Summary
Hier presenteren we een protocol dat de cultuur van canine intestinale organoïden beschrijft in een tweekamerig, permeabel ondersteuningssysteem. Organoïde zaaien in de doorlatende steunen, het onderhoud van de monolaag en de daaropvolgende experimenten met de permeabiliteit van geneesmiddelen worden beschreven.
Abstract
Het permeabele ondersteuningssysteem wordt meestal gebruikt in combinatie met traditionele tweedimensionale (2D) cellijnen als een in vitro hulpmiddel voor het evalueren van de orale permeabiliteit van nieuwe therapeutische kandidaat-geneesmiddelen. Het gebruik van deze conventionele cellijnen heeft echter beperkingen, zoals veranderde expressie van tight junctions, gedeeltelijke celdifferentiatie en de afwezigheid van belangrijke nucleaire receptoren. Ondanks deze tekortkomingen zijn de Caco-2- en MDCK-modellen algemeen geaccepteerd en gevalideerd voor de voorspelling van menselijke in vivo orale permeabiliteit.
Honden zijn een relevant translationeel model voor biomedisch onderzoek vanwege hun overeenkomsten in gastro-intestinale anatomie en darmmicroflora met mensen. Dienovereenkomstig, en ter ondersteuning van de parallelle ontwikkeling van geneesmiddelen, is de uitwerking van een efficiënt en nauwkeurig in vitro hulpmiddel voor het voorspellen van in vivo permeabiliteitskenmerken van geneesmiddelen, zowel bij honden als bij mensen, zeer wenselijk. Een dergelijk hulpmiddel zou het canine intestinale organoïde systeem kunnen zijn, gekenmerkt door driedimensionale (3D), zelfgeassembleerde epitheelstructuren afgeleid van volwassen stamcellen.
Het (1) Permeable Support Seeding Protocol beschrijft de experimentele methoden voor het dissociëren en zaaien van hondenorganoïden in de inserts. Canine organoïde isolatie, cultuur en oogst zijn eerder beschreven in een afzonderlijke set protocollen in dit speciale nummer. Methoden voor algemeen onderhoud van de canine intestinale organoïde monolaag worden grondig besproken in het (2) Monolayer Maintenance Protocol. Daarnaast beschrijft dit protocol methoden om de structurele integriteit van de monolaag te beoordelen via transepitheliale elektrische weerstand (TEER) metingen en lichtmicroscopie. Ten slotte beschrijft het (3) Permeabiliteit Experimenteel Protocol de taken die direct aan een experiment voorafgaan, waaronder in vitro validatie van experimentele resultaten.
Over het algemeen overwint het canine organoïde model, gecombineerd met een dual-chamber celkweektechnologie, beperkingen die verband houden met 2D-experimentele modellen, waardoor de betrouwbaarheid van voorspellingen van de schijnbare orale permeabiliteit van therapeutische kandidaat-geneesmiddelen zowel bij de hond als bij de menselijke patiënt wordt verbeterd.
Introduction
Permeabele ondersteuningssystemen worden meestal gebruikt om de schijnbare permeabiliteit van therapeutische kandidaat-geneesmiddelen door de intestinale epitheliale barrièrete bepalen 1,2. Ze kunnen ook worden gebruikt om cellulaire secretie3, celmigratie4 en geneesmiddeltoxiciteit5 te beoordelen. In vitro orale geneesmiddelpermeabiliteitstests zijn een belangrijke stap in het ontdekkings- en ontwikkelingsprocesvan geneesmiddelen 2, waarbij individuele kandidaat-geneesmiddelen worden getest in het vroege stadium van de R&D-levenscyclus van het geneesmiddel6. Het doorlatende ondersteuningssysteem is een celkweekapparaat met twee kamers dat bestaat uit een insert met een semiporeus membraan dat in een multiwellplaat is geplaatst. Dit systeem biedt directe toegang tot de apicale en basolaterale zijden van een cel-monolaag gekweekt in de insert7. De monolaag die in deze systemen wordt gebruikt, is meestal afgeleid van gastro-intestinale epitheelcellen (bijv. Humaan colorectaal adenocarcinoom Caco-2 cellijn)8. Celculturen groeien in een gepolariseerde toestand die de natuurlijke microarchitectuur van intestinale epitheelcellen nabootst, waardoor verdere cellulaire differentiatie, vergelijkbare microanatomie en functiemogelijk is 7. Details van de doorlatende steuninzet zijn te vinden in figuur 1. Het zaaien van de inserts met 2D-celculturen, traditioneel gebruikt voor het beoordelen van de darmdringingspermeabiliteit van geneesmiddelen, is relatief betaalbaar en gemakkelijk tekweken 9. Deze systemen vertonen verschillende belangrijke beperkingen, waaronder hun beperkte capaciteit om het darmmetabolisme van therapeutische kandidaat-geneesmiddelen te voorspellen10,11. Dit geldt voor alle mechanismen van medicijnabsorptie, of het nu passieve absorptie is door de tight junctions tussen epitheelcellen, actieve transepitheliale absorptie door efflux of opnametransporters (bijv. P-glycoproteïne, monocarboxylaattransporter 1) en geneesmiddelen die worden gemetaboliseerd door enterocyten.
Honden delen een gemeenschappelijke omgeving en dieet met mensen12. De darmanatomie en de samenstelling van het microbioom van honden lijken sterk op die van mensen13, die de afgelopen 36.000 jaar is toegeschreven aan domesticatie en gedeelde diëten14. Helaas kunnen deze overeenkomsten ook veel voorkomende oorzaken / triggers zijn voor de ontwikkeling van ziekten. Honden ontwikkelen vergelijkbare chronische morbiditeiten als mensen, zoals obesitas15, inflammatoire darmziekte16, colorectaal adenocarcinoom17, gastro-intestinale stromale tumor (GIST)18 en verschillende andere pathologieën geassocieerd met hun relatieve levensduur19. Dienovereenkomstig kunnen hondenorganoïden met succes worden gebruikt voor omgekeerd translationeel onderzoek naar deze chronische multifactoriële ziekten in de geest van het One Health Initiative20.
Caco-2-cellen zijn de meest gebruikte cellijnen voor orale absorptietests van geneesmiddelen21. Deze cellen worden momenteel beschouwd als het "gouden standaard" model voor in vitro intestinale permeabiliteitstests 2,22,23. De Caco-2 cellijn drukt efflux- en opnametransporters uit die in het menselijke darmkanaal worden aangetroffen, hoewel op verschillende expressieniveaus 24,25,26. Caco-2-cellen worden ook veel gebruikt als modellen om te bepalen of een medicijn een substraat of remmer is van intestinale effluxtransporters22,27. Hoewel de Caco-2-cellen van colonoorsprong zijn, bootsen ze een enterocytcel na. Helaas vertegenwoordigen Caco-2-cellen slechts één celtype uit de epitheellaag van de dunne darm9, die er niet in slaagt om de complexe samenstelling van het intestinale epitheelceltype nauwkeurig samen te vatten. Gobletcellen die zich bijvoorbeeld toeleggen op slijmproductie zijn afwezig in Caco-2-culturen, zodat slijm-geneesmiddelinteracties niet kunnen worden beoordeeld zonder cocultuur met andere cellijnen28. Bovendien brengen Caco-2-culturen geen enkele van de belangrijke nucleaire receptoren tot expressie die typisch in de darm aanwezig zijn, zoals pregnane X-receptor (PXR), steroïde X-receptor (SXR) en constitutieve androstaanreceptor (CAR)29. Bijgevolg slagen Caco-2-culturen er niet in om de inductie van medicijntransporters en enzymen door bepaalde geneesmiddelen die inductoren van deze receptoren zijn (bijv. rifampicine) te modelleren30.
