Summary
La detección rápida y la cuantificación confiable de los eventos de edición de ARN a escala genómica siguen siendo un desafío y actualmente dependen de métodos de secuenciación directa de ARN. El protocolo descrito aquí utiliza la electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un método simple, rápido y portátil para detectar la edición de ARN.
Abstract
La edición de ARN es un proceso que conduce a alteraciones de la secuencia posttranscripcional en los ARN. La detección y cuantificación de la edición de ARN se basa principalmente en la secuenciación de Sanger y las técnicas de secuenciación de ARN. Sin embargo, estos métodos pueden ser costosos y llevar mucho tiempo. En este protocolo, se utiliza un sistema portátil de electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN. El proceso se basa en el principio de electroforesis, que utiliza altas temperaturas para desnaturalizar muestras de ácido nucleico a medida que se mueven a través de un gel de poliacrilamida. A través de un rango de temperaturas, un fragmento de ADN forma un gradiente de ADN de doble cadena a hebras parcialmente separadas y luego a ADN de cadena simple completamente separado. Los sitios editados por ARN con distintas bases de nucleótidos producen diferentes perfiles de fusión en los análisis de μTGGE. Utilizamos el enfoque basado en μTGGE para caracterizar las diferencias entre los perfiles de fusión de cuatro fragmentos de ARN editados y sus correspondientes fragmentos no editados (tipo salvaje). Las puntuaciones de similitud de patrones (PaSS) se calcularon comparando los patrones de banda producidos por los ARN editados y no editados y se utilizaron para evaluar la reproducibilidad del método. En general, la plataforma descrita aquí permite la detección de mutaciones incluso de base única en ARN de una manera directa, simple y rentable. Se prevé que esta herramienta de análisis ayudará a nuevos hallazgos de biología molecular.
Introduction
Las variantes de nucleótido único (SNV) en el ARN genómico, incluidas las variantes de A a I, C a U y U a C, pueden indicar eventos de edición de ARN. Sin embargo, la detección de SNVs en el ARN sigue siendo una tarea técnicamente desafiante. Convencionalmente, la proporción de ARN editado a no editado se determina mediante secuenciación directa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real específica del alelo o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de desnaturalización 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques no son particularmente efectivos en tiempo o costo, y sus bajas precisiones, causadas por altos niveles de ruido, plantean cuellos de botella tecnológicos para la detección de SNV basada en ARN 7,8. Aquí, describimos un protocolo basado en la electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) como un método alternativo que elimina la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN para los análisis de edición de ARN.
La electroforesis es un método preferido para la separación y el análisis de biomoléculas en laboratorios de ciencias de la vida. TGGE permite la separación de fragmentos de ADN de doble cadena que son del mismo tamaño pero tienen diferentes secuencias. La técnica se basa en las diferencias relacionadas con la secuencia en las temperaturas de fusión de los fragmentos de ADN y los cambios posteriores en sus movilidades en geles porosos con un gradiente de temperatura lineal 9,10. La fusión de fragmentos de ADN genera perfiles de fusión específicos. Una vez que el dominio con la temperatura de fusión más baja alcanza la temperatura correspondiente en una posición particular en el gel, se produce la transición de una estructura helicoidal a una estructura parcialmente fundida, y la migración de la molécula prácticamente se detendrá. Por lo tanto, TGGE utiliza tanto la movilidad (información de tamaño) como las transiciones estructurales inducidas por la temperatura de los fragmentos de ADN (información dependiente de la secuencia), lo que lo convierte en un enfoque poderoso para la caracterización de fragmentos de ADN. Los puntos característicos en un patrón de fusión TGGE, que corresponden a tres transiciones estructurales de la molécula de ADN, son el punto de disociación inicial de la hebra, el punto de disociación media de la hebra y el punto de disociación final de la hebra (Figura 1). Las variaciones de secuencia dentro de los dominios, incluso las diferencias de una sola base, afectan la temperatura de fusión, por lo tanto, las moléculas con diferentes secuencias mostrarán patrones discretos de fusión (desnaturalización) en los análisis TGGE. Por lo tanto, TGGE se puede utilizar para analizar SNV en ARN genómico y puede ser un método invaluable de alto rendimiento para detectar la edición de ARN. Esta ganancia de alto rendimiento se pierde cuando se utiliza TGGE tradicional basado en electroforesis en gel. Sin embargo, una versión miniaturizada de TGGE, llamada microTGGE (μTGGE), se puede utilizar para acortar el tiempo electroforético del gel y acelerar el análisis con un aumento de 100 veces en la productividad11. La simplicidad y la compacidad del método μTGGE se han mejorado con la introducción de PalmPAGE12, un sistema de electroforesis en gel aplicable en el campo, portátil y asequible.
