Summary
Bu makalede, solucan toplamaları, spatulaları ve neşterleri açık alev yerine bir mikro yakma fırını kullanarak sterilize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans), öncelikle lisans kurumlarında araştırma ve eğitim için en uygun model organizmadır. Lisans öğrencileri, C. elegans kültürlerini korumak için gereken steril tekniği hızlı bir şekilde öğrenebilirler. Solucanları bir plakadan diğerine aktarmak için kullanılan platin toplarının sterilizasyonu, geleneksel olarak bir Bunsen brülöründen veya etanol fenerinden bir alev içinde tutularak yapılır. Bununla birlikte, Bunsen brülörleri bir gaz kaynağına ihtiyaç duyar ve her iki ekipman parçası da açık alevle ilişkili kazara yangın riski taşır. Burada gösterilen, solucan toplamalarını, spatulaları ve neşterleri kızılötesi bakteriyolojik döngü mikro yakma fırını kullanarak sterilize etmek için bir tekniktir. Bu ekipman sadece bir elektrik prizi gerektirir ve potansiyel yangın tehlikelerini en aza indirir. Risk ve gaz gereksinimlerini azaltarak, bu teknik lisans ortamında araştırma ve öğretim için çok uygundur.
Introduction
Model organizma C. elegans, düşük maliyet, bakım kolaylığıve uygulama yelpazesi 1,2,3,4 nedeniyle öncelikle lisans kurumlarında (PUI'ler) hem araştırma hem de eğitim için çok uygundur. Solucanları işlemek için - örneğin, bir solucanı bir plakadan diğerine taşımak için, deneyciler bir solucan toplama kullanabilirler. C. elegans ile kullanılmak üzere çeşitli seçimler yapılabilir veya satın alınabilir. Seçimler en yaygın olarak cam, metal veya ahşap sapa monte edilmiş bir platin veya platin / iridyum ucu kullanılarak yapılır. Cam tutamaklar, tel sabitlenene kadar bir platin telin etrafında bir Pasteur pipeti eriterek şirket içinde yapılabilir. Solucanların ve besin kaynaklarının nasıl yetiştirileceği ve korunacağı da dahil olmak üzere C. elegans yetiştiriciliği hakkında ek bilgiler WormBook5 ve diğer kaynaklardabulunabilir 6,7,8.
C. elegans ile çalışırken, mikroplar ve mantarlarla kontaminasyonu önlemek için tipik olarak aseptik teknikler kullanılır. Aseptik tekniklere örnek olarak aletlerin sterilizasyonu, reaktiflerin otoklavlanması ve steril alanlarda çalışma yapılması verilebilir. Solucan sapları tipik olarak açık alev9 kullanılarak sterilize edilir. Ek olarak, solucan toplamanın sterilizasyonu solucanları yakar, böylece birden fazla solucan suşu ile çalışırken suşların kazara karışmasını önler. Solucan kepçelerini sterilize etmek için tipik yöntemler, bir Bunsen brülöründen, etanol fenerinden veya standart çakmaktan açık bir alev içerir (Tablo 1). Bir lisans öğrencisi bir etanol fenerini doldururken bilmeden etanol döktüğünde ve feneri tutuştururken yanlışlıkla küçük bir yangın başlattığında, laboratuvardaki mevcut yöntemlere daha güvenli alternatifler aramak için motive olduk. Ne yazık ki, etanol fenerleri10,11,12 kullanılarak birçok kaza bildirilmiştir. Neyse ki, mikrobiyolojide kullanılmak üzere alternatif sterilizasyon yöntemleri doğrulanmıştır ve bu makalenin amacı, C. elegans ile kullanılmak üzere aletleri sterilize etmek için bu ekipmanın nasıl kullanılacağını göstermektir.
Mikrobiyoloji laboratuvarlarında aseptik teknik de kritik öneme sahiptir. Platinden yapılmış serolojik halkalar ve teller, açık alev13 veya mikro yakma fırını 14,15,16 kullanılarak sterilize edilir. Mikro yakma fırınlarının diğer isimleri arasında mikro sterilizatörler veya bacto-yakma fırınları bulunur. Mikro yakma fırınının geleneksel alev yöntemlerine göre avantajları arasında yangın tehlikesinin azaltılması, yanan malzemelerin sıçramasının ortadan kaldırılması ve laminer bir akış davlumbazı/biyogüvenlik kabininde çalışabilme yeteneği bulunmaktadır16,17,18. Aslında, hem Amerikan Mikrobiyoloji Derneği hem de Dünya Sağlık Örgütü, açık alev kullanımı üzerinde mikro yakma fırınlarının kullanılmasını önermektedir17,19,20. Bunsen brülörleriyle karşılaştırıldığında, mikro yakma fırınları, bazı laboratuvarların sahip olamayacağı veya öğrencilerin kullanması için her tezgahta bulunmamış olabileceği bir gaz hattı gerektirmez. Bu avantajlardan esinlenerek, C. elegans laboratuvarında toplama, spatula ve neşter gibi yaygın olarak kullanılan aletlerin sterilizasyonu için alev kullanımını mikro yakma fırınlarıyla değiştirmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu yöntem, C. elegans ile çalışırken güvenliği ve / veya esnekliği artırmak isteyen eğitmenler ve araştırmacılar için uygun olabilir.