De 3D intestinale organoïde technologie pakt enkele van deze beperkingen aan19. Organoïden zijn zelfgeassembleerde constructies afgeleid van volwassen stamcellen die kunnen worden vastgesteld uit weefselmonsters die zijn geoogst met behulp van micro-invasieve technieken20. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen worden gebruikt voor intestinale permeabiliteitsmodellen31,32. Canine organoids bieden een relevant alternatief voor menselijke organoïden omdat menselijk stamcelonderzoek wordt beperkt door ethische kwesties33. Bovendien bieden hondenorganoïden een in vitro systeem voor het onderzoeken van de permeabiliteit van hondengeneesmiddelen, metabolisme, actief transport en interacties tussen geneesmiddelen en geneesmiddelen. Om deze technologische kloof aan te pakken, is de consistente en betrouwbare groei van canine intestinale organoïden in een doorlatend ondersteuningssysteem beschreven34. Een permeabiliteitstest met canine intestinale organoïden kan mogelijk de intestinale permeabiliteit en het metabolisme van kleine geneesmiddelmoleculen voorspellen in vergelijking met momenteel gebruikte assays (Caco-2). Bevestiging van deze cruciale kenmerken leent dit nieuwe in vitro systeem voor toekomstig werk dat de potentiële impact van inductoren op intracellulair metabolisme en actief transport onderzoekt.
Canine organoïden zijn samengesteld uit alle celtypen die typisch aanwezig zijn in de epitheellaag van de darm. Vanuit een functioneel en microanatomisch beeld repliceren ze op betrouwbare wijze de omgeving van de epitheliale laag van de hondendarm19,35. Bovendien is de aanwezigheid van slijm, hondenspecifieke medicijntransporters en enzymen en de algehele cellulaire differentiatie in intestinale organoïden van honden vergelijkbaar met wat in vivo bij honden wordt gezien34. Organoïden kunnen dus worden geïsoleerd van zieke veterinaire patiënten en worden gebruikt om het effect van verschillende ziekteprocessen (bijv. Chronische darmontsteking) op de orale permeabiliteit van geneesmiddelen bij honden te modelleren19,36. Het canine intestinale organoïde systeem kan ook worden gebruikt in andere omgevingen dan experimenten met de permeabiliteit van geneesmiddelen. Deze 3D-structuren kunnen ook worden geïsoleerd van zieke patiënten zoals eerder beschreven door Chandra et al. voor inflammatoire darmaandoeningen, colorectaal adenocarcinoom en gastro-intestinale stromale tumor19.
Het Permeable Support Seeding Protocol beschrijft methoden voor het vaststellen van canine intestinale organoïde culturen in de inserts. Dit eerste protocol schetst methoden om gevestigde canine organoïde culturen te dissociëren die in de extracellulaire membraanmatrix zijn opgenomen. Verder wordt het voorcoaten van de inserts met collageen I en de extracellulaire membraanmatrix besproken in dit protocol. Het inbedden van hondenorganoïden in de doorlatende steuninzetstukken wordt ook in detail beschreven.
Het tweede protocol is het Monolayer Maintenance Protocol, dat algemeen onderhoud van honden 3D-organoïden in een insert omvat. De frequentie en volumes van de organoïde media die worden gebruikt om de cultuur te vernieuwen, en manieren om celkweekschade te voorkomen, worden gepresenteerd in dit tweede protocol, samen met experimentele methoden voor het beoordelen van de samenvloeiing van de epitheliale monolaag.
Ten slotte richt het Permeability Experimental Protocol zich op manieren om te bepalen of de intestinale 3D-organoïden van honden in een permeabiliteitstest klaar zijn voor experimenteel gebruik en de verificatiestappen die nodig zijn voordat een experiment wordt uitgevoerd. Deze sectie beschrijft ook de opzet en de succesvolle uitvoering van een permeabiliteitsexperiment, samen met de incubatie en bemonstering van therapeutische kandidaat-geneesmiddelen in de kamers van de monolaagcultuur. Het gebruik van het fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC-dextran) met lage permeabiliteit om de integriteit van de monolaag te bewaken, wordt ook besproken. Ten slotte wordt een in vitro evaluatiemethode beschreven voor het valideren van de resultaten na afloop van een experiment. Permeabiliteitsexperimenten zijn een extreem uitgebreid onderwerp en worden zeer goed samengevat door Hubatsch et al.37. De workflow van de protocollen is samengevat in figuur 2.
Figuur 1: Canine intestinale organoïden op een doorlatend ondersteuningssysteem. De doorlatende steuninzet is geplaatst in een put van een 24-well plaat. Het microporeuze membraan maakt het zaaien van gedissocieerde canine intestinale organoïden mogelijk, en deze cellen zullen uiteindelijk een organoïde 2D-monolaag vormen. Deze technologie biedt toegang tot zowel de AP- als de BL-zijde van de monolaag. Organoïde medium wordt geïntroduceerd in zowel de AP- als bl-kamers van de permeabele ondersteuning. De absorptie (AP→BL) en secretie (BL→AP) van het kandidaat-geneesmiddel worden geïllustreerd, evenals twee mogelijke vormen van drugstransport. Afkortingen: AP = apiical; BL = basolateraal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflow van canine organoid permeabele ondersteuningsprotocollen. De permeabele steuninzet is voorgecoat met een mengsel van de extracellulaire membraanmatrix en collageen I en gedurende 1 uur geïncubeerd. Tijdens het incubatieproces wordt de organoïde cultuur gedissocieerd. Individuele organoïde cellen worden in de insert gezaaid, medium in de basolaterale kamer wordt onmiddellijk na het zaaien toegevoegd, terwijl medium aan de apicale kamer wordt toegevoegd 24 uur nadat het zaaiproces is voltooid. Onderhoud en monitoring van de organoïden omvatten regelmatige mediumveranderingen, TEER-waardemetingen en lichtmicroscopie om de integriteit van de monolaag te evalueren. Vóór het experiment moeten de organoïden worden gedifferentieerd door ROCK-remmer en GSKiβ uit de media te verwijderen. De TEER-waarden worden gemeten op de dag van het experiment en de organoïde monolaag wordt via lichtmicroscopie geïnspecteerd op schade aan de cellen. Medium wordt vervolgens geruild voor een geschikte buffer en voorafgaand aan het experiment geïncubeerd. De FITC-dextran-test wordt gebruikt tijdens intestinale permeabiliteitsexperimenten39 als een marker van monolaagintegriteit. TEER-metingen worden na het experiment uitgevoerd en lichtmicroscopie valideert de resultaten na 24 uur. Afkortingen: TEER = transepitheliale elektrische weerstand; ROCK = rho-geassocieerd kinase; GSKiβ = glycogeensynthase kinase bèta; F = fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Het onderzoek werd goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee van Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). In de volgende sectie (stappen 1.1-1.3) wordt het Permeable Support Seeding Protocol beschreven en worden de procedures samengevat in figuur 3.
Figuur 3: Workflow van het permeabele support seeding protocol. De doorlatende steuninzetstukken zijn voorgecoat met een combinatie van CMGF+ R/G, collageen I en de extracellulaire membraanmatrix en vervolgens geïncubeerd. Media uit de canine organoïde cultuur worden aangezogen en vervangen door een Cell Recovery Solution, gevolgd door een incubatie van 30 minuten bij 4 °C. De kweek wordt vervolgens overgebracht naar een buis en organoïde dissociatie wordt uitgevoerd met behulp van trypsine-achtige protease. Niet-gesofonieerde organoïden worden verwijderd door passage door een zeef om een eencellige suspensie te bereiken, en de celconcentratie wordt bepaald met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. De cellen worden gezaaid op een permeabel steunelement en CMGF + R / G wordt toegevoegd aan de basolaterale kamer. De cultuur wordt vervolgens gedurende 24 uur geïncubeerd en de resterende vloeistof wordt uit de apicale kamer verwijderd en vervangen door CMGF + R / G. Afkortingen: ROCK = rho-geassocieerd kinase; GSKiβ = glycogeensynthase kinase bèta; CMGF + R/G = Compleet medium met groeifactoren versterkt met ROCK-remmer en GSKiβ. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Permeabel ondersteuning seeding protocol
- Voorcoating van de doorlatende steuninzetstukken
- Bereid compleet medium voor met groeifactoren verrijkt met Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor en glycogeen synthase kinase-beta inhibitor (GSKiβ) (CMGF + R/G) volgens de informatie in Tabel 1.
