Summary
Denne artikel beskriver en metode til sterilisering af ormepluk, spatler og skalpeller ved hjælp af et mikroforbrændingsanlæg i stedet for åben ild.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) er en optimal modelorganisme til forskning og uddannelse på primært bachelorinstitutioner. Undergraduates kan hurtigt lære den sterile teknik, der kræves for at opretholde C. elegans kulturer. Sterilisering af platinplukker, der bruges til at overføre orme fra en plade til en anden, sker traditionelt ved at holde pluk i en flamme fra en Bunsen-brænder eller ethanollanterne. Bunsen-brændere kræver dog en gaskilde, og begge dele udstyr udgør risikoen for utilsigtet brand i forbindelse med åben ild. Demonstreret her er en teknik til sterilisering af ormeplukker, spatler og skalpeller ved hjælp af et infrarødt bakteriologisk loop mikroforbrændingsanlæg. Dette udstyr kræver kun en stikkontakt og minimerer potentielle brandfarer. Ved at sænke risiko- og gaskravene er denne teknik velegnet til forskning og undervisning i en bachelorindstilling.
Introduction
Modelorganismen C. elegans er velegnet til både forskning og uddannelse på primært bachelorinstitutioner (PUI'er) på grund af de lave omkostninger, nem vedligeholdelse og anvendelsesområde 1,2,3,4. For at håndtere orme - for eksempel at flytte en orm fra en plade til en anden, kan eksperimenter bruge en ormplukker. En række valg kan foretages eller købes til brug med C. elegans. Picks er oftest lavet ved hjælp af en platin eller platin / iridium spids, monteret i et glas, metal eller træ håndtag. Glashåndtag kan fremstilles internt ved at smelte en Pasteur-pipette rundt om en platintråd, indtil ledningen er fastgjort. Yderligere oplysninger om C. elegans husdyrhold, herunder hvordan man dyrker og vedligeholder orme og deres fødekilder, kan findes i WormBook5 og andre kilder 6,7,8.
Når man arbejder med C. elegans, anvendes aseptiske teknikker typisk til at forhindre forurening med mikrober og svampe. Eksempler på aseptiske teknikker omfatter sterilisering af instrumenter, autoklavering af reagenser og udførelse af arbejde i sterile felter. Ormeplukkere steriliseres typisk ved hjælp af en åben ild9. Derudover forbrænder sterilisering af ormeplukket orme og forhindrer dermed utilsigtede blandinger af stammer, når man arbejder med flere ormstammer. Typiske metoder til sterilisering af ormevalg involverer en åben ild fra enten en Bunsen-brænder, ethanollanterne eller standardlighter (tabel 1). Vi var motiverede til at søge sikrere alternativer til eksisterende metoder i laboratoriet, da en bachelorstuderende ubevidst spildte ethanol, mens han fyldte en ethanollanterne og ved et uheld startede en lille brand, da lanternen blev antændt. Desværre er der rapporteret om mange ulykker ved hjælp afethanollanterner 10,11,12. Heldigvis er alternative steriliseringsmetoder blevet valideret til brug i mikrobiologi, og formålet med denne artikel er at demonstrere, hvordan man bruger dette udstyr til at sterilisere instrumenter til brug med C. elegans.
I mikrobiologiske laboratorier er den aseptiske teknik også kritisk. Serologiske sløjfer og ledninger fremstillet af platin steriliseres enten ved hjælp af en åben ild13 eller et mikroforbrændingsanlæg 14,15,16. Andre navne på mikroforbrændingsanlæg omfatter mikrosterilisatorer eller bactoforbrændingsanlæg. Fordelene ved mikroforbrændingsanlægget i forhold til traditionelle flammemetoder inkluderer reduceret brandfare, eliminering af sprøjtning af forbrændingsmaterialer og evne til at arbejde i en laminær flowhætte / biosikkerhedsskab 16,17,18. Faktisk anbefaler både American Society of Microbiology og Verdenssundhedsorganisationen at bruge mikroforbrændingsanlæg frem for brugen af en åben ild 17,19,20. I sammenligning med Bunsen-brændere kræver mikroforbrændingsanlæg heller ikke en gasledning, som nogle laboratorier måske ikke har eller måske ikke har placeret ved hver bænk, som eleverne kan bruge. Inspireret af disse fordele blev der udviklet en protokol til at erstatte brugen af flamme med mikroforbrændingsanlæg til sterilisering af almindeligt anvendte instrumenter såsom plukker, spatler og skalpeller i C. elegans laboratoriet. Denne metode kan være hensigtsmæssig for instruktører og forskere, der søger at øge sikkerheden og / eller fleksibiliteten, når de arbejder med C. elegans.
