुलर नस (लगभग 2 सेमी) पर काटें, और फिर नस को उजागर करने के लिए मांसपेशियों और ऊतक को अलग करें। 16 ग्राम होममेड मल्टी-ओरिफेल इंट्रावेनस कैथेटर को दाईं बाहरी जुगुलर नस में डालें, और इसे दाईं अवर वेना कावा या दाएं आलिंद में सावधानी से डालें।
नोट: बाईं ऊरु नस और धमनी बाएं इंगुइनल क्षेत्र की सतह के नीचे हैं। नस धमनी की तुलना में मोटी होती है, और धमनियों का रक्त रंग चमकदार लाल होता है। दाहिनी जुगुलर नस दाहिने ग्रीवा क्षेत्र के बीच में है; जब त्वचा को काटा जाता है और मांसपेशियों को अलग किया जाता है, तो नस देखी जा सकती है (लगभग 0.3-0.4 सेमी चौड़ी)। जब कैथेटर की नोक दाएं आलिंद को छूती है, तो रक्तचाप की लहर में उतार-चढ़ाव होगा। फिर, कैथेटर को थोड़ा पीछे खींचने के बाद, कैथेटर की नोक बेहतर वेना कावा में होगी।
दाईं बाहरी नस के माध्यम से हेपरिन सोडियम (500 आईयू / किग्रा) का प्रबंधन करें। संदूषण से बचने के लिए नम धुंध के साथ प्रत्येक प्रवेशनी क्षेत्र को कवर करें।
नोट: इसे लगभग 40 सेमी ऊपर उठाने के लिए ऑपरेटिंग टेबल के नीचे एक बॉक्स रखें।

3. डीएचसीए की शुरुआत

डीएचसीए सर्किट को पहले पूंछ धमनी में कैथेटर के साथ कनेक्ट करें, और पंप प्रवाह दर को 1-2 एमएल / मिनट पर रखें। फिर, जलाशय को दाहिने बाहरी जुगुलर नस में कैथेटर से जोड़ें। सुनिश्चित करें कि जलाशय में हमेशा लगभग 1 सेमी का रक्त स्तर होता है।
पानी की टंकी चालू करें, और पहले पानी का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
रक्तचाप स्थिर होने के बाद, रक्त पंप करने के लिए पंप प्रवाह को धीरे-धीरे 80-100 एमएल / किग्रा / मिनट तक बढ़ाएं।

4. शीतलन

कमरे का तापमान लगभग 20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। डिस्पोजेबल दस्ताने में बर्फ के टुकड़े रखें, और फिर उन्हें चूहे के सिर और किनारों पर रखें। चूहों के मलाशय के तापमान के अनुसार वास्तविक समय में टैंक के तापमान को समायोजित करें।
बाईं ऊरु धमनी से 0.1 एमएल रक्त एकत्र करें, और इसे रक्त गैस विश्लेषण के लिए रक्त गैस मशीन पर रखें। रक्त गैस विश्लेषण (जैसे, पीएसीओ₂) के परिणामों के अनुसार वेंटिलेटर के प्रासंगिक मापदंडों को उचित रूप से बदलें।
नोट: हृदय गति और रक्तचाप बदल सकते हैं, और पंप प्रवाह दर को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। पानी की टंकी और चूहे के बीच तापमान ढाल 10 डिग्री सेल्सियस से कम होना चाहिए। सुनिश्चित करें कि तापमान 30 मिनट के भीतर 15-20 डिग्री सेल्सियस तक कम हो सकता है। पीएसीओ₂ की सामान्य सीमा 35-45 मिमीएचजी है। यदि रक्त गैस के परिणाम कम पीएसीओ₂ दिखाते हैं, तो ज्वारीय मात्रा कम हो सकती है और इसके विपरीत।

