Summary
Cet article décrit une méthode de stérilisation des pics à vers, des spatules et des scalpels à l’aide d’un micro-incinérateur à la place d’une flamme nue.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) est un organisme modèle optimal pour la recherche et l’éducation dans les établissements de premier cycle. Les étudiants de premier cycle peuvent rapidement apprendre la technique stérile nécessaire pour maintenir les cultures de C. elegans . La stérilisation des pics de platine utilisés pour transférer les vers d’une plaque à l’autre se fait traditionnellement en tenant le pic dans une flamme d’un brûleur Bunsen ou d’une lanterne à l’éthanol. Cependant, les brûleurs Bunsen nécessitent une source de gaz, et les deux pièces d’équipement présentent un risque d’incendie accidentel associé à une flamme nue. Voici une technique de stérilisation des pics à vers, des spatules et des scalpels à l’aide d’un micro-incinérateur à boucle bactériologique infrarouge. Cet équipement ne nécessite qu’une prise électrique et minimise les risques d’incendie potentiels. En réduisant les risques et les besoins en gaz, cette technique est bien adaptée à la recherche et à l’enseignement dans un contexte de premier cycle.
Introduction
L’organisme modèle C. elegans est bien adapté à la recherche et à l’éducation dans les établissements principalement de premier cycle (PUI) en raison de son faible coût, de sa facilité d’entretien et de sa gamme d’applications 1,2,3,4. Afin de manipuler les vers - par exemple, pour déplacer un ver d’une plaque à l’autre, les expérimentateurs peuvent utiliser un pic à ver. Une variété de pics peuvent être faits ou achetés pour une utilisation avec C. elegans. Les pics sont le plus souvent fabriqués à l’aide d’une pointe en platine ou en platine / iridium, montée dans un manche en verre, en métal ou en bois. Les poignées en verre peuvent être fabriquées en interne en faisant fondre une pipette Pasteur autour d’un fil de platine jusqu’à ce que le fil soit sécurisé. Des informations supplémentaires sur l’élevage de C. elegans, y compris sur la façon de cultiver et d’entretenir les vers et leurs sources de nourriture, peuvent être trouvées dans WormBook5 et d’autres sources 6,7,8.
Lorsque vous travaillez avec C. elegans, des techniques aseptiques sont généralement utilisées pour prévenir la contamination par des microbes et des champignons. Des exemples de techniques aseptiques comprennent la stérilisation des instruments, l’autoclavage des réactifs et la réalisation de travaux dans des champs stériles. Les pics à vis à vis sont généralement stérilisés à l’aide d’une flammenue 9. De plus, la stérilisation du pic à vers incinére les vers, empêchant ainsi les mélanges accidentels de souches lors du travail avec plusieurs souches de vers. Les méthodes typiques de stérilisation des pics à vers impliquent une flamme nue provenant d’un brûleur Bunsen, d’une lanterne à éthanol ou d’un briquet standard (tableau 1). Nous étions motivés à chercher des alternatives plus sûres aux méthodes existantes en laboratoire lorsqu’un étudiant de premier cycle a renversé sans le savoir de l’éthanol en remplissant une lanterne à éthanol et a accidentellement déclenché un petit incendie en allumant la lanterne. Malheureusement, de nombreux accidents ont été signalés à l’aide de lanternes à éthanol 10,11,12. Heureusement, des méthodes de stérilisation alternatives ont été validées pour une utilisation en microbiologie, et le but de cet article est de démontrer comment utiliser cet équipement pour stériliser des instruments destinés à être utilisés avec C. elegans.
Dans les laboratoires de microbiologie, la technique aseptique est également essentielle. Les boucles sérologiques et les fils en platine sont stérilisés soit à l’aide d’une flamme nue13, soit à l’aide d’un micro-incinérateur 14,15,16. D’autres noms pour les micro-incinérateurs comprennent les micro-stérilisateurs ou les bacto-incinérateurs. Les avantages du micro-incinérateur par rapport aux méthodes traditionnelles de flamme comprennent la réduction du risque d’incendie, l’élimination des éclaboussures de matériaux incinérés et la capacité de travailler dans une hotte à flux laminaire / armoire de biosécurité 16,17,18. En fait, l’American Society of Microbiology et l’Organisation mondiale de la santé recommandent d’utiliser des micro-incinérateurs plutôt que d’utiliser une flamme nue 17,19,20. Par rapport aux brûleurs Bunsen, les micro-incinérateurs ne nécessitent pas non plus de conduite de gaz, ce que certains laboratoires n’ont peut-être pas ou n’ont peut-être pas situé à chaque banc pour que les étudiants puissent l’utiliser. Inspiré par ces avantages, un protocole a été développé pour remplacer l’utilisation de la flamme par des micro-incinérateurs pour la stérilisation d’instruments couramment utilisés tels que les pics, les spatules et les scalpels dans le laboratoire C. elegans. Cette méthode peut convenir aux instructeurs et aux chercheurs qui cherchent à améliorer la sécurité et/ou la flexibilité lorsqu’ils travaillent avec C. elegans.
