Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Kultur der Darmorganoide von Hunden in einem durchlässigen Zweikammer-Stützsystem beschreibt. Die organoide Aussaat in den durchlässigen Trägern, die Monolayer-Wartung und nachfolgende Wirkstoffpermeabilitätsexperimente werden beschrieben.
Abstract
Das permeable Trägersystem wird typischerweise in Verbindung mit traditionellen zweidimensionalen (2D) Zelllinien als In-vitro-Werkzeug zur Bewertung der oralen Permeabilität neuer therapeutischer Wirkstoffkandidaten verwendet. Die Verwendung dieser konventionellen Zelllinien hat jedoch Einschränkungen, wie die veränderte Expression von Tight Junctions, die partielle Zelldifferenzierung und das Fehlen wichtiger Kernrezeptoren. Trotz dieser Mängel sind die Caco-2- und MDCK-Modelle weithin akzeptiert und für die Vorhersage der oralen Permeabilität des Menschen in vivo validiert.
Hunde sind aufgrund ihrer Ähnlichkeiten in der gastrointestinalen Anatomie und der Darmflora mit dem Menschen ein relevantes translationales Modell für die biomedizinische Forschung. Dementsprechend und zur Unterstützung der parallelen Arzneimittelentwicklung ist die Ausarbeitung eines effizienten und genauen In-vitro-Tools zur Vorhersage von In-vivo-Arzneimittelpermeabilitätseigenschaften sowohl bei Hunden als auch bei Menschen sehr wünschenswert. Ein solches Werkzeug könnte das intestinale Organoidsystem des Hundes sein, das durch dreidimensionale (3D), selbstorganisierte Epithelstrukturen gekennzeichnet ist, die aus adulten Stammzellen stammen.
Das (1) Permeable Support Seeding Protocol beschreibt die experimentellen Methoden zur Dissoziation und Aussaat von Hundeorganoiden in den Einsätzen. Die Isolierung, Kultur und Ernte von Organoiden bei Hunden wurde zuvor in einer separaten Reihe von Protokollen in dieser Sonderausgabe beschrieben. Methoden zur allgemeinen Erhaltung der intestinalen Organoid-Monoschicht des Hundes werden im (2) Monolayer Maintenance Protocol ausführlich diskutiert. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll Methoden zur Beurteilung der strukturellen Integrität der Monoschicht durch transepitheliale elektrische Widerstandsmessungen (TEER) und Lichtmikroskopie. Schließlich beschreibt das (3) Permeability Experimental Protocol die Aufgaben, die einem Experiment direkt vorausgehen, einschließlich der In-vitro-Validierung der experimentellen Ergebnisse.
Insgesamt überwindet das Organoidmodell für Hunde, kombiniert mit einer Zweikammer-Zellkulturtechnologie, die mit experimentellen 2D-Modellen verbundenen Einschränkungen und verbessert dadurch die Zuverlässigkeit der Vorhersagen der scheinbaren oralen Permeabilität therapeutischer Arzneimittelkandidaten sowohl beim Hund als auch beim menschlichen Patienten.
Introduction
Permeable Unterstützungssysteme werden typischerweise verwendet, um die scheinbare Permeabilität von therapeutischen Wirkstoffkandidaten durch die Darmepithelbarriere 1,2 zu bestimmen. Sie können auch verwendet werden, um die Zellsekretion3, die Zellmigration4 und die Arzneimitteltoxizität5 zu beurteilen. In-vitro-Tests zur oralen Arzneimittelpermeabilität sind ein wichtiger Schritt im Arzneimittelentdeckungs- und -entwicklungsprozess2, wobei einzelne Arzneimittelkandidaten in einem frühen Stadium des Lebenszyklus der Arzneimittelforschung und -entwicklung getestetwerden 6. Das permeable Trägersystem ist ein Zweikammer-Zellkulturapparat, der aus einem Einsatz mit einer semiporösen Membran besteht, die in einer Mehrkammerplatte platziert ist. Dieses System ermöglicht den direkten Zugriff auf die apikalen und basolateralen Seiten einer Zell-Monoschicht, die im Insert7 gewachsen ist. Die in diesen Systemen verwendete Monoschicht wird typischerweise von gastrointestinalen Epithelzellen abgeleitet (z. B. humane kolorektale Adenokarzinom-Caco-2-Zelllinie)8. Zellkulturen wachsen in einem polarisierten Zustand, der die natürliche Mikroarchitektur von Darmepithelzellen nachahmt und eine weitere zelluläre Differenzierung, ähnliche Mikroanatomie und Funktionermöglicht 7. Details zum durchlässigen Stützeinsatz finden Sie in Abbildung 1. Die Aussaat der Einsätze mit 2D-Zellkulturen, die traditionell zur Beurteilung der Darmpermeabilität verwendet werden, ist relativ erschwinglich und leicht zu kultivieren9. Diese Systeme weisen mehrere große Einschränkungen auf, einschließlich ihrer begrenzten Fähigkeit, den Darmstoffwechsel von therapeutischen Arzneimittelkandidaten vorherzusagen10,11. Dies gilt für alle Mechanismen der Arzneimittelabsorption, sei es die passive Absorption durch die engen Verbindungen zwischen den Epithelzellen, die aktive transepitheliale Absorption durch Efflux oder Aufnahmetransporter (z. B. P-Glykoprotein, Monocarboxylat-Transporter 1) und Medikamente, die durch Enterozyten metabolisiert werden.
Hunde teilen eine gemeinsame Umgebung und Ernährung mit Menschen12. Die Darmanatomie und die Zusammensetzung des Mikrobioms von Hunden ähneln stark der des Menschen13, was der Domestizierung und der gemeinsamen Ernährung in den letzten 36.000 Jahren zugeschriebenwurde 14. Leider können diese Ähnlichkeiten auch häufige Ursachen/Auslöser für die Krankheitsentwicklung sein. Hunde entwickeln ähnliche chronische Morbiditäten wie Menschen, wie Fettleibigkeit15, entzündliche Darmerkrankung 16, kolorektales Adenokarzinom 17, gastrointestinaler Stromatumor (GIST)18 und verschiedene andere Pathologien, die mit ihrer relativen Langlebigkeitverbunden sind 19. Dementsprechend können canine Organoide im Sinne der One Health Initiative20 erfolgreich für die reverse translationale Erforschung dieser chronischen multifaktoriellen Erkrankungen eingesetzