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Biology

Modelo de aneurisma aórtico abdominal de ratón inducido por la aplicación perivascular de elastasa

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63608
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Internal Medicine, Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

El presente protocolo describe un método quirúrgico estandarizado para el modelo AAA inducido por elastasa a través de la aplicación directa de elastasa a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal en ratones.

Abstract

El aneurisma aórtico abdominal (AAA), aunque principalmente asintomático, es potencialmente mortal ya que la ruptura de AAA generalmente tiene un resultado devastador. Actualmente, hay varios modelos experimentales distintos de AAA, cada uno enfatizando un aspecto diferente en la patogénesis de AAA. El modelo AAA inducido por elastasa es el segundo modelo AAA de roedores más utilizado. Este modelo implica la infusión directa o la aplicación de elastasa pancreática porcina (EPP) en el segmento infrarrenal de la aorta. Debido a los desafíos técnicos, la mayoría de los modelos AAA inducidos por elastasa hoy en día se realizan con la aplicación externa en lugar de una infusión intraluminal de EPP. La infiltración de elastasa causará la degradación de las láminas elásticas en las capas mediales, lo que resultará en la pérdida de la integridad de la pared aórtica y la posterior dilatación de la aorta abdominal. Sin embargo, una desventaja del modelo AAA inducido por elastasa es la variación inevitable de cómo se realiza la cirugía. Específicamente, la técnica quirúrgica de aislar el segmento infrarrenal de la aorta, el material utilizado para el envoltorio de la aorta y la incubación del EPP, la actividad enzimática del EPP y la duración del tiempo de aplicación del EPP pueden ser determinantes importantes que afectan la eventual tasa de formación de AAA y el diámetro del aneurisma. En particular, la diferencia en estos factores de diferentes estudios sobre AAA puede conducir a problemas de reproducibilidad. Este artículo describe un proceso quirúrgico detallado del modelo AAA inducido por elastasa a través de la aplicación directa de EPP a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal en el ratón. Después de este procedimiento, se puede lograr una tasa de formación AAA estable de alrededor del 80% en ratones machos y hembras. La consistencia y reproducibilidad de los estudios AAA que utilizan un modelo AAA inducido por elastasa se puede mejorar significativamente mediante el establecimiento de un procedimiento quirúrgico estándar.

Introduction

El aneurisma aórtico abdominal (AAA) se define como una dilatación segmentaria de la aorta abdominal con al menos un aumento del 50% del diámetro del vaso1. Aaa es potencialmente fatal, ya que la ruptura puede resultar en una tasa de mortalidad extremadamente alta, incluso con la intervención 2,3,4. Se ha informado que AAA es responsable de aproximadamente 13,000 muertes anuales en los Estados Unidos, lo que la convierte en la10ª causa principal de muerte 1,5.

La patogénesis de AAA aún no se entiende completamente 6,7,8. Para investigar el mecanismo molecular de AAA y probar posibles dianas terapéuticas, se han establecido varios modelosexperimentales de AAA 9,10. Los modelos de roedores de AAA incluyen modelos de elastasa, cloruro de calcio, angiotensina II y xenoinjerto, entre los cuales el modelo AAA inducido por elastasa es el segundo modelo más utilizado 10,11,12,13,14,15,16,17. Este modelo implica la infusión directa o la aplicación de elastasa pancreática porcina (EPP) en el segmento infrarrenal de la aorta. La penetración de la elastasa en la capa medial de la aorta provocará la degradación de las láminas elásticas y la infiltración de células inflamatorias, lo que conllevará la pérdida de la integridad de la pared aórtica y la posterior dilatación de la aorta abdominal 7,18. El modelo AAA inducido por elastasa fue reportado por primera vez por Anidjar et al. en 1990 utilizando ratas, en las que un segmento aislado de la aorta fue perfundido con elastasa17. Más tarde, en 2012, Bhamidipati et al.19 informaron de un modelo modificado que utilizaba una aplicación periadventitial de EPP. Hoy en día, la mayoría de las cirugías para el modelo AAA inducido por elastasa están inspiradas en el grupo de Bhamidipati y se realizan con la aplicación externa en lugar de la perfusión intraluminal de EPP. Aunque la aplicación externa tiene menos requerimiento de habilidades quirúrgicas finas, la tasa de incidencia de AAA es relativamente menor y el tamaño algo menor que el de la perfusión intraluminal11,19.

