Summary
פרוטוקול זה מציג את כינונו של דום היפותרמי עמוק במחזור הדם בחולדות, אשר ניתן ליישם כדי לחקור תסמונת תגובה דלקתית מערכתית, פגיעה איסכמיה/רפרפוזיה, עקה חמצונית, דלקת עצבית וכו '.
Abstract
דום היפותרמי עמוק במחזור הדם (DHCA) מיושם באופן שגרתי במהלך ניתוחים למחלות לב מולדות מורכבות ומחלת קשת אבי העורקים. המחקר הנוכחי נועד לספק שיטה ליצירת DHCA בחולדות. כדי להעריך את ההשפעה של תהליך DHCA על סימנים חיוניים, נעשה שימוש במודל חולדות מעקף קרדיו-פולמונרי בטמפרטורה רגילה (CPB) ללא מעצר במחזור הדם כבקרה. כצפוי, DHCA הוביל לירידה משמעותית בטמפרטורת הגוף וללחץ דם עורקי ממוצע. ניתוח גזי הדם הצביע על כך ש-DHCA העלה את רמות החומצה הלקטית, אך לא השפיע על ה-pH בדם ועל ריכוזי ההמוגלובין, המטוקריט, Na+, Cl−, K+ וגלוקוז. יתר על כן, בהשוואה לחולדות CPB בטמפרטורה רגילה, תוצאות מיקרוסקופיית האלקטרונים של ההולכה הראו עלייה קלה באוטופגוזומים בהיפוקמפוס בחולדות DHCA.
Introduction
דום היפותרמי עמוק במחזור הדם (DHCA) משמש בניתוחי לב מאז 19531. DHCA כרוך בהורדת טמפרטורת הליבה של המטופל לרמות היפותרמיות עמוקות (15-22 מעלות צלזיוס) לפני הפרעה גלובלית לזרימת הדם לגוף2. המעצר במחזור הדם יכול לספק שדה ניתוח נטול דם יחסית. היפותרמיה עמוקה מקטינה את חילוף החומרים, במיוחד במוח ובשריר הלב, שהיא שיטה יעילה להגנה מפני איסכמיה3. DHCA מיושם בדרך כלל במהלך ניתוחים למחלות לב מולדות מורכבות, מחלת קשת אבי העורקים, ואפילו גידולים בכליות או יותרת הכליה עם פקקת קאווה ורידית 4,5. לכן, הקמת מודלים של בעלי חיים DHCA מספקת התייחסות חשובה לעידון ההליך ולמניעת סיבוכים במסגרות קליניות.
למרות שניתן להקים מודלים עם כלבים6, ארנבות7 ובעלי חיים אחרים, עדיף להשתמש בחולדות בגלל יכולת ההפעלה שלהן ועלותן הנמוכה. מודל החולדות DHCA תואר לראשונה בשנת 2006 על ידי Jungwirth et al.8. נמצא כי משך המעצר במחזור הדם השפיע על התוצאות הנוירולוגיות. מאז, מודלים של חולדות DHCA נחקרו באופן נרחב. הובהר כי DHCA עלול לעורר תסמונת תגובה דלקתית מערכתית (SIRS)9. במחקרים מאוחרים יותר, פרמקולוגים מצאו כי דלקת עצבית הקשורה ל-DHCA המושרה על-ידי SIRS יכולה להיות מוחלשת על-ידי רסברטרול10 וטריפטוליד11. הצוות שלנו מצא גם כי ניתן להחליש דלקת עצבית הקשורה ל-DHCA על-ידי עיכוב החלבון קושר ה-RNA12 הניתן להצטננות. במערכת הלב וכלי הדם, לסופראוקסיד דיסמוטאז יש השפעה קרדיו-פרוטקטיבית על פגיעות איסכמיה/רפרפוזיה (I/R) במהלך DHCA13. תוצאות אלה הרחיבו את ההבנה של תהליכים פתופיזיולוגיים הקשורים ל-DHCA והציעו כיוונים חדשים לשיפור התוצאות של DHCA. עם זאת, התוצאות לגבי אנדוטוקסמיה, עקה חמצונית ואוטופגיה לאחר DHCA אינן חד משמעיות. DHCA משתמשת באותה טכנולוגיה תפעולית כמו מעקף הלב-פולמונרי (CPB)14, אך אסטרטגיית הניהול שלה שונה, והצעדים ליצירת DHCA שונים בין צוותים שונים 8,9,10,11. המחקר הנוכחי נועד לספק שיטה לביסוס הליך DHCA בחולדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקולים עברו בדיקה מוסדית וקיבלו אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים, בית החולים פווואי, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (FW-2021-0005). כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות.