Protocol
1. Forbered mikroforbrændingsanlægget
- Fastgør en løkkeholder tilbehørsstyr til mikroforbrændingsanlægget ved at klippe det fast på den ydre tønde.
- Tilslut mikroforbrændingsanlæg til en standard 120 V eller 230 V stikkontakt, alt efter hvad der er relevant.
BEMÆRK: Dette kan gøres på en bordplade eller i en laminær flowhætte. - Drej mikroforbrændingsanlægget til den høje indstilling, og lad det varme op i 10-20 minutter afhængigt af producentens anvisninger for at nå en optimal temperatur på 800-825 oC.
BEMÆRK: Hvis forbrændingsanlægget holdes tændt i mere end 3 timer, kan indstillingen for lavere temperatur (500 oC) bruges som standbyindstilling. Ifølge producentens brugervejledninger forlænger dette udstyrets brugbare levetid.
2. Steriliser pluk, spatel eller skalpel
- Indsæt instrumentet i det cylindriske steriliseringsområde uden at røre siderne ved at glide langs styret21.
BEMÆRK: Ved sterilisering af en skalpel er det vigtigt at undgå at røre den keramiske væg med bladet. Skrabning af den keramiske væg kan kompromittere varmeenhedens integritet. - Hold instrumentet i steriliseringsområdet i 5-7 s.
- Fjern instrumentet uden at røre siderne ved at glide baglæns langs styret.
- Ved pluk skal du lade instrumentet køle af i 3-5 s, før du rører ved en orm for at undgå at brænde det.
BEMÆRK: Skalpeller eller spatler, der ikke må køle af, synger agaren. - Efter plukning af orme skal du genindsætte plukningen i kammeret i 5-7 s for at forbrænde eventuelle orme på plukningen.
3. Sammenlignende metode - sterilisering af instrumenter ved hjælp af en Bunsen-brænder
- Tilslut Bunsen-brænderen til gasledningen ved hjælp af gummirør. Sørg for at fastgøre slangen tæt og placere brænderen væk fra overliggende genstande.
- Tænd for gas ved at dreje på knappen på gasledningen.
- Tænd brænderen ved hjælp af en angriber eller lighter.
- Juster flammen ved hjælp af gasknappen og luftindtaget, indtil en blå kegle er synlig.
- Hold pluk, spatel eller skalpel i flammen, indtil den lyser rødt.
- Ved plukveer skal du lade instrumentet køle af i 3-5 sekunder, før du rører ved en orm for at undgå at brænde det.
BEMÆRK: Skalpeller eller spatler, der ikke må køle af, synger agaren. - Efter plukning af orme skal du indsætte pluk i flammen igen for at forbrænde eventuelle orme på plukningen.
4. Forsøg
- Kultur OP50 Escherichia coli (E. coli) bakterier i Luria Broth22 natten over på en 37 oC shaker.
- Efter natten over kultur fortyndes kulturen i sterilt vand i et forhold på 1:100.
BEMÆRK: Denne fortyndingsfaktor blev valgt for at sikre adskillelse af kolonier efter plettering. - Dyp en ormeplukning steriliseret ved hjælp af en Bunsen-brænder i bakterieopløsningen, gensteriliser med Bunsen-brænderen, og hvirvl den i 100 ml sterilt vand.
- Plade 100 μL vand på en 10 cm LB agar22,23 petriskål, spred vandet ved hjælp af en steril cellespreder, og inkuber ved stuetemperatur i 24 timer med låget på.