Aquí, se utiliza un nuevo protocolo basado en TGGE para examinar tres tipos de sitios de edición de ARN (A-to-I, C-to-U y U-to-C) en cuatro genes, incluidos dos de tejidos de Arabidopsis thaliana y dos expresados en células HEK293 de mamíferos (Figura 1A). El protocolo integra el uso de PalmPAGE (hardware), un sistema portátil para la detección rápida de la edición de ARN, y uMelt (software)13. Con un tiempo de ejecución promedio de 15-30 min, este protocolo permite una identificación rápida, confiable y fácil de la edición de ARN sin la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN.
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Protocol
1. Optimización del fragmento objetivo
NOTA: Se utilizaron cuatro genes editados en el desarrollo de este protocolo, incluidos dos genes nucleares (AT2G16586 y AT5G02670) de A. thaliana, y los genes que codifican la proteína fluorescente azul (BFP) y la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) expresadas en células HEK293.
- Para identificar fragmentos de genes con diferentes perfiles de fusión, que representan regiones editadas versus no editadas, genere curvas de fusión predichas utilizando la herramienta basada en la web uMelt HETS, una extensión del software original uMelt13.
NOTA: Esta herramienta predice las formas de las curvas de fusión para productos heterodúplex y homodúplex. - Para cada gen objetivo, diseñe tres pares de fragmentos de genes (300-324 pb de longitud). Cada par se compone de un fragmento con un sitio editado y un fragmento de tipo comodín correspondiente con un sitio no editado, ubicado en el extremo terminal de 5', la posición media o el extremo terminal de 3'.
- Seleccione el par no editado/editado que mostró la diferencia máxima entre las regiones de fusión en el eje de helicidad para un análisis más detallado. Para el análisis μTGGE, sintetice el fragmento de gen seleccionado mediante amplificación por PCR, tal como se describe en la sección 2 siguiente.
- Diseñe los cebadores hacia adelante y hacia atrás utilizando el software DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) y verifique utilizando la herramienta NCBI Primer-BLAST.
- Diluir los cebadores en tampón TE (10 mM Tris-HCl que contiene 1 mM EDTA· Na2) y almacenarlos a una concentración de 100 pmol/μL. Antes de su uso, diluya cada imprimación a una concentración de 10 pmol/μL utilizando agua destilada.
2. Extracción de ARN y amplificación RT-PCR del fragmento objetivo
- Extracción de ARN
- Extraiga el ARN total de la fuente de genes editados y no editados utilizando métodos estándar, como la extracción de TRIzol14 o kits disponibles comercialmente.
- Realizar la síntesis del ADNc correspondiente utilizando un protocolo RT-PCR estándar como se describe en el paso 2.2.
- Transcripción inversa
- Agregue 1 μL de imprimación oligo(dT), 1 μL de mezcla de dNTP de 10 mM, 10 μL de ARN total y 10 μL de agua destilada estéril a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasas.
- Calentar la mezcla a 65 °C durante 5 min y luego incubar en hielo durante al menos 1 min.
- Recoger el contenido del tubo por centrifugación a velocidad máxima (12.000 x g) durante 2-3 s, y añadir 4 μL de tampón ReverTra Ace 5x, 1 μL de 0,1 M TDT y 1 μL de transcriptasa inversa M-MLV (Virus de la Leucemia Murina moloney) (200 U/μL, Tabla de Materiales).
- Mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo suavemente. Si utiliza cebadores aleatorios, incube el tubo a 25 °C durante 5 min.
- Incubar el tubo a 55 °C durante 60 min y luego inactivar la reacción calentando a 70 °C durante 15 min, en un calentador digital de baño seco/bloque.
- Mida la concentración de ADNc utilizando un espectrofotómetro y guárdela a -25 °C.