- Bereid een ijsemmer voor en begin met het ontdooien van de extracellulaire membraanmatrix op ijs. Plaats een plaat met 24 putten met het benodigde aantal inzetstukken in de incubator om voor te verwarmen. Verzamel rattenstaartcollageen I (3 mg / ml) en plaats het op ijs terwijl het beschermt tegen licht. Verzamel CMGF + R/G en leg het op ijs.
- Bereken het totale aantal inserts en blanco's dat nodig is voor het experiment, waarbij 100 μL van de coatingoplossing voor elke insert opzij wordt gehouden.
OPMERKING: Bereid meer coatingoplossing voor dan nodig is; het wordt aanbevolen om ten minste 15% meer te bereiden dan nodig is. - Meng in een buis van 15 ml CMGF+ R/G met de extracellulaire membraanmatrix (1%) en collageen I (1%) en pipetteer voorzichtig.
- Bekleed elke polyester inzetstuk met 100 μL van de coatingoplossing en plaats de inzetstukken gedurende 1 uur in de incubator (37 °C; 5% CO2 atmosfeer).
- Na de incubatie, zuig de coatingoplossing zorgvuldig van elke insert met behulp van een vacuümaspirator of een P1000-pipet, waarbij u voorzichtig bent om het wisselplaatfilter niet te verstoren. Plaats een voorgecoate plaat in de couveuse om warm te blijven.
- Organoïde dissociatie van honden
OPMERKING: Gebruik hondenorganoïden die minstens vier dagen zijn gekweekt. Voordat u met dissociatie begint, raadpleegt u Gabriel et al.38 om te bepalen wanneer een monster gezond, dicht en voldoende is voor experimenten. Het wordt aanbevolen om voor elke putbeplatingsprocedure een extra put organoïden te dissociëren. Bovendien wordt aanbevolen het gewenste aantal inserts met ~ 20% te verhogen om rekening te houden met ongelijke organoïde groei of schade veroorzaakt door onjuiste manipulatie. Als u van plan bent FITC-dextran te gebruiken, bereid dan extra putten voor.- Bereid een ijsemmer en een flacon koude 1x Advanced DMEM/F12 voorraad in de bioveiligheidskast.
- Plaats de extracellulaire membraanmatrix op ijs om te beginnen met ontdooien, dompel het onder in ijs om te beschermen tegen snel ontdooien en stolling te voorkomen. Plaats een doos met pipetpunten (P200) in de vriezer voor het beplaten van de extracellulaire membraanmatrix.
- Prechill een gekoelde centrifuge tot 4 °C.
- Verplaats CMGF+ R/G van de vriezer/koelkast naar een waterbad van 37 °C. Vermijd directe blootstelling aan licht indien mogelijk.
- Verwijder alle medium van de 24-well plaat met organoïde cultuur voor een geschikt aantal putten (1 put van een 24-well plaat per 2-4 inserts) terwijl u ervoor zorgt dat de extracellulaire membraanmatrix niet wordt verstoord.
OPMERKING: Het volume kan variëren, afhankelijk van het gebruikte celtelsysteem. - Voeg 0,5 ml voorgechilleerde celhersteloplossing per put toe om de extracellulaire membraanmatrixkoepels op te lossen.
- Incubeer de plaat in de koelkast (4 °C) gedurende 30 min.
- Pipetteer de suspensie, verzamel alle organoïden en opgeloste extracellulaire membraanmatrix en breng ze over naar een buis van 15 ml.
- Centrifugeer (700 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C) en verwijder het supernatant tot het niveau de 0,5 ml bereikt, waarbij u ervoor zorgt dat de pellet niet wordt verstoord.
- Voeg 1 ml trypsine-achtige protease toe en incubeer gedurende 8 minuten in het waterbad van 37 °C. Veeg de buis meerdere keren tijdens de incubatieperiode om de cellen te mengen.
- Breng de buis met het monster terug naar een bioveiligheidskast en voeg langzaam 7 ml vooraf gechilleerde Advanced DMEM / F12 toe om het trypsine-achtige protease te inactiveren en de celdissociatie te stoppen.
- Prewet een 40 μm celzeef met 1 ml Advanced DMEM/F12. Pipetteer het mengsel voorzichtig en filter de suspensie erdoor; pipet extra Advanced DMEM/F12 om de zeef te spoelen.
- Centrifugeer de buis (700 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Verstoor de pellet niet.
- Resuspensieer de celpellet in ~50-100 μL kweekmedium (CMGF+ R/G) voor elke bron van organoïden die werd gedissocieerd.
- Tel een substeekproef van de suspensie (~10 μL) met behulp van een hemocytometer of een geschikte machine en bepaal het totale celnummer in de suspensie.
- Canine organoïde zaaien
- Verdun of concentreer de celsuspensie om een celconcentratie van ~ 75.000 cellen per ml te verkrijgen.
- Zaad 100 μL van de suspensie in elke insert met behulp van BSA (1%) voorgecoate tips om celhechting tijdens de overdracht te voorkomen. Voeg één gecoate insert toe als een celvrije blanco zonder dat er organoïden groeien terwijl er nog steeds regelmatige mediawijzigingen worden ontvangen.
- Draai de plaat voorzichtig in een cirkelvormige beweging gedurende ~ 30 s om de gezaaide cellen over het inzetstuk te verspreiden. Bevestig via lichtmicroscopie de gelijkmatige verdeling van cellen.
- Voeg 700 μL CMGF + R/G toe aan de basolaterale kamer en plaats de plaat gedurende 24 uur in de incubator (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ).
- Verwijder na 24 uur voorzichtig de celsuspensie uit de apicale kamer en vervang deze door 200 μL CMGF + R/G. Breng de plaat terug naar de incubator.
2. Organoïde cel monolaag onderhoudsprotocol
OPMERKING: In de volgende sectie (stappen 2.1-2.2) wordt het onderhoudsprotocol voor organoïde celmonolagen beschreven. De workflow van procedures die in dit protocol worden gepresenteerd, is samengevat in figuur 4. Een tabel voor het maken van aantekeningen die kan helpen bij de standaardisatie van TEER-waardemetingen is weergegeven in aanvullende tabel 1.
Figuur 4: Workflow van het onderhoud van de doorlatende ondersteuningscultuur. TEER-waarden worden gemeten met behulp van elektroden (sondes) en een volt/ohm-meter. Sondes moeten chemisch worden gesteriliseerd met 70% alcohol voordat ze in de putten worden ingebracht. De lege en organoïde celinzetstukken worden gemeten en TEER-waarden worden berekend. Medium wordt vervolgens ververst in zowel apicale als basolaterale kamers, en de canine organoïde cultuur op de insert wordt gevisualiseerd met behulp van lichtmicroscopie. Scheuren in organoïde cultuur of microporeus membraan worden genoteerd en behandeld volgens het protocol. Afkorting: TEER = transepitheliale elektrische weerstand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- TEER-waardemeting
OPMERKING: TEER-waardemetingen worden uitgevoerd met behulp van een epitheliale volt / ohm-meter met eetstokbevestiging. Raadpleeg de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. TEER-waarden geven informatie over de integriteit van de organoïde monolaag van de hond.- Voer TEER-waardemetingen uit op elke alternatieve dag tijdens de celkweekgroei.