Protocol
1. Mikro yakma fırınını hazırlayın
- Bir döngü tutucu aksesuar kılavuzunu mikro yakma fırınına dış namluya kırparak takın.
- Mikro yakma fırınını uygun şekilde standart bir 120 V veya 230 V elektrik prizine takın.
NOT: Bu, tezgah üstü veya laminer akış davlumbazında yapılabilir. - Mikro yakma fırınını yüksek ayara getirin ve 800-825 oC'lik optimum sıcaklığa ulaşmak için üreticinin talimatlarına bağlı olarak 10-20 dakika ısınmasına izin verin.
NOT: Yakma fırınını 3 saatten daha uzun süre açık tutarsanız, bekleme ayarı olarak daha düşük sıcaklık ayarı (500 oC) kullanılabilir. Üreticilerin kullanım kılavuzlarına göre, bu ekipmanın kullanım ömrünü uzatır.
2. Toplama, spatula veya neşteri sterilize edin
- Cihazı kılavuz21 boyunca kaydırarak yanlara dokunmadan silindirik sterilizasyon alanına yerleştirin.
NOT: Bir neşter sterilize ediliyorsa, seramik duvara bıçakla dokunmaktan kaçınmak çok önemlidir. Seramik duvarın kazınması, ısıtma ünitesinin bütünlüğünü tehlikeye atabilir. - Aleti sterilizasyon alanında 5-7 s tutun.
- Kılavuz boyunca geriye doğru kaydırarak yanlara dokunmadan aleti çıkarın.
- Toplamalar için, yanmasını önlemek için bir solucana dokunmadan önce cihazın 3-5 s soğumasını bekleyin.
NOT: Soğumasına izin verilmeyen neşterler veya spatulalar agar'ı söyleyecektir. - Solucanları topladıktan sonra, toplama üzerindeki solucanları yakmak için toplama kabına 5-7 s tekrar yerleştirin.
3. Karşılaştırmalı yöntem - bir Bunsen brülörü kullanarak aletlerin sterilizasyonu
- Bunsen brülörünü kauçuk boru kullanarak gaz hattına bağlayın. Boruyu sıkıca sabitlediğinizden ve brülörü baş üstü nesnelerden uzağa yerleştirdiğinizden emin olun.
- Gaz hattındaki düğmeyi çevirerek gazı açın.
- Brülörü bir forvet veya çakmak kullanarak ateşleyin.
- Mavi bir koni görünene kadar gaz düğmesini ve hava girişini kullanarak alevi ayarlayın.
- Toplamayı, spatulayı veya neşteri kırmızı parlayana kadar alevin içinde tutun.
- Toplamalar için, yanmasını önlemek için bir solucana dokunmadan önce cihazın 3-5 saniye soğumasını bekleyin.
NOT: Soğumasına izin verilmeyen neşterler veya spatulalar agar'ı söyleyecektir. - Solucanları topladıktan sonra, toplama üzerindeki solucanları yakmak için toplama işlemini aleve tekrar yerleştirin.
4. Deney
- Kültür OP50 Escherichia coli (E. coli) bakterileri Luria Broth22'de gece boyunca 37 oC'lik bir çalkalayıcıda.
- Gece kültüründen sonra, kültürü steril suda 1:100 oranında seyreltin.
NOT: Bu seyreltme faktörü, kaplamadan sonra kolonilerin ayrılmasını sağlamak için seçilmiştir. - Bunsen brülörü kullanılarak sterilize edilmiş bir solucan kepçesini bakteriyel çözeltiye batırın, Bunsen brülörü ile yeniden sterilize edin ve 100 mL steril suda döndürün.
