Summary
Realizamos una inyección lipofílica de un punto para rastrear las células endoteliales, seguida de una arteriotomía y sutura de aneurismas de la pared lateral en la aorta abdominal de la rata. La formación de neointima parecía depender de la arteria madre en los aneurismas descelularizados y fue promovida por el reclutamiento de células de la pared del aneurisma en paredes vitales ricas en células.
Abstract
El recorte microquirúrgico crea una barrera posterior del flujo sanguíneo hacia los aneurismas intracraneales, mientras que el tratamiento endovascular se basa en la formación de neoíntima y trombo. La fuente de células endoteliales que cubren la capa endoluminal de la neoíntima sigue sin estar clara. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue investigar el origen de las células formadoras de neointima después de la inyección de trazador celular en el modelo de aneurisma microquirúrgico de la pared lateral de la rata de Helsinki ya bien establecido.
Los aneurismas de la pared lateral se crearon suturando bolsas arteriales descelularizadas o vitales de extremo a lado de la aorta en ratas Lewis macho. Antes de la arteriotomía con sutura de aneurisma, se realizó una inyección de trazador celular que contenía colorante CM-Dil en la aorta sujetada para etiquetar las células endoteliales en el vaso adyacente y rastrear su proliferación durante el seguimiento (FU). Tratamiento seguido de enrollamiento (n = 16) o colocación de stent (n = 15). En la FU (7 días o 21 días), todas las ratas se sometieron a angiografía por fluorescencia, seguida de recolección de aneurismas y evaluación macroscópica e histológica con recuentos de células inmunohistológicas para regiones específicas de interés.
Ninguno de los 31 aneurismas se había roto en el seguimiento. Cuatro animales murieron prematuramente. Se observó perfusión macroscópicamente residual en el 75,0% en espiral y el 7,0% de las ratas con stent. La cantidad de células positivas para trazadores celulares se elevó significativamente en los stents descelularizados en comparación con los aneurismas en espiral con respecto al trombo en el día 7 (p = 0,01) y neointima en el día 21 (p = 0,04). No se encontraron diferencias significativas en trombos o neoíntimas en aneurismas vitales.
Estos hallazgos confirman peores patrones de curación en los aneurismas en espiral en comparación con los de stent. La formación de neointima parece particularmente dependiente de la arteria madre en los aneurismas descelularizados, mientras que está respaldada por el reclutamiento de las células de la pared del aneurisma en las paredes vitales ricas en células. En términos de traducción, el tratamiento con stent podría ser más apropiado para los aneurismas altamente degenerados, mientras que el enrollamiento solo podría ser adecuado para los aneurismas con paredes de vasos en su mayoría sanas.
Introduction
La hemorragia subaracnoidea causada por la ruptura de un aneurisma intracraneal (AI) es una condición neuroquirúrgica devastadora asociada con una alta morbilidad y mortalidad 1,2,3,4. Además del recorte microquirúrgico, que proporciona contacto directo de endotelio a endotelio, los dispositivos endovasculares han ganado cada vez más importancia en las últimas décadas para tratar las IA rotas e incidentalmente descubiertas. La respuesta de curación en las EA tratadas endovascularmente depende principalmente de la formación de neoíntima y la organización del trombo. Ambos son procesos sinérgicos, dependiendo de la migración celular desde el vaso adyacente y la pared del aneurisma. 5 Hasta la fecha, el origen de las células endoteliales en la formación neointima de aneurismas tratados con endovascular sigue sin estar claro. Hay un debate en curso en la literatura sobre la fuente de la que se reclutan las células formadoras de neointima.