- Verplaats de Epitheliale Volt/Ohm Meter en de bijbehorende elektroden naar de bioveiligheidskast. Steriliseer de elektroden chemisch in 70% alcohol voor gebruik. Stel de functie in op Ohm. Wacht minstens één minuut tot de elektroden droog zijn.
- Voordat u de eerste meting uitvoert, plaatst u de draadelektrode in de poort en schakelt u de stroom in. Zorg ervoor dat de meter 1.000 Ω weergeeft met de draadelektrode-insert in plaats van eetstokjes te meten. Als dit niet het geval is, past u het apparaat aan.
- Plaats de elektroden in de apicale en basolaterale kamer van de celvrije insert (blanco), zodat de apicale kamer de kortere elektrode bevat en de basolaterale kamer de langere elektrode (zoals te zien in figuur 4). Raak het membraan niet aan, maar zorg er tegelijkertijd voor dat de elektroden in het medium worden ondergedompeld.
- Wacht een paar seconden totdat de waarde stabiliseert en noteer de waarde in een labboek. Meet de resterende organoïde monolagen van honden en zorg ervoor dat u de elektroden steriliseert met 70% alcohol bij het meten van verschillende monsters. Zorg ervoor dat u de organoïde monolaag niet aanraakt met de elektrode.
- Nadat de metingen zijn uitgevoerd, steriliseert u de elektroden voor de laatste keer met 70% alcohol. Zorg ervoor dat u ze beschermt tegen schade veroorzaakt door ongepaste manipulatie en bewaar ze volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereken de TEER-waarden voor elke put met behulp van Eq (1), waarbijR-monster enR-blanco de ohm-waarden (Ω) zijn van respectievelijk de monolaag en lege putten, en het oppervlak (cm²) dat van de insert is.
(1)
- Monolayer onderhoud
OPMERKING: Bekijk het aanbevolen plan voor middelgrote wijzigingen in tabel 2.- Gebruik steriele wegwerp 9" Pasteur pipetten en een vacuüm aspirator, aspirateereer voorzichtig het medium uit de apicale en vervolgens de basolaterale kamers. Kantel de plaat om het mediumoppervlak duidelijk te zien. Vermijd aspiratie te dicht bij het microporeuze membraan in de apicale kamer om schade aan de celmonolaag te voorkomen.
OPMERKING: Gebruik een nieuwe Pasteur-pipet wanneer u tussen monsters beweegt. Pipetten zijn ook een mogelijke vervanging voor deze procedure. - Voeg langzaam CMGF + R / G toe met behulp van P1000-pipetten gericht op een wand van de apicale of basolaterale kamer. Voer de mediumverandering in de apicale kamer zeer zorgvuldig uit om te voorkomen dat de monolaag wordt beschadigd.
- Controleer de putten om de dag onder een lichtmicroscoop, evalueer de gezondheid van de cultuur en controleer op scheuren in de organoïde monolaag of het microporeuze membraan. Gebruik fasecontrastmicroscopie om details van de cultuur te benadrukken.
OPMERKING: In het geval van canine organoïde monolaagscheuren krijgt de monolaag de tijd om te herstellen en opnieuw te groeien. In het geval van microporeuze membraanscheuren moet de put worden uitgesloten van het experiment.
- Gebruik steriele wegwerp 9" Pasteur pipetten en een vacuüm aspirator, aspirateereer voorzichtig het medium uit de apicale en vervolgens de basolaterale kamers. Kantel de plaat om het mediumoppervlak duidelijk te zien. Vermijd aspiratie te dicht bij het microporeuze membraan in de apicale kamer om schade aan de celmonolaag te voorkomen.
(1)Tabel 2: Aanbevelingen voor mediaverandering voor organoïde culturen. CMGF+ R/G wordt om de dag op elke andere dag vervangen in de apicale en basolaterale kamer van de putten. De langere kweekperiode in het weekend vereist een verhoogd volume van medium in zowel basolaterale als apicale kamers, dat op een vrijdagmiddag wordt aangebracht en op maandag wordt gewijzigd. Afkortingen: ROCK = rho-associated kinase; GSKiβ = glycogeensynthase kinase bèta; CMGF + R/G = Compleet medium met groeifactoren versterkt met ROCK-remmer en GSKiβ. Klik hier om deze tabel te downloaden.
3. Experimenteel protocol voor permeabiliteit
OPMERKING: In de volgende sectie (stappen 3.1-3.5) wordt het experimentele protocol voor permeabiliteit beschreven. De experimentele protocolworkflow om de in vitro permeabiliteit van een geneesmiddel te meten is samengevat in figuur 5.
Figuur 5: Workflow van het experimentele protocol. Organoïde medium moet worden veranderd van CMGF + R / G naar CMGF + tussen acht en twaalf dagen na het zaaien van de inserts, waardoor cellulaire differentiatie mogelijk is. Na het veranderen van het medium (zowel apicale als basolaterale) in CMGF +, zouden de TEER-waarden nog steeds moeten toenemen, waarbij de canine organoïde monolaag bijna samenvloeiing bereikt. Ten minste vier dagen nadat het medium is veranderd in CMGF+, wordt de gereedheid van de monolagen geëvalueerd. Wanneer de monolaag volledig is gevormd en de TEER-waarden een plateaufase bereiken (meestal tussen 1.500 en 2.500 Ω,cm2), wordt het medium gedurende 30 minuten vervangen door de transportbuffer om de monolaag in staat te stellen zich aan te passen aan de nieuwe omgeving. Op het moment 0 minuten van het experiment wordt de FITC-dextran-test uitgevoerd en wordt het basolaterale monster van 20 minuten verzameld. De resultaten worden vervolgens geanalyseerd op een plaatlezer. Na het experiment worden de apicale en basolaterale kamerinhoud opnieuw gewijzigd in CMGF+ en worden TEER-waardemetingen uitgevoerd. De monolagen worden gedurende 24 uur geïncubeerd en de integriteit van de monolaag wordt beoordeeld door herhaalde TEER-metingen. Afkortingen: TEER = transepitheliale elektrische weerstand; ROCK = rho-geassocieerd kinase; GSKiβ = glycogeensynthase kinase bèta; CMGF + R/G = Compleet medium met groeifactoren versterkt met ROCK-remmer en GSKiβ; CMGF+ = Compleet medium met groeifactoren maar zonder ROCK-remmer of GSKiβ; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; F = fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Evaluatie van de gereedheid van organoïde monolagen
OPMERKING: Deze stap vindt plaats 8-14 dagen na het zaaien.- Controleer de monolaag minstens om de dag onder de lichtmicroscoop (gebruik fasecontrast om de integriteit van de monolaag te visualiseren). Ga verder met de volgende stap wanneer de celmonolaag volledig is gevormd zonder openingen of duidelijke tekenen van tranen.
- Verander het organoïde medium van CMGF+ R/G naar CMGF+ (met uitzondering van ROCK-remmer en GSKiβ van de mediumsamenstelling). Het wordt aanbevolen om het medium ten minste vier dagen voorafgaand aan het experiment te verwisselen.
OPMERKING: Deze stap maakt een juiste differentiatie van de organoïde monolaag mogelijk. - Ga ongeveer om de dag door met het meten van TEER-waarden. Wanneer teer-waarden beginnen te plateau op ongeveer 1.500 tot 2.000 Ω × cm² (figuur 6), meet u elke dag de TEER-waarden.