הערה: חולדות ספראג-דאולי זכרים (משקל: 500-600 גרם, גיל: 12-14 שבועות) הוחזקו בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם גישה חופשית למזון ומים. החולדות חולצו באופן אקראי לשתי קבוצות (n = 6, כל קבוצה): קבוצת DHCA, וקבוצת CPB בטמפרטורה רגילה (קבוצת NtCPB).
1. עבודת הכנה
- עקרו את כלי הניתוח (מלקחיים, מספריים, מיקרו-מלקחיים, אלקטרוקואגולטור, מכונת גילוח וכו') לפני הניסוי (איור 1).
- הקפידו על זמינות החומרים המתכלים, הכוללים 2-0 משי, צינורית 16 גרם (קטטר אנדוטרכאלי), צינורית 22 גרם, צינורית תוצרת בית של 16 גרם (קטטר תוך ורידי רב-כנפי), מזרקי הזרקה, גזה וסרט הדבקה.
הערה: עבור צינורית תוצרת בית של 16 גרם, השתמש באזמל כדי לחתוך שניים או שלושה פתחים בקוטר 2 מ"מ בקצה הצינורית, מה שיעזור להפוך את הניקוז הוורידי לחלק יותר. - ודא את הזמינות של סבופלורן, 2% לידוקאין, מי מלח, הפרין (5 IU/mL, 250 IU/mL), אפינפרין (40 מיקרוגרם/מ"ל), נוראדרנלין (20 מיקרוגרם/מ"ל), עמילן הידרוקסיאתיל וביקרבונט.
- ודאו שמעגלי ה-DHCA מכילים מאגר (שונה מהטפטפת של מרפי), משאבת רולר, מחליף חום, מחמצן ממברנה, צינורות מחברים ומיכל מים (איור 2). חבר את המעגל, ומערבב 12 מ"ל של עמילן הידרוקסיאתיל עם 1 מ"ל של נתרן הפרין (250 IU) ו 1 מ"ל של מלח. הפעילו את המעגל עם 14 מ"ל מתמיסת הפרימינג כאשר משאבת הגלילים מסתובבת בעדינות (10-40 מ"ל/דקה).
הערה: המאגר הוא remolded ממכשיר עירוי דם עם הטפטפת של מרפי. חלק הזרימה הוורידית של הטפטפת נשאר ב 10-15 ס"מ, ואת החלק מוצא ורידי נשאר ב 10 ס"מ.
2. הרדמה וקנולציה
- הרדימו את החולדות עם 2%-3% sevoflurane, ולאחר מכן בדקו את היעדר רפלקס הלחמית והרפיית שרירים לאחר שהחולדה מאבדת את הכרתה.
הערה: רפלקס הלחמית מתייחס לסגירה מיידית של העפעף בכל פעם שנוגעים בקרנית. השתמשו בצמר גפן כדי לגעת מעט בקרנית. כאשר עומק ההרדמה מספיק, העפעפיים לא ייסגרו. - בצע אינטובציה אנדוטרכאלית עם צינורית של 16 גרם לאחר רפלקס הלחמית נעלם ולא נצפתה התנגדות שרירים. חבר את הצינור למכונת הנשמה, והגדר את הפרמטרים על ידי לחיצה על הכפתורים במכונת ההנשמה (נפח גאות ושפל: 1.0-1.2 מ"ל / 100 גרם, קצב לב: 80 פעימות לדקה [bpm], I:E = 1:1, חלק חמצן השראה: 60%).
- שים שמיכת חימום חשמלית מתחת לחולדה, ותקן את החולדה עם סרט. יש למרוח משחת עיניים על העיניים כדי למנוע יובש. לגלח את השיער באזור המפשעה השמאלי, באזור צוואר הרחם הימני ובזנב עם מכונת גילוח. לאחר מכן, לחטא את העור שלוש פעמים עם יוד ואלכוהול.
