Summary
このプロトコルは、ラットにおける深部低体温循環停止の確立を示しており、全身性炎症反応症候群、虚血/再灌流障害、酸化ストレス、神経炎症などの調査に適用できます。
Abstract
深部低体温循環停止(DHCA)は、複雑な先天性心疾患および大動脈弓疾患の手術中に日常的に適用されます。本研究は、ラットにおいてDHCAを確立する方法を提供することを目的とする。バイタルサインに対するDHCAプロセスの影響を評価するために、循環停止のない常温心肺バイパス(CPB)ラットモデルを対照として使用しました。予想通り、DHCAは体温と平均動脈血圧の有意な低下をもたらしました。血液ガス分析の結果,DHCAは乳酸濃度を上昇させたが,血中pHおよびヘモグロビン,ヘマトクリット,Na+,Cl-,K+,グルコース濃度には影響しなかった。さらに、常温CPBラットと比較して、透過型電子顕微鏡観察の結果、DHCAラットにおける海馬オートファゴソームの軽度の増加を示した。
Introduction
深部低体温循環停止(DHCA)は、1953年以来心臓外科で使用されています1。DHCAには、体への血流を世界的に遮断する前に、患者の深部温度を深刻な低体温レベル(15〜22°C)に下げることが含まれます2。循環停止は、比較的無血の手術野を提供することができます。深部低体温は、特に脳および心筋における代謝を低下させ、これは虚血に対する効果的な保護方法である3。DHCAは、複雑な先天性心疾患、大動脈弓疾患、さらには大静脈血栓を伴う腎腫瘍または副腎腫瘍の手術中に一般的に適用されます4,5。したがって、DHCA動物モデルの確立は、手順の改良と臨床現場での合併症の予防のための重要な参考資料を提供します。
イヌ6、ウサギ7、その他の動物でモデルを樹立することができるが、操作性や低コストからラットを用いることが好ましい。DHCAラットモデルは、2006年にJungwirthらによって初めて記載された8。循環停止の持続時間が神経学的転帰に影響を与えることがわかった。それ以来、DHCAラットモデルは広く調査されてきました。DHCAが全身性炎症反応症候群(SIRS)9を誘発することが明らかになっています。その後の研究では、薬理学者は、SIRSによって誘発されるDHCA関連の神経炎症がレスベラトロール10およびトリプトリド11によって弱める可能性があることを発見しました。私たちのチームはまた、DHCA関連の神経炎症が、低温誘導性RNA結合タンパク質12を阻害することによって軽減できることを発見しました。心血管系では、スーパーオキシドジスムターゼはDHCA13中の虚血/再灌流(I / R)損傷に対して心臓保護効果があります。これらの結果は、DHCA関連の病態生理学的プロセスの理解を拡大し、DHCAの転帰を改善するための新しい方向性を提供しました。しかし、DHCA後のエンドトキシン血症、酸化ストレス、オートファジーに関する結果は決定的ではありません。DHCAは心肺バイパス(CPB)14と同じ運用技術を使用していますが、その管理戦略は異なり、DHCAを生成する手順はチームによって異なります8、9、10、11。本研究は、ラットにおけるDHCA手順を確立するための方法を提供することを目的とする。
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Protocol
プロトコルは制度的レビューを受け、中国医学科学院の不破病院の施設動物管理および使用委員会から承認を受けました(FW-2021-0005)。すべての実験手順は、国立衛生研究所によって発行された実験動物の世話と使用のためのガイドに従って実行されました。
注:オスのSprague-Dawleyラット(体重:500〜600 g、年齢:12〜14週間)は、餌と水に自由にアクセスできる標準的な実験室条件下で飼育されました。.ラットを2つの群(n = 6、各群)にランダムに割り付けた:DHCA群、および常温CPB群(NtCPB群)。
1.準備作業
- 実験前に手術器具(鉗子、はさみ、マイクロ鉗子、電気凝固装置、シェーバーなど)を滅菌します(図1)。
- 2-0シルク、16 Gカニューレ(気管内カテーテル)、22 Gカニューレ、自家製16 Gカニューレ(マルチオリフィス静脈内カテーテル)、注射注射器、ガーゼ、テープなどの消耗品の入手可能性を確保します。
注:自家製の16 Gカニューレの場合、メスを使用して、カニューレの先端にある直径2 mmの開口部を2つまたは3つ切断すると、静脈ドレナージがスムーズになります。 - セボフルラン、2%リドカイン、生理食塩水、ヘパリン(5 IU / mL、250 IU / mL)、エピネフリン(40 μg / mL)、ノルエピネフリン(20 μg / mL)、ヒドロキシエチルデンプン、および重炭酸塩の可用性を確保します。.