Mediante el uso de una inyección de trazador celular de colorante CM-Dil (ver la Tabla de Materiales) en la aorta abdominal de ratas, nuestro objetivo fue analizar el papel de las células endoteliales, originadas en la arteria madre, en la formación de neointima en dos puntos de tiempo fu diferentes (día 7 y día 21) (Figura 1). Una ventaja del modelo es la incubación local directa del trazador celular in vivo en una arteria madre antes de la sutura del aneurisma, lo que permite la FU en puntos de tiempo posteriores. Las técnicas de inyección in vivo , como la incubación de trazadores celulares, no se han descrito en la literatura. Una ventaja de esta técnica es la inyección directa, de un punto, intraoperatoria, in vivo , que hace que el modelo sea robusto y reproducible.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El apoyo veterinario se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Local, Suiza (BE 60/19). Las directrices de ARRIVE y los principios de 3R se han seguido estrictamente 6,7. Se incluyeron treinta y una ratas Lewis macho, de 12 semanas de edad y con un peso de 492 ± 8 g. Alojar a todas las ratas a una temperatura ambiente de 23 °C y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Proporcionar acceso gratuito a agua y pellets. Los análisis estadísticos se han realizado mediante la prueba no paramétrica U de Wilcoxon-Mann-Whitney. Los valores de probabilidad (p) de ≤ 0,05 y/o ≤ 0,01 se consideraron significativos.
1. Preparación general de fase preoperatoria y aspectos anestesiológicos
- Aleatorizar ratas en grupos de tratamiento de bobina o stent (Figura 2) a través de un sistema de aleatorización basado en la web. Ahora, realice un examen clínico preoperatorio de todos los animales planificados para la cirugía junto a un quirófano tranquilo y aséptico manteniendo una temperatura ambiente de 23 ± 3 ° C. Analizar el comportamiento de los animales e inspeccionar las membranas mucosas y la turgencia como parte del examen clínico preoperatorio.
- Registra el peso de cada animal.
- Antes de la cirugía, incubar las bolsas arteriales de ratas donantes en dodecil sulfato de sodio al 0,1% durante 10 h a 37 °C para obtener aneurismas descelularizados8. Recoja estas bolsas de animales donantes unos días antes de la cirugía.
- Prepare toda la longitud de la aorta abdominal con microscisores y fórceps y aplique 6-0 ligaduras no absorbibles en un intervalo de 3-4 mm.
- Generar directamente aneurismas vitales intraoperatoriamente por una bolsa de vasos arteriales previamente ligada desde la parte torácica de un animal donante9. Realizar toracotomía con tijeras y pinzas quirúrgicas en el punto de tiempo FU indicado y ligar la bolsa del vaso a la longitud deseada.
- Implantar directamente la bolsa en el receptor y cosechar el aneurisma del animal donante para su posterior análisis macroscópico y procesamiento histológico.
- Para la inducción de la anestesia, coloque a todas las ratas en una caja limpia provista de oxígeno (O2) hasta la pérdida del conocimiento después de 5-10 min. Anestesiar a las ratas con una inyección subcutánea (SC) de una mezcla de fentanilo 0,005 mg/kg, medetomidina 0,15 mg/kg y midazolam 2 mg/kg.
NOTA: Esto asegura un plano quirúrgico de al menos 45 min. - Comprobar la profundidad de la anestesia por la ausencia del reflejo de retirada del pedal.
- Coloque las ratas en posición supina y afeite la parte toracoabdominal con una afeitadora eléctrica.
- Fije las 4 patas de las ratas con cinta adhesiva en una placa, cubierta por una almohadilla térmica conectada a una sonda rectal autorreguladora. Inserte la sonda rectal en el ano de la rata para mantener la temperatura deseada de 37 ° C con la ayuda de la almohadilla térmica.
- Ahora, instale un sensor en la pata trasera derecha conectado a un sistema computarizado para verificar los signos vitales intraoperatoriamente.
- Cubra la nariz y la boca de la rata con una máscara facial. Si requiere anestesia prolongada, comience con isoflurano (1.0-2.0% titulado para efecto en 100% O2).
- Desinfecte el campo quirúrgico con povidona yodada o desinfectantes alternos y cubra el campo quirúrgico de manera estéril.
- Para el cuidado perianestésico, aplique un lubricante oftálmico estéril en los ojos y cúbralos con una máscara de lámina opaca para evitar el secado y el daño de la lámpara quirúrgica.
- Durante la cirugía, suministre oxígeno continuamente a través de la máscara facial, controle la temperatura corporal y proporcione calor con una almohadilla térmica, manteniendo la normotermia.