5. गहरी हाइपोथर्मिक संचार गिरफ्तारी

जब मलाशय का तापमान 15-20 डिग्री सेल्सियस तक गिर जाता है, तो संचार गिरफ्तारी के दौरान गहरे हाइपोथर्मिया के रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए डिस्पोजेबल दस्ताने (बर्फ युक्त) बदलें।
रोलर पंप को रोकें, जलाशय को पर्यावरण के संपर्क में रखें, और बाहरी जुगुलर नस से जलाशय में धीरे-धीरे रक्त निकालें।
रक्तचाप तरंग पर ध्यान दें। जब रक्तचाप और हृदय की धड़कन दर 0 हो जाती है, तो जल निकासी को रोक दें, और जलाशय को बंद रखें। वेंटिलेटर बंद कर दें।
नोट: संचार गिरफ्तारी की अवधि प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार भिन्न होती है।

6. वार्म-अप और रीपरफ्यूजन

सभी डिस्पोजेबल दस्ताने हटा दें, और कमरे के तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं। शिरापरक जल निकासी ट्यूब क्लिपिंग रखते हुए झिल्ली ऑक्सीजनेटर वेंटिलेशन को बहाल करें। यह सुनिश्चित करने के लिए रोलर पंप चालू करें कि जलाशय में रक्त धीरे-धीरे चूहे के शरीर में वापस चला जाता है।
वेंटिलेटर चालू करें। एक बार जब जलाशय में रक्त का स्तर 1 सेमी पर रहता है, तो जल निकासी ट्यूब को ढीला करें, और रक्त को दाएं आलिंद से धीरे-धीरे जलाशय में निकालें।
हीटिंग लैंप, हीटिंग पैड और पानी की टंकी चालू करें। पानी की टंकी के तापमान को पहले 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और फिर चूहे के मलाशय के तापमान के अनुसार समय पर इसके आउटलेट तापमान को समायोजित करें।
नोट: हीटिंग लैंप को चूहे के वक्ष गुहा में बड़ी रक्त वाहिकाओं पर निर्देशित किया जाना चाहिए, और ऊतकों को जलाने से बचने के लिए इसे एक निश्चित दूरी पर रखा जाना चाहिए। आउटलेट तापमान और चूहे के मलाशय के तापमान (<10 डिग्री सेल्सियस) के बीच तापमान अंतर पर ध्यान दें। यदि आवश्यक हो, तो रक्त गैस का परीक्षण करें, और फिर तदनुसार वेंटिलेटर मापदंडों को समायोजित करें, और बाइकार्बोनेट, इलेक्ट्रोलाइट्स आदि का प्रशासन करें।
मलाशय का तापमान 34 डिग्री सेल्सियस पर लौटने के बाद हीटिंग लैंप को हटा दें।
नोट: यह कदम, तेजी से रीवार्मिंग प्रक्रिया की निरंतरता के रूप में, धीमा होना चाहिए। इस स्तर पर, सेवोफ्लुरेन वेपोराइज़र, मैकेनिकल वेंटिलेटर और रोलर पंप के उपकरण मापदंडों को सीपीबी की शुरुआत में स्तरों पर बहाल किया जा सकता है।

7. सीपीबी को बंद करना

धीरे-धीरे और धीरे-धीरे रोलर पंप प्रवाह दर को कम करें, और शिरापरक जल निकासी की गति को समायोजित करें जब तक कि प्रवाह दर 1 एमएल / मिनट तक कम न हो जाए।
नोट: प्रत्येक प्रवाह दर समायोजन 3-5 मिनट के लिए देखा जाना चाहिए।
जलाशय को पर्यावरण के संपर्क में रखें (जलाशय कैप को बंद करके)। शेष रक्त को परिपथ में 1 mL/min की प्रवाह दर के साथ डालें।
झिल्ली ऑक्सीकरण और रोलर पंप को रोकें।
गहरे संज्ञाहरण के तहत यांत्रिक वेंटिलेशन की अवधि के बाद चूहे को इच्छामृत्यु करें।
नोट: यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है। सीपीबी और इच्छामृत्यु को हटाने के बीच की अवधि विभिन्न अध्ययन प्रोटोकॉल के अनुसार भिन्न होती है। आयोडीन और अल्कोहल के साथ घावों को कीटाणुरहित करना याद रखें और फिर इच्छामृत्यु से पहले संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक प्रवेशनी क्षेत्र को नम धुंध के साथ कवर करें। संज्ञाहरण की गहराई बढ़ाने के लिए सेवोफ्लुरेन की आउटपुट एकाग्रता बढ़ाएं।

