Summary
Dit artikel beschrijft een methode voor het steriliseren van wormenprikkers, spatels en scalpels met behulp van een microverbrandingsoven in plaats van een open vuur.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) is een optimaal modelorganisme voor onderzoek en onderwijs aan voornamelijk niet-gegradueerde instellingen. Studenten kunnen snel de steriele techniek leren die nodig is om C. elegans-culturen te behouden. Sterilisatie van platinaprikkers die worden gebruikt om wormen van de ene plaat naar de andere over te brengen, wordt traditioneel gedaan door de plectrum in een vlam van een Bunsen-brander of ethanollantaarn te houden. Bunsen-branders hebben echter een gasbron nodig en beide apparaten vormen het risico van accidenteel vuur in verband met een open vuur. Hier wordt een techniek gedemonstreerd voor het steriliseren van wormenprikkers, spatels en scalpels met behulp van een infrarood bacteriologische lus micro-verbrandingsoven. Deze apparatuur heeft alleen een stopcontact nodig en minimaliseert potentiële brandgevaar. Door het verlagen van risico's en gasvereisten, is deze techniek zeer geschikt voor onderzoek en onderwijs in een niet-gegradueerde omgeving.
Introduction
Het modelorganisme C. elegans is zeer geschikt voor zowel onderzoek als onderwijs aan voornamelijk niet-gegradueerde instellingen (PUI's) vanwege de lage kosten, het onderhoudsgemak en het toepassingsgebied 1,2,3,4. Om wormen te verwerken - bijvoorbeeld om een worm van de ene plaat naar de andere te verplaatsen, kunnen experimentatoren een wormenpluk gebruiken. Een verscheidenheid aan picks kan worden gemaakt of gekocht voor gebruik met C. elegans. Plectrums worden meestal gemaakt met behulp van een platina of platina / iridium tip, gemonteerd in een glazen, metalen of houten handvat. Glazen handgrepen kunnen in eigen huis worden gemaakt door een Pasteur-pipet rond een platinadraad te smelten totdat de draad vastzit. Aanvullende informatie over de houderij van C. elegans, inclusief het kweken en onderhouden van wormen en hun voedselbronnen, is te vinden in WormBook5 en andere bronnen 6,7,8.
Bij het werken met C. elegans worden meestal aseptische technieken gebruikt om besmetting met microben en schimmels te voorkomen. Voorbeelden van aseptische technieken zijn sterilisatie van instrumenten, autoclaveren van reagentia en het uitvoeren van werk in steriele velden. Wormenprikkers worden meestal gesteriliseerd met behulp van een open vuur9. Bovendien verbrandt sterilisatie van de wormenpluk wormen, waardoor onbedoelde verwisseling van stammen bij het werken met meerdere wormstammen wordt voorkomen. Typische methoden voor het steriliseren van wormenprikkers omvatten een open vlam van een Bunsen-brander, ethanollantaarn of standaardaansteker (tabel 1). We waren gemotiveerd om veiligere alternatieven te zoeken voor bestaande methoden in het laboratorium toen een student onbewust ethanol morste tijdens het vullen van een ethanollantaarn en per ongeluk een klein vuurtje veroorzaakte bij het ontsteken van de lantaarn. Helaas zijn er veel ongelukken gemeld met ethanollantaarns 10,11,12. Gelukkig zijn alternatieve sterilisatiemethoden gevalideerd voor gebruik in de microbiologie en het doel van dit artikel is om aan te tonen hoe deze apparatuur kan worden gebruikt om instrumenten te steriliseren voor gebruik met C. elegans.