OPMERKING: Deze steady state kan ongeveer 2-3 dagen worden gehandhaafd, wat het optimale tijdvenster is om permeabiliteitstests uit te voeren (meestal op dag 11 tot 13). De plateau TEER-waarden kunnen enigszins oscilleren op basis van de intestinale lokalisatie van de organoïden, meettemperatuur, ras, leeftijd en ziektetoestand van de hond. - Plan de permeabiliteitstest van het geneesmiddel onmiddellijk om een snelle daling van de TEER-waarden of overgroei van de organoïde monolaag naar meerdere cellagen te voorkomen.
- Voorbereiding op het experiment
OPMERKING: Incubator shakers kunnen tijdens het experiment worden gebruikt om de effecten van de niet-gestineerde waterlaag te voorkomen. Meet TEER-waarden bij consistente temperaturen.- Meet op de dag van het experiment de TEER-waarden en bevestig dat de waarden een stabiele toestand hebben bereikt en niet snel afnemen.
- Kies de beste monolagen (via lichtmicroscopie en TEER-waarden) uit het overschot van 20% inserts om het experiment uit te voeren.
- Observeer de monolagen onder een lichtmicroscoop en sluit onvolledige, gescheurde of overwoekerde organoïde monolagen uit.
- Bereid de transportbuffer voor en pas de pH aan de gewenste waarden aan.
OPMERKING: De samenstelling van de experimentele buffer verschilt op basis van de experimentele opstelling. Een veelgebruikte buffer bestaat uit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), glucose (12,5 mM) en 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES, 25 mM). Deze samenstelling zorgt voor de levensvatbaarheid van organoïde cultuur tijdens een experiment. - Aspirateer het medium zorgvuldig uit de apicale en basolaterale kamers van de geselecteerde putten.
- Voeg 200 μL transportbuffer toe aan de apicale kamer en 800 μL aan de basolaterale kamer.
OPMERKING: Transportbuffer moet eerst worden toegevoegd aan de apicale kamer en vervolgens aan de basolaterale kamer om loslating van de monolaag van het microporeuze membraan te voorkomen. - Plaats de plaat gedurende 30 minuten in de incubator (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ) om in evenwicht te komen.
OPMERKING: De canine organoïde monolagen zijn nu klaar voor het geneesmiddeldoorlaatbaarheidsexperiment.
- Typische experimentele lay-out-IgY concentratie oplossing
OPMERKING: Het experimentele ontwerp en de lay-out kunnen veranderen afhankelijk van de onderzoeksvraag. De permeabiliteit van immunoglobuline Y (IgY) via een organoïde monolaag wordt in het protocol als voorbeeld gebruikt en kan worden gewijzigd. De term donorkamer verwijst naar de kamer waar het medicijn in eerste instantie wordt toegepast, terwijl de ontvangende kamer verwijst naar de kamer die het medicijn uit de donorkamer accepteert. Een typisch experiment verzamelt monsters in de ontvangstkamers gedurende 2 uur (bijv. 15, 30, 60, 90, 120 min).- Bereid de IgY-oplossing (medicijn of opgeloste stof naar keuze) door deze in de transportbuffer op te lossen tot de gewenste eindconcentratie. Bereid meer medicijnoplossing dan nodig is.
OPMERKING: Geneesmiddelen met een lage oplosbaarheid in water kunnen eerst worden opgelost in een organisch oplosmiddel (bijv. ethanol, DMSO) voordat ze aan de buffer worden toegevoegd. De uiteindelijke concentratie van het oplosmiddel moet lager zijn dan 1% om de celmonolaag niet te beschadigen. - Verwijder de buffer uit de donorkamer (apicale of basolaterale kamer) van elk putje.
- Voeg de IgY-oplossing (geneesmiddeloplossing) toe aan alle donorkamers. Gebruik de resterende oplossing als de tijd 0 donoroplossing voor de meting van de initiële geneesmiddelconcentratie.
- Verwijder op de vereiste tijdstippen 50 μL uit de ontvangstkamer en plaats deze in een gelabelde buis. Verwijder op het laatste tijdstip een monster uit de donorkamer. Breng aan het einde van het experiment de donor- en ontvanger aliquots over naar een vriezer van -20 °C.
OPMERKING: Als er veel tijdspunten nodig zijn, kan vervanging van de buffer in de ontvangstkamer worden uitgevoerd, maar moet rekening worden gehouden met de berekening van de schijnbare permeabiliteit. De concentratie in de ontvangstkamer mag aan het einde van het experiment niet meer dan 10% van de donorkamer bereiken om de gootsteencondities te handhaven44.
- Bereid de IgY-oplossing (medicijn of opgeloste stof naar keuze) door deze in de transportbuffer op te lossen tot de gewenste eindconcentratie. Bereid meer medicijnoplossing dan nodig is.
- Organoïde cel monolaag kwaliteitscontrole
OPMERKING: FITC-dextran-oplossing kan worden gebruikt om de integriteit van de monolaag tijdens het experiment te bevestigen. FITC-dextran wordt gebruikt als voorbeeld van een monolayer integrity assay. Anderen omvatten Lucifer geel, PEG-4000, radioactief gelabeld mannitol en inuline44.- Aspirateer op tijdstip 0 min de inhoud van de apicale kamer en vervang door 250 μL FITC-dextran-oplossing (5 mg/ml, 4 kDa) in drievoud voor elke experimentele groep.
OPMERKING: Stel FITC-dextran niet bloot aan licht. - Verwijder na 20 min de buffer uit de basolaterale kamer.
- Meet de fluorescentie-intensiteit van het basolaterale monster met behulp van een fluorescentieplaatlezer (gebruik een kalibratiecurve; excitatie ingesteld op 485 nm en emissiewaarde op 528 nm).
OPMERKING:P-app van FITC kan ook worden berekend met behulp van de methode die in de discussie wordt beschreven. - Nadat het experiment is afgerond, zuigt u zorgvuldig overtollige buffer op uit de apicale en basolaterale kamers.
- Voeg 200 μL CMGF+ toe in de apicale kamer en 700 μL aan de basolaterale kamer.
- Meet TEER-waarden in de afzonderlijke putten.
- Plaats de plaat gedurende 24 uur in de incubator (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ).
- Meet, indien van toepassing, na 24 uur teER-waarden om mogelijke schade aan de monolaag tijdens het kwaliteitscontrolegedeelte van het experiment te beoordelen. Gebruik lichtmicroscopie om de integriteit van de canine organoïde monolaag te visualiseren.
- Aspirateer op tijdstip 0 min de inhoud van de apicale kamer en vervang door 250 μL FITC-dextran-oplossing (5 mg/ml, 4 kDa) in drievoud voor elke experimentele groep.
- Bevestiging van celmonolagen voor downstream-analyse
- Bereid formaline-azijnzuur-alcoholoplossing (FAA, samenstelling in tabel 1).
- Verwijder de transportbuffer of CMGF+ uit de apicale en basolaterale kamers met behulp van een P1000-pipet of steriele wegwerp 9" Pasteur-pipetten en een vacuümaspirator.
- Vul de apicale en basale kamers met FAA.
- Na 24 uur ademt u de FAA op en vervangt u deze door 70% ethanol.
- Wikkel de plaat met flexibele laboratoriumfilm om verdamping te voorkomen en ga verder met het blokkeren van de bereiding.