Protocol
1. Préparer le micro-incinérateur
- Fixez un guide d’accessoire de support de boucle au micro-incinérateur en le clipsant sur le canon extérieur.
- Branchez le micro-incinérateur sur une prise électrique standard de 120 V ou 230 V, selon le cas.
REMARQUE: Cela peut être fait sur une paillasse ou dans une hotte à flux laminaire. - Tournez le micro-incinérateur au réglage élevé et laissez-le se réchauffer pendant 10 à 20 minutes selon les instructions du fabricant pour atteindre une température optimale de 800 à 825 °C.
REMARQUE: Si vous maintenez l’incinérateur allumé pendant plus de 3 h, le réglage de température inférieure (500 °C) peut être utilisé comme réglage de veille. Selon les manuels d’utilisation des fabricants, cela prolonge la durée de vie utile de l’équipement.
2. Stériliser le pic, la spatule ou le scalpel
- Insérez l’instrument dans la zone de stérilisation cylindrique sans toucher les côtés en glissant le long du guide21.
REMARQUE: Si vous stérilisez un scalpel, il est essentiel d’éviter de toucher la paroi en céramique avec la lame. Le grattage du mur en céramique peut compromettre l’intégrité de l’unité de chauffage. - Tenez l’instrument dans la zone de stérilisation pendant 5 à 7 s.
- Retirez l’instrument sans toucher les côtés en glissant vers l’arrière le long du guide.
- Pour les pics, laissez refroidir l’instrument pendant 3 à 5 s avant de toucher un ver pour éviter de le brûler.
REMARQUE: Les scalpels ou les spatules qui ne sont pas autorisés à refroidir chanteront la gélose. - Après avoir cueilli les vers, réinsérez le pic dans la chambre pendant 5 à 7 s pour incinérer tous les vers sur le pic.
3. Méthode comparative - stérilisation d’instruments à l’aide d’un brûleur Bunsen
- Connectez le brûleur Bunsen à la conduite de gaz à l’aide d’un tube en caoutchouc. Assurez-vous de bien fixer le tube et de positionner le brûleur loin des objets aériens.
- Allumez le gaz en tournant le bouton de la conduite de gaz.
- Allumez le brûleur à l’aide d’un gâche ou d’un briquet.
- Réglez la flamme à l’aide du bouton de gaz et de l’entrée d’air jusqu’à ce qu’un cône bleu soit visible.
- Tenez le pic, la spatule ou le scalpel dans la flamme jusqu’à ce qu’il brille en rouge.
- Pour les pics, laissez l’instrument refroidir pendant 3 à 5 secondes avant de toucher un ver pour éviter de le brûler.
REMARQUE: Les scalpels ou les spatules qui ne sont pas autorisés à refroidir chanteront la gélose. - Après avoir cueilli des vers, réinsérez le pic dans la flamme pour incinérer les vers sur le pic.
4. Expérience
- Culture op50 Escherichia coli (E. coli) bactéries dans le bouillon Luria22 pendant la nuit sur un shaker de 37 °C.
- Après la culture pendant la nuit, diluer la culture dans de l’eau stérile dans un rapport de 1:100.
NOTE: Ce facteur de dilution a été choisi pour assurer la séparation des colonies après le placage. - Trempez un pic à ver stérilisé à l’aide d’un brûleur Bunsen dans la solution bactérienne, stérilisez-le à nouveau avec le brûleur Bunsen et faites-le tourbillonner dans 100 mL d’eau stérile.
- Plaquer les 100 μL d’eau sur une boîte de Petri gélose22,23 LB de 10 cm, étaler l’eau à l’aide d’un épandeur cellulaire stérile et incuber à température ambiante pendant 24 h avec le couvercle.
- Effectuez les étapes 4.3 à 4.4 à l’aide d’un pic à vis sans fin stérilisé à l’aide d’un micro-incinérateur.
- Comme témoin positif, effectuez les étapes 4.3 à 4.4 sans stérilisation à nouveau.
- Comme témoin négatif, effectuez les étapes 4.3 à 4.4 en utilisant de l’eau stérile à la place de la solution bactérienne.
- Comptez les colonies manuellement après la période d’incubation.