- 10 cm'lik bir LB agar 22,23 Petri kabı üzerine 100 μL suyu tabaklayın, steril bir hücre dağıtıcı kullanarak suyu yayın ve oda sıcaklığında kapak açıkken24 saat boyunca inkübe edin.
- Bir mikro yakma fırını kullanılarak sterilize edilmiş bir solucan toplama makinesi kullanarak 4.3-4.4 adımlarını uygulayın.
- Pozitif bir kontrol olarak, yeniden sterilizasyon olmadan 4.3-4.4 adımlarını uygulayın.
- Negatif bir kontrol olarak, bakteriyel çözelti yerine steril su kullanarak 4.3-4.4 adımlarını uygulayın.
- Kuluçka döneminden sonra kolonileri manuel olarak sayın.
Representative Results
Bir aleve karşı bir mikro yakma fırını kullanılarak göreceli kontaminasyon oranlarını göstermek için basit bir deney (bölüm 4) tasarlanmıştır (Şekil 1, Tablo 2). Bu sonuçlar yöntemler arasında kontaminasyon oranlarını temsil etse de, mikro yakma tekniğini kullanmak için bu yöntemi tekrarlamak gerekli olmayacaktır. Deneme üçlü olarak çalıştırıldı. Negatif kontrol, bakteri içermeyen steril suydu. Pozitif kontrolde sterilizasyon tekniği kullanılmadı: Toplama seyreltilmiş OP50 kültürüne batırıldı ve ardından doğrudan steril suya aktarıldı. Tüm çoğaltmalar ve koşullar aynı gün paralel olarak çalıştırıldı. Her üç negatif kontrol plakasında da sıfır koloni sayıldı. Bunsen brülörü toplamaları sterilize etmek için kullanıldığında ortalama 4.7 (± 0.3 SEM) koloni sayısı elde edildi. Mikro-yakma fırını durumunda ortalama 3.3 (±1.2 SEM) koloni sayısı gözlendi. Bununla birlikte, pozitif kontrol durumunda ortalama 298.3 (±17.9 SEM) koloni sayısı elde edildi. Bunsen brülörünü mikro yakma fırını ile karşılaştıran eşit varyansı varsayan 2 kuyruklu bir t-testi, istatistiksel olarak anlamlı bir fark vermedi, p = 0.35. Böylece, mikro yakma fırını, Bunsen brülörü için eşit derecede etkili sterilite sonuçları elde etti.
Şekil 1: Sterilizasyon yöntemlerinde bakteri sayımı. Kazmalar steril suya 1:100 OP50 kültürüne batırıldı ve daha sonra bir Bunsen brülörü veya mikro yakma fırını kullanılarak sterilize edildi. Toplamalar daha sonra steril suya batırıldı, LB agar22,23 üzerine kaplandı ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca inkübe edildi ve koloniler manuel olarak sayıldı. Pozitif kontrolün sterilizasyonu yoktu ve negatif kontrol bakteri içermeyen steril su kullandı. n = koşul başına 3 çoğaltma. Not: Y ekseni, grafiğin ilgili bölümlerindeki veri noktalarının ayrılmasına izin vermek için bozulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sterilizasyon Yöntemi | Masraf | Laboratuvar Gereksinimleri | Avantaj -ları | Dezavantaj -ları | |||
| Mikro yakma fırını | 365-530 ABD doları | 120 V veya 230 V çıkış | • Portatif • Açık alevli veya açıkta kalan ısıtma elemanı yok • Laminer davlumbazlarda ve biyolojik güvenlik kabinlerinde kullanılabilir |
• Isınma süresi • Daha yüksek maliyet |
|||
| Bunsen Brülör | 24-169 ABD doları | Gaz Hattı | • Hızlı kurulum • Düşük maliyet |
• Açık Alev • Laminer davlumbaz veya biyolojik güvenlik kabininde kullanılması önerilmez |
|||
| Etanol Lamba | 11 Dolar | Hiç kimse | • Hızlı kurulum • Düşük maliyet • Yeniden doldurulabilir |
• Açık Alev • Yeniden doldurma sırasında güvenlik tehlikesi • Laminer davlumbaz veya biyolojik güvenlik kabininde kullanılması önerilmez • Bazı kurumlarda izin verilmez |
|||
| Çakmak | 5-8 ABD doları | Hiç kimse | • Düşük maliyet • Erişilebilir • Tek kullanımlık • Yeniden doldurulabilir |
• Açık Alev • Elle çalıştırılan • Laminer davlumbaz veya biyolojik güvenlik kabininde kullanılması önerilmez |
|||
Tablo 1: Aletleri sterilize etme yöntemlerinin karşılaştırılması. Aletleri sterilize etmek için dört yöntem, avantajlara, dezavantajlara, maliyetlere ve laboratuvar gereksinimlerine göre karşılaştırılmıştır.