- Controle continuamente otros signos vitales (distensión del pulso y la respiración, frecuencia cardíaca y respiratoria, y saturación de oxígeno).
2. Fase operatoria - inyección de trazador celular
NOTA: El enfoque quirúrgico detallado en el modelo 9 de aneurisma microquirúrgico de la pared lateralde la rata de Helsinki y las técnicas para la implantación de bobinas y stents se describen en otra parte 8,10,11.
- Guarde el trazador de células lipofílicas fluorescente a ≤ -20 °C todo el tiempo, protegido de la luz.
- Realice la cirugía preparando la aorta de rata y la vena cava, seguida de la separación de ambas, así como el pinzamiento temporal proximal y distal de la aorta.
NOTA: Esta técnica ha sido descrita anteriormente9.- Sujete las partes proximal y distal de la aorta con dos clips temporales de titán.
- Coloque un microswab con acolchado púrpura cada uno debajo de las partes proximal y distal de la aorta para una mejor visualización de la arteria.
- Ahora, proteja el abdomen con una gasa húmeda.
- El día de la operación, disolver 2 μL del trazador celular mediante pipeteo en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Transfiera la mezcla a una jeringa de 1 ml equipada con una cánula estéril de 27-1/2 G (0,4 x 13 mm).
NOTA: Tenga cuidado de evitar la exposición a la luz mientras realiza los pasos 2.5 y 2.6. - Apague la luz en el quirófano. Mientras mira bajo un microscopio, realice la inyección de un punto en la parte ventral media de la aorta usando micro fórceps e inyecte cuidadosamente 1 ml de solución salina heparinizada al 0,9%.
- Inyecte el trazador celular con cuidado (Video 1) e inmediatamente apague el microscopio operativo también. Una vez más, proteja el abdomen con una gasa húmeda.
- Deje que el tinte se incube durante al menos 15 min. Después del período de incubación, encienda el microscopio y las luces de la sala de operaciones.
- Realizar la arteriotomía longitudinal y sutura del aneurisma, como se describe en otra parte11.
- Use microfuerzas y microscisores para realizar la arteriotomía de modo que su longitud promedie el diámetro del aneurisma cosechado (paso 1.3). Para asegurar la longitud correcta, coloque el aneurisma al lado de la aorta antes de realizar la arteriotomía. Suturar el aneurisma con 8-10 puntos únicos utilizando una sutura 10-0 no absorbible, y retirar cuidadosamente las abrazaderas temporales -comenzando distalmente- bajo riego continuo con solución salina heparinizada. Cierre la herida en capas. Cabe destacar que utilice una densidad de embalaje de bobina de 1 cm.
NOTA: La técnica de implantación de bobina o stent se ha descrito en otra parte 8,10.
- Use microfuerzas y microscisores para realizar la arteriotomía de modo que su longitud promedie el diámetro del aneurisma cosechado (paso 1.3). Para asegurar la longitud correcta, coloque el aneurisma al lado de la aorta antes de realizar la arteriotomía. Suturar el aneurisma con 8-10 puntos únicos utilizando una sutura 10-0 no absorbible, y retirar cuidadosamente las abrazaderas temporales -comenzando distalmente- bajo riego continuo con solución salina heparinizada. Cierre la herida en capas. Cabe destacar que utilice una densidad de embalaje de bobina de 1 cm.
3. Monitorización de fase postoperatoria y cuidados analgésicos
- Al final de la cirugía, invierta la anestesia con una mezcla de inyección SC de buprenorfina 0,05 mg/kg, atipamezol 0,75 mg/kg y flumazenil 0,2 mg/kg. Deje que cada animal operado se recupere en una jaula limpia hasta que esté completamente despierto y caliente, según sea necesario, con una lámpara de calefacción.
- Durante 3 días, administrar 1 mg/kg de meloxicam (una inyección o aplicación oral al día) y buprenorfina (0,05 mg/kg cuatro veces al día) SC. Durante la noche, proporcione buprenorfina continuamente en el agua potable con la misma dosis: 6 ml de buprenorfina 0,3 mg/ml, 360 ml de agua potable, 10 ml de glucosa al 5%.