In microbiologische laboratoria is de aseptische techniek ook van cruciaal belang. Serologische lussen en draden van platina worden gesteriliseerd met behulp van een open vlam13 of een microverbrandingsoven 14,15,16. Andere namen voor micro-verbrandingsovens zijn micro-sterilisatoren of bacto-verbrandingsovens. Voordelen van de microverbrandingsoven ten opzichte van traditionele vlammethoden zijn onder meer verminderd brandgevaar, eliminatie van spatten van verbrande materialen en de mogelijkheid om te werken in een laminaire stromingskap / bioveiligheidskast 16,17,18. In feite raden zowel de American Society of Microbiology als de Wereldgezondheidsorganisatie het gebruik van micro-verbrandingsovens aan boven het gebruik van een open vlam 17,19,20. In vergelijking met Bunsen-branders hebben microverbrandingsovens ook geen gasleiding nodig, die sommige laboratoria misschien niet hebben of misschien niet op elke bank hebben geplaatst voor studenten om te gebruiken. Geïnspireerd door deze voordelen werd een protocol ontwikkeld om het gebruik van vlammen te vervangen door micro-verbrandingsovens voor sterilisatie van veelgebruikte instrumenten zoals plectrums, spatels en scalpels in het C. elegans-laboratorium. Deze methode kan geschikt zijn voor instructeurs en onderzoekers die de veiligheid en/of flexibiliteit bij het werken met C. elegans willen verbeteren.
Protocol
1. Bereid de microverbrandingsoven voor
- Bevestig een accessoiregeleider met lushouder aan de microverbrandingsoven door deze op de buitenste loop te klikken.
- Sluit de microverbrandingsoven aan op een standaard stopcontact van 120 V of 230 V, naargelang het geval.
LET OP: Dit kan op een benchtop of in een laminaire flow kap. - Zet de microverbrandingsoven op de hoge stand en laat hem 10-20 minuten opwarmen, afhankelijk van de instructies van de fabrikant om een optimale temperatuur van 800-825 oC te bereiken.
OPMERKING: Als u de verbrandingsoven langer dan 3 uur aanhoudt, kan de lagere temperatuurinstelling (500 oC) als stand-by-instelling worden gebruikt. Volgens de gebruikershandleidingen van de fabrikant verlengt dit de gebruiksduur van de apparatuur.
2. Steriliseer de plectrum, spatel of scalpel
- Plaats het instrument in het cilindrische sterilisatiegebied zonder de zijkanten aan te raken door langs de geleider21 te schuiven.
OPMERKING: Bij het steriliseren van een scalpel is het van cruciaal belang om te voorkomen dat u de keramische wand met het mes aanraakt. Het schrapen van de keramische muur kan de integriteit van de verwarmingseenheid in gevaar brengen. - Houd het instrument gedurende 5-7 s in het sterilisatiegebied.
- Verwijder het instrument zonder de zijkanten aan te raken door naar achteren langs de geleider te schuiven.
- Voor plectrums, laat het instrument 3-5 s afkoelen voordat u een worm aanraakt om te voorkomen dat het verbrandt.
OPMERKING: Scalpels of spatels die niet mogen afkoelen, zingen de agar. - Na het plukken van wormen, plaats de plectrum opnieuw in de kamer voor 5-7 s om eventuele wormen op de plectrum te verbranden.
3. Vergelijkende methode - sterilisatie van instrumenten met behulp van een Bunsen-brander
- Sluit de Bunsen-brander aan op de gasleiding met behulp van rubberen buizen. Zorg ervoor dat u de slang goed vastzet en plaats de brander uit de buurt van voorwerpen boven het hoofd.
- Zet gas aan door aan de knop op de gasleiding te draaien.
- Steek de brander aan met een aansteker of aansteker.
- Stel de vlam in met behulp van de gasknop en de luchtinlaat totdat een blauwe kegel zichtbaar is.
- Houd de plectrum, spatel of scalpel in de vlam totdat deze rood gloeit.
- Voor beitels, laat het instrument 3-5 seconden afkoelen voordat u een worm aanraakt om te voorkomen dat het verbrandt.
OPMERKING: Scalpels of spatels die niet mogen afkoelen, zingen de agar. - Na het plukken van wormen, steekt u de plectrum opnieuw in de vlam om eventuele wormen op de plectrum te verbranden.
4. Experimenteer
- Kweek OP50 Escherichia coli (E. coli) bacteriën in Luria Bouillon22 's nachts op een 37 oC shaker.
- Verdun na de nachtkweek de cultuur in steriel water in een verhouding van 1:100.
OPMERKING: Deze verdunningsfactor is gekozen om de scheiding van kolonies na beplating te garanderen. - Dompel een wormenprik gesteriliseerd met behulp van een Bunsen-brander in de bacteriële oplossing, steriliseer opnieuw met de Bunsen-brander en draai deze in 100 ml steriel water.