- Udfør trin 4.3-4.4 ved hjælp af en ormplukning steriliseret ved hjælp af et mikroforbrændingsanlæg.
- Som en positiv kontrol skal du udføre trin 4.3-4.4 uden gensterilisering.
- Som en negativ kontrol skal du udføre trin 4.3-4.4 ved hjælp af sterilt vand i stedet for bakterieopløsningen.
- Tæl kolonierne manuelt efter inkubationsperioden.
Representative Results
Et simpelt eksperiment (afsnit 4) blev udtænkt for at demonstrere de relative kontamineringshastigheder ved hjælp af et mikroforbrændingsanlæg versus en flamme (figur 1, tabel 2). Selv om disse resultater repræsenterer kontamineringsrater på tværs af metoder, ville det ikke være nødvendigt at gentage denne metode for at anvende mikroforbrændingsteknikken. Eksperimentet blev kørt i tre eksemplarer. Negativ kontrol var sterilt vand uden bakterier. Den positive kontrol anvendte ingen af steriliseringsteknikkerne: Plukningen blev dyppet i den fortyndede OP50-kultur og derefter overført direkte til det sterile vand. Alle replikater og betingelser blev kørt parallelt samme dag. I alle tre negative kontrolplader blev der talt nul kolonier. Et gennemsnitligt antal på 4,7 (± 0,3 SEM) kolonier blev opnået, da Bunsen-brænderen blev brugt til at sterilisere plukker. Et gennemsnitligt antal på 3,3 (±1,2 SEM) kolonier blev observeret i mikroforbrændingsanlægstilstanden. Imidlertid blev der opnået et gennemsnitligt antal på 298,3 (±17,9 SEM) kolonier i den positive kontroltilstand. En 2-halet t-test, der antog samme varians, der sammenlignede Bunsen-brænderen med mikroforbrændingsanlægget, gav ingen statistisk signifikant forskel, p = 0,35. Således opnåede mikroforbrændingsanlægget sterilitetsresultater, der var lige så effektive som Bunsen-brænderen.
Figur 1: Bakterietællinger på tværs af steriliseringsmetoder. Picks blev dyppet i 1:100 OP50-kultur i sterilt vand og derefter steriliseret ved hjælp af en Bunsen-brænder eller et mikroforbrændingsanlæg. Picks blev derefter dyppet i sterilt vand, belagt på LB agar22,23 og inkuberet i 24 timer ved stuetemperatur, og kolonier blev talt manuelt. Positiv kontrol havde ingen sterilisering, og negativ kontrol brugte sterilt vand uden bakterier. n = 3 replikater pr. betingelse. Bemærk: y-aksen er brudt for at muliggøre adskillelse af datapunkter i relevante dele af grafen. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Steriliseringsmetode | Koste | Lab krav | Fordele | Ulemper | |||
| Mikroforbrændingsanlæg | $365–530 | 120 V eller 230 V udløb | • Bærbar • Ingen åben ild eller udsat varmeelement • Kan anvendes i laminære flowhætter og biologiske sikkerhedsskabe |
• Opvarmningstid • Højere omkostninger |
|||
| Bunsen brænder | $ 24–169 | Gasledning | • Hurtig opsætning • Lave omkostninger |
• Åben ild • Anbefales ikke til brug i laminær flowhætte eller biologisk sikkerhedsskab |
|||
| Ethanol lampe | 40 kr. | Ingen | • Hurtig opsætning • Lave omkostninger • Genopfyldelig |
• Åben ild • Sikkerhedsrisiko ved genopfyldning • Anbefales ikke til brug i laminær flowhætte eller biologisk sikkerhedsskab • Ikke tilladt på visse institutioner |
|||
| Lighter | 5-8 kr. | Ingen | • Lave omkostninger • Tilgængelig • Engangsbrug • Genopfyldelig |
• Åben ild • Håndbetjent • Anbefales ikke til brug i laminær flowhætte eller biologisk sikkerhedsskab |
|||
Tabel 1: Sammenligning af metoder til sterilisering af instrumenter. Fire metoder til sterilisering af instrumenter blev sammenlignet baseret på fordele, ulemper, omkostninger og laboratoriekrav.