- בדוק את עומק ההרדמה לפני שתעבור לשלבים הבאים. אם קצב הנשימה גבוה מזה שנקבע על ידי מכונת ההנשמה (80 פעימות לדקה), או אם יש קשיחות שרירים, ואז להגדיל את ריכוז הפלט של sevoflurane.
הערה: כאשר עומק ההרדמה מספיק, קצב הנשימה צריך להיות מסונכרן עם מכונת ההנשמה, ואת השרירים צריך להיות רגוע לחלוטין ללא מתח. בדקו את עומק ההרדמה כל 30 דקות כדי לוודא שהחולדה לא חווה חזרה להכרה במהלך ההליך. - השתמש באזמל כדי לחתוך את העור באזור המפשעה השמאלי (כ 1 ס"מ), ולנתח את השריר והרקמה ברכות כדי לחשוף את הווריד והעורק השמאלי של הירך. להפריד את העורק בזהירות.
- צינורית 22 גרם קטטר תוך ורידי לתוך עורק הירך השמאלי. Ligate את העורק ואת קטטר עם משי 2-0 (באזור של cannulation). יש להשתמש בהפרין המכיל מלח (5 UI/mL) כדי לשטוף את הצינורית כדי למנוע קרישה. חבר את הקטטר לחיישן הלחץ כדי לנטר את לחץ הדם.
- חותכים את עור הזנב (כ -1.5 ס"מ), ולאחר מכן משתמשים באזמל כדי לחתוך את החיתולית השטחית של עורק הזנב כדי לחשוף את עורק הזנב, שנמצא באמצע שדה הניתוח.
- לנטרל את עורק הזנב עם קטטר תוך ורידי של 22 גרם. Ligate את העורק ואת קטטר עם משי 2-0 (באזור של cannulation). יש להשתמש בהפרין המכיל מי מלח (5 UI/mL) כדי לשטוף את הקטטר כדי למנוע קרישה.
הערה: בעת שימורי הצנתר התוך ורידי, יד שמאל מחזיקה את העורק/וריד עם מלקחיים, ויד ימין חודרת את העורק/וריד עם המחט בתוך הקטטר ואז מכניסה את הצינורית לעורק. - לחתוך את העור על הווריד jugular ימין (כ 2 ס"מ), ולאחר מכן להפריד את השריר והרקמה כדי לחשוף את הווריד. הכנס 16 גרם קטטר תוך ורידי תוצרת בית לתוך הווריד הג'וגולרי החיצוני הימני, והכנס אותו לווריד הווריד הנבוב התחתון הנכון או לאטריום הימני בזהירות.
הערה: הווריד והעורק השמאלי של הירך נמצאים מתחת לפני השטח של אזור המפשעה השמאלי. הווריד עבה יותר מהעורק, וצבע הדם של העורקים אדום בוהק. וריד הג'וגולרי הימני נמצא באמצע אזור צוואר הרחם הימני; כאשר העור נחתך והשרירים מופרדים, ניתן לראות את הווריד (ברוחב של כ-0.3-0.4 ס"מ). כאשר קצה הקטטר נוגע באטריום הימני, גל לחץ הדם ישתנה. לאחר מכן, לאחר משיכת הקטטר מעט אחורה, קצה הקטטר יהיה בווריד הנבוב העליון. - יש לתת הפרין נתרן (500 יחב"ל/ק"ג) דרך הווריד החיצוני הימני. לכסות כל אזור משומר עם גזה לחה כדי למנוע זיהום.
הערה: שים קופסה מתחת לשולחן הניתוחים כדי להגביה אותה בערך 40 ס"מ.
3. ייזום DHCA
- חבר תחילה את מעגל ה-DHCA לקטטר בעורק הזנב, ושמור על קצב זרימת המשאבה של 1-2 מ"ל/דקה. לאחר מכן, חבר את המאגר עם קטטר בווריד הג'וגולרי החיצוני הימני. וודאו שתמיד יש במאגר רמה של כ-1 ס"מ בדם.
- הפעל את מיכל המים, והגדר תחילה את טמפרטורת המים על 37 °C (77 °F).
- לאחר שלחץ הדם יציב, הגבירו בעדינות את זרימת המשאבה עד 80-100 מ"ל/ק"ג/דקה כדי לשאוב את הדם.
4. קירור
- הגדר את טמפרטורת החדר לסביבות 20 °C (75 °F). שים קוביות קרח בכפפות חד פעמיות, ולאחר מכן מניחים אותם על הראש והצדדים של החולדה. התאימו את טמפרטורת המיכל בזמן אמת בהתאם לטמפרטורה הרקטלית של החולדות.