Figuur 6: TEER-waarden voor experimentele groepen. TEER-waarden werden gemeten in vijf groepen intestinale organoïde monolagen bij honden. Drie groepen waren samengesteld uit canine jejunal enteroids en twee groepen bestonden uit colonoïden. Elke groep omvatte 12 tot 22 replicaties. De TEER-waarden voor jejunale enteroïde culturen worden weergegeven van dag 4 tot dag 14 en colonoïdeculturen worden getoond van dag 4 tot dag 12 (metingen eindigden toen de organoïde monolaag steady-state waarden bereikte, wat aangeeft dat de monolaag klaar was voor experimenteel gebruik). Foutbalken drukken SEM van de metingen uit. Afkorting: TEER = transepitheliale elektrische weerstand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
Standaard operationele procedures voor de kweek van hondenorganoïden werden eerder beschreven33, en het Canine Organoid Protocol is ook in detail besproken in dit speciale nummer38. Canine intestinale organoïden gekweekt op permeabele steunen werden gefixeerd en paraffine-ingebed om de microanatomie van de monolaag en de celpopulaties te onderzoeken. Het paraffine-inbeddingsproces werd eerder besproken door Gabriel et al.38. Routinematige kleuring (hematoxyline en eosine) is uitgevoerd en de Alcian Blue-kleuringstechniek werd gebruikt om bokaalcellen in de canine organoïde monolaag te detecteren (zie figuur 7).
Figuur 7: Canine intestinale organoïde monolayer kleuring. Canine intestinale organoïden van colonoorsprong in de permeabele ondersteuning zijn paraffine-ingebed en gekleurd met H &E en AB. Representatieve beelden werden genomen met behulp van lichtmicroscopie bij 40x (A) en 60x (B) vergroting. H &E-kleuring onthult een kolomvormige epitheliale monolaag en de microvilli in het apicale deel van de cellen kan worden waargenomen bij 60x vergroting. AB-kleuring onthult verder de aanwezigheid van bokaalcellen (donkerblauw) in de canine intestinale organoïde monolaag. Schaalstaven = 20 μm (A), 50 μm (B). Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; AB = Alcian Blauw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De organoïde cultuur op de permeabele steun moet gedurende 10 tot 14 dagen worden gekweekt om klaar te zijn voor een permeabiliteitsexperiment. Lichtmicroscopie wordt gebruikt in combinatie met TEER-waardemetingen om de gereedheid van de organoïde cultuur voor permeabiliteitstests van kandidaat-geneesmiddelen te bevestigen. Representatieve lichtmicroscopische beelden van verschillende canine intestinale organoïde monolagen van gezonde en zieke dieren zijn weergegeven in figuur 8.
Figuur 8: Canine intestinal organoid monolayer microscopie. Beelden van groeiende monolagen zoals gezien onder lichtmicroscopie. Organoïde monolagen afgeleid van gezonde donoren worden vertegenwoordigd door jejunale enteroïde (10x; 40x) en colonoïde (20x; 40x) culturen. Organoïde monolagen van zieke donoren worden vertegenwoordigd door duodenale (5x; 10x) en ileale (5x; 10x) enteroïden afgeleid van een hond met de diagnose PLE. Beide PLE-organoïde culturen zijn voorbeelden van onjuiste celisolatie tijdens het zaaien van organoïden, en deze culturen konden niet worden gebruikt voor medicijndoorlaatbaarheidstests vanwege de aanwezigheid van 3D-organoïden. Voorbeelden van afwijkingen van de juiste monolaagvorming, zoals monolaagscheuren (5x), worden veroorzaakt door onzorgvuldige manipulatie van de biologische monsters. De langdurige kweek van organoïden (10x; 20x) wordt veroorzaakt door het lange onderhoud van de organoïden op het insert wanneer de organoïden beginnen te lijken op hun oorspronkelijke 3D-structuur. Ter vergelijking worden afbeeldingen van traditionele 2D-cellijnen op de permeabele dragers gepresenteerd die vaak worden gebruikt voor geneesmiddelendoorlaatbaarheidsstudies (MDCK-10x; 40x en Caco-2-10x; 20x). Afkortingen: PLE = eiwit-verliezende enteropathie; MDCK = Madin-Darby hondennier. Schaalstaven = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Organoïde monolagen werden ook gefixeerd in 3% Paraformaldehyde-3% Glutaaraldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werd gebruikt om de ultrastructuur van de organoïde cultuur op de doorlatende steunen te karakteriseren. Microanatomische structuren van microvilli en tight junctions zijn te zien in figuur 9.
Figuur 9: TEM-beelden van gezonde intestinale organoïde monolagen bij honden. TEM werd gebruikt om de cellulaire microarchitectuur van jejunale (A), ileale (B) en colon (C) organoïde monolagen te onthullen. Het microporeuze membraan van het doorlatende steunelement is gemarkeerd met een gele pijl. De aanwezigheid van microvilli (blauwe pijl) en tight junctions (rode pijl) wordt in de beelden afgebakend. Afkorting: TEM = Transmissie elektronenmicroscopie. Schaalstaven = 5 μm (A), 2 μm (B, C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zowel TEER-metingen als lichtmicroscopie moeten worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het systeem klaar is voor permeabiliteitstests. De test is klaar voor gebruik wanneer TEER een stabiele toestand bereikt, terwijl lichtmicroscopie zal helpen om schade of overgroei van de organoïden uit te sluiten. Een samenvatting van typische TEER-metingen van vijf groepen bestaande uit jejunale enteroïden en colonoïden bij honden is weergegeven in figuur 6.
Tabel 1: Samenstelling van organoïde media en FAA. De volledige samenstelling van CMGF+, CMGF+ R/G en FAA zijn samengevat in deze tabel. Afkortingen: ROCK = rho-associated kinase; GSKiβ = glycogeensynthase kinase bèta; CMGF + R/G = Compleet medium met groeifactoren versterkt met ROCK-remmer en GSKiβ; CMGF+ = Compleet medium met groeifactoren maar zonder ROCK-remmer of GSKiβ; FAA = formaline-azijnzuur-alcohol; EFG =epidermale groeifactor. Deze tabel is aangepast van 38. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Tabel voor het maken van aantekeningen op hondenorganoïde het permeabele ondersteuningssysteem. Afkortingen: TEER = transepitheliale elektrische weerstand; ROCK = rho-geassocieerd kinase; GSKiβ = glycogeensynthase kinase bèta; CMGF + R/G = Compleet medium met groeifactoren versterkt met ROCK-remmer en GSKiβ; CMGF+ = Compleet medium met groeifactoren maar zonder ROCK inhibitor of GSKiβ. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Canine intestinale organoïde culturen in het permeabele ondersteuningsapparaat zijn een uniek concept dat traditionele geneesmiddeldoorlaatbaarheidstests40 verbindt met een nieuw in vitro hondenmodel41. Verschillende soorten canine intestinale organoïden kunnen worden gebruikt en geëvalueerd op basis van het doel van het experiment met minimale aanpassingen. Het testen van meerdere concentraties van het medicijn van belang in 3-4 putten per groep wordt aanbevolen. De concentraties kunnen gebaseerd zijn op de verwachte darmconcentratie van het geneesmiddel. Bovendien kan het gebruik van eerder onderzoek helpen bij het bepalen van geschikte tijdstippen voor de onderzoeksopzet. Passende documentatie van de onderzoeksopzet moet worden gemaakt om de repliceerbaarheid te vergroten en te helpen bij het oplossen van problemen.
Deze technologie heeft verschillende beperkingen vanwege de nieuwheid van de methode42, vooral vanwege het gebrek aan standaardisatie in experimenteel ontwerp en uitvoering van het protocol in laboratoria. Dit gebrek aan standaardisatie is erkend door andere groepen43, en de Canine 3D Organoid Monolayer Protocols zullen leiden tot interlaboratoriumreproduceerbaarheid en standaardisatie introduceren in dit systeem. Gestandaardiseerde benaderingen van gegevensanalyse verbeteren de repliceerbaarheid en kunnen de resultaten van voorlopige drugstests met behulp van de hondenorganoïden in het permeabele ondersteuningssysteem in verschillende laboratoria versterken. Het canine 3D organoïde model mist ook datasets die in vitro Papp-waarden van modelgeneesmiddelen vergelijken met hun bekende menselijke of canine in vivo intestinale absorptie, net als Caco-2-cellen 44,45,46. Zodra dergelijke gegevens zijn gegenereerd, kan dit canine organoïde model worden gebruikt om de darmdoorlaatbaarheid tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen te beoordelen.