- DHCA回路にリザーバー(マーフィーのドロッパーから変更)、ローラーポンプ、熱交換器、膜型酸素供給器、接続チューブ、および水タンクが含まれていることを確認します(図2)。回路を接続し、12 mLのヒドロキシエチルデンプンを1 mLのヘパリンナトリウム(250 IU)および1 mLの生理食塩水と混合します。ローラーポンプを穏やかに回転させた状態で、14 mLのプライミング溶液で回路をプライミングします(10-40 mL / min)。
注:リザーバーは、マーフィーのスポイトを備えた輸血装置から再成形されます。点滴器の静脈流入部分は10〜15cmのままであり、静脈出口部分は10cmのままである。
2.麻酔とカニューレ挿入
- ラットを2%〜3%のセボフルランで麻酔し、ラットが意識を失った後の結膜反射および筋弛緩の欠如を試験する。
注:結膜反射とは、角膜に触れるたびにまぶたが瞬時に閉じることを指します。綿棒を使用して角膜に少し触れます。麻酔の深さが十分であれば、まぶたは閉じません。 - 結膜反射が消失し、筋肉抵抗が観察されなくなった後、16Gカニューレで気管内挿管を行います。チューブを人工呼吸器に接続し、人工呼吸器のボタンをクリックしてパラメータを設定します(一回換気量:1.0〜1.2 mL / 100g、心拍数:毎分80拍[bpm]、I:E = 1:1、吸気酸素分率:60%)。
- ラットの下に電気加熱毛布を置き、ラットをテープで固定します。眼科用軟膏を目に塗り、乾燥を防ぎます。左鼠径部、右頸部、尾部の毛をシェーバーで剃ります。その後、ヨウ素とアルコールで皮膚を3回消毒します。
- 次のステップに進む前に、麻酔の深さを確認してください。呼吸数が人工呼吸器によって設定された呼吸数(80bpm)よりも高い場合、または筋肉の剛性がある場合は、セボフルランの出力濃度を増加させます。
注:麻酔の深さが適切な場合、呼吸リズムを人工呼吸器と同期させ、筋肉を緊張せずに完全に弛緩させる必要があります。30分ごとに麻酔の深さをチェックして、ラットが手順全体を通して意識の回復を経験していないことを確認します。 - メスを使って左鼠径部(約1cm)の皮膚を切断し、筋肉や組織を柔らかく解剖して左大腿静脈と動脈を露出させます。動脈を慎重に分離します。
- 22Gの静脈内カテーテルを左大腿動脈にカニューレ挿入します。動脈とカテーテルを2-0シルク(カニュレーションの領域で)で結睭します。生理食塩水含有ヘパリン(5 UI / mL)を使用してカニューレを洗い流し、凝固を防ぎます。.カテーテルを圧力センサーに接続して血圧を監視します。
- 尾の皮膚(約1.5 cm)を切り、メスを使用して尾動脈の表在筋膜を切断し、手術野の中央にある尾動脈を露出させます。
- 22Gの静脈内カテーテルで尾動脈をカニューレ挿入します。動脈とカテーテルを2-0シルク(カニュレーションの領域で)で結睭します。生理食塩水含有ヘパリン(5 UI / mL)を使用してカテーテルを洗い流し、凝固を防ぎます。
注:静脈内カテーテルをカニューレ挿入する場合、左手は鉗子で動脈/静脈を保持し、右手はカテーテル内の針で動脈/静脈を突き刺してから、カニューレを動脈に入れます。 - 右頸静脈(約2 cm)の皮膚を切り取り、筋肉と組織を分離して静脈を露出させます。16Gの自家製マルチオリフィス静脈内カテーテルを右外頸静脈に挿入し、右下大静脈または右心房に慎重に入れます。
注:左大腿静脈と動脈は左鼠径部の表面下にあります。静脈は動脈よりも太く、動脈の血の色は真っ赤です。右頸静脈は右頸部の中央にあります。皮膚を切って筋肉を離すと、静脈が見えます(幅約0.3〜0.4 cm)。カテーテルの先端が右心房に触れると、血圧の波が変動します。次に、カテーテルを少し引き戻すと、カテーテルの先端が上大静脈になります。 - ヘパリンナトリウム(500IU / kg)を右外静脈 から 投与します。.汚染を避けるために、各カニューレ領域を湿ったガーゼで覆います。
注意: 手術台の下に箱を置き、約40cm持ち上げます。
3. DHCAの開始
- 最初にDHCA回路を尾動脈のカテーテルに接続し、ポンプの流量を1〜2 mL / minに保ちます。次に、リザーバーを右外頸静脈のカテーテルに接続します。リザーバーに常に約1 cmの血中濃度があることを確認してください。
- 水タンクの電源を入れ、最初に水温を37°Cに設定します。
- 血圧が安定したら、ポンプ流量を80〜100 mL / kg / minまで静かに増やして血液を送り出します。
4.冷却
- 室温を20°C前後に設定します。 角氷を使い捨て手袋に入れてから、ラットの頭と側面に置きます。ラットの直腸温に応じてリアルタイムでタンクの温度を調整します。