- לאסוף 0.1 מ"ל של דם מן העורק הירך השמאלי, ומניחים אותו על מכונת גז הדם לניתוח גז הדם. שנה את הפרמטרים הרלוונטיים של מכונת ההנשמה בהתאם לתוצאות ניתוח גז הדם (למשל, PaCO2).
הערה: קצב הלב ולחץ הדם עשויים להשתנות, ויש להתאים את קצב זרימת המשאבה בהתאם. שיפוע הטמפרטורה בין מיכל המים לחולדה צריך להיות פחות מ -10 מעלות צלזיוס. ודא שניתן להפחית את הטמפרטורה ל 15-20 מעלות צלזיוס תוך 30 דקות. הטווח הנורמלי של PaCO2 הוא 35-45 מ"מ כספית. אם תוצאות גז הדם מראות PaCO2 נמוך יותר, ניתן להקטין את נפח הגאות ולהיפך.
5. מעצר היפותרמי עמוק במחזור הדם
- כאשר הטמפרטורה הרקטלית יורדת ל 15-20 מעלות צלזיוס, לשנות את הכפפות חד פעמיות (המכיל קרח) כדי להבטיח את שמירה על היפותרמיה עמוקה במהלך מעצר הדם.
- עצור את משאבת הרולר, שמור על המאגר במגע עם הסביבה, ונקז את הדם באיטיות מהווריד הג'וגולרי החיצוני למאגר.
- שימו לב לצורת הגל של לחץ הדם. כאשר לחץ הדם וקצב פעימות הלב הם 0, עצרו את הניקוז והשאירו את המאגר סגור. כבה את מכונת ההנשמה.
הערה: משך המעצר במחזור הדם משתנה בהתאם למטרת הניסוי.
6. חימום ו reperfusion
- מסירים את כל הכפפות החד פעמיות, ומעלים את טמפרטורת החדר ל-25 מעלות צלזיוס. שחזר את אוורור מחמצן הממברנה תוך שמירה על חיתוך צינור הניקוז הוורידי. הפעילו את משאבת הגלילים כדי לוודא שהדם במאגר חוזר לאט לאט לגוף החולדה.
- הפעל את מכונת ההנשמה. ברגע שמפלס הדם במאגר נשאר 1 ס"מ, שחררו את צינור הניקוז, ונקזו את הדם מהאטריום הימני למאגר באיטיות.
- הפעל את מנורת החימום, את כרית החימום ואת מיכל המים. הגדר את הטמפרטורה של מיכל המים ל -25 מעלות צלזיוס תחילה, ולאחר מכן התאם את טמפרטורת היציאה שלו בזמן בהתאם לטמפרטורה הרקטלית של החולדה.
הערה: מנורת החימום צריכה להיות מכוונת אל כלי הדם הגדולים בחלל בית החזה של החולדה, ויש לשמור אותה במרחק מסוים כדי למנוע שריפת הרקמות. שימו לב להפרש הטמפרטורות בין טמפרטורת היציאה לטמפרטורה הרקטלית של החולדה (<10 מעלות צלזיוס). במידת הצורך, בדוק את גז הדם, ולאחר מכן להתאים את הפרמטרים הנשמה בהתאם, ולנהל ביקרבונט, אלקטרוליטים, וכו ' - הסר את מנורת החימום לאחר שהטמפרטורה הרקטלית חוזרת ל -34 מעלות צלזיוס.
הערה: שלב זה, כהמשך לתהליך ההתחממות המהירה, צריך להיות איטי. בשלב זה, ניתן לשחזר את פרמטרי הציוד של אידוי sevoflurane, מכונת הנשמה מכנית ומשאבת רולר לרמות בתחילת ה- CPB.
7. גמילה מה-CPB
- הפחת לאט ובהדרגה את קצב זרימת משאבת הרולר, וכוונן את מהירות הניקוז הוורידי עד שקצב הזרימה יפחת ל-1 מ"ל/דקה.
הערה: יש להקפיד על כל התאמת קצב זרימה למשך 3-5 דקות. - שמור על המאגר במגע עם הסביבה (על ידי הסרת מכסה המאגר). להחדיר את הדם הנותר במעגל עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה.