Aunque se usa ampliamente en estudios AAA, el modelo AAA inducido por elastasa posee ciertas limitaciones. Una advertencia de este modelo son las variaciones inevitables de cómo se realiza la cirugía, lo que puede llevar a la cuestión de la reproducibilidad. Por ejemplo, puede existir la diferencia en el procedimiento quirúrgico con respecto a cómo se aísla el segmento infrarrenal de la aorta y qué parte del segmento se selecciona para la aplicación de EPP entre diferentes laboratorios. La actividad enzimática del EPI y la duración del tiempo de incubación del EPI también pueden variar. Estos, sin embargo, son todos determinantes esenciales que afectan la eventual tasa de formación de AAA y el diámetro del aneurisma. La variación de estos determinantes críticos hace que la comparación de datos de estudios AAA de diferentes grupos que utilizan este modelo sea muy difícil. Por lo tanto, se necesita un procedimiento quirúrgico estandarizado como una herramienta para obtener resultados comparables de varias instituciones.

Este artículo describe un protocolo quirúrgico estandarizado para el modelo AAA inducido por elastasa a través de la aplicación directa de EPP a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal en ratones. También se discutirán los detalles sobre el material quirúrgico y los procedimientos esenciales para la generación exitosa y robusta de AAA en ratones que utilizan este modelo.

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Protocol

Los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan (PRO00010092). Para los experimentos se utilizaron ratones machos y hembras C57BL / 6J de tipo salvaje (WT), de ~ 7 semanas de edad.

1. Preparación animal

  1. Alimente a los ratones con la dieta estándar de chow (ver Tabla de Materiales) antes y después de la cirugía.
    NOTA: Se pueden utilizar diferentes cepas y edades de ratones. Sin embargo, se recomienda una edad que oscila entre 5,5 y 12 semanas de edad para lograr la tasa de incidencia máxima.
  2. Para cada ratón, administrar 5 mg/kg de Carprofen por vía subcutánea 30 min antes de la inducción de la anestesia.
  3. Después de 30 min, administrar 100 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilazina mediante inyección intraperitoneal para inducir la anestesia.

2. Preparación para la cirugía

  1. Preparar el material quirúrgico.
    1. Cortar los guantes de nitrilo en tiras de 4 cm x 4 mm. Corta las almohadillas de algodón en trozos de 3 cm x 2 mm. Autoclave estos con otros instrumentos quirúrgicos, incluyendo tijeras quirúrgicas, fórceps de tejido y hemostáticos Halsted-Mosquito (ver Tabla de Materiales).
  2. Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla de apósito absorbente estéril. Inmovilizar las patas delanteras y traseras con cinta quirúrgica.
  3. Use aplicadores con punta de algodón (consulte la Tabla de materiales) para cepillar la loción removedora de vello sobre el área abdominal media e inferior, luego frote el área con una gasa quirúrgica para eliminar el vello.
  4. Desinfecte el área quirúrgica al menos tres veces en un movimiento circular con aplicaciones alternas de alcohol al 70% y un exfoliante a base de yodo o a base de clorhexidina. Dejar secar.