- 左大腿動脈から0.1mLの血液を採取し、血液ガス分析のために血液ガス装置に置きます。血液ガス分析の結果に応じて人工呼吸器の関連パラメータを適宜変更する(例えば、PaCO2)。
注意: 心拍数と血圧が変化する可能性があるため、それに応じてポンプの流量を調整する必要があります。水タンクとラットの間の温度勾配は10°C未満である必要があります。 30分以内に温度を15〜20°Cに下げることができることを確認してください。PaCO2 の正常範囲は35〜45mmHgである。血液ガスの結果がより低いPaCO2を示す場合、一回換気量が減少し、逆もまた同様である。
5.深部低体温循環停止
- 直腸温が15〜20°Cに下がったら、使い捨て手袋(氷を含む)を交換して、循環停止中の深い低体温の維持を確実にします。
- ローラーポンプを停止し、リザーバーを環境と接触させたまま、外頸静脈からリザーバーにゆっくりと血液を排出します。
- 血圧波形に注意してください。血圧と心拍数が0になったら、排水を停止し、リザーバーを閉じたままにします。人工呼吸器をオフにします。
注:循環停止の期間は、実験の目的によって異なります。
6.ウォームアップと再灌流
- 使い捨て手袋をすべて取り外し、室温を25°Cに上げます。 静脈ドレナージチューブのクリッピングを維持しながら、膜型酸素供給器の換気を回復します。ローラーポンプをオンにして、リザーバー内の血液がゆっくりとラットの体に戻ることを確認します。
- 人工呼吸器をオンにします。リザーバー内の血中濃度が1 cmになったら、ドレナージチューブを緩め、右心房からリザーバーにゆっくりと血液を排出します。
- 加熱ランプ、加熱パッド、および水タンクをオンにします。最初に水タンクの温度を25°Cに設定し、次にラットの直腸温度に応じて適時に出口温度を調整します。
注:加熱ランプはラットの胸腔内の大きな血管に向けるべきであり、組織の燃焼を避けるために一定の距離に保つ必要があります。出口温度とラットの直腸温度(<10°C)の温度差に注意してください。必要に応じて、血液ガスをテストし、それに応じて人工呼吸器のパラメーターを調整し、重炭酸塩、電解質などを投与します。 - 直腸温度が34°Cに戻ったら、加熱ランプを取り外します。
注意: このステップは、急速な再ウォーミングプロセスの継続として、遅くする必要があります。この段階で、セボフルラン気化器、機械式人工呼吸器、およびローラーポンプの機器パラメータをCPBの開始時のレベルに戻すことができます。
7. CPBからの離乳
- ローラーポンプの流量をゆっくりと徐々に減らし、流量が1mL / minに減少するまで静脈ドレナージ速度を調整します。
注意: 各流量調整は3〜5分間観察する必要があります。 - リザーバーを環境と接触させたままにします(リザーバーキャップを外して)。回路内の残りの血液に1 mL / minの流量を注入します。
- 膜酸素化とローラーポンプを停止します。
- 深い麻酔下での機械的換気の期間の後にラットを安楽死させる。
注: これはターミナルプロシージャです。CPBからの離乳から安楽死までの期間は、さまざまな研究プロトコルによって異なります。安楽死前の汚染を避けるために、ヨウ素とアルコールで傷を消毒し、各カニューレ領域を湿ったガーゼで覆うことを忘れないでください。麻酔の深さを増やすためにセボフルランの出力濃度を増加させる。
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Representative Results
対照群として、循環停止のない正常温度CPB(NtCPB)ラットは、処置全体を通して安定した平均動脈血圧(MAP)および体温を示したが、DHCAラットのMAPは心停止中に減少した(p < 0.01、 図3A)。DHCAラットの温度は冷却段階で急速に低下し、再加温段階で徐々に回復しました。DHCA回路からラットを離乳させると、DHCAラットの温度は正常に戻った(図3B)。
ラットに対するDHCAプロセスの影響を血液ガス分析によって調査した。プライミング溶液との全血接触後、ヘモグロビン(Hb)の濃度は両群で6 g / dLよりも高かった(図4A)。DHCA回路からラットを離乳させると、CPB回路の残りの血液がラットに注入されたため、濃度は9 g / dLに増加しました。ヘマトクリット値(HCT)は、Hbと同様の傾向を示した(図4B)。CPB手順の開始時に、HbとHCTの違いは、ラットの体重の違いによるものであった可能性があります。DHCAラットの平均体重は571.1 g ± 7.254 gでしたが、NtCPB群のラットの平均体重は535.0 g ± 8.317 gでした(p = 0.075)。Hb濃度の違いは血液の酸素輸送能力の違いにつながるが、2つのグループの変化傾向は同じであり、DHCAがHb濃度にさらに影響を与えなかったことを示している。DHCAおよび再灌流後、乳酸のレベルは急速に増加し、これはDHCA群でより顕著であった(図4C)。pHはDHCA手順後に低下し、これは乳酸蓄積の結果である可能性が最も高い(図4D)。実験全体を通して、Na+、Cl−、K+、およびグルコースの濃度は、どの時点でも有意差を示さなかった(図5)。これらの結果から,DHCAは乳酸の増加のみを引き起こし,血中pHやヘモグロビン,ヘマトクリット,Na+,Cl-,K+,グルコース濃度には影響しないことが示唆された。