- עצור את חמצון הממברנה ואת משאבת הרולר.
- להרדים את החולדה לאחר תקופה של אוורור מכני בהרדמה עמוקה.
הערה: זהו הליך מסוף. משך הזמן בין גמילה מה-CPB להמתת חסד משתנה בהתאם לפרוטוקולי המחקר השונים. זכור לחטא את הפצעים עם יוד ואלכוהול ולאחר מכן לכסות כל אזור משומר עם גזה לחה כדי למנוע זיהום לפני המתת חסד. הגדל את ריכוז הפלט של sevoflurane כדי להגדיל את עומק ההרדמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כקבוצת הביקורת, חולדות CPB בטמפרטורה הרגילה (NtCPB) ללא דום במחזור הדם הראו לחץ דם עורקי יציב (MAP) וטמפרטורת גוף במהלך כל ההליך, בעוד שהמפה של חולדות DHCA ירדה במהלך דום הלב (p < 0.01, איור 3A). הטמפרטורה של חולדות DHCA ירדה במהירות במהלך שלב הקירור והתאוששה בהדרגה במהלך שלב החימום מחדש. כאשר גמלים את החולדות ממעגלי ה-DHCA, הטמפרטורה של חולדות ה-DHCA חזרה לנורמה (איור 3B).
ההשפעה של תהליך DHCA על חולדות נחקרה על ידי ניתוח גז דם. לאחר כל מגע הדם עם תמיסת הפרימינג, ריכוז ההמוגלובין (Hb) היה גבוה מ-6 גרם/דצ"ל בשתי הקבוצות (איור 4A). כאשר גמלו את החולדות ממעגל ה-DHCA, הריכוז עלה ל-9 גרם/דצ"ל בגלל עירוי הדם שנותר במעגל ה-CPB לתוך החולדה. המטוקריט (HCT) הראה נטייה דומה ל-Hb (איור 4B). בתחילת הליך ה-CPB, ייתכן שההבדלים ב-Hb וב-HCT נבעו מהמשקלים השונים של החולדות. המשקל הממוצע של חולדות DHCA היה 571.1 גרם ± 7.254 גרם, בעוד שהמשקל הממוצע של החולדות בקבוצת NtCPB היה 535.0 גרם ± 8.317 גרם (p = 0.075). למרות שהבדלים בריכוז ההמוגלובין המסוכרר יובילו להבדלים ביכולת של הדם להעביר חמצן, מגמות השינוי של שתי הקבוצות היו זהות, מה שמצביע על כך ש-DHCA לא השפיע בנוסף על ריכוז ה-Hb. לאחר DHCA ורפרפוזיה, רמת החומצה הלקטית עלתה במהירות, וזה היה בולט יותר בקבוצת DHCA (איור 4C). ה-pH ירד לאחר הליך DHCA, שהיה ככל הנראה תוצאה של הצטברות חומצה לקטית (איור 4D). במהלך הניסוי כולו, הריכוזים של Na+, Cl−, K+ וגלוקוז לא הראו הבדלים משמעותיים בשום נקודת זמן (איור 5). תוצאות אלה מצביעות על כך ש-DHCA גרם רק לעלייה בחומצה לקטית, אך לא השפיע על ה-pH בדם ועל ריכוז ההמוגלובין, המטוקריט, Na+, Cl−, K+ וגלוקוז.
אוטופגיה היא תהליך שבו תאים אאוקריוטים משתמשים בליזוזומים כדי לפרק את החלבונים הציטופלסמיים שלהם ואת האברונים הפגועים15. בתנאים פיזיולוגיים וכמה פתולוגיים, רמה קלה של אוטופגיה חיונית לשמירה על הומאוסטזיס סלולרי. עם זאת, אוטופגיה מוגזמת עלולה להוביל ללחץ מטבולי, להתפרקות של מרכיבי התא ואפילו למוות תאי16. כדי להעריך את ההשפעה של DHCA על אוטופגיה עצבית, השתמשנו במיקרוסקופיית אלקטרונים של הולכה, ובאופן מפתיע מצאנו מספר מוגבר של אוטופגוזומים בהיפוקמפי של חולדות DHCA (איור 6). בהתבסס על התפקודים הדו-כיווניים של אוטופגוזומים, השאלה אם האוטופגוזומים המוגברים ממלאים הגנה עצבית ומפצה או תפקיד פתולוגי במהלך DHCA עדיין זקוקה למחקר נוסף.