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Representative Results

नियंत्रण समूह के रूप में, संचार गिरफ्तारी के बिना सामान्य तापमान सीपीबी (एनटीसीपीबी) चूहों ने पूरी प्रक्रिया के दौरान एक स्थिर औसत धमनी रक्तचाप (एमएपी) और शरीर का तापमान दिखाया, जबकि कार्डियक अरेस्ट के दौरान डीएचसीए चूहों का एमएपी कम हो गया (पी < 0.01, चित्रा 3 ए)। शीतलन चरण के दौरान डीएचसीए चूहों का तापमान जल्दी से गिर गया और रीवार्मिंग चरण के दौरान धीरे-धीरे ठीक हो गया। डीएचसीए सर्किट से चूहों को दूर करते समय, डीएचसीए चूहों का तापमान सामान्य हो गया (चित्रा 3 बी)।

चूहों पर डीएचसीए प्रक्रिया के प्रभाव की जांच रक्त गैस विश्लेषण द्वारा की गई थी। प्राइमिंग समाधान के साथ पूरे रक्त संपर्क के बाद, हीमोग्लोबिन (एचबी) की एकाग्रता दोनों समूहों में 6 ग्राम / डीएल से अधिक थी (चित्रा 4 ए)। डीएचसीए सर्किट से चूहों को बाहर निकालते समय, सीपीबी सर्किट में शेष रक्त के चूहे में डालने के कारण एकाग्रता 9 ग्राम / डीएल तक बढ़ गई। हेमटोक्रिट (एचसीटी) ने एचबी (चित्रा 4 बी) के समान प्रवृत्ति दिखाई। सीपीबी प्रक्रिया की शुरुआत में, एचबी और एचसीटी में अंतर चूहों के अलग-अलग वजन के कारण हो सकता है। डीएचसीए चूहों का औसत वजन 571.1 ग्राम ± 7.254 ग्राम था, जबकि एनटीसीपीबी समूह में चूहों का औसत वजन 535.0 ग्राम ± 8.317 ग्राम (पी = 0.075) था। यद्यपि एचबी एकाग्रता में अंतर ऑक्सीजन परिवहन के लिए रक्त की क्षमता में अंतर पैदा करेगा, दोनों समूहों के परिवर्तन के रुझान समान थे, यह दर्शाता है कि डीएचसीए ने एचबी एकाग्रता को अतिरिक्त रूप से प्रभावित नहीं किया था। डीएचसीए और रीपरफ्यूजन के बाद, लैक्टिक एसिड का स्तर जल्दी से बढ़ गया, और यह डीएचसीए समूह (चित्रा 4 सी) में अधिक स्पष्ट था। डीएचसीए प्रक्रिया के बाद पीएच में कमी आई, जो सबसे अधिक संभावना लैक्टिक एसिड संचय (चित्रा 4 डी) का परिणाम था। पूरे प्रयोग के दौरान, Na⁺, Cl⁻, K⁺, और ग्लूकोज की सांद्रता ने किसी भी समय महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया (चित्रा 5)। इन परिणामों से पता चलता है कि डीएचसीए ने केवल लैक्टिक एसिड में वृद्धि की, लेकिन रक्त पीएच और हीमोग्लोबिन, हेमटोक्रिट, एनए ⁺, सीएल^-, के ⁺, और ग्लूकोज की एकाग्रता को प्रभावित नहीं किया।