- En la fase postoperatoria inmediata, alberge a cada animal en una sola jaula para su protección. Reagrupar a los animales después de 24 h.
- Si alguna rata muestra un comportamiento angustiado o agresivo después de la inyección de SC, administre buprenorfina en el agua potable durante el día.
- Proporcione alimentación suave en el piso de la jaula para apoyar la alimentación y la recuperación después de la operación.
- Observe y cuide a todos los animales de acuerdo con la hoja de puntuación de bienestar y dolor.
- Administrar analgesia de rescate SC (meloxicam 1 mg/kg y 0,05 mg/kg buprenorfina) cuando sea necesario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un total de 31 animales fueron incluidos en el entorno de laboratorio: 27 ratas fueron incluidas en el análisis estadístico final; 4 ratas murieron prematuramente (tasa de mortalidad del 12,9%). Intraoperatoriamente, la distensión respiratoria se redujo significativamente (p = 0,03) en ratas con stent (12,9 μm ± 0,7) en comparación con ratas tratadas con bobina (13,5 μm ± 0,6). Se realizó una angiografía por fluorescencia para cada rata al final de la FU final. La reperfusión se indicó en los 6 animales tratados con bobina, mientras que la reperfusión se observó en solo el 12,5% de los 8 animales tratados con stent.
Los volúmenes basales agrupados de aneurismas para el día 7 y el día 21 no difirieron significativamente (ni para los aneurismas descelularizados (p = 0,9) ni vitales (p = 0,1)) entre los grupos de tratamiento con bobina o stent (Figura 3). Los volúmenes de FU agrupados para aneurismas descelularizados mostraron un crecimiento de aneurisma no significativo en enrollados en comparación con los aneurismas con stent (p = 0,28), significativamente mayor en el grupo vital en espiral que en el stent (60,1 mm3 ± 31,1 mm3 vs. 20,5 mm3 ± 20,6 mm3; p = 0,002).
Las cantidades de células positivas para trazadores celulares en la neointima de aneurismas descelularizados no difirieron significativamente entre los grupos tratados con stent o bobina en el día 7 FU (p = 0,8), pero fueron significativamente mayores en ratas con stent en el día 21 FU (Figura 4; p = 0,04). En ratas con aneurisma vital, no se observaron diferencias significativas a los 7 días (p = 1,0) o a los 21 días (Figura 5) FU (p = 0,66). En los aneurismas descelularizados a los 7 días de FU, permanecieron significativamente más células positivas para trazadores celulares en el trombo del grupo tratado con stent en comparación con el grupo tratado con bobina (p = 0,01). Esta diferencia no se observó en los aneurismas vitales a los 7 días de FU. Consulte la Tabla 1 para la proporción de células positivas para trazadores celulares para descelularizados, así como aneurismas vitales en espiral y con stent para el día 7 y el día 21 fu. La contratinción para el factor de von Willebrand (F8) se realizó en las células endoteliales de la neointima de cada rata (Figura 6).
La duración media del procedimiento quirúrgico fue de 119,1 ± 21,3 min para el grupo de enrollamiento en comparación con 154,1 ± 30,2 min para el grupo de stent (p = 0,001). El número de puntos para las suturas de aneurisma también difirió significativamente (p = 0,000002) para los grupos de bobina (15,6 ± 2,9 puntos) y stent (11,3 ± 1,1).