איור 1: כלי ניתוח המשמשים במודל DHCA. (א) יוד, (ב) מזרקי הזרקה, (ג) סרט דבק, (ד) גזה לחה, (ה) מלקחיים, (ו) מספריים, (ז,ח) מיקרו-מלקחיים, (i) אלקטרוקואגולטור, (י) מכונת גילוח, ו-(יא) משי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מעגל מעקף קרדיופולמונרי של מודל חולדות DHCA. (A) א: מחמצן ממברנה; ב: מחליף חום; ג: מאגר; ד1: הצינור המחבר את משאבת הגלילים (קוטר חיצוני [OD), 6 מ"מ; קוטר פנימי [ID], 4 מ"מ; אורך, 15 ס"מ); ד2: הצינור המחבר את מחליף החום ומחמצן הממברנה (OD, 6 מ"מ; מזהה 4 מ"מ; אורך, 8 ס"מ); ד3: קו יציאת העורק (OD, 2.5 מ"מ; תעודת זהות, 1.5 מ"מ; אורך, 20 ס"מ). (ב) א: מאגר; ב: מחמצן ממברנה; ג: מחליף חום; ד: משאבת רולר. החץ הצהוב מראה את כיוון זרימת הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: סימנים חיוניים של חולדות DHCA וחולדות CPB בטמפרטורה רגילה. (A) לחץ העורק הממוצע והטמפרטורה הרקטלית (B) היו מנוטרים באופן רציף לאורך כל ההליך. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM), n = 6 לכל קבוצה. DHCA = 30 דקות ההבדלים בין שתי הקבוצות בכל נקודת זמן הושוו באמצעות מבחן t של תלמיד לא מזווג. קיצורים: DHCA = מעצר היפותרמי עמוק במחזור הדם; NtCPB = מעקף קרדיופולמונרי בטמפרטורה רגילה; MAP = לחץ דם עורקי ממוצע. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; p > 0.05 לא מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ה-pH והריכוזים של המוגלובין, המטוקריט וחומצה לקטית בחולדות. דגימות דם עורקים לניתוח של (A) המוגלובין, (B) המטוקריט, (C) חומצה לקטית, (D) ו- pH נאספו דרך עורק הירך בשלוש נקודות זמן: התחלת CPB, לפני DHCA, וגמילה מה- CPB. DHCA = 30 דקות הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM, n = 6 לכל קבוצה. ההבדל בין שתי הקבוצות בכל נקודת זמן הושווה באמצעות מבחן t של סטודנט לא מזווג. קיצורים: DHCA = מעצר היפותרמי עמוק במחזור הדם; NtCPB = מעקף קרדיופולמונרי בטמפרטורה רגילה; Hb = המוגלובין; HCT = המטוקריט; Lac = חומצה לקטית. * עמ' < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הריכוז של Na+, Cl−, K+ וגלוקוז בחולדות. דגימות דם עורקים לניתוח של (A) Na+, (B) Cl−, (C) K+, ו-(D) גלוקוז נאספו דרך עורק הירך בשלוש נקודות זמן: התחלת CPB, לפני DHCA, וגמילה מה-CPB. DHCA = 30 דקות הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM, n = 6 לכל קבוצה. ההבדלים בין שתי הקבוצות בכל נקודת זמן הושוו באמצעות מבחן t של תלמיד לא מזווג. קיצורים: DHCA = מעצר היפותרמי עמוק במחזור הדם; NtCPB = מעקף קרדיופולמונרי בטמפרטורה רגילה; דבק = גלוקוז. p > 0.05 לא מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: אוטופגוזומים בהיפוקמפי של חולדות. החולדות הומתו 30 דקות לאחר הגמילה ממעגל ה-CPB, וההיפוקמפי נקטף מיד. לאחר מכן, ההיפוקמפי היה קבוע בגלוטראלדהיד לצורך מיקרוסקופיית אלקטרונים נוספת כדי לחקור את הביטוי של אוטופגוזומים בהיפוקמפי של (A) חולדות NtCPB ו-(B) חולדות DHCA. DHCA = 30 דקות סרגלי קנה מידה: 1 μm ו- 250 ננומטר. החצים מצביעים על אוטופגוזומים. קיצורים: DHCA = מעצר היפותרמי עמוק במחזור הדם; NtCPB = מעקף קרדיופולמונרי בטמפרטורה רגילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קנולציה היא ההליך הבסיסי ביותר