ऑटोफैगी एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें यूकेरियोटिक कोशिकाएं अपने साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन और क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल^को नीचा दिखाने के लिए लाइसोसोम का उपयोग करती हैं। शारीरिक और कुछ रोग संबंधी स्थितियों में, सेलुलर होमियोस्टैसिस के रखरखाव के लिए ऑटोफैगी का हल्का स्तर आवश्यक है। हालांकि, अत्यधिक ऑटोफैगी चयापचय तनाव, सेल घटकों के क्षरण और यहां तक कि कोशिका मृत्यु का कारण बन सकती^है। तंत्रिका ऑटोफैगी पर डीएचसीए के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया और आश्चर्यजनक रूप से, डीएचसीए चूहों के हिप्पोकैम्पी में ऑटोफैगोसोम की बढ़ती संख्या पाई (चित्रा 6)। ऑटोफैगोसोम के द्विदिश कार्यों के आधार पर, क्या बढ़े हुए ऑटोफैगोसोम एक न्यूरोप्रोटेक्टिव और प्रतिपूरक या डीएचसीए के दौरान पैथोलॉजिकल भूमिका निभाते हैं, अभी भी आगे के शोध की आवश्यकता है।

चित्र 1: DHCA मॉडल में उपयोग किए जाने वाले सर्जिकल उपकरण। (a) आयोडीन, (b) इंजेक्शन सिरिंज, (c) चिपकने वाला टेप, (d) नम धुंध, (e) फोर्सप्स, (f) कैंची, (g, h) माइक्रो-फोर्सप्स, (i) एक इलेक्ट्रोकोआगुलेटर, (j) एक शेवर, और (k) रेशम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2: डीएचसीए चूहे मॉडल का कार्डियोपल्मोनरी बाईपास सर्किट। (ए) ए: मेम्ब्रेन ऑक्सीजनेटर; बी: हीट एक्सचेंजर; ग: जलाशय; डी₁: रोलर पंप (बाहरी व्यास [ओडी], 6 मिमी; आंतरिक व्यास [आईडी], 4 मिमी; लंबाई, 15 सेमी) को संलग्न करने वाली ट्यूब; डी₂: हीट एक्सचेंजर और मेम्ब्रेन ऑक्सीजनेटर (ओडी, 6 मिमी) को जोड़ने वाली ट्यूब; आईडी 4 मिमी; लंबाई, 8 सेमी); डी₃: धमनी आउटलेट लाइन (ओडी, 2.5 मिमी; आईडी, 1.5 मिमी; लंबाई, 20 सेमी)। (बी) ए: जलाशय; बी: मेम्ब्रेन ऑक्सीजनेटर; सी: हीट एक्सचेंजर; डी: रोलर पंप। पीला तीर रक्त प्रवाह की दिशा को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 3: DHCA चूहों और सामान्य तापमान CPB चूहों के महत्वपूर्ण संकेत। (A) औसत धमनी दबाव और (B) मलाशय के तापमान की पूरी प्रक्रिया में लगातार निगरानी की गई। डेटा को माध्य (एसईएम), एन = 6 प्रति समूह की औसत ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। DHCA = 30 मिनट। प्रत्येक समय बिंदु पर दो समूहों के बीच अंतर की तुलना एक अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। संक्षेप: डीएचसीए = गहरी हाइपोथर्मिक संचार गिरफ्तारी; एनटीसीपीबी = सामान्य तापमान कार्डियोपल्मोनरी बाईपास; एमएपी = औसत धमनी रक्तचाप। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001; p > 0.05 नहीं दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: चूहों में पीएच और हीमोग्लोबिन, हेमटोक्रिट और लैक्टिक एसिड की सांद्रता। (ए) हीमोग्लोबिन, (बी) हेमटोक्रिट, (सी) लैक्टिक एसिड, (डी) और पीएच के विश्लेषण के लिए धमनी रक्त के नमूने तीन समय बिंदुओं पर ऊरु धमनी के माध्यम से एकत्र किए गए थे: डीएचसीए से पहले सीपीबी की शुरुआत, और सीपीबी को हटाना। DHCA = 30 मिनट। डेटा को एसईएम, एन = 6 प्रति समूह ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। प्रत्येक समय बिंदु पर दो समूहों के बीच अंतर की तुलना