-
Amplificación por PCR y secuenciación confirmatoria de productos
- Añadir los siguientes reactivos a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasa: 4 μL de tampón de polimerasa Taq 5x, 2 μL de mezcla de dNTP de 2 mM, 2 μL de MgCl2 de mM, 1,6 μL del conjunto de imprimación (adelante y atrás; cada uno 10 mM), 2 μL de plantilla de ADNc, 0,1 μL de Taq polimerasa (2,5 U/μL) y 8,3 μL de agua destilada estéril (volumen final, 20 μL).
- Realizar PCR con las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min; 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 2 min, recocido a una temperatura adecuada (dependiendo del juego de imprimación específico utilizado) durante 30 s, y extensión a 72 °C durante 2 min; y luego una extensión final a 72 °C durante 7 min.
- Para purificar los productos de PCR, agregue 2 U de exonucleasa I y 0.5 U de fosfatasa alcalina de camarón (ExoSAP). Incubar el tubo en un termociclador a 37 °C durante 1 h, seguido de 80 °C durante 15 min, y luego mantener a 4 °C hasta el siguiente paso.
- Para la secuenciación confirmatoria, agregue 11,5 μL de agua destilada estéril, 2,5 μL de imprimación directa o inversa y 1 μL de productos de PCR (con ExoSAP) a un nuevo tubo de microcentrífuga.
NOTA: Utilice los servicios de secuenciación de ADN (por ejemplo, Eurofins Genomics) para el análisis de secuenciación. - Para validar la especificidad de los productos de PCR, realice la secuenciación con cebadores hacia adelante y hacia atrás. Los pares de cebadores utilizados en el análisis representativo se dan en la Tabla 1.
- Diluya los productos de PCR purificados a una concentración de 200 ng/μL con agua desionizada. A continuación, mezcle 6 μL del producto purificado con 3 μL de 6x colorante de carga de gel en un tubo de 250 μL y eleve el volumen total a 12 μL con agua estéril. Guarde el producto de PCR (a -25 °C) hasta que esté listo para continuar con μTGGE como se describe a continuación.
3. Análisis μTGGE
NOTA: El análisis μTGGE se realiza utilizando un sistema miniaturizado y económico. En la Figura 2 se muestra una descripción general del sistema completo, incluidos los casetes de gel, el soporte de casete de gel, la plataforma de electroforesis de gel horizontal, la fuente de alimentación y el sistema de imágenes de gel.
- Montaje de los casetes de gel
- El casete de gel utilizado para el análisis de μTGGE se muestra en la Figura 2A. El diseño consta de tres placas de gel de 1 pulgada: una placa de gel inferior, una placa de gel superior y una placa de borde de carril. Coloque la placa de gel superior entre las otras dos placas y enséblela en el soporte de cassette de gel para la polimerización del gel.
- Preparación de gel de poliacrilamida
- Añadir 7,2 g de urea a un tubo de 50 ml y disolver en 10 ml de agua estéril. Calentar la muestra en un microondas durante 20-30 s y luego llevarla a temperatura ambiente (RT).
- Añadir 3 mL de tampón tris/borato/EDTA (TBE) de 5x (Tabla de materiales), 2,25 ml de acrilamida/bis al 40% (p/v) (19:1), 75 μL de 10x persulfato de amonio y 15 μL de tetrametilendiamina a la solución.
- Vierta inmediatamente la solución de gel en el soporte del cassette de gel lentamente, evitando la formación de burbujas de aire.
- Generación de perfiles de fusión utilizando la unidad μTGGE
- Utilice la versión miniaturizada y económica del aparato μTGGE que se muestra en la Figura 2 con un gradiente de temperatura (25-65 °C) establecido perpendicularmente a la dirección de la migración del ADN.
- Remoje las almohadillas tampón de electroforesis superior e inferior (0,5 cm x 2,5 cm) en 2 ml de 1 tampón TBE.
- Coloque el cassette de gel en la unidad de cámara de electroforesis horizontal y coloque las almohadillas tampón superior e inferior en consecuencia, como se muestra en la Figura 2.
- A continuación, cargue 10 μL del producto de PCR en el pozo medio (más largo) y 1 μL del producto de PCR en cada pozo lateral.
- Después de una espera de 1 minuto, conecte la unidad de alimentación y suministre 100 V durante 12 minutos a un gradiente de temperatura lineal de 25-65 ° C.
