Summary
在基因组尺度上快速检测和可靠地定量RNA编辑事件仍然具有挑战性，目前依赖于直接RNA测序方法。这里描述的实验方案使用微温梯度凝胶电泳（μTGGE）作为检测RNA编辑的简单，快速和便携式方法。
Abstract
RNA编辑是导致RNA转录后序列改变的过程。RNA编辑的检测和定量主要依赖于Sanger测序和RNA测序技术。但是，这些方法可能成本高昂且耗时。在该协议中，便携式微温梯度凝胶电泳（μTGGE）系统被用作快速检测RNA编辑的非测序方法。该过程基于电泳原理，当核酸样品在聚丙烯酰胺凝胶上移动时，该原理使用高温使核酸样品变性。在一定温度范围内，DNA片段形成完全双链DNA到部分分离链的梯度，然后形成完全分离的单链DNA。具有不同核苷酸碱基的RNA编辑位点在μTGGE分析中产生不同的熔解谱。我们使用基于μTGGE的方法表征四个编辑RNA片段的熔解谱与其相应的未编辑（野生型）片段之间的差异。通过比较编辑和未编辑的RNA产生的条带模式来计算模式相似性评分（PaSSs），并用于评估该方法的再现性。总体而言，此处描述的平台能够以直接，简单且经济高效的方式检测RNA中的单个碱基突变。预计该分析工具将有助于新的分子生物学发现。
Introduction
基因组RNA中的单核苷酸变异（SNVs），包括A-to-I，C-to-U和U-to-C变体，可以指示RNA编辑事件。然而，在RNA中检测SNV仍然是一项技术上具有挑战性的任务。传统上，编辑与未编辑的RNA的比例是通过直接测序，等位基因特异性实时聚合酶链反应（PCR）或变性高效液相色谱（HPLC）方法1，2，3，4，5，6来确定的。然而，这些方法并不是特别具有时间或成本效益，并且由高水平噪声引起的低准确性为基于RNA的SNV检测7，8带来了技术瓶颈。在这里，我们描述了一种基于温度梯度凝胶电泳（TGGE）的方案，以鉴定单核苷酸多态性（SNP）作为替代方法，无需直接RNA测序方法进行RNA编辑分析。
电泳是生命科学实验室中分离和分析生物分子的首选方法。TGGE能够分离大小相同但具有不同序列的双链DNA片段。该技术依赖于DNA片段熔化温度的序列相关差异以及随后其在线性温度梯度为9，10的多孔凝胶中迁移率的变化。DNA片段的熔化产生特定的熔解谱。一旦熔融温度最低的结构域在凝胶中的特定位置达到相应的温度，就会发生从螺旋结构到部分熔化结构的转变，分子的迁移实际上将停止。因此，TGGE利用DNA片段的迁移率（尺寸信息）和温度诱导的结构转变（序列依赖性信息），使其成为表征DNA片段的强大方法。TGGE熔化模式中的特征点对应于DNA分子的三个结构转变，它们是链初始解离点，链中间解离点和链末端解离点（图1）。结构域内的序列变化，甚至是单碱基差异，都会影响熔化温度，因此，具有不同序列的分子在TGGE分析中将显示离散的熔化（变性）模式。因此，TGGE可用于分析基因组RNA中的SNV，并且可以成为检测RNA编辑的宝贵高通量方法。当使用传统的基于凝胶电泳的TGGE时，这种高通量增益会丢失。然而，TGGE的小型化版本，称为microTGGE（μTGGE），可用于缩短凝胶电泳时间并加速分析，使生产率提高100倍11。μTGGE方法的简单性和紧凑性通过引入PalmPAGE 12得到了改善，PalmPAGE12是一种现场适用，手持式且价格合理的凝胶电泳系统。
在这里，一种新的基于TGGE的方案用于检查四个基因中的三种类型的RNA编辑位点（A-to-I，C-to-U和U-to-C），包括拟 南 芥组织中的两种和两种在哺乳动物HEK293细胞中表达的RNA编辑位点（图1A）。该协议集成了PalmPAGE（硬件）和uMelt（软件）13的使用，PalmPAGE是一种用于快速检测RNA编辑的便携式系统。该方案的平均运行时间为15-30分钟，可实现快速、可靠和轻松的RNA编辑鉴定，而无需直接的RNA测序方法。
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Protocol
1. 目标片段的优化