एक अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। संक्षेप: डीएचसीए = गहरी हाइपोथर्मिक संचार गिरफ्तारी; एनटीसीपीबी = सामान्य तापमान कार्डियोपल्मोनरी बाईपास; एचबी = हीमोग्लोबिन; एचसीटी = हेमटोक्रिट; लैक = लैक्टिक एसिड। * पी < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5: चूहों में Na⁺, Cl⁻, K⁺, और ग्लूकोज की सांद्रता। (ए) एनए ⁺, (बी) सीएल^-, (सी) के ⁺, और (डी) ग्लूकोज के विश्लेषण के लिए धमनी रक्त के नमूने तीन समय बिंदुओं पर ऊरु धमनी के माध्यम से एकत्र किए गए थे: डीएचसीए से पहले सीपीबी की शुरुआत, और सीपीबी को हटाना। DHCA = 30 मिनट। डेटा को एसईएम, एन = 6 प्रति समूह ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। प्रत्येक समय बिंदु पर दो समूहों के बीच अंतर की तुलना एक अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। संक्षेप: डीएचसीए = गहरी हाइपोथर्मिक संचार गिरफ्तारी; एनटीसीपीबी = सामान्य तापमान कार्डियोपल्मोनरी बाईपास; ग्लू = ग्लूकोज। p > 0.05 नहीं दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6: चूहों के हिप्पोकैम्पी में ऑटोफैगोसोम। सीपीबी सर्किट से बाहर निकलने के 30 मिनट बाद चूहों को मार दिया गया, और हिप्पोकैम्पी को तुरंत काट लिया गया। फिर, (ए) एनटीसीपीबी चूहों और (बी) डीएचसीए चूहों के हिप्पोकैम्पी में ऑटोफैगोसोम की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए आगे ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए हिप्पोकैम्पी को ग्लूटाराल्डिहाइड में तय किया गया था। DHCA = 30 मिनट। स्केल सलाखों: 1 μm और 250 nm. तीर ऑटोफैगोसोम की ओर इशारा करते हैं। संक्षेप: डीएचसीए = गहरी हाइपोथर्मिक संचार गिरफ्तारी; एनटीसीपीबी = सामान्य तापमान कार्डियोपल्मोनरी बाईपास। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

चूहों में डीएचसीए स्थापित करने के लिए कैनुलाशन सबसे मौलिक प्रक्रिया है। कैनुलाशन से पहले, धमनी को 2% लिडोकेन के 0.5 एमएल के साथ भिगोने से कैनुला करना आसान हो जाएगा। कैनुलाशन के बाद, माइक्रोथ्रोम्बस^{गठन से} बचने के लिए बाहरी जुगुलर नस के माध्यम से 500 आईयू / किग्रा हेपरिन के साथ हेपरिनाइजेशन आवश्यक है। हमने बार-बार पाया है कि हेपरिन की यह खुराक सक्रिय थक्के समय (एसीटी) >480 एस के लक्ष्य को प्राप्त कर सकती है। रीवार्मिंग अवधि सबसे कठिन हिस्सा है। हमारे प्रयोग में तापमान को 18 डिग्री सेल्सियस से 34 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ने में 60 मिनट से अधिक समय लगा, जबकि कुछ अन्य प्रयोगों में रीवार्मिंग अवधि 30 मिनट या 40 मिनट में^की जा सकती ^है। लिनार्डी एट अल ने बताया कि एक उच्च रीवार्मिंग दर (45 मिनट) ने भड़काऊ प्रतिक्रिया में वृद्धि की और डीएचसीए²⁰ के बाद मस्तिष्क एडिमा को प्रभावित कर सकता है। इस बीच, द सोसाइटी ऑफ थोरैसिक सर्जन्स, द सोसाइटी ऑफ कार्डियोवैस्कुलर एनेस्थेसियोलॉजिस्ट्स और द अमेरिकन सोसाइटी ऑफ एक्स्ट्राकोर्पोरियल टेक्नोलॉजी के दिशानिर्देशों से संकेत मिलता है कि ठंडा करने या फिर से गर्म करने के दौरान तापमान ग्रेडिएंट क्रमशः गैसीय एम्बोली और आउटगैसिंग की पीढ़ी से बचने के लिए¹⁰ डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं होना चाहिए।