להקמת DHCA בחולדות. לפני הצינור, השריית העורק עם 0.5 מ"ל של 2% לידוקאין תקל על הצינור. לאחר הקנולציה, יש צורך בהפריניזציה עם 500 IU/kg הפרין דרך הווריד הג'וגולרי החיצוני כדי למנוע היווצרות מיקרוטרומבוס17. מצאנו שוב ושוב כי מינון זה של הפרין יכול להשיג את המטרה של זמן קרישה מופעל (ACT) >480 שניות. תקופת החימום מחדש היא החלק הקשה ביותר. לקח יותר מ-60 דקות עד שהטמפרטורה עלתה מ-18 מעלות צלזיוס ל-34 מעלות צלזיוס בניסוי שלנו, בעוד שתקופת החימום מחדש יכלה להיעשות תוך 30 דקות או 40 דקות בניסויים אחריםב-18,19. Linardi et al. דיווחו כי קצב התחממות גבוה יותר (45 דקות) הגביר את התגובה הדלקתית ועלול להשפיע על בצקת המוח לאחר DHCA20. בינתיים, הנחיות של החברה של מנתחי בית החזה, החברה של מרדימים לב וכלי דם, ואת האגודה האמריקאית של טכנולוגיה Extracorporeal עולה כי שיפוע הטמפרטורה במהלך קירור או התחממות מחדש לא יעלה על 10 °C (75 °F) כדי למנוע את הדור של emboli גזי ו outgassing, בהתאמה21.
במהלך תקופת החימום מחדש, הלב עלול להתקשות לפעום מחדש בשל אספקת חמצן נמוכה או חומצה שנצברה במהלך דום לב. בנוסף, הלב עשוי שלא להגיב ל-10-20 מיקרוגרם של אפינפרין. בשלב זה, יש להגדיל את קצב זרימת המשאבה, ולהבטיח לחץ זלוף מספיק. אם לחץ דם עקשן עדיין קיים כאשר נפח דם מספיק נקבע, נוראדרנלין (4 מיקרוגרם בכל פעם) יכול להיות מנוהל כדי לכווץ את כלי הדם ההיקפיים, לשפר את הלחץ הדיאסטולי, ובכך לשפר את הזלוף הכלילי22.
יש כמה מגבלות של הניסוי שלנו. כריתת חזה לא בוצעה, ולכן הגירוי nociceptive היה שונה מזה של חולים קליניים. שנית, הפתרון הקרדיופלגי לא שימש לקרדיופלגיה. בניסוי שלנו, דום הלב נגרם על ידי היפותרמיה ולחץ דם נמוך. השיטה הקיימת מפחיתה את הנזק מבית החזה, כלומר ניתן להשתמש בה כדי לחקור את ההשפעה של היפותרמיה ואיסכמיה על האיברים.
מודל זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של טיפולים תרופתיים עבור SIRS המושרה על ידי DHCA, פגיעה ב- I/R, עקה חמצונית, דלקת עצבית, שינויים נוירו-התנהגותיים וכו '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לליאנג ג'אנג על שעזר לאסוף את נתוני הווידאו במהלך הניסוי. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 82070479) וקרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (מספר מענק: 3332022128).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat Exchanger | Xi’an Xijing Medical Appliance Co., Ltd | Animal-M | |
| Membrane Oxygenator | Dongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd. | Micro-M | |
| Monitor | Chengdu Techman Co., Ltd | BL-420s | |
| Roller Pump | Changzhou Prefluid Technology Co.,Ltd | BL100 | |
| SD Rat | HFK Bioscience Co.,Ltd. | / | |
| Sevoflurane | Maruishi Pharmaceutical Co. Ltd | H20150020 | |
| Shaver | Hangzhou Huayuan Pet Products Co.,Ltd. | / | |
| Vaporizer | SPACECABS | / | |
| Ventilator | Shanghai Alcott Biotech Co., Ltd | ALC-V8S | |
| Water Tank | Maquet Critical Care AB | Jostra HCU20-600 |
References
- Lewis, F. J., Taufic, M. Closure of atrial septal defects with the aid of hypothermia; experimental accomplishments and the report of one successful case. Surgery. 33 (1), 52-59 (1953).