- Leg de 100 μL water op een 10 cm LB agar22,23 petrischaaltje, verspreid het water met behulp van een steriele celstrooier en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 24 uur met het deksel erop.
- Voer stappen 4.3-4.4 uit met behulp van een wormenprik die is gesteriliseerd met een microverbrandingsoven.
- Voer als positieve controle stap 4.3-4.4 uit zonder opnieuw te steriliseren.
- Voer als negatieve controle stap 4.3-4.4 uit met steriel water in plaats van de bacteriële oplossing.
- Tel de kolonies handmatig na de incubatietijd.
Representative Results
Een eenvoudig experiment (sectie 4) werd bedacht om de relatieve besmettingspercentages aan te tonen met behulp van een micro-verbrandingsoven versus een vlam (figuur 1, tabel 2). Hoewel deze resultaten besmettingspercentages tussen methoden vertegenwoordigen, zou het niet nodig zijn om deze methode te herhalen om de microverbrandingstechniek te gebruiken. Het experiment werd in drievoud uitgevoerd. Negatieve controle was steriel water zonder bacteriën. De positieve controle gebruikte geen sterilisatietechniek: de pick werd in de verdunde OP50-cultuur gedompeld en vervolgens rechtstreeks op het steriele water overgebracht. Alle replicaties en omstandigheden werden parallel uitgevoerd op dezelfde dag. In alle drie de negatieve controleplaten werden nul kolonies geteld. Een gemiddelde telling van 4,7 (± 0,3 SEM) kolonies werd verkregen toen de Bunsen-brander werd gebruikt om beitels te steriliseren. Een gemiddelde telling van 3,3 (±1,2 SEM) kolonies werd waargenomen in de toestand van de microverbrandingsoven. Een gemiddelde telling van 298,3 (±17,9 SEM) kolonies werd echter verkregen in de positieve controleconditie. Een 2-tailed t-test uitgaande van gelijke variantie waarbij de Bunsen-brander werd vergeleken met de microverbrandingsoven leverde geen statistisch significant verschil op, p = 0,35. Zo bereikte de microverbrandingsoven steriliteitsresultaten die even effectief waren als de Bunsen-brander.
Figuur 1: Bacteriële tellingen over sterilisatiemethoden. Picks werden ondergedompeld in 1:100 OP50-cultuur in steriel water en vervolgens gesteriliseerd met behulp van een Bunsen-brander of micro-verbrandingsoven. Plectrums werden vervolgens in steriel water gedompeld, op LB agar22,23 geplateerd en gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, en kolonies werden handmatig geteld. Positieve controle had geen sterilisatie en negatieve controle gebruikte steriel water zonder bacteriën. n = 3 replicaties per aandoening. Opmerking: de y-as is verbroken om scheiding van gegevenspunten in relevante delen van de grafiek mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Sterilisatie methode | Kosten | Labvereisten | Voordelen | Nadelen | |||
| Micro-verbrandingsoven | $ 365-530 | 120 V of 230 V stopcontact | • Draagbaar • Geen open vuur of blootgesteld verwarmingselement • Bruikbaar in laminaire flowkappen en biologische veiligheidskasten |
• Opwarmtijd • Hogere kosten |
|||
| Bunsen Brander | $ 24-169 | Gasleiding | • Snelle installatie • Lage kosten |
• Open Vuur • Niet aanbevolen voor gebruik in laminaire flow kap of biologische veiligheidskast |
|||
| Ethanol Lamp | 11 dollar | Geen | • Snelle installatie • Lage kosten • Navulbaar |
• Open Vuur • Veiligheidsrisico bij het bijvullen • Niet aanbevolen voor gebruik in laminaire flow kap of biologische veiligheidskast • Niet toegestaan bij bepaalde instellingen |
|||
| Aansteker | $ 5-8 | Geen | • Lage kosten • Toegankelijk • Wegwerp • Navulbaar |
• Open Vuur • Handbediende • Niet aanbevolen voor gebruik in laminaire flow kap of biologische veiligheidskast |
|||
Tabel 1: Vergelijking van methoden voor het steriliseren van instrumenten. Vier methoden voor het steriliseren van instrumenten werden vergeleken op basis van voor- en nadelen, kosten en laboratoriumvereisten.