3. Procedimiento quirúrgico

  1. Realice los siguientes pasos para acceder a la cavidad abdominal.
    1. Pruebe al ratón para detectar la falta de respuesta de pellizco en el dedo del pie antes de la incisión en la piel.
    2. Haga una incisión longitudinal de 2,5 cm en la piel a lo largo de la línea media del abdomen medio e inferior con tijeras quirúrgicas.
    3. Tire suavemente hacia arriba del músculo subyacente y haga una incisión longitudinal de 2,5 cm a lo largo de la línea alba para acceder a la cavidad abdominal.
  2. Exponer la aorta abdominal.
    1. Use aplicadores húmedos con punta de algodón para mover los intestinos y el estómago hacia el lado derecho del ratón.
      NOTA: Idealmente, esto expondrá el segmento infrarrenal de la aorta. Si la aorta es difícil de localizar, el riñón derecho y la arteria renal derecha pueden identificar la aorta (ya que el riñón derecho tiene una ubicación anatómica ligeramente más baja que el riñón izquierdo).
    2. Use fórceps para extraer suavemente el tejido conectivo que cubre la aorta abdominal y la vena cava inferior (IVC).
      NOTA: La aorta abdominal y la CIV están contenidas dentro de la misma vaina del vaso. Es innecesario eliminar todo el tejido conectivo, ya que la eliminación completa aumentaría el riesgo de dañar estos dos vasos.
    3. Use fórceps para diseccionar suavemente la parte posterior de la aorta abdominal y la CIV de los músculos subyacentes.
      NOTA: Las puntas de los fórceps deben ir a la parte posterior de la vaina transversalmente y crear un agujero en la fascia que conecte la vaina con los músculos subyacentes. Una vez hecho el agujero, extienda su tamaño soltando lentamente las pinzas.
    4. Coloque un trozo de la guantera de 4 cm x 4 mm (como se mencionó anteriormente, paso 2.1.1) a través de la parte posterior de la aorta abdominal y la CIV, luego enderece la raya. Coloque la raya a ~ 0.5 cm de distancia de la arteria renal derecha.
      NOTA: Asegúrese de que el orificio sea lo suficientemente grande como para que la fascia circundante no tuerza la raya.
    5. Sobre la raya, coloque un trozo de algodón de 3 cm x 2 mm a través de la parte posterior de la aorta abdominal y el IVC, luego enderece la almohadilla de algodón.
  3. Incubar la elastasa.
    1. Use una pipeta para dejar caer 30 μL de elastasa pancreática porcina (actividad enzimática total de 1.8 unidades, consulte la Tabla de materiales) sobre el segmento de la aorta sobre la almohadilla de algodón, luego envuelva la almohadilla de algodón y la raya alrededor de la aorta y la IVC. Enjuague un trozo de gasa de 10 cm x 10 cm con solución salina estéril al 0,9% y colóquelo sobre el abdomen.
      NOTA: La gasa solo necesita enjuague parcial, ya que exagerar correría el riesgo de diluir la elastasa debajo.
    2. Después de 30 minutos, retire la raya y la almohadilla de algodón con fórceps.
  4. Cierre la cavidad abdominal siguiendo los pasos a continuación.
    1. Irrigar la aorta y la cavidad abdominal con 500 μL de solución salina estéril al 0,9%. Use una gasa de 10 cm x 10 cm para absorber la solución salina restante.
    2. Reaproximar las capas musculares con una sutura de monofilamento no absorbible 6-0.
    3. Cierre la piel con 3-4 suturas de monofilamentos no absorbibles interrumpidas 6-0.

4. Cuidados postoperatorios

  1. Administrar 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea en el postoperatorio día 1.
  2. Retire las suturas de la piel en el postoperatorio Día 10.

5. Medición del diámetro del aneurisma de la aorta abdominal

  1. Sacrificar a los ratones por sobredosis de CO2 en el día 14 postoperatorio. Esto representa el punto temporal de la dilatación máxima.
  2. Acceda a la cavidad abdominal como se describe en el paso 3.1.
  3. Realizar perfusión vascular inyectando 10 mL de solución salina al 0,9% en la circulación a través del ventrículo izquierdo.
  4. Exponer el segmento infrarrenal de la aorta abdominal como se describe en los pasos 3.1-3.2. Retire con cuidado el tejido conectivo circundante y separe la aorta abdominal de la IVC.
  5. Mide el diámetro de la aorta abdominal con una pinza.

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Representative Results

Un total de veintitrés ratones de tipo salvaje (WT) de 7 semanas de edad, incluidas 12 hembras y 11 machos, fueron operados siguiendo el protocolo presentado. La tasa de supervivencia fue del 100% (excluida la mortalidad quirúrgica). El diámetro máximo de la aorta abdominal se midió mediante una pinza.

La AAA se definió como la dilatación de la aorta abdominal con un aumento del 50% en el diámetro de los vasos. Por lo tanto, se seleccionó un aumento del 50% en el diámetro máximo de la aorta abdominal como punto de corte para una inducción AAA exitosa. Con base en este criterio, la tasa de incidencia de AAA en el día 14 postoperatorio fue del 91,7% para las hembras, con 11 de las 12 que se sometieron a cirugía desarrollaron AAA; mientras que la tasa de incidencia para los animales machos fue del 72,7%, con 8 de cada 11 que se sometieron a cirugía desarrollaron AAA (Figura 1A). Entre los 19 animales en los que se produce AAA, hay un aumento de 1,7 veces y 1,6 veces el diámetro máximo de la aorta abdominal en hembras y machos en comparación con los controles no quirúrgicos, respectivamente (Figura 1B). Las imágenes representativas de las aortas de los grupos no quirúrgicos y quirúrgicos en el día 14 postoperatorio se muestran en la Figura 1C.