注意：在该协议的开发中使用了四个编辑基因，包括来自 拟南芥的两个核基因（AT2G16586和AT5G02670），以及在HEK293细胞中表达的编码蓝色荧光蛋白（BFP）和增强绿色荧光蛋白（EGFP）的基因。
- 为了识别具有不同熔解谱的基因片段，代表编辑区域与非编辑区域，使用基于web的uMelt HETS工具（原始uMelt软件13的扩展）生成预测的熔解曲线。
注意：此工具可预测异源双相和同种双相产物的熔解曲线形状。 - 对于每个靶基因，设计三对基因片段（长度为300-324 bp）。每对包含一个具有编辑位点的片段和一个具有非编辑位点的相应野生型片段组成，该片段位于5'末端，中间位置或3'终端端。
- 选择在螺旋度轴上显示熔化区域之间最大差异的非编辑/编辑对，以进行进一步分析。对于μTGGE分析，通过PCR扩增合成选定的基因片段，如下文第2节所述。
- 使用DNADynamo软件（https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm）设计正向和反向引物，并使用NCBI引物-BLAST工具进行验证。
- 在TE缓冲液中稀释引物（10 mM Tris-HCl，含1 mM EDTA·Na2）并将其储存在100 pmol / μL的浓度下，使用蒸馏水将每个引物稀释至10 pmol / μL的浓度。
2. 靶片段的RNA提取和RT-PCR扩增
- 核糖核酸提取
- 使用标准方法（例如 TRIzol 提取14 或市售试剂盒）从编辑和未编辑基因的来源中提取总 RNA。
- 使用步骤2.2中所述的标准RT-PCR方案进行相应cDNA的合成。
- 反转录
- 向无核酸酶微量离心管中加入1μL寡核苷酸（dT）引物，1μL 10mM dNTP混合物，10μL总RNA和10μL无菌蒸馏水。
- 将混合物在65°C下加热5分钟，然后在冰上孵育至少1分钟。
- 通过以最大速度（12，000× g）离心2-3秒收集管的内容物，并加入4μL的5x ReverTra Ace缓冲液，1μL的0.1M DTT和1μL的M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆转录酶（200 U / μL， 材料表）。
- 轻轻地上下移液混合。如果使用随机引物，将试管在25°C下孵育5分钟。
- 将管在55°C下孵育60分钟，然后通过在70°C下加热15分钟，在数字干浴/块加热器中灭活反应。
- 使用分光光度计测量cDNA的浓度并将其储存在-25°C。
-
产物的PCR扩增和确认测序
- 将以下试剂加入无核酸酶的微量离心管中：4 μL 5x Taq聚合酶缓冲液，2 μL 2 mM dNTP混合物，2 μL 25 mM MgCl2，1.6 μL引物集（正向和反向;每个10 mM），2 μL cDNA模板，0.1μL Taq聚合酶（2.5 U / μL）和8.3μL无菌蒸馏水（最终体积， 20微升）。
- 在以下循环条件下进行PCR：在95°C下初始变性2分钟;在95°C下变性35次循环2分钟，在合适的温度下退火（取决于所使用的特定引物集）30秒，并在72°C下延伸2分钟;然后在72°C下最终延伸7分钟。
- 为了纯化PCR产物，加入2 U的Exonuclease I和0.5 U的虾碱性磷酸酶（ExoSAP）。将管在37°C的热循环仪中孵育1小时，然后在80°C下孵育15分钟，然后保持在4°C直至下一步。
- 对于确证测序，向新的微量离心管中加入11.5μL无菌蒸馏水，2.5μL正向或反向引物以及1μLPCR产物（使用ExoSAP）。
注意：使用DNA测序服务（例如，Eurofins Genomics）进行测序分析。 - 为了验证PCR产物的特异性，使用正向和反向引物进行测序。代表性分析中使用的引物对在 表1中给出。
- 用去离子水将纯化的PCR产物稀释至200ng / μL的浓度。接下来，将6μL纯化产物与250μL管中的3μL6x凝胶上样染料混合，并用无菌水将总体积提高至12μL。将PCR产物储存（在-25°C下），直到准备使用μTGGE，如下所述。
3. 微断层分析