Figura 1: Diagrama de flujo de la configuración experimental. Un total de 35 animales fueron operados y aleatorizados a grupos de enrollamiento o colocación de stents. Dos animales del grupo de stent murieron en el curso postoperatorio inmediato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fotografías intraoperatorias de aneurismas durante la embolización de la bobina y el stent. (A) representa un aneurisma de la pared lateral (#), suturado en la aorta abdominal de la rata (*). Tenga en cuenta el dispositivo de bobina introducido en el aneurisma antes de realizar la última puntada única para completar la sutura del aneurisma. Observe la tinción rosada (flecha) en el lado izquierdo de la arteriotomía, lo que indica la distribución correcta del trazador celular. (B) La misma configuración que en A, mostrando el dispositivo de stent ya in situ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mediciones macroscópicas post mortem en 31 animales. Los volúmenes de aneurisma (mm3) se documentaron antes de la implantación y en el seguimiento, representados a lo largo del eje y. (A) Línea de base (descelularizada), (B) seguimiento (descelularizada), (C) línea de base (vital), (D) seguimiento (vital). Se agrupan los datos del día 7 y el día 21. ** p < 0,01. Los valores se expresan como medianas con rangos intercuartílicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen ejemplar de un aneurisma descelularizado tratado con stent en el día 21. A la derecha, se muestra una descripción general de la imagen de un aneurisma monoclonal antiα-SMA, agotado de células (aumento de 2 veces); barra de escala = 150 μm. Izquierda, contramantada con DAPI; los glóbulos rojos son células trazadoras positivas (A) en la pared del aneurisma, (B) en el trombo, (C) células residuales teñidas pero descoloridas positivas para trazadores celulares en la neointima, y (D) en el complejo de vasos adyacentes. Barras de escala = 100 μm (A-D). Una sola flecha marca la pared del aneurisma, la flecha doble la arteria madre. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; α-SMA = actina del músculo α liso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imagen ejemplar de un aneurisma vital tratado con bobina en el día 21. Lado derecho, se muestra una descripción general de la imagen de un antiα-SMA monoclonal, aneurisma rico en células (aumento de 2 veces); barra de escala = 150 μm. Lado izquierdo, contramantado con DAPI; los glóbulos rojos son células trazadoras positivas (A) en la pared del aneurisma, (B) en el trombo, (C) células múltiples positivas en la neoíntima y (D) en el complejo de vasos adyacentes. Barras de escala = 100 μm (A-D). Una sola flecha marca la pared del aneurisma, la flecha doble la arteria madre. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; α-SMA = actina del músculo α liso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Aumento de 40 veces de la tinción F8. # representa la formación de trombos, * la neointima y § el lado endoluminal debajo del orificio del aneurisma. Nótese la estratificación endotelial que se muestra como tinción púrpura en la capa endoluminal de la neointima. Barra de escala = 175 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Colorante DAPI/CM-Dil (%) | Bobina | Stent | |||
| Día 7 | Día 21 | Día 7 | Día 21 | ||
| Bolsas descelularizadas | Neointima | 68.00% | 7.70% | 72.20% | 34.30% |
| Arteria madre | 75.50% | 10.50% | 76.50% | 35.60% | |
| Trombo | 7.50% | 5.50% | 25.20% | 8.30% | |
| Pared del aneurisma | 12.20% | 8.50% | 11.70% | 9% | |
| Bolsas vitales | Neointima | 56.70% | 11.50% | 58.20% | 15.00% |
| Arteria madre | 60.00% | 24.20% | 81.50% | 26.00% | |
| Trombo | 62.00% | 26.20% | 71.20% | 23.70% | |
| Pared del aneurisma | 13.20% | 10.20% | 13.50% | 11.60% |
Tabla 1: Proporción de células positivas para trazadores celulares en neoíntima, arteria madre, trombo y pared del aneurisma. Los valores se representan como porcentajes para bolsas descelularizadas y vitales para el tratamiento con bobinas y stents para el día 7 y el día 21. Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol.
Video 1: Inyección de trazador celular en la parte abdominal de la aorta de rata. Esta técnica se realiza mediante una inyección de un punto en la aorta de rata sujetada. Haga clic aquí para descargar este video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este estudio demuestra que la formación de neointima está mediada a través de células endoteliales que se originan en la arteria madre del complejo aneurisma, pero está respaldada por el reclutamiento de células derivadas de la pared del aneurisma en aneurismas vitales. Sin embargo, el papel de las células progenitoras circulantes en la curación de aneurismas sigue siendo controvertido12,13. En general, se incluyeron 31 ratas Lewis macho en esta investigación; sólo 4 murieron prematuramente (12,9% de mortalidad).