- Miler, R. D., et al. Miller's Anesthesia., eighth edition. , Saunders. Philadephia, US. (2015).
- Gocoł, R., et al. The role of deep hypothermia in cardiac surgery. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (13), 7061 (2021).
- Zhu, P., et al. The role of deep hypothermic circulatory arrest in surgery for renal or adrenal tumor with vena cava thrombus: A single-institution experience. Journal of Cardiothoracic Surgery. 13 (1), 85 (2018).
- Poon, S. S., Estrera, A., Oo, A., Field, M. Is moderate hypothermic circulatory arrest with selective antegrade cerebral perfusion superior to deep hypothermic circulatory arrest in elective aortic arch surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 23 (3), 462-468 (2016).
- Giuliano, K., et al. Inflammatory profile in a canine model of hypothermic circulatory arrest. Journal of Surgical Research. 264, 260-273 (2021).
- Wang, Q., et al. Hyperoxia management during deep hypothermia for cerebral protection in circulatory arrest rabbit model. ASAIO Journal. 58 (4), 330-336 (2012).
- Jungwirth, B., et al. Neurologic outcome after cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest in rats: Description of a new model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 131 (4), 805-812 (2006).
- Engels, M., et al. A cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest rat model for the investigation of the systemic inflammation response and induced organ damage. Journal of Inflammation. 11, 26 (2014).
- Chen, Q., Sun, K. P., Huang, J. S., Wang, Z. C., Hong, Z. N. Resveratrol attenuates neuroinflammation after deep hypothermia with circulatory arrest in rats. Brain Research Bulletin. 155, 145-154 (2020).
- Chen, Q., Lei, Y. Q., Liu, J. F., Wang, Z. C., Cao, H. Triptolide improves neurobehavioral functions, inflammation, and oxidative stress in rats under deep hypothermic circulatory arrest. Aging. 13 (2), 3031-3044 (2021).
- Liu, M., et al. A novel target to reduce microglial inflammation and neuronal damage after deep hypothermic circulatory arrest. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (6), 2431-2444 (2020).
- Pinto, A., et al. The extracellular isoform of superoxide dismutase has a significant impact on cardiovascular ischaemia and reperfusion injury during cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (6), 1035-1044 (2016).
- Hirao, S., Masumoto, H., Itonaga, T., Minatoya, K. A recovery cardiopulmonary bypass model without transfusion or inotropic agents in rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56986 (2018).
- Ha, J. Y., Kim, J. S., Kim, S. E., Son, J. H. Simultaneous activation of mitophagy and autophagy by staurosporine protects against dopaminergic neuronal cell death. Neuroscience Letters. 561, 101-106 (2014).
- Yamamoto, A., Yue, Z. Autophagy and its normal and pathogenic states in the brain. Annual Review of Neuroscience. 37, 55-78 (2014).
- You, X. M., et al. Rat cardiopulmonary bypass model: Application of a miniature extracorporeal circuit composed of asanguinous prime. Journal of Extra-Corporeal Technology. 37 (1), 60-65 (2005).
- Chen, Q., Lei, Y. Q., Liu, J. F., Wang, Z. C., Cao, H. Beneficial effects of chlorogenic acid treatment on neuroinflammation after deep hypothermic circulatory arrest may be mediated through CYLD/NF-κB signaling. Brain Research. 1767, 147572 (2021).
- Li, Y. A., et al. Differential expression profiles of circular RNAs in the rat hippocampus after deep hypothermic circulatory arrest. Artificial Organs. 45 (8), 866-880 (2021).
- Linardi, D., et al. Slow versus fast rewarming after hypothermic circulatory arrest: effects on neuroinflammation and cerebral oedema. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 58 (4), 792-780 (2020).
- Engelman, R., et al. The Society of Thoracic Surgeons, The Society of Cardiovascular Anesthesiologists, and The American Society of ExtraCorporeal Technology: Clinical practice guidelines for cardiopulmonary bypass--Temperature management during cardiopulmonary bypass. Annals of Thoracic Surgery. 100 (2), 748-757 (2015).
- Jenke, A., et al. AdipoRon attenuates inflammation and impairment of cardiac function associated with cardiopulmonary bypass-induced systemic inflammatory response syndrome. Journal of the American Heart Association. 10 (6), 018097 (2021).