Het is van cruciaal belang dat er bij het zaaien van de organoïden op het permeabele ondersteuningssysteem op wordt gelet op het zaaien van een voldoende hoge dichtheid van op de juiste manier gedissocieerde cellen. De TEER-waarden van het systeem zijn betrouwbaarder en reproduceerbaarder wanneer ze in strikte monolagen worden gekweekt. Langdurige kweek van de monolagen kan leiden tot een exponentiële toename van TEER-waarden die verder reiken dan de fysiologische waarden van de darm. H & E-secties van dergelijke 3D-structuren tonen vervolgens verschillende lagen cellen boven elkaar met veranderde structuren van enterocyten dichter bij het membraan.
Na succesvolle uitbreiding van de canine intestinale organoïde monolaag, kunnen de resultaten op dezelfde manier worden geanalyseerd als traditionele 2D-celtests door de schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt (Papp) formule44 van een geneesmiddel te berekenen. DeP-appwaarde (zie Eq (2)) beschrijft de transportsnelheid over de cellulaire monolaag47.
(2)
De 
is de beginhelling van de concentratie ten opzichte van de tijdcurve (bijvoorbeeld nmol/s). A is het gebied van de insert (cm2) en C0 is de beginconcentratie van het geneesmiddel of de verbinding in de donorkamer37. Betrouwbare herkenning van monolaagintegriteit is een cruciaal onderdeel van de permeabiliteitstest die standaardisatie vereist. Lichtmicroscopie en TEER-metingen worden aanbevolen om hondenorganoïden in een doorlaatbaar ondersteuningssysteem te beoordelen en de juiste timing van het experiment te helpen bepalen. Bovendien kunnen nul moleculaire permeabiliteitsmarkers (bijv. FITC-dextran, Lucifer yellow, PEG-400) worden gebruikt om de integriteit van organoïde monolagen functioneel te evalueren. Er moet op worden gelet of de geteste verbinding wordt aangetast door een transporteur. P-glycoproteïne (P-gp) wordt gebruikt als een veel voorkomend voorbeeld van een effluxpomp. Er moet een effluxverhouding worden gegenereerd (P-app, BL-AP / P-app, AP-BL) met vergelijking met een bekend P-gp-sondesubstraat.
Lichtmicroscopie (gewoon of verbeterd met fasecontrast) is een methode van onschatbare waarde om te controleren op de integriteit van de 2D- of 3D-monolaag en het filterinzetstuk bij het beoordelen van mogelijke cellulaire overgroei. Figuur 7 kan dienen als een gids voor het herkennen van gezonde intestinale intestinale organoïde celculturen bij honden. TEER-waarden zijn een belangrijke maat voor de vorming van intercellulaire juncties en differentiatie van de organoïde culturen in een intact darmepitheel. De intestinale organoïden van de hond differentiëren tot enterocyten en bokaalcellen (figuur 6). Deze slijmproducerende cellen maken de studie van geneesmiddel-slijminteracties mogelijk, wat moeilijk te bereiken is met behulp van traditionele 2D-celculturen48. De aanwezigheid van entero-endocriene cellen is eerder bevestigd in intestinale organoïden van honden door Chandra et al.33.
Verdere karakterisering van de canine organoïde monolagen afgeleid van jejunale, ileale en colonorganoïden met behulp van TEM wordt verstrekt. TEM-afbeeldingen tonen cellulaire microarchitectuur, inclusief tight junctions en microvilli-vorming, wat de complexiteit en bruikbaarheid van deze organoïde modellen in de translationele geneeskunde verder illustreert. Op basis van de experimentele resultaten waren de organoïde culturen op de doorlatende drager klaar voor experimenten tussen dag 11 en dag 13 na het zaaien (figuur 9). De TEER-waarden varieerden op dit moment tussen 1.500 en 2.500 Ω,cm2. De plateaufase van TEER-waarden duurt een zeer beperkt tijdsbestek waarin het experiment moet worden gestart voordat de TEER-waarden langzaam beginnen af te nemen. TEER-waarden kunnen ook een cruciaal onderdeel zijn van het weergeven van belangrijke experimentele resultaten, omdat sommige geneesmiddelen of hulpstoffen van geneesmiddelen kunnen interageren met de monolaag (bijv. tight junctions), wat een grote invloed kan hebben op teer-waarde-uitlezingen. Dit alleen al kan dienen als gegevens voor een experiment.
Canine intestinale organoïden in een celkweekapparaat met twee kamers kunnen worden toegepast op andere gebieden dan orale geneesmiddeldoorlaatbaarheid vanwege de unieke architectuur van de resulterende celmonolaag. Ze kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in microbiologisch onderzoek (bijvoorbeeld de impact van het veranderen van gi-microbiële flora), virale opnamestudies, geneesmiddel-geneesmiddelinteracties en mechanismen voor medicijntransport49. De donorkamer is meestal gevuld met het testgeneesmiddel of de verbinding van keuze en aliquots uit de ontvangstkamer worden op verschillende tijdstippen genomen. Deze aliquots kunnen worden geanalyseerd met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie, massaspectrometrie, enzymgebonden immunosorbenttest of andere technieken om de hoeveelheid en snelheid te bepalen waarmee de opgeloste stof door de monolaag dringt.
Deze studies vereisen een intacte monolaag om de permeabiliteit van geneesmiddelen nauwkeurig te beoordelen. Dit vereist meestal groeiende monolagen die groter zijn dan die nodig zijn om rekening te houden met onbruikbare putten. Organoïde cel monolagen kunnen ook worden gebruikt om virale opname te meten, hetzij van de apicale of basale kant van een monolaag, met uitlezingen waaronder immunofluorescentie-assays- gebruikmakende antilichamen om de cellulaire opname van het virus te detecteren. Ten slotte kunnen meerdere geneesmiddelen (d.w.z. substraat en remmer) op de donorkamer worden aangebracht om op transporter gebaseerde geneesmiddel-geneesmiddelinteracties te identificeren.
Op basis van de huidige waarnemingen zullen deze methoden niet alleen toepasbaar zijn op hondenorganoïden in kweekinzetstukken, maar ook geschikt zijn voor andere veterinaire soorten en orgaansystemen, met kleine aanpassingen die nodig zijn om het beste bij de soort of het orgaanmodel van keuze te passen. Protocollen voor de intestinale organoïde groei van honden moesten worden aangepast op basis van de unieke eigenschappen van de cultuur. Het protocol kan dus worden aangepast aan een andere soort, maar vereist subtiele wijzigingen in het protocol. Modificaties kunnen beginnen met veranderingen in de dichtheid van het zaaien van cellen en zich uitbreiden tot veranderingen in de mediasamenstelling om de organoïden van belang goed te differentiëren.
De standaardisatie, gedetailleerde documentatie van experimentele procedures en consistente monitoring van de celmonolagen zijn cruciale praktijken die nodig zijn voor de doorlaatbare ondersteuningstests en zijn niet beperkt tot het hondensysteem. Deze mogelijke soorten of orgaanmodificaties zijn van cruciaal belang om te documenteren en te rapporteren voor verdere vooruitgang in het veld. Dit model heeft verschillende beperkingen, bijvoorbeeld de kostenvereisten, interlaboratoriumvariabiliteit en beperkte gegevens over het vermogen om intestinale absorptie in vivo te voorspellen. Honden bezitten in sommige gevallen andere medicijntransporters en metaboliserende enzymen dan mensen50.