- Una vez completada la carrera, saque el cassette y retire la cubierta de vidrio superior.
- Vierta 300 μL de 10 veces la mancha SYBR Gold sobre el gel. Visualice los perfiles de fusión utilizando la linterna LED azul instalada en el dispositivo electroforético del tamaño de la palma de la mano.
NOTA: Se debe guardar un archivo simplificado de la imagen del gel para el cálculo de la puntuación de similitud de patrón (PaSS). - Repita cada experimento electroforético 3x para confirmar la reproducibilidad de los datos.
4. Cálculos de PaSS
NOTA: Los cálculos se realizan utilizando el software μTGGE Analyzer.
- Descargue y abra el software.
- Abra el archivo JPEG que contiene la imagen del gel. Tenga en cuenta que el software solo aceptará archivos en formato JPEG.
- Haga clic en el botón Marco y seleccione el área apropiada (marco) de la imagen del gel.
- Haga clic en el botón Corrección de coordenadas y agregue dos puntos de referencia, como se muestra en la Figura 1B.
- Haga clic en el botón Adición de puntos de característica y agregue puntos de muestra como se muestra en la Figura 1B. A continuación, guarde los datos de imagen de gel procesados en formato μTGGE (*.tgg).
- Haga clic en el botón Ejemplo y seleccione la opción Buscar puntos simples para comparar dos o más imágenes.
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Representative Results
Uso de μTGGE para identificar cambios en la base de un solo nucleótido en eventos de edición de ARN
Para este protocolo se utilizaron cuatro genes editados (Tabla 1), incluyendo el gen BFP producido en células HEK293 (con edición de ARN C-to-U por las enzimas desaminasas del complejo enzimático de edición de ARNm de apolipoproteína B; APOBEC115), el gen EGFP que contiene el codón de parada ocre (TAA) producido en células HEK293 (con edición de ARN A-to-I por adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN 1; ADAR116), y los genes nucleares AT2G16586 y AT5G02670 en A. thaliana17,18 (con edición de ARN U-to-C). Las diferencias de un solo nucleótido entre las muestras editadas y las correspondientes no editadas se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Luego se realizó un análisis de μTGGE para examinar las diferencias entre las curvas de fusión de las muestras (Figura 3).
Para el tipo de edición de ARN de C a U, la muestra no editada con la base C original mostró un patrón de fusión más largo en el punto de fusión final de la hebra que la muestra editada con la base U modificada (Figura 3A). Para el tipo de edición de ARN de A a I(G), la muestra editada con la base I(G) modificada mostró un patrón de fusión más largo en el punto de fusión final de la hebra que la muestra no editada con la base A original (Figura 3B). Para el tipo de edición de ARN U-to-C "inverso", se analizaron dos genes. Para el gen AT2G16586, la muestra editada con la base C modificada mostró un patrón de fusión más largo entre los puntos de fusión inicial de la hebra y los puntos de fusión final de la hebra que la muestra no editada con la base U original (Figura 3C). Sin embargo, no se observó un patrón similar para el otro gen AT5G02670 (Figura 3D). No obstante, hubo una clara diferencia entre los tipos no editados y editados en el punto de fusión final. Esto muestra que observar claramente los perfiles de fusión es un paso importante para distinguir entre tipos no editados y editados.