Representative Results
Une expérience simple (section 4) a été conçue pour démontrer les taux de contamination relatifs à l’aide d’un micro-incinérateur par rapport à une flamme (figure 1, tableau 2). Bien que ces résultats représentent les taux de contamination d’une méthode à l’autre, il ne serait pas nécessaire de répéter cette méthode pour utiliser la technique du micro-incinérateur. L’expérience a été menée en trois exemplaires. Le contrôle négatif était de l’eau stérile sans bactéries. Le témoin positif n’a utilisé aucune technique de stérilisation : le pic a été plongé dans la culture d’OP50 diluée puis transféré directement dans l’eau stérile. Toutes les répliques et conditions ont été exécutées en parallèle le même jour. Dans les trois plaques témoins négatives, aucune colonie n’a été comptée. Un nombre moyen de 4,7 colonies (± 0,3 SEM) a été obtenu lorsque le brûleur Bunsen a été utilisé pour stériliser les pics. Un dénombrement moyen de 3,3 colonies (±1,2 SEM) a été observé dans l’état de micro-incinérateur. Cependant, un nombre moyen de 298,3 colonies (±17,9 SEM) a été obtenu dans la condition témoin positive. Un test t à 2 queues supposant une variance égale comparant le brûleur Bunsen au micro-incinérateur n’a donné aucune différence statistiquement significative, p = 0,35. Ainsi, le micro-incinérateur a obtenu des résultats de stérilité aussi efficaces que le brûleur Bunsen.
Figure 1 : Numération bactérienne dans les méthodes de stérilisation. Les pics ont été plongés dans une culture OP50 de 1:100 dans de l’eau stérile, puis stérilisés à l’aide d’un brûleur Bunsen ou d’un micro-incinérateur. Les pics ont ensuite été trempés dans de l’eau stérile, plaqués sur de la gélose LB 22,23, et incubés pendant 24 h à température ambiante, et les colonies ont été comptées manuellement. Le contrôle positif n’avait pas de stérilisation, et le contrôle négatif utilisait de l’eau stérile sans bactérie. n = 3 réplications par condition. Remarque : L’axe des y est brisé pour permettre la séparation des points de données dans les parties pertinentes du graphique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Méthode de stérilisation | Coût | Exigences du laboratoire | Avantages | Inconvénients | |||
| Micro-incinérateur | 365 à 530 $ | Prise 120 V ou 230 V | • Portable • Pas de flamme nue ou d’élément chauffant exposé • Utilisable dans les hottes à flux laminaire et les armoires de sécurité biologique |
• Temps d’échauffement • Coût plus élevé |
|||
| Bec Bunsen | 24 à 169 $ | Conduite de gaz | • Configuration rapide • Faible coût |
• Flamme nue • Non recommandé pour une utilisation dans une hotte à flux laminaire ou une armoire de sécurité biologique |
|||
| Lampe à l’éthanol | 11 $ | Aucun | • Configuration rapide • Faible coût • Rechargeable |
• Flamme nue • Danger pour la sécurité lors du remplissage • Non recommandé pour une utilisation dans une hotte à flux laminaire ou une armoire de sécurité biologique • Non autorisé dans certaines institutions |
|||
| Briquet | 5 à 8 $ | Aucun | • Faible coût • Accessible • Jetable • Rechargeable |
• Flamme nue • Opéré à la main • Non recommandé pour une utilisation dans une hotte à flux laminaire ou une armoire de sécurité biologique |
|||
Tableau 1 : Comparaison des méthodes de stérilisation des instruments. Quatre méthodes de stérilisation des instruments ont été comparées en fonction des avantages, des inconvénients, des coûts et des exigences du laboratoire.
| Répliquer | Condition | |||
| Micro-incinérateur | Bec Bunsen | Contrôle négatif | Contrôle positve | |
| 1 | 1 | 5 | 0 | 278 |
| 2 | 4 | 4 | 0 | 334 |
| 3 | 5 | 5 | 0 | 283 |
| Méchant | 3.3 | 4.7 | 0.0 | 298.3 |
| SEM | 1.2 | 0.3 | 0.0 | 17.9 |
Tableau 2 : Données brutes sur le nombre de bactéries dans les méthodes de stérilisation. Les pics ont été plongés dans une culture OP50 de 1:100 dans de l’eau stérile, puis stérilisés à l’aide d’un brûleur Bunsen ou d’un micro-incinérateur. Les pics ont ensuite été trempés dans de l’eau stérile, plaqués sur de la gélose LB 22,23, et incubés pendant 24 h à température ambiante, et les colonies ont été comptées manuellement. Le contrôle positif n’avait pas de stérilisation, et le contrôle négatif utilisait de l’eau stérile sans bactérie. n = 3 réplications par condition. Moyenne et SEM rapportées sous les dénombrements individuels.