Verder moet het organoïde systeem voor honden worden getest op een verscheidenheid aan andere apparaten met twee kamers van andere fabrikanten om de geschiktheid van een dergelijk model te bepalen (de geschiktheid van verschillende filtermembraansamenstellingen moet bijvoorbeeld worden bepaald). Een ander nadeel is dat het medicijndoorlaatbaarheidsexperiment van het manuscript minder beschrijvend is dan de vorige delen. Dit wordt veroorzaakt door een overdaad aan informatie op dit gebied. Het doel van dit deel van het manuscript was om deze methoden op een aanpasbare manier te beschrijven zonder de randen van de hoekstenen van deze experimenten te snijden. Meer gedetailleerde informatie over permeabiliteitsexperimenten is verzameld door Hubatsch et al.37. Bovendien kunnen permeabele inserts worden gebruikt in cocultuur-, celmigratie- en invasietestexperimenten4.
Kortom, de canine intestinale organoïden in kweekapparatuur met twee kamers hebben het potentieel om te worden gebruikt in een breed scala aan toepassingen, waaronder biomedische velden en translationele geneeskunde, om er maar een paar te noemen. De protocollen creëren verschillende strategieën om een experiment te plannen en de betrouwbaarheid van interlaboratoriumgegevens voor organoïde modellen op het gebied van biologie te bevorderen.
Disclosures
K. Allenspach is mede-oprichter van LifEngine Animal Health en 3D Health Solutions. Ze is consultant voor Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics en Mars. J.P. Mochel is mede-oprichter van LifEngine Animal Health en 3D Health Solutions en fungeert als consultant voor Ceva Animal Health en Ethos Animal Health. Dit artikel weerspiegelt de standpunten van de auteurs en mag niet worden geïnterpreteerd als de goedkeuring, mening of het beleid van de Food and Drug Administration. Andere auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.
Acknowledgments
We willen onze dank uitspreken aan de medewerkers van het Veterinary Diagnostic Laboratory of Iowa State University, namelijk Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green en Jennifer Groeltz-Thrush, voor de tijdige verwerking van monsters. We willen ook Jodi Smith en Bethann Valentine bedanken voor het leveren van materiaal voor de permeabiliteitsexperimenten. We willen ook David Diaz-Reganon bedanken voor zijn hulp bij Figuur 9. Met uitzondering van figuur 6 zijn alle figuren in BioRender.com gemaakt. De auteurs willen de steun erkennen van de Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award en NSF SBIR subaward naar ISU # 1912948.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid media | |||
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (trimethoprim sulfate) | Sigma | T7883-5G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous | Acros Organics | 170080010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-Dextran | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Materials and Equipment | |||
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 9" Pasteur Pipets | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning | 3470 | Permeable Support |
| Millicell ERS (Probes) | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 Voltohmmeter | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Flexible Laboratory Film |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments JoVE. (80), e50638 (2013).
- Youhanna, S., Lauschke, V. M. The Past, present and future of intestinal in vitro cell systems for drug absorption studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (1), 50-65 (2021).
- Belic, S., et al. Comparative analysis of inflammatory cytokine release and alveolar epithelial barrier invasion in a transwell®bilayer model of mucormycosis. Frontiers in Microbiology. 3204, 3204 (2019).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51046 (2014).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411 (2019).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- Natoli, M., Leoni, B. D., D’Agnano, I., Zucco, F., Felsani, A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicology in Vitro. 26 (8), 1243-1246 (2012).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Chandler, M., et al. Obesity and associated comorbidities in people and companion animals: a One Health perspective. Journal of Comparative Pathology. 156 (4), 296-309 (2017).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Galeta, P., Lázničková-Galetová, M., Sablin, M., Germonpré, M. Morphological evidence for early dog domestication in the European Pleistocene: New evidence from a randomization approach to group differences. Anatomical Record. 304 (1), 42-62 (2021).
- Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 14 (3), 140-162 (2018).
- Allenspach, K., Wieland, B., Gröne, A., Gaschen, F. Chronic enteropathies in dogs: Evaluation of risk factors for negative outcome. Journal of Veterinary Internal Medicine. 21 (4), 700-708 (2007).
- Wang, J., et al. Proliferative and invasive colorectal tumors in pet dogs provide unique insights into human colorectal cancer. Cancers. 10 (9), 330 (2018).
- Gillespie, V., Baer, K., Farrelly, J., Craft, D., Luong, R. Canine gastrointestinal stromal tumors: Immunohistochemical expression of CD34 and examination of prognostic indicators including proliferation markers Ki67 and AgNOR. Veterinary Pathology. 48 (1), 283-291 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: the One Health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Artursson, P., Palm, K., Luthman, K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 22 (1-2), 67-84 (1996).
- Balimane, P. V., Han, Y. H., Chong, S. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal. 8 (1), 1-13 (2006).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Calcagno, A. M., Ludwig, J. A., Fostel, J. M., Gottesman, M. M., Ambudkar, S. V. Comparison of drug transporter levels in normal colon, colon cancer, and caco-2 cells: Impact on drug disposition and discovery. Molecular Pharmaceutics. 3 (1), 87-93 (2006).
- Hilgendorf, C., et al. Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metabolism and Disposition. 35 (8), 1333 (2007).
- Seithel, A., Karlsson, J., Hilgendorf, C., Björquist, A., Ungell, A. L. Variability in mRNA expression of ABC- and SLC-transporters in human intestinal cells: Comparison between human segments and Caco-2 cells. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (4), 291-299 (2006).
- Volpe, D. A. Transporter assays as useful in vitro tools in drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 11 (1), 91-103 (2016).
- Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS ONE. 16 (10), 257824 (2021).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Thummel, K. E., et al. Transcriptional control of intestinal cytochrome P-4503A by 1α,25-dihydroxy vitamin D3. Molecular Pharmacology. 60 (6), 1399-1406 (2001).
- Kodama, N., et al. Characteristic analysis of intestinal transport in enterocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Drug Metabolism and Disposition. 44 (10), 1662-1667 (2016).
- Akazawa, T., et al. Application of intestinal epithelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells for studies of prodrug hydrolysis and drug absorption in the small intestine. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 46 (11), 1497-1506 (2018).
- Lo, B., Parham, L. Ethical issues in stem cell research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (179), e63515 (2022).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
- van Breemen, R. B., Li, Y. Caco-2 cell permeability assays to measure drug absorption. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1 (2), 175-185 (2005).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Olivatti, T. O. F., Alcantara, G. P., Lemos, A. C. C. E., Silva, M. G., Miot, H. A. Standardization of organoid culture for evaluation of melanogenesis induced by UVB, UVA and visible light. Anais Brasileiros de Dermatologia. 95 (1), 46-51 (2020).
- Volpe, D. A., et al. Classification of drug permeability with a Caco-2 cell monolayer assay. Clinical Research and Regulatory Affairs. 24 (1), 39-47 (2007).
- Chen, C., Ma, M. G., Fullenwider, C. L., Chen, W. G., Sadeque, A. J. M. Biopharmaceutics permeability classification of lorcaserin, a selective 5-hydroxytryptamine 2C agonist: Method suitability and permeability class membership. Molecular Pharmaceutics. 10 (12), 4739-4745 (2013).
- Jarc, T., et al. Demonstrating suitability of the Caco-2 cell model for BCS-based biowaiver according to the recent FDA and ICH harmonised guidelines. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (8), 1231-1242 (2019).
- Newby, D., Freitas, A. A., Ghafourian, T. Decision trees to characterise the roles of permeability and solubility on the prediction of oral absorption. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 751-765 (2015).
- Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS ONE. 8 (7), 68761 (2013).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Martinez, M. N., Mochel, J. P., Neuhoff, S., Pade, D. Comparison of canine and human physiological factors: understanding interspecies differences that impact drug pharmacokinetics. The AAPS Journal. 23 (3), 59 (2021).