Figure 1
Figura 1: Caracterización de AAA en ratones sometidos a cirugía. Toda la medición se realiza el día 14 postoperatorio. (A) La tasa de incidencia de AAA en ratones que se sometieron a cirugía. (B) Diámetro máximo de la aorta infrarrenal en ratones tanto de grupos no quirúrgicos (n = 4 para hembras como para machos) y quirúrgicos (n = 12 para hembras; n = 11 para machos). Los datos son medios ± SEM. *p < 0,05. (C) Imágenes representativas de aortas en ratones de grupos no quirúrgicos y quirúrgicos. Barra de escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El modelo AAA inducido por elastasa fue reportado por primera vez por Anidjar et al. usando ratas en 199017. Una variedad de versiones modificadas se han introducido en los últimos treinta años, junto con una mejora significativa en las técnicas quirúrgicas 19,20,21,22. Cientos de institutos utilizan modelos AAA inducidos por elastasa como el segundo modelo experimental de roedores más utilizado para estudios AAA12. Es natural que diferentes grupos realicen la cirugía para este modelo de manera ligeramente diferente. Como resultado, una advertencia de este modelo son las variaciones inevitables de cómo se realiza la cirugía, lo que hace que la comparación de datos de diferentes grupos utilizando este modelo sea muy difícil. Las variaciones incluyen, entre otras, cómo se expone el segmento infrarrenal de la aorta, qué tan extensamente se limpia la capa fascial que cubre la aorta, cuánto dura el período de incubación, así como el material utilizado para la envoltura de la aorta y la incubación de elastasa y el volumen de elastasa agregado al material de envoltura. Estos, sin embargo, son todos determinantes esenciales que afectan la tasa de incidencia final y el diámetro de AAA. Se necesita un procedimiento quirúrgico estandarizado para resolver el problema de la reproducibilidad causada por estas variaciones. Aquí se presenta un protocolo quirúrgico estandarizado para el modelo AAA inducido por elastasa mediante la aplicación directa de EPP a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal en el ratón.

Aparte de la tasa de inducción consistente de AAA, este protocolo posee las ventajas de bajos gastos y corto tiempo de operación. El material quirúrgico utilizado en este protocolo se puede obtener fácilmente a bajo costo. El tiempo promedio de operación de este protocolo es de 50 min, incluyendo 30 min de incubación de EPP. Estas ventajas permitirán la realización más fácil de muchos estudios en animales, contribuyendo a un poder estadístico y una reproducibilidad más sustanciales.

La exposición de la aorta abdominal es el paso más crítico en este protocolo. Es esencial eliminar el tejido conectivo en la vaina del vaso que rodea la aorta abdominal y la CIV para que la elastasa tenga una mejor oportunidad de penetrar en la capa medial de la aorta. Sin embargo, la eliminación completa de estos tejidos conectivos lleva mucho tiempo y corre el riesgo de dañar la aorta subyacente y la CIV. Este es el paso a partir del cual se causa la mayor parte de la mortalidad quirúrgica. Si la CIV o la aorta están dañadas, la mayoría de los animales no sobrevivirán las siguientes 48 h, incluso si sobreviven a la cirugía, posiblemente debido al sangrado continuo después de la cirugía que conduce a la exsanguinación. Por esta razón, un delicado equilibrio entre exponer la aorta en la mayor medida posible y no dañar los grandes vasos debe reflexionarse. Dejar una pequeña cantidad de tejido conectivo en la vaina del vaso reducirá significativamente la mortalidad perioperatoria sin afectar la aparición de AAA. Por lo tanto, no se recomienda eliminar completamente el tejido conectivo que cubre la aorta y la IVC para la exposición a la aorta abdominal. Aún así, se debe tener extrema precaución durante la aorta abdominal y la disección de IVC del tejido conectivo adyacente.

Anatómicamente, la aorta abdominal y la CIV están estrechamente unidas a través de una fina capa de fascia y contenidas juntas en la misma vaina de vasos. Algunos modelos experimentales, como la trombosis venosa, pueden requerir la separación de la aorta de la IVC adyacente. Sin embargo, no es necesario hacerlo en el modelo AAA23 inducido por elastasa. Algunos pueden preferir girar la vaina del vaso en el sentido de las agujas del reloj para que la aorta esté justo por encima de la IVC, y la elastasa se puede aplicar directamente a la aorta. Esto es innecesario ya que la almohadilla de algodón debajo está saturada de elastasa, y la aorta estará continuamente expuesta a la elastasa, independientemente de su relación anatómica con la IVC. Se recomienda que la parte posterior de la aorta y la CIV estén adecuadamente separadas de los músculos subyacentes a través de fórceps . En caso de que la disección no sea lo suficientemente extensa en este paso, la fuerza de tensión será creada por la fascia circundante y los músculos en la franja y la almohadilla de algodón, lo que resultará en su torsión y posterior absorbancia ineficiente de la elastasa.