Análisis cuantitativo de patrones de fusión μTGGE que representan eventos de edición de ARN
A continuación, calculamos los valores de PaSS11 para evaluar la reproducibilidad de los perfiles de fusión basados en μTGGE que representan los cuatro eventos de edición de ARN descritos anteriormente. El valor paSS proporciona una medida de qué tan cerca se pueden superponer dos patrones de fusión, generando un valor más alto (máximo: 1) para patrones de fusión muy similares. Por lo tanto, se espera que los valores de PaSS para las comparaciones de muestras no editadas y editadas sean inferiores a uno. Como se muestra en la Figura 1B, los puntos de característica de los patrones de fusión que correspondían a las transiciones estructurales de ADN de doble cadena a adn de cadena simple se utilizaron para calcular los valores de PaSS. Para eliminar las variables experimentales, la normalización asistida por ordenador se realizó utilizando dos puntos de referencia internos: el punto de referencia #1, que representa la posición de la muestra en forma de doble cadena (el carril más a la izquierda), y el punto de referencia #2, que representa la posición de la muestra en forma de cadena simple (el carril más a la derecha). Las coordenadas de los puntos de entidad se normalizaron a las de los puntos de referencia internos y luego se utilizaron para calcular los valores de PaSS. Cada experimento se repitió tres veces y se determinó el valor promedio. Como era de esperar, los valores de PaSS de las cuatro muestras editadas fueron inferiores a uno (Figura 4). Los valores de PaSS de los tipos de edición de ARN de C a U y de A a I fueron más bajos que los de los dos tipos de edición de ARN de U a C. Es probable que esta diferencia esté relacionada con las ubicaciones respectivas de los sitios de edición. Específicamente, los sitios editados de C-to-u y A-to-I se ubicaron relativamente cerca de los extremos terminales de 5'(en las posiciones 48 y 59 de los fragmentos de ~300 bp, respectivamente), mientras que los sitios editados de U a C se ubicaron cerca del medio de los fragmentos (en las posiciones 152 y 169). Estos hallazgos sugieren que los sitios editados ubicados en posiciones terminales se pueden detectar usando μTGGE más fácilmente que aquellos ubicados hacia el centro de los fragmentos.
Optimización de los patrones de fusión de TGGE para identificar eventos de edición de ARN
Como nuestros resultados anteriores sugirieron que el valor de PaSS puede variar dependiendo de la posición específica del sitio de edición de ARN, examinamos las diferencias entre los patrones de fusión de un fragmento de 300 pb del gen BFP (expresado en células HEK293T) en el que un sitio editado de C a U se encontraba cerca del extremo 5'-terminal, cerca del extremo 3'-terminal, o en el centro del fragmento (Figura 5A). Antes del análisis μTGGE, los patrones de fusión del fragmento no editado y tres fragmentos editados se predijeron utilizando la herramienta basada en la web uMelt HETS. Este análisis mostró que se esperaría que la modificación de C a U desplazara la curva de fusión hacia la izquierda a lo largo del eje de temperatura (Figura 5B). Los valores de PaSS calculados a partir de los análisis μTGGE de los fragmentos no editados y los tres editados se ordenaron de la siguiente manera: edición de ARN final 5'-terminal < edición de ARN final 3'-terminal < centro de edición de ARN de extremos 5'- y 3'-terminal (Figura 5C). En particular, estos valores de PaSS fueron consistentes con los resultados predichos usando uMelt. Estos hallazgos indican que las diferencias de base de nucleótidos ubicadas en el extremo terminal de 5'o 3'resultan en mayores variaciones entre los valores de PaSS de genes editados y no editados que las diferencias de base de nucleótidos ubicadas más centralmente. Además, estos resultados sugieren que el conocimiento previo de las diferencias entre los perfiles de fusión de genes editados y no editados puede utilizarse como guía para optimizar los fragmentos de genes para la edición de ARN.
Figura 1: Procedimiento utilizado para identificar la edición de ARN por μTGGE. (A) Los tipos de eventos de edición de ARN examinados. (B) Una ilustración esquemática de los perfiles de fusión típicos de genes editados y no editados. En μTGGE, una muestra migra a través de un gel de gradiente de temperatura, produciendo una curvatura característica. Los puntos de función del patrón de fusión se asignan y luego se procesan para calcular un valor de puntuación de similitud de patrón (PaSS). El cálculo de PaSS se realiza como se muestra en la ecuación, donde el vector P de cada punto de característica está en su posición correspondiente y la función de temperatura y movilidad (es decir, vector P = P (T, m)). Los superíndices (1) y (2) representan los genes editados y no editados, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustraciones y fotografías del dispositivo de electroforesis en gel del tamaño de la palma de la mano. (A) Montaje de los tres 1 en casetes de gel. (B) Ilustración del soporte de casete de gel con la placa de gradiente de temperatura. La fotografía muestra las posiciones de las almohadillas de amortiguación superior e inferior, así como la de la muestra después de la carga inicial. (C) Descripción general del