| Kopiere | Betingelse | |||
| Mikroforbrændingsanlæg | Bunsen brænder | Negativ kontrol | Positve kontrol | |
| 1 | 1 | 5 | 0 | 278 |
| 2 | 4 | 4 | 0 | 334 |
| 3 | 5 | 5 | 0 | 283 |
| Betyde | 3.3 | 4.7 | 0.0 | 298.3 |
| SEM | 1.2 | 0.3 | 0.0 | 17.9 |
Tabel 2: Rådata for bakterietal på tværs af steriliseringsmetoder. Picks blev dyppet i 1:100 OP50-kultur i sterilt vand og derefter steriliseret ved hjælp af en Bunsen-brænder eller et mikroforbrændingsanlæg. Picks blev derefter dyppet i sterilt vand, belagt på LB agar22,23 og inkuberet i 24 timer ved stuetemperatur, og kolonier blev talt manuelt. Positiv kontrol havde ingen sterilisering, og negativ kontrol brugte sterilt vand uden bakterier. n = 3 replikater pr. betingelse. Gennemsnit og SEM rapporteret under individuelle tællinger.
Discussion
C. elegans er en modelorganisme, der er velegnet til øvelser i bachelorundervisningslaboratorier. Brugen af mikroforbrændingsanlæg i stedet for åben ild giver fordele i både forskningslaboratorier og klasseværelseslaboratorier. Faktisk kan bachelor laboratoriekurser udgøre en højere risiko for utilsigtede brande i betragtning af antallet af nyuddannede forskere i rummet. Derudover øges risikoen for brand, når ethanol bruges til at sterilisere instrumenter nær flammekilden, da ethanoldampe er antændelige. Bærbarheden giver også en fordel for klasseværelser, hvor der ikke er installeret gasledninger ved hver bænk. Denne metode er blevet anvendt i undervisnings- og forskningslaboratorier på vores institution, hvilket resulterer i ingen stigninger i forurening og nul laboratoriesikkerhedsulykker siden dens inkorporering i 2016.
For at sikre kompatibilitet med mikroforbrændingsanlæg blev en række valg med forskellige monteringer, trådsammensætninger og trådmålere testet. Trådsammensætning omfattede 100% platin såvel som 90% platin / 10% iridium med en trådtykkelse på 30-32 G, og uanset tykkelse og sammensætning kompromitterede opvarmningsmetoden ikke trådintegriteten. Monteringerne omfattede to forskellige typer kommercielt tilgængelige plukhåndtag og internt fremstillede glasbeslag fra Pasteur-pipetter. Bemærk, at pluk ikke lyser rødglødende, som de gør i flammen. Imidlertid opnås tilstrækkelig sterilisering stadig, så længe sterilisatoren har nået den rette temperatur. Det er således vigtigt at lade mikroforbrændingsanlægget varme op i 10 eller 20 minutter, som angivet i producentens anvisninger. At holde instrumentet i kammeret i mindst 5 s for at opnå sterilisering er også kritisk. Hvis instrumentet efterlades i kammeret længere end 7 s, vil det ikke skade instrumentet, men det er unødvendigt. Selvom dette er en relativt ligetil procedure med minimale trin og sandsynligvis ikke har brug for fejlfinding, kan det tage lidt øvelse at lære at stabilisere instrumentet i tønden uden at røre siderne.