Una limitación de este protocolo es la forma final del AAA inducido. Es inevitable que cuando se deja caer sobre la aorta, algo de elastasa fluya a otros segmentos de la aorta que no están envueltos por la almohadilla de algodón. Además, el sangrado cercano causado por la disección, incluso de pequeña cantidad, puede lavar la elastasa de la almohadilla de algodón a otros segmentos de la aorta durante el período de incubación de 30 minutos. Estos conducirán a que la elastasa penetre en otros segmentos de la aorta, causando así la ruptura de la capa medial y la dilatación de la aorta abdominal no limitada al segmento envuelto por la almohadilla de algodón. Como resultado, en lugar de exhibir aneurismas en forma fusiforme causados por dilatación focal, algunos animales demuestran dilatación general de un segmento largo de la aorta abdominal. Sin embargo, el diámetro máximo de la aorta en estos animales que tienen dilatación continua de la aorta todavía muestra un aumento de más del 50% en comparación con los controles. Mientras tanto, no se observan diferencias en el diámetro máximo de la aorta entre los animales que exhiben dilatación continua y dilatación focal de la aorta abdominal, lo que sugiere que la forma del aneurisma no es un indicador de inducción AAA exitosa ni tamaño aaa real en este protocolo de caso.

Otra limitación de este protocolo es aplicar este método a animales más grandes. El modelo AAA tópico inducido por elastasa debe aplicarse fácilmente a otros animales pequeños como las ratas. Sin embargo, la elastasa por sí sola puede no ser suficiente para que los animales más grandes como los cerdos o los primates induzcan un fenotipo AAA consistente. Por ejemplo, Marinov et al. informaron que la perfusión de elastasa sola en cerdos podría causar algunos cambios histológicos, incluida la interrupción de la elastina, pero no pudo inducir un aneurisma consistente24. Shannon A et al. reportaron un modelo porcino de AAA infrarrenal inducido por elastasa. Sin embargo, requiere una combinación de angioplastia con balón, perfusión, elastasa tópica y una dieta que contenga BAPN (un inhibidor de la lisiloxidasa que previene la reticulación del colágeno) dada la considerable durabilidad de laaorta 25. Por lo tanto, parece que la aplicación de un protocolo AAA estandarizado inducido por elastasa en animales más grandes sigue siendo bastante desafiante debido a la diferencia en el tamaño y la durabilidad de la aorta entre ratones y animales más grandes, los desafíos técnicos y el costo potencialmente alto.

En resumen, a pesar de algunas limitaciones, AAA se puede inducir consistentemente tanto en ratones machos como hembras en este protocolo estandarizado. Se espera que la consistencia y la reproducibilidad de los estudios AAA que utilizan el modelo AAA inducido por elastasa mejoren significativamente mediante el establecimiento de este procedimiento quirúrgico estándar.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a la Unidad de Medicina animal de laboratorio de la Universidad de Michigan por su ayuda con la alimentación y la cría de animales. Este estudio está respaldado por NIH RO1 HL138139, NIH RO1 HL153710 a J. Zhang, NIH RO1 HL109946, RO1 HL134569 a Y.E. Chen y la subvención 20POST35110064 de la American Heart Association a G. Zhao.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture Pro Advantage P420697
Carprofen Zoetis Inc. NDC: 54771-8507
Chow Diet LabDiet 3005659-220 PicoLab 5L0D
Cotton Applicator Dynarex 4303
Cotton Pad Rael UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8 GraphPad Software Inc. Version 8.4.3
Grarfe Forceps Fine Science Tools 11051-10
Halsted Mosquito Hemostats Fine Science Tools 13009-12
Ketamine Par Pharmaceutical NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves Fisherbrand 19-130-1597
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Porcine pancreatic elastase Sigma-Aldrich E1250-100MG
Scissors Fine Science Tools 14068-12
Sterile 0.9% saline solution Baxter 2B1324X
Xylazine Akorn NDC: 59399-110-20

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