रीवार्मिंग अवधि के दौरान, कार्डियक अरेस्ट के दौरान जमा कम ऑक्सीजन डिलीवरी या एसिडोसिस के कारण दिल को फिर से धड़कने में कठिनाई हो सकती है। इसके अतिरिक्त, दिल एपिनेफ्रीन के 10-20 μg का जवाब नहीं दे सकता है। इस बिंदु पर, पंप प्रवाह दर में वृद्धि की जानी चाहिए, और पर्याप्त छिड़काव दबाव सुनिश्चित किया जाना चाहिए। यदि पर्याप्त रक्त की मात्रा निर्धारित होने पर दुर्दम्य हाइपोटेंशन अभी भी मौजूद है, तो परिधीय वाहिकाओं को संकुचित करने, डायस्टोलिक दबाव में सुधार करने और इस प्रकार, कोरोनरी छिड़काव²² में सुधार करने के लिए नॉरपेनेफ्रिन (प्रति समय 4 μg) प्रशासित किया जा सकता है।

हमारे प्रयोग की कुछ सीमाएं हैं। थोराकोटॉमी नहीं किया गया था, इसलिए नोसिसेप्टिव उत्तेजना नैदानिक रोगियों से अलग थी। दूसरे, कार्डियोप्लेजिया के लिए कार्डियोप्लेजिक समाधान का उपयोग नहीं किया गया था। हमारे प्रयोग में, कार्डियक अरेस्ट हाइपोथर्मिया और हाइपोटेंशन से प्रेरित था। मौजूदा विधि थोराकोटॉमी से क्षति को कम करती है, जिसका अर्थ है कि इसका उपयोग अंगों पर हाइपोथर्मिया और इस्केमिया के प्रभाव की जांच के लिए किया जा सकता है।

इस मॉडल को डीएचसीए-प्रेरित एसआईआरएस, आई / आर चोट, ऑक्सीडेटिव तनाव, न्यूरोइन्फ्लेमेशन, न्यूरोबिहेवियरल परिवर्तन, आदि के लिए पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र और औषधीय उपचार की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक प्रयोग के दौरान वीडियो डेटा एकत्र करने में मदद करने के लिए लियांग झांग को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या: 82070479) और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (अनुदान संख्या: 3332022128) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat Exchanger	Xi’an Xijing Medical Appliance Co., Ltd	Animal-M
Membrane Oxygenator	Dongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd.	Micro-M
Monitor	Chengdu Techman Co., Ltd	BL-420s
Roller Pump	Changzhou Prefluid Technology Co.,Ltd	BL100
SD Rat	HFK Bioscience Co.,Ltd.	/
Sevoflurane	Maruishi Pharmaceutical Co. Ltd	H20150020
Shaver	Hangzhou Huayuan Pet Products Co.,Ltd.	/
Vaporizer	SPACECABS	/
Ventilator	Shanghai Alcott Biotech Co., Ltd	ALC-V8S
Water Tank	Maquet Critical Care AB	Jostra HCU20-600