| Nabootsen | Conditie | |||
| Micro-verbrandingsoven | Bunsen Brander | Negatieve controle | Positve Controle | |
| 1 | 1 | 5 | 0 | 278 |
| 2 | 4 | 4 | 0 | 334 |
| 3 | 5 | 5 | 0 | 283 |
| Bedoelen | 3.3 | 4.7 | 0.0 | 298.3 |
| SEM | 1.2 | 0.3 | 0.0 | 17.9 |
Tabel 2: Ruwe gegevens van bacteriële tellingen over sterilisatiemethoden. Picks werden ondergedompeld in 1:100 OP50-cultuur in steriel water en vervolgens gesteriliseerd met behulp van een Bunsen-brander of micro-verbrandingsoven. Plectrums werden vervolgens in steriel water gedompeld, op LB agar22,23 geplateerd en gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, en kolonies werden handmatig geteld. Positieve controle had geen sterilisatie en negatieve controle gebruikte steriel water zonder bacteriën. n = 3 replicaties per aandoening. Gemiddelde en SEM gerapporteerd onder individuele tellingen.
Discussion
C. elegans is een modelorganisme dat zeer geschikt is voor oefeningen in niet-gegradueerde onderwijslaboratoria. Het gebruik van micro-verbrandingsovens in plaats van open vuur biedt voordelen in zowel onderzoekslaboratoria als klaslokaallaboratoria. In feite kunnen niet-gegradueerde laboratoriumcursussen een hoger risico op accidentele branden vormen, gezien het aantal nieuw opgeleide wetenschappers in de kamer. Bovendien neemt het risico op brand toe wanneer ethanol wordt gebruikt om instrumenten in de buurt van de vlambron te steriliseren, omdat ethanoldampen ontvlambaar zijn. De draagbaarheid biedt ook een voordeel voor klaslokalen waar niet op elke bank gasleidingen zijn geïnstalleerd. Deze methode is gebruikt in onderwijs- en onderzoekslaboratoria van onze instelling, wat heeft geresulteerd in geen toename van besmetting en nul laboratoriumveiligheidsongevallen sinds de oprichting in 2016.
Om compatibiliteit met micro-verbrandingsovens te garanderen, werd een reeks beitels met verschillende bevestigingen, draadsamenstellingen en draadmeters getest. De draadsamenstelling omvatte 100% platina en 90% platina / 10% iridium met een draaddikte van 30-32 G, en ongeacht de dikte en samenstelling, de verwarmingsmethode bracht de draadintegriteit niet in gevaar. De bevestigingen omvatten twee verschillende soorten in de handel verkrijgbare pickhandgrepen en in-house gemaakte glazen bevestigingen van Pasteur pipetten. Merk op dat plectrums niet roodgloeiend gloeien zoals in de vlam. Er wordt echter nog steeds voldoende sterilisatie bereikt zolang de sterilisator de juiste temperatuur heeft bereikt. Het is dus van cruciaal belang om de microverbrandingsoven 10 of 20 minuten te laten opwarmen, zoals aangegeven in de instructies van de fabrikant. Het is ook van cruciaal belang om het instrument minstens 5 s in de kamer te houden om sterilisatie te bereiken. Het instrument langer dan 7 s in de kamer laten liggen, zal geen schade toebrengen aan het instrument, maar is onnodig. Hoewel dit een relatief eenvoudige procedure is met minimale stappen en het onwaarschijnlijk is dat problemen moeten worden opgelost, kan het enige oefening vergen om te leren het instrument in de loop te stabiliseren zonder de zijkanten aan te raken.
Om een open vuur te vervangen, moet een sterilisatiemethode alle toepassingen omvatten die in een laboratorium worden gebruikt. Naast sterilisatie-instrumenten kunnen C. elegans-laboratoria ook Bunsen-branders gebruiken om een steriel veld te creëren om andere taken uit te voeren, zoals het gieten van platen of het inenten van culturen13. Of dit echter een steriel veld creëert of nog levensvatbare verontreinigingen aantrekt, blijft controversieel14. Hoewel niet bij alle instellingen een optie, kan een bioveiligheidskast of laminaire stromingskap voor deze doeleinden worden gebruikt, waardoor een laboratorium kan functioneren zonder het gebruik van open vuur. Gebruiksaanwijzingen voor de meeste micro-verbrandingsovens raden af om te gebruiken voor sterilisatie van scalpelbladen omdat het schrapen van de binnenwanden de sterilisator beschadigt. Als u echter zorgvuldig een gids gebruikt, kan men een scalpelmes of spatel steriliseren zonder de binnenwanden aan te raken. Dit breidt het gebruik van de techniek uit om brokken mogelijk te maken zonder een vlam te gebruiken en stelt een C. elegans-laboratorium in staat om te functioneren zonder tussen technieken te schakelen tussen het steriliseren van verschillende objecten.