sistema completo, incluida la fuente de alimentación, la plataforma de electroforesis de gel horizontal y el sistema de imágenes de gel. Este sistema proporciona una solución viable para análisis rápidos in situ basados en electroforesis en gel de poliacrilamida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis TGGE de cambios de un solo nucleótido en eventos de edición de ARN. Los perfiles de fusión para tres tipos diferentes de edición de ARN se examinaron utilizando cuatro genes. (A) Edición de ARN C-to-U en BFP expresada en células HEK293T. (B) Edición de ARN A-to-I(G) en EGFP expresado en células HEK293T. (C) Edición de ARN U-to-C en el gen AT2G16586 de A. thaliana. (D) Edición de ARN U-to-C en el gen AT5G02670 de A. thaliana. Las ubicaciones de los sitios editados se resaltan en amarillo (con fuente roja) y las posiciones de imprimación se subrayan. Las diferencias entre los patrones de fusión de las muestras editadas y no editadas se indican mediante círculos rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los valores promedio de PaSS para los cuatro genes editados examinados aquí. Las barras de error representan la desviación estándar de tres réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de PaSS específico de la posición. (A) El sitio de edición de ARN de tipo C a U en el gen BFP expresado en células HEK293T se desplazó al extremo 5'-terminal, extremo 3'-terminal o centro del fragmento de gen. (B) Predicción teórica de los patrones de fusión de los fragmentos no editados y tres editados que se muestran en (A). Las predicciones se realizaron utilizando uMelt. (C) Los valores medios de PaSSde los genes editados que se muestran en (A). Las barras de error representan la desviación estándar de tres réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| S.No | Edición de ARN | Fuente | Posición | Identificación de genes | Cartilla delantera | Imprimación inversa | Longitud de la secuencia | ||
| 1 | C-a-U | Células HEK293T | 48º | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | De la A a la I | Células HEK293T | 59º | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-a-C | Arabidopsis | 152º | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-a-C | Arabidopsis | 169º | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tabla 1: Lista de genes utilizados en el protocolo actual
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Discussion
La edición de ARN juega un papel importante en la biología; sin embargo, los métodos actuales de detección de edición de ARN, como la cromatografía y la secuenciación, presentan varios desafíos debido a su alto costo, requisitos de tiempo excesivos y complejidad. El protocolo descrito aquí es un método simple, rápido y rentable para detectar la edición de ARN que utiliza un sistema portátil, de tamaño micrométrico y basado en TGGE. Este sistema se puede utilizar para diferenciar entre genes editados y no editados antes de la secuenciación de Sanger. Específicamente, los genes editados y no editados con modificaciones de nucleótidos de base única se pueden diferenciar en función de los cambios en los perfiles de fusión de TGGE. Como incorpora 1 en geles, el sistema requiere cantidades muy pequeñas de muestras y permite una rápida detección de diferencias entre secuencias. Además, el protocolo descrito aquí es muy fácil de seguir tanto para expertos como para recién llegados al campo. La optimización del fragmento de gen objetivo es fundamental para una clara diferenciación entre regiones editadas y no editadas, y este proceso se simplifica en el protocolo actual.
Este protocolo es compatible con análisis multiplex utilizando cebadores marcados fluorescentemente. Para los análisis cuantitativos, las muestras de ARN desconocidas (editadas o no editadas) pueden etiquetarse con fluorescencia verde y comigratearse con un estándar de referencia etiquetado con fluorescencia roja (editado o no editado) durante el análisis TGGE.
Además de demostrar la capacidad del método μTGGE para detectar eventos de edición de ARN de un solo nucleótido, también validamos la similitud entre el resultado experimental obtenido utilizando μTGGE y un resultado teórico obtenido para el mismo fragmento de gen utilizando uMELT. Además, encontramos que las diferencias de base de nucleótidos ubicadas en los terminales 5'- y 3'- de los fragmentos de genes producen mayores diferencias en los perfiles de fusión de μTGGE (es decir, valores de PaSS más pequeños) que los ubicados hacia el centro de los fragmentos. Aunque prometedor, el protocolo actual puede limitarse al análisis y detección de tipos específicos de modificaciones de nucleótidos durante la edición de ARN. En nuestra próxima investigación se realizará una mayor optimización y desarrollo de este protocolo para analizar otros tipos y / o ubicaciones de edición de ARN.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (17H02204 y 18K19288). Ruchika fue apoyada financieramente por el gobierno japonés (beca MEXT). Agradecemos a la Sra. Radhika Biyani (Laboratorio Takagi, JAIST) y al Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) por su ayuda con los experimentos relacionados con la electroforesis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
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