| Çoğaltmak | Koşul | |||
| Mikro yakma fırını | Bunsen Brülör | Negatif Kontrol | Pozitif Kontrol | |
| 1 | 1 | 5 | 0 | 278 |
| 2 | 4 | 4 | 0 | 334 |
| 3 | 5 | 5 | 0 | 283 |
| Demek | 3.3 | 4.7 | 0.0 | 298.3 |
| SEM | 1.2 | 0.3 | 0.0 | 17.9 |
Tablo 2: Sterilizasyon yöntemlerindeki bakteri sayımlarının ham verileri. Kazmalar steril suya 1:100 OP50 kültürüne batırıldı ve daha sonra bir Bunsen brülörü veya mikro yakma fırını kullanılarak sterilize edildi. Toplamalar daha sonra steril suya batırıldı, LB agar22,23 üzerine kaplandı ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca inkübe edildi ve koloniler manuel olarak sayıldı. Pozitif kontrolün sterilizasyonu yoktu ve negatif kontrol bakteri içermeyen steril su kullandı. n = koşul başına 3 çoğaltma. Ortalama ve SEM, bireysel sayımların altında rapor edilmiştir.
Discussion
C. elegans , lisans öğretim laboratuvarlarındaki alıştırmalar için çok uygun bir model organizmadır. Açık alevler yerine mikro yakma fırınlarının kullanılması hem araştırma laboratuvarlarında hem de sınıf laboratuvarlarında fayda sağlamaktadır. Aslında, lisans laboratuvar dersleri, odadaki yeni eğitilmiş bilim adamlarının sayısı göz önüne alındığında, kazara yangın riski daha yüksek olabilir. Ek olarak, etanol buharları tutuşabilir olduğu için alev kaynağının yakınındaki aletleri sterilize etmek için etanol kullanıldığında yangın riski artar. Taşınabilirlik, her bir tezgahta gaz hatlarının kurulmadığı sınıflar için de bir avantaj sağlar. Bu yöntem, kurumumuzdaki öğretim ve araştırma laboratuvarlarında kullanılmakta olup, 2016 yılında kuruluşundan bu yana kontaminasyonda herhangi bir artış ve sıfır laboratuvar güvenlik kazası ile sonuçlanmıştır.
Mikro yakma fırınlarıyla uyumluluğu sağlamak için, farklı montajlara, tel bileşimlerine ve tel göstergelerine sahip bir dizi seçim test edildi. Tel bileşimi, 30-32 G tel kalınlığına sahip% 100 platin ve% 90 platin / % 10 iridyum içeriyordu ve kalınlık ve bileşimden bağımsız olarak, ısıtma yöntemi tel bütünlüğünden ödün vermedi. Montajlar, ticari olarak temin edilebilen iki farklı tipte toplama kolu ve Pasteur pipetlerden şirket içi cam montajları içeriyordu. Seçimlerin alevde olduğu gibi kırmızı-sıcak yanmadığını unutmayın. Bununla birlikte, sterilizatör uygun sıcaklığa ulaştığı sürece yeterli sterilizasyon hala elde edilir. Bu nedenle, mikro yakma fırınının üreticinin talimatlarında belirtildiği gibi 10 veya 20 dakika ısınmasına izin vermek çok önemlidir. Sterilizasyonu sağlamak için cihazı odada en az 5 s tutmak da kritik öneme sahiptir. Aletin haznede 7 sn'den daha uzun süre bırakılması cihaza zarar vermez, ancak gereksizdir. Bu, minimum adımlarla nispeten basit bir prosedür olsa da ve sorun giderme gerektirmeyecek olsa da, cihazı yanlara dokunmadan namluda sabitlemeyi öğrenmek biraz pratik gerektirebilir.