Zoals beschreven in tabel 1, bieden microverbrandingsovens verhoogde veiligheid, verhoogde compatibiliteit met laminaire stromingskappen en verhoogde draagbaarheid ten opzichte van op vlam gebaseerde methoden, maar hebben ze beperkingen. Ze zijn duurder dan de andere methoden en vereisen een opwarmtijd voordat sterilisatietemperaturen worden bereikt. Kortom, deze methode, die routinematig wordt gebruikt in veel microbiologische laboratoria, kan van toepassing zijn in sommige C. elegans onderzoeks- en onderwijslaboratoria die de laboratoriumveiligheid willen verbeteren zonder afbreuk te doen aan de steriliteit.
Disclosures
Er werden geen belangenconflicten bekendgemaakt.
Acknowledgments
De auteurs willen suzanne Howard en Justin Finne bedanken. Dit werk werd gefinancierd door de Wellesley College Neuroscience Department. N2-wormen werden geleverd door de CGC die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). De publicatiekosten voor dit artikel werden ondersteund door het Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
- Attix, H., et al. Wild caught nematode identification and early embryo development: An accessible undergraduate research experience. microPublication Biology. 2021, (2021).
- Rose, J. K. Demonstrating connections between neuron signaling and behavior using C. elegans learning assays and optogenetics in a laboratory class. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 16 (3), 223-231 (2018).
- Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education: JUNE: A Publication of FUN, Faculty for Undergraduate Neuroscience. 15 (1), 44-55 (2016).
- Raley-Susman, K. M., Gray, J. M. Exploration of gerontogenes in the nervous system: a multi-level neurogenomics laboratory module for an intermediate neuroscience and behavior course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 8 (2), 108-115 (2010).
- Stiernagle, T.
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
- JoVE. Biology I: yeast, Drosophilia, and C. Elegant. C. Elegans Maintenace. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Hope, I. A. C. elegans: A Practical Approach. , IRL. Oxford University Press. Oxford. (1999).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with Worms: Caenorhabditis elegans as a Model Organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
- Waechter-Brulla, D. Improving safety in the microbiology laboratory through active learning and investigation. American Society for Microbiology. , (2000).
- Young, J. A. It says in the books that ethanol burns with a cool flame. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1488 (2000).
- Mojtabai, F., Kaufman, J. A. Learning by accident. V. 2. , Laboratory Safety Institute. Natick, MA. (2005).
- JoVE. General Laboratory Techniques. Introduction to the Bunsen Burner. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Katz, D. S. The streak plate protocol. American Society for Microbiology Laboratory Protocols. , (2008).
- Public Health Agency of Canada. Agency of Canada Canadian Biosafety Handbook. Government of Canada. , Ottawa, ON. (2016).
- Emmert, E. A. B. ASM Task Committee on Laboratory Biosafety Biosafety guidelines for handling microorganisms in the teaching laboratory: development and rationale. Journal of Microbiology & Biology Education. 14 (1), 78-83 (2013).
- Collins, C. H. Health Hazards in Microbiology. Handbook of Laboratory Health and Safety Measures. Pal, S. B. , Springer. Dordrecht. (1990).
- Laboratory Biosafety Manual. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/I/item/9789240011311 (2020).
- Fleming, D. O. Laboratory Safety Principles and Practices. American Society for Microbiology. , ASM Press. Washington, D.C. (1995).
- Gordon, R. C., Davenport, C. V. Simple modification to improve usefulness of the Bacti-Cinerator. Applied Microbiology. 26 (3), 423 (1973).
- Cold Spring Harbor.
- Cold Spring Harbor. Media containing agar or agarose. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