For at erstatte åben ild skal en steriliseringsmetode dække alle de anvendelser, der anvendes i et laboratorium. Ud over steriliseringsinstrumenter kan C. elegans laboratorier også bruge Bunsen-brændere til at skabe et sterilt felt til at udføre andre opgaver såsom hældning af plader eller inokulering af kulturer13. Men om dette skaber et sterilt felt eller trækker i stadig levedygtige forurenende stoffer forbliver kontroversielt14. Selvom det ikke er en mulighed på alle institutioner, kan et biosikkerhedsskab eller en laminær flowhætte bruges til disse formål, så et laboratorium kan fungere uden brug af åben ild. Brugsanvisninger til de fleste mikroforbrændingsanlæg anbefaler ikke brug til sterilisering af skalpelblade, fordi skrabning af de indre vægge beskadiger sterilisatoren. Men hvis man omhyggeligt bruger en guide, kan man sterilisere et skalpelblad eller spatel uden at røre ved de indre vægge. Dette udvider brugen af teknikken til at muliggøre chunking uden brug af en flamme og gør det muligt for et C. elegans laboratorium at fungere uden at skifte teknikker mellem sterilisering af forskellige genstande.
Som beskrevet i tabel 1 tilbyder mikroforbrændingsanlæg øget sikkerhed, øget kompatibilitet med laminære flowhætter og øget bærbarhed i forhold til flammebaserede metoder, men har begrænsninger. De er dyrere end de andre metoder og kræver en opvarmningstid, før steriliseringstemperaturerne opnås. Afslutningsvis kan denne metode, der rutinemæssigt anvendes i mange mikrobiologiske laboratorier, være anvendelig i nogle C. elegans forsknings- og undervisningslaboratorier, der søger at forbedre laboratoriesikkerheden uden at gå på kompromis med steriliteten.
Disclosures
Der blev ikke oplyst om interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Suzanne Howard og Justin Finne. Dette arbejde blev finansieret af Wellesley College Neuroscience Department. N2-orme blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Publikationsgebyrerne for denne artikel blev støttet af Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
- Attix, H., et al. Wild caught nematode identification and early embryo development: An accessible undergraduate research experience. microPublication Biology. 2021, (2021).
- Rose, J. K. Demonstrating connections between neuron signaling and behavior using C. elegans learning assays and optogenetics in a laboratory class. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 16 (3), 223-231 (2018).
- Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education: JUNE: A Publication of FUN, Faculty for Undergraduate Neuroscience. 15 (1), 44-55 (2016).
- Raley-Susman, K. M., Gray, J. M. Exploration of gerontogenes in the nervous system: a multi-level neurogenomics laboratory module for an intermediate neuroscience and behavior course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 8 (2), 108-115 (2010).
- Stiernagle, T.
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
- JoVE. Biology I: yeast, Drosophilia, and C. Elegant. C. Elegans Maintenace. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Hope, I. A. C. elegans: A Practical Approach. , IRL. Oxford University Press. Oxford. (1999).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with Worms: Caenorhabditis elegans as a Model Organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
- Waechter-Brulla, D. Improving safety in the microbiology laboratory through active learning and investigation. American Society for Microbiology. , (2000).
- Young, J. A. It says in the books that ethanol burns with a cool flame. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1488 (2000).
- Mojtabai, F., Kaufman, J. A. Learning by accident. V. 2. , Laboratory Safety Institute. Natick, MA. (2005).
- JoVE. General Laboratory Techniques. Introduction to the Bunsen Burner. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Katz, D. S. The streak plate protocol. American Society for Microbiology Laboratory Protocols. , (2008).
- Public Health Agency of Canada. Agency of Canada Canadian Biosafety Handbook. Government of Canada. , Ottawa, ON. (2016).
- Emmert, E. A. B. ASM Task Committee on Laboratory Biosafety Biosafety guidelines for handling microorganisms in the teaching laboratory: development and rationale. Journal of Microbiology & Biology Education. 14 (1), 78-83 (2013).
- Collins, C. H. Health Hazards in Microbiology. Handbook of Laboratory Health and Safety Measures. Pal, S. B. , Springer. Dordrecht. (1990).
- Laboratory Biosafety Manual. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/I/item/9789240011311 (2020).
- Fleming, D. O. Laboratory Safety Principles and Practices. American Society for Microbiology. , ASM Press. Washington, D.C. (1995).
- Gordon, R. C., Davenport, C. V. Simple modification to improve usefulness of the Bacti-Cinerator. Applied Microbiology. 26 (3), 423 (1973).
- Cold Spring Harbor.
- Cold Spring Harbor. Media containing agar or agarose. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