注意：μTGGE分析是使用小型化和经济的系统进行的。整个系统概述，包括凝胶盒、凝胶盒支架、水平凝胶电泳平台、电源和凝胶成像系统， 如图2所示。
- 凝胶盒的组装
- 用于μTGGE分析的凝胶盒如图 2A所示。该设计由三个1英寸凝胶板组成：一个底部凝胶板，一个顶部凝胶板和一个通道形成板。将顶部凝胶板夹在另外两个板之间，并组装在凝胶盒支架中以进行凝胶聚合。
- 聚丙烯酰胺凝胶制备
- 向50 mL管中加入7.2g尿素，并溶解在10mL无菌水中。在微波炉中加热样品20-30秒，然后将其带到室温（RT）。
- 向溶液中加入3 mL 5x Tris/Borate/EDTA （TBE） 缓冲液（材料表），2.25 mL 40% （w/v） 丙烯酰胺/双 （19：1）、75 μL 10x 过硫酸铵和 15 μL 四甲基乙二胺。
- 立即将凝胶溶液缓慢倒入凝胶盒支架中，避免形成气泡。
- 使用μTGGE单元生成熔解剖面
- 使用 图2 所示的μTGGE装置的小型化经济型版本，其温度梯度（25-65°C）垂直于DNA迁移方向。
- 将上部和下部电泳缓冲液垫（0.5 cm x 2.5 cm）浸泡在2 mL 1x TBE缓冲液中。
- 将凝胶盒置于水平电泳室单元中，并相应地放置上下缓冲垫，如图 2所示。
- 接下来，将10μLPCR产物装入中间（较长的）孔中，将1μLPCR产物装入每侧孔中。
- 等待1分钟后，连接电源单元并在25-65°C的线性温度梯度下供应100 V 12分钟。
- 运行完成后，取出暗盒并取下上部玻璃盖。
- 将300μL10x SYBR金染色剂倒入凝胶上。使用安装在手掌大小的电泳设备中的蓝色LED手电筒可视化熔化曲线。
注意：应保存凝胶图像的软文件，以便计算模式相似性评分（PaSS）。 - 重复每个电泳实验3次，以确认数据的可重复性。
4. 帕斯卡计算
注：计算是使用μTGGE分析仪软件执行的。
- 下载并打开软件。
- 打开包含凝胶图像的 JPEG 文件。请注意，该软件将只接受JPEG格式的文件。
- 单击 “镜架 ”按钮，然后选择凝胶图像的相应区域（镜架）。
- 单击 坐标校正 按钮并添加两个参考点，如图 1B所示。
- 单击“ 添加特征点 ”按钮并添加采样点，如图 1B 所示。然后将处理后的凝胶图像数据保存为μTGGE（*.tgg）格式。
- 单击“ 示例 ”按钮，然后选择“ 搜索简单点 ”选项以比较两个或多个图像。
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Representative Results
使用μTGGE鉴定RNA编辑事件中的单核苷酸碱基变化
该方案使用了四个编辑基因（表1），包括在HEK293细胞中产生的BFP基因（通过载脂蛋白B mRNA编辑酶复合物的脱氨酶进行C-to-U RNA编辑;APOBEC115），含有HEK293细胞中产生的赭色终止密码子（TAA）的EGFP基因（通过腺苷脱氨酶作用于RNA 1进行A-to-I RNA编辑）;ADAR116），以及拟南芥17，18中的AT2G16586和AT5G02670核基因（具有U-to-C RNA编辑）。通过DNA测序确认编辑和相应未编辑样品之间的单核苷酸差异。然后进行μTGGE分析以检查样品熔化曲线之间的差异（图3）。
对于C-to-U RNA编辑类型，具有原始C碱基的未编辑样品在链末端熔点处显示出比具有修饰U碱基的编辑样品更长的熔化模式（图3A）。对于A-to-I（G）RNA编辑类型，具有修饰的I（G）碱基的编辑样品在链末端熔点处比具有原始A碱基的未编辑样品显示出更长的熔化图案（图3B）。对于“反向”U-to-C RNA编辑类型，分析了两个基因。对于AT2G16586基因，具有修饰C碱基的编辑样品在链初始熔化点和链末端熔点之间的熔化模式比具有原始U碱基的未编辑样品之间的熔化模式更长（图3C）。然而，对于另一个AT5G02670基因，没有观察到类似的模式（图3D）。尽管如此，在最终熔点处，未经编辑和编辑的类型之间存在明显差异。这表明，清楚地观察熔化曲线是区分非编辑和编辑类型的重要步骤。