Açık bir alevin yerini almak için, bir sterilizasyon yönteminin laboratuvarda kullanılan tüm uygulamaları kapsaması gerekir. C. elegans laboratuvarları, sterilizasyon aletlerine ek olarak, plakaların dökülmesi veya kültürlerin aşılanması gibi diğer görevleri yerine getirmek için steril bir alan oluşturmak için Bunsen brülörlerini de kullanabilir13. Bununla birlikte, bunun steril bir alan yaratıp yaratmadığı veya hala uygulanabilir kirleticileri içerip çekmediği tartışmalı olmaya devam etmektedir14. Tüm kurumlarda bir seçenek olmasa da, bu amaçlar için bir biyogüvenlik kabini veya laminer akış başlığı kullanılabilir ve bir laboratuvarın açık alev kullanmadan çalışmasına izin verir. Çoğu mikro yakma fırını için kullanım kılavuzları, neşter bıçaklarının sterilizasyonunda kullanılmamasını önerir, çünkü iç duvarların kazınması sterilizatöre zarar verir. Bununla birlikte, dikkatli bir şekilde bir kılavuz kullanılırsa, iç duvarlara dokunmadan bir neşter bıçağı veya spatula sterilize edilebilir. Bu, bir alev kullanmadan parçalamaya izin vermek için tekniğin kullanımını genişletir ve bir C. elegans laboratuvarının farklı nesneleri sterilize etmek arasında teknikler değiştirmeden çalışmasına izin verir.
Tablo 1'de belirtildiği gibi, mikro yakma fırınları daha fazla güvenlik, laminer akış davlumbazlarıyla daha fazla uyumluluk ve alev bazlı yöntemlere göre daha fazla taşınabilirlik sunar, ancak sınırlamaları vardır. Diğer yöntemlere göre daha maliyetlidirler ve sterilizasyon sıcaklıklarına ulaşılmadan önce ısınma süresi gerektirirler. Sonuç olarak, birçok mikrobiyoloji laboratuvarında rutin olarak kullanılan bu yöntem, steriliteden ödün vermeden laboratuvar güvenliğini artırmak isteyen bazı C. elegans araştırma ve öğretim laboratuvarlarında uygulanabilir.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması açıklanmadı.
Acknowledgments
Yazarlar Suzanne Howard ve Justin Finne'ye teşekkür eder. Bu çalışma Wellesley College Sinirbilim Bölümü tarafından finanse edildi. N2 solucanları, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Bu makalenin yayın ücretleri Wellesley College Kütüphane ve Teknoloji Hizmetleri Açık Erişim Fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
- Attix, H., et al. Wild caught nematode identification and early embryo development: An accessible undergraduate research experience. microPublication Biology. 2021, (2021).
- Rose, J. K. Demonstrating connections between neuron signaling and behavior using C. elegans learning assays and optogenetics in a laboratory class. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 16 (3), 223-231 (2018).
- Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education: JUNE: A Publication of FUN, Faculty for Undergraduate Neuroscience. 15 (1), 44-55 (2016).
- Raley-Susman, K. M., Gray, J. M. Exploration of gerontogenes in the nervous system: a multi-level neurogenomics laboratory module for an intermediate neuroscience and behavior course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 8 (2), 108-115 (2010).
- Stiernagle, T.
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
- JoVE. Biology I: yeast, Drosophilia, and C. Elegant. C. Elegans Maintenace. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Hope, I. A. C. elegans: A Practical Approach. , IRL. Oxford University Press. Oxford. (1999).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with Worms: Caenorhabditis elegans as a Model Organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
- Waechter-Brulla, D. Improving safety in the microbiology laboratory through active learning and investigation. American Society for Microbiology. , (2000).
- Young, J. A. It says in the books that ethanol burns with a cool flame. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1488 (2000).
- Mojtabai, F., Kaufman, J. A. Learning by accident. V. 2. , Laboratory Safety Institute. Natick, MA. (2005).
- JoVE. General Laboratory Techniques. Introduction to the Bunsen Burner. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Katz, D. S. The streak plate protocol. American Society for Microbiology Laboratory Protocols. , (2008).
- Public Health Agency of Canada. Agency of Canada Canadian Biosafety Handbook. Government of Canada. , Ottawa, ON. (2016).
- Emmert, E. A. B. ASM Task Committee on Laboratory Biosafety Biosafety guidelines for handling microorganisms in the teaching laboratory: development and rationale. Journal of Microbiology & Biology Education. 14 (1), 78-83 (2013).
- Collins, C. H. Health Hazards in Microbiology. Handbook of Laboratory Health and Safety Measures. Pal, S. B. , Springer. Dordrecht. (1990).
- Laboratory Biosafety Manual. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/I/item/9789240011311 (2020).
- Fleming, D. O. Laboratory Safety Principles and Practices. American Society for Microbiology. , ASM Press. Washington, D.C. (1995).
- Gordon, R. C., Davenport, C. V. Simple modification to improve usefulness of the Bacti-Cinerator. Applied Microbiology. 26 (3), 423 (1973).
- Cold Spring Harbor.
- Cold Spring Harbor. Media containing agar or agarose. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