A diferencia del recorte quirúrgico, que promueve el contacto posterior entre endotelio y endotelio, el éxito del tratamiento endovascular se basa en respuestas biológicas tardías. Las técnicas recientemente desarrolladas, como la desviación del flujo, los dispositivos endovasculares bioactivos o las terapias basadas en células intraluminales, son notables con respecto a los dispositivos de tratamiento endovascular14,15. En este contexto, la evidencia muestra que el éxito del tratamiento en la erradicación exitosa del aneurisma se asocia aditivamente con la respuesta biológica de la propia pared del aneurisma 5,16,17.
Estudios recientes han sugerido que la organización del trombo y la formación de neoíntima son procesos concurrentes en la curación del aneurisma después de las terapias endovasculares. Ambos procesos involucrados en la curación del aneurisma dependen de las células en movimiento del vaso adyacente del complejo del aneurisma y la pared del aneurisma en sí. Además, ambos procesos se ven facilitados por la presencia de dispositivos endovasculares como bobinas o stents. Como demostraron Grüter et al.5 , las células organizadoras de trombos derivan principalmente del vaso adyacente para ambos tipos de enfoques de tratamiento endovascular. Aquí, la formación de neoíntima en aneurismas tratados con bobina se basa principalmente en la migración celular desde la pared del vaso, mientras que el vaso adyacente sirvió como donante principal en aneurismas tratados con stent.
Un hilo común en el establecimiento y la expansión de preguntas de investigación utilizando el modelo de aneurisma microquirúrgico de pared lateral de rata de Helsinki se pudo observar a lo largo de los años. En primer lugar, los aneurismas descelularizados y, por lo tanto, degenerados son más propensos al crecimiento y la ruptura que los aneurismas vitales ricos en células9. Además, el tratamiento con bobina mostró más éxito en el tratamiento de aneurismas con bolsas vitales que en las altamente degeneradas8. Además, el trasplante de células proporcionó suficiente curación de aneurismas incluso en aneurismas altamente degenerados14. Al comparar diferentes dispositivos endovasculares en este modelo de aneurisma, el tratamiento con stent fue claramente superior al tratamiento con bobina sola11. Por lo tanto, apreciando los diferentes modos de reclutamiento celular en aneurismas enrollados y con stent de la arteria madre y la pared del aneurisma5, las principales preguntas siguen siendo si la formación de neoíntima se desencadena principalmente por células endoteliales de la arteria madre, células de la pared del aneurisma o incluso células progenitoras circulantes. Los hallazgos recientes sobre células progenitoras circulantes que desencadenan la formación de neoíntima son controvertidos 12,13,15,18.
Solo se incluyeron ratas macho en esta serie para evitar los efectos de confusión del estrógeno sobre el crecimiento del aneurisma, la formación de trombos y la inflamación de la pared, como se informó anteriormente19. Además de la sofisticada monitorización multimodal con angiografía por fluorescencia20 y monitorización de signos vitales, utilizamos un trazador celular específico para etiquetar la arteria madre para diferenciar las células derivadas de las células circulantes en el torrente sanguíneo de las derivadas de la verdadera migración de las células vecinas. Sin embargo, no podemos excluir un ligero desvanecimiento de la intensidad de la señal de las células endoteliales con el tiempo y la división celular, aunque los estudios han demostrado una fuerte intensidad de señal de los miofibroblastos en estos puntos de tiempo (día 7 y día 21)14. Por último, este modelo de aneurisma utilizó la hemodinámica y los procesos biológicos posteriores, como la tasa de trombosis espontánea o la curación del aneurisma, que están altamente influenciados por la constelación de la pared lateral del aneurisma21.
Como se demuestra en estos hallazgos, sigue siendo obvio que el vaso adyacente del complejo del aneurisma sirve como una fuente importante de células en la formación de una neoíntima. Estos hallazgos están fuertemente en línea con los resultados recientemente publicados por Kallmes et al., que muestran que el grosor del puntal también es un determinante de la aposición de la pared en los desviadores de flujo, que es un importante impulsor de la endotelización efectiva. Aquí, el aumento del grosor del puntal reduce la probabilidad de malapposición, mejora el contacto con la pared de la arteria madre y, por lo tanto, optimiza la reconstrucción celular a través de puntales22. En ratas con aneurismas descelularizados, se observó una cantidad significativamente mayor de células endoteliales positivas para trazadores celulares en el grupo con stent en el día 21 que en el grupo en espiral en el mismo punto de tiempo (Tabla 1).