定量分析代表RNA编辑事件的μTGGE熔解模式
接下来，我们计算PaSS值11 以评估基于μTGGE的熔解图谱的再现性，该图谱代表上述四个RNA编辑事件。PaSS值用于衡量两种熔融模式的叠加程度，从而为高度相似的熔化模式生成更高的值（最大值：1）。因此，用于比较未经编辑和编辑的样本的PaSS值预计小于1。如图 1B所示，使用与从双链DNA到单链DNA的结构转变相对应的熔融模式的特征点来计算PaSS值。为了消除实验变量，使用两个内部参考点进行计算机辅助归一化：参考点#1，以双链形式表示样品的位置（最左边的泳道）和参考点#2，代表单链形式的样品位置（最右边的泳道）。特征点的坐标被归一化为内部参考点的坐标，然后用于计算PaSS值。每个实验重复三次，并确定平均值。正如预期的那样，四个编辑样本的PaSS值低于1（图4）。C-to-U和A-to-I RNA编辑类型的PaSS值低于两种U-to-C RNA编辑类型的PaSS值。这种差异可能与编辑站点的相应位置有关。具体而言，C-to-you和A-to-I编辑站点相对靠近5'终端端（分别位于~300 bp片段的48和59位置），而U-to-C编辑站点位于片段中间附近（位于位置152和169）。这些发现表明，与位于片段中心的位置相比，使用μTGGE可以更容易地检测到位于终端位置的编辑位点。
优化TGGE熔解模式以识别RNA编辑事件
由于我们之前的结果表明，PaSS值可能因RNA编辑位点的特定位置而异，因此我们检查了BFP基因（在HEK293T细胞中表达）的300 bp片段的熔融模式之间的差异，其中C-to-U编辑位点位于靠近5'末端，靠近3'末端， 或在片段的中心（图5A）。在进行μTGGE分析之前，使用基于uMelt HETS网络的工具预测了未编辑片段和三个编辑片段的熔化模式。该分析表明，C-to-U修饰有望使熔化曲线沿温度轴向左移动（图5B）。根据未编辑片段和三个编辑片段的μTGGE分析计算的PaSS值排序如下：5'-末端RNA编辑<3'-末端RNA编辑<中心5'-和3'-末端末端RNA编辑（图5C）。值得注意的是，这些PaSS值与使用uMelt预测的结果一致。这些发现表明，位于5'或3'末端的核苷酸碱基差异导致编辑和非编辑基因的PaSS值之间的差异大于位于更中心的核苷酸碱基差异。此外，这些结果表明，事先了解编辑基因和非编辑基因的熔解谱之间的差异可以用作优化RNA编辑的基因片段的指南。
图1：用于通过μTGGE鉴定RNA编辑的程序。 （A）检查RNA编辑事件的类型。（B）编辑和未编辑基因的典型熔融图谱的示意图。在μTGGE中，样品通过温度梯度凝胶迁移，产生特征曲率。分配熔化模式的特征点，然后对其进行处理以计算模式相似性评分（PaSS）值。PaSS计算如方程所示，其中每个特征点的向量 P 在其相应的位置以及温度和迁移率的函数（即向量 P = P （T，m））中。上标 （1） 和 （2） 分别表示编辑和未编辑的基因。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：手掌大小的凝胶电泳设备的插图和照片。 （A）将三个1的凝胶盒组装。（B）带有温度梯度板的凝胶盒支架的图示。该照片显示了上部和下部缓冲垫的位置，以及初始上样后样品的位置。（C）概述整个系统，包括电源，水平凝胶电泳平台和凝胶成像系统。该系统为基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的快速现场分析提供了可行的解决方案。 请点击此处查看此图的大图。
图3：RNA编辑事件中单核苷酸变化的TGGE分析。 使用四个基因检查了三种不同RNA编辑类型的熔解图谱。（A）在HEK293T细胞中表达的BFP中的C-U RNA编辑。（B）在HEK293T细胞中表达的EGFP中的A-to-I（G）RNA编辑。（C）在来自 拟南芥的AT2G16586基因中进行U-to-C RNA编辑。（D）在来自 拟南芥的AT5G02670基因中进行U-to-C RNA编辑。编辑后的网站的位置以黄色（红色字体）突出显示，并且底漆位置带有下划线。已编辑和未编辑样品的熔化模式之间的差异由红色圆圈表示。 请点击此处查看此图的大图。