Discussion
C. elegans est un organisme modèle bien adapté aux exercices dans les laboratoires d’enseignement de premier cycle. L’utilisation de micro-incinérateurs à la place des flammes nues offre des avantages à la fois dans les laboratoires de recherche et dans les laboratoires de classe. En fait, les cours de laboratoire de premier cycle peuvent présenter un risque plus élevé d’incendies accidentels compte tenu du nombre de scientifiques nouvellement formés dans la salle. De plus, le risque d’incendie augmente lorsque l’éthanol est utilisé pour stériliser des instruments près de la source de flamme, car les vapeurs d’éthanol sont inflammables. La portabilité confère également un avantage pour les salles de classe où les conduites de gaz ne sont pas installées à chaque banc. Cette méthode a été utilisée dans les laboratoires d’enseignement et de recherche de notre établissement, ce qui n’a entraîné aucune augmentation de la contamination et aucun accident de sécurité en laboratoire depuis son incorporation en 2016.
Pour assurer la compatibilité avec les micro-incinérateurs, une gamme de pics avec différents supports, compositions de fils et jauges de fils a été testée. La composition du fil comprenait 100% de platine ainsi que 90% de platine / 10% d’iridium avec une épaisseur de fil de 30-32 G, et indépendamment de l’épaisseur et de la composition, la méthode de chauffage ne compromettait pas l’intégrité du fil. Les supports comprenaient deux types différents de poignées de pic disponibles dans le commerce et des supports en verre fabriqués en interne à partir de pipettes Pasteur. Notez que les pics ne brillent pas au rouge comme ils le font dans la flamme. Cependant, une stérilisation suffisante est toujours réalisée tant que le stérilisateur a atteint la bonne température. Ainsi, il est essentiel de permettre au micro-incinérateur de se réchauffer pendant 10 ou 20 min, comme indiqué dans les instructions du fabricant. Il est également essentiel de garder l’instrument dans la chambre pendant au moins 5 secondes pour obtenir la stérilisation. Laisser l’instrument dans la chambre plus de 7 s ne causera pas de dommages à l’instrument, mais n’est pas nécessaire. Bien qu’il s’agisse d’une procédure relativement simple avec un minimum d’étapes et qu’il soit peu probable qu’elle nécessite un dépannage, il faudra peut-être un peu de pratique pour apprendre à stabiliser l’instrument dans le canon sans toucher les côtés.
Afin de remplacer une flamme nue, une méthode de stérilisation doit couvrir toutes les applications utilisées en laboratoire. En plus des instruments de stérilisation, les laboratoires de C. elegans peuvent également utiliser des brûleurs Bunsen pour créer un champ stérile afin d’effectuer d’autres tâches telles que verser des plaques ou inoculer des cultures13. Cependant, la question de savoir si cela crée un champ stérile ou attire des contaminants encore viables reste controversée14. Bien qu’il ne s’agisse pas d’une option dans tous les établissements, une armoire de biosécurité ou une hotte à flux laminaire peut être utilisée à ces fins, permettant à un laboratoire de fonctionner sans utiliser de flammes nues. Les manuels d’instructions de la plupart des micro-incinérateurs déconseillent l’utilisation pour la stérilisation des lames de scalpel car le grattage des parois internes endommage le stérilisateur. Cependant, si vous utilisez soigneusement un guide, on peut stériliser une lame de scalpel ou une spatule sans toucher les parois intérieures. Cela étend l’utilisation de la technique pour permettre le morcellement sans utiliser de flamme et permet à un laboratoire de C. elegans de fonctionner sans changer de technique entre la stérilisation de différents objets.
Comme indiqué dans le tableau 1, les micro-incinérateurs offrent une sécurité accrue, une compatibilité accrue avec les hottes à flux laminaire et une portabilité accrue par rapport aux méthodes à flamme, mais ont des limites. Elles sont plus coûteuses que les autres méthodes et nécessitent un temps de réchauffement avant que les températures de stérilisation ne soient atteintes. En conclusion, cette méthode, qui est couramment utilisée dans de nombreux laboratoires de microbiologie, peut être applicable dans certains laboratoires de recherche et d’enseignement de C. elegans cherchant à améliorer la sécurité des laboratoires sans compromettre la stérilité.
Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’a été divulgué.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Suzanne Howard et Justin Finne. Ce travail a été financé par le département de neurosciences du Wellesley College. Les vers N2 ont été fournis par la CCG, qui est financée par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Les frais de publication de cet article ont été pris en charge par le Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
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