オートファジーは、真核細胞がリソソームを使用して細胞質タンパク質と損傷した細胞小器官を分解するプロセスです15。生理学的およびいくつかの病理学的状態において、軽度のレベルのオートファジーは細胞の恒常性の維持に不可欠です。しかし、過剰なオートファジーは、代謝ストレス、細胞成分の分解、さらには細胞死につながる可能性があります16。神経オートファジーに対するDHCAの影響を評価するために、透過型電子顕微鏡を使用し、驚くべきことに、DHCAラットの海馬でオートファゴソームの数が増加していることを発見しました(図6)。オートファゴソームの双方向機能に基づいて、増加したオートファゴソームがDHCA中に神経保護的および代償的または病理学的役割を果たすかどうかは、まださらなる研究が必要です。
図1:DHCAモデルで使用された手術器具 。 (a)ヨウ素、(b)注射注射器、(c)粘着テープ、(d)湿潤ガーゼ、(e)鉗子、(f)はさみ、(g、h)マイクロ鉗子、(i)電気凝固装置、(j)シェーバー、および(k)絹。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:DHCAラットモデルの心肺バイパス回路。 (a)a:膜型人工肺装置;b:熱交換器;c:貯水池;d1:ローラーポンプを取り付けるチューブ(外径[OD]6mm;内径[ID]4mm;長さ15cm);d2:熱交換器と膜型酸素供給装置を接続するチューブ(OD、6mm;ID 4 mm;長さ、8センチ)。d3: 動脈出口線 (OD, 2.5 mm;内径、1.5ミリメートル;長さ、20センチ)。(b)a:貯水池;b:膜型酸素供給器; c:熱交換器;d:ローラーポンプ。黄色の矢印は血流の方向を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DHCAラットおよび常温CPBラットのバイタルサイン。 (A)平均動脈圧および(B)直腸温は、手順全体を通して継続的に監視された。データは、平均±標準誤差(SEM)として表され、グループあたりn = 6です。DHCA = 30 分各時点での2つのグループ間の差は、対応のないスチューデントのt検定を使用して比較されました。略語:DHCA =深部低体温循環停止;NtCPB =常温心肺バイパス;MAP =平均動脈血圧。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; p>0.05は示されていません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ラットのpHとヘモグロビン、ヘマトクリット、乳酸の濃度。 (A)ヘモグロビン、(B)ヘマトクリット、(C)乳酸、(D)およびpHの分析のための動脈血サンプルは、CPBの開始、DHCAの前、およびCPBからの離乳の3つの時点で大腿動脈 を介して 収集されました。DHCA = 30 分データはSEM±平均値として表され、グループあたりn = 6である。各時点での2つのグループの差は、対応のないスチューデントの t検定を使用して比較されました。略語:DHCA =深部低体温循環停止;NtCPB =常温心肺バイパス;Hb =ヘモグロビン;Hct =ヘマトクリット値;ラック=乳酸。 * p < 0.05。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ラットにおけるNa+、Cl−、K+、およびグルコースの濃度。(A)Na+、(B)Cl-、(C)K+、および(D)グルコースの分析のための動脈血サンプルは、CPBの開始、DHCAの前、およびCPBからの離乳の3つの時点で大腿動脈を介して収集されました。DHCA = 30 分データはSEM±平均値として表され、グループあたりn = 6である。各時点での2つのグループ間の差は、対応のないスチューデントのt検定を使用して比較されました。略語:DHCA =深部低体温循環停止;NtCPB =常温心肺バイパス;グル=グルコース。p > 0.05 は示されていません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ラットの海馬におけるオートファゴソーム。 ラットはCPB回路から離乳してから30分後に安楽死させ、海馬は直ちに収穫されました。次に、海馬をグルタルアルデヒドで固定し、さらに透過型電子顕微鏡検査を行い、(A)NtCPBラットおよび(B)DHCAラットの海馬におけるオートファゴソームの発現を調べた。DHCA = 30 分スケールバー:1μmおよび250nm。矢印はオートファゴソームを指しています。略語:DHCA =深部低体温循環停止;NtCPB =常温心肺バイパス術。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