图4：这里检查的四个编辑基因的平均PaSS值。 误差线表示三个仿行的标准差。 请点击此处查看此图的大图。
图5：位置特异性PaSS分析。（A）在HEK293T细胞中表达的BFP基因中的C--U型RNA编辑位点被转移到基因片段的5'末端，3'-末端或中心。（B）对（A）中所示的未经编辑的碎片和三个编辑片段的熔化模式的理论预测。预测是使用 uMelt 执行的。（C） （A）中所示的编辑基因的平均 PaSS 值。误差线表示三个仿行的标准差。请点击此处查看此图的大图。
| S.No | 核糖核酸编辑 | 源 | 位置 | 基因识别 | 前向底漆 | 反向底漆 | 序列长度 | ||
| 1 | C 到 U | HEK293T电池 | 第48名 | EGFP | 亚格特加 TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT 断续器 |
324 | ||
| 2 | A 到 I | HEK293T电池 | 第59名 | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT 泰阿特克加 |
300 | ||
| 3 | U-到 C | 拟 南 芥 | 152千 | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-到 C | 拟 南 芥 | 169千 | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGTC |
300 | ||
表1：当前方案中使用的基因列表
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Discussion
RNA编辑在生物学中起着重要作用;然而，目前检测RNA编辑的方法，如色谱和测序，由于其高成本，过多的时间要求和复杂性，提出了一些挑战。这里描述的实验方案是一种简单，快速且经济高效的RNA编辑检测方法，它使用便携式，微型尺寸，基于TGGE的系统。该系统可用于在Sanger测序之前区分编辑和非编辑基因。具体而言，具有单碱基核苷酸修饰的编辑和未编辑基因可以根据TGGE熔解谱的变化进行区分。由于它在凝胶中包含1个，因此该系统需要非常少量的样品，并且可以快速检测序列之间的差异。此外，这里描述的协议对于该领域的专家和新手来说都非常容易遵循。靶基因片段的优化对于明确区分编辑区域和非编辑区域至关重要，并且该过程在当前方案中得到了简化。
该方案与使用荧光标记引物的多重分析兼容。对于定量分析，在TGGE分析期间，可以用绿色荧光标记未知RNA样品（编辑或非编辑），并与红色荧光标记的参考标准品（编辑或非编辑）进行同步。
除了证明μTGGE方法检测单核苷酸RNA编辑事件的能力外，我们还验证了使用μTGGE获得的实验结果与使用umELT获得的同一基因片段的理论结果之间的相似性。此外，我们发现位于基因片段的5'-和3'末端的核苷酸碱基差异在μTGGE熔化曲线（即较小的PaSS值）中产生比位于片段中心的差异更大的差异。虽然前景看好，但目前的方案可能仅限于在RNA编辑过程中分析和检测特定类型的核苷酸修饰。在我们即将进行的研究中，将进一步优化和开发该协议以分析RNA编辑的其他类型的和/或位置。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学促进会的科学研究补助金（17H02204和18K19288）的支持。Ruchika得到了日本政府的财政支持（文部科学省奖学金）。我们感谢Radhika Biyani女士（JAIST高木实验室）和Kirti Sharma博士（BioSeeds Corporation）在电泳相关实验方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
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