Este hallazgo podría atribuirse al hecho de que los stents, aplicados en una región rica en células de la arteria madre incluso en aneurismas altamente degenerados, sirven como estructuras guía para los movimientos celulares, permitiendo el revestimiento endotelial continuo de la capa endoluminal de la neointima y proporcionando una curación progresiva del aneurisma. Aditivamente, comparando la colocación de stents y el enrollamiento en el día 7 FU, se observó una cantidad significativamente mayor de células positivas para trazadores celulares en el trombo de animales con stent que en los en espiral. Por lo tanto, una explicación razonable es que los puntales de stent facilitan fácilmente la migración celular desde el vaso adyacente en el trombo. En los aneurismas vitales que compararon el enrollamiento versus la colocación de stents, ni para neointima después de 21 días, ni para la formación de trombos en el día 7, se observaron diferencias significativas en las células positivas para trazadores celulares. En línea con un hallazgo anterior5, esto se puede atribuir al apoyo a la formación de neointima a través del reclutamiento celular en paredes de vasos sanos.
La ausencia de diferencias significativas en las cantidades de células trazadoras-positivas en el trombo después de 21 días en aneurismas descelularizados o vitales enrollados y con stent se debe a que el neointima estaba casi completamente sellado23. Por lo tanto, incluso a través de stents, la migración celular al trombo ya no es posible. Los puntos críticos a considerar al realizar la implantación del stent incluyen una posible ruptura del vaso iatrogénico durante la aplicación del stent o la formación de estenosis crítica en la región de la arteriotomía, con un posible desarrollo de isquemia en las extremidades inferiores. Para prevenir la isquemia, elija el sitio de arteriotomía junto a la bifurcación del vaso para la inserción del stent lo suficientemente pequeño como para evitar la estenosis iatrogénica después de la implantación del stent y la arteriotomía de sutura. Además, antes del cierre, enjuague esta región con solución salina heparinizada para minimizar el transporte distal de cualquier émbolo potencial debido a la presencia de cualquier componente trombogénico.
Los materiales requeridos para estos procedimientos suelen ser extremadamente costosos y raros, y su disponibilidad es crucial para los residentes jóvenes en neurocirugía24,25. Sin embargo, además de la gran cantidad de información obtenida de este modelo, la práctica de esta cirugía ayudará a mejorar las habilidades quirúrgicas.
Para concluir, la respuesta de curación biológica de los aneurismas tratados endovascularmente en el modelo de aneurisma microquirúrgico de la pared lateral de la rata de Helsinki depende de la migración celular desde el complejo de vasos adyacentes. Además, es apoyado por el reclutamiento de células de una pared de aneurisma vital y saludable. Sin embargo, en los aneurismas descelularizados y, por lo tanto, altamente degenerados, la arteria rica en células madre es la fuente más importante de células para la formación de una neoíntima, que se ve facilitada por dispositivos endovasculares, como los stents, que conectan los tejidos ricos en células adyacentes al orificio del aneurisma. Para ayudar a traducir este hallazgo en entornos clínicos, los aneurismas altamente degenerados podrían tratarse a través de andamios colocados en regiones de vasos sanos ricos en células. La embolización en espiral por sí sola podría ser suficiente para los aneurismas con paredes de vasos en su mayoría sanas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores son los únicos responsables del diseño y la realización del estudio presentado y no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Alessandra Bergadano, DVM, PhD, por la supervisión dedicada de la salud animal a largo plazo. Este trabajo fue apoyado por los fondos de investigación del Consejo de Investigación, Kantonsspital Aarau, Aarau, Suiza, y la fundación científica nacional suiza SNF (310030_182450).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
- Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638 (2014).
- Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model - introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
- Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
- Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
- Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall--a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
- Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
- Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, Suppl 1 13-19 (2020).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques - systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