カニューレ挿入は、ラットにDHCAを確立するための最も基本的な手順です。カニューレ挿入の前に、動脈を0.5 mLの2%リドカインに浸すと、カニューレ挿入が容易になります。カニューレ挿入後、微小血栓形成を避けるために、外頸静脈を介した500IU / kgヘパリンによるヘパリン化が必要です17。我々は、この用量のヘパリンの活性化凝固時間(ACT)>480秒の目標を達成できることを繰り返し見出した。再温暖化期間は最も難しい部分です。私たちの実験では、温度が18°Cから34°Cに上昇するのに60分以上かかりましたが、他のいくつかの実験では30分または40分で再加温期間を行うことができました18,19。Linardiらは、より高い再加温速度(45分)が炎症反応を増加させ、DHCA20後の脳浮腫に影響を与える可能性があると報告しました。一方、胸部外科学会、心臓血管麻酔科医協会、および米国体外技術学会のガイドラインでは、冷却または再加温中の温度勾配は、ガス状の塞栓とガス放出の発生を回避するために、それぞれ10°Cを超えてはならないことが示されています21。
再加温期間中、心停止中に蓄積された低酸素供給またはアシドーシスのために、心臓の再鼓動が困難になる場合があります。さらに、心臓は10〜20μgのエピネフリンに反応しない可能性があります。この時点で、ポンプの流量を増やし、十分な灌流圧力を確保する必要があります。十分な血液量が決定されたときに難治性低血圧が依然として存在する場合、ノルエピネフリン(1回当たり4μg)を投与して末梢血管を収縮させ、拡張期血圧を改善し、したがって冠状動脈灌流を改善することができる22。
私たちの実験にはいくつかの制限があります。開胸術は行われなかったため、侵害受容刺激は臨床患者のそれとは異なる。第二に、心臓麻痺溶液は心臓麻痺には使用されませんでした。私たちの実験では、心停止は低体温と低血圧によって誘発されました。既存の方法は開胸術による損傷を軽減するため、低体温や虚血の臓器への影響を調べることができます。
このモデルは、DHCA誘発SIRS、I/R傷害、酸化ストレス、神経炎症、神経行動学的変化などの病態生理学的メカニズムと薬理学的治療の調査に適用できます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、実験中にビデオデータを収集するのを手伝ってくれたLiang Zhangに感謝している。この研究は、中国国家自然科学基金会(助成金番号:82070479)および中央大学基礎研究基金(助成金番号:3332022128)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat Exchanger | Xi’an Xijing Medical Appliance Co., Ltd | Animal-M | |
| Membrane Oxygenator | Dongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd. | Micro-M | |
| Monitor | Chengdu Techman Co., Ltd | BL-420s | |
| Roller Pump | Changzhou Prefluid Technology Co.,Ltd | BL100 | |
| SD Rat | HFK Bioscience Co.,Ltd. | / | |
| Sevoflurane | Maruishi Pharmaceutical Co. Ltd | H20150020 | |
| Shaver | Hangzhou Huayuan Pet Products Co.,Ltd. | / | |
| Vaporizer | SPACECABS | / | |
| Ventilator | Shanghai Alcott Biotech Co., Ltd | ALC-V8S | |
| Water Tank | Maquet Critical Care AB | Jostra HCU20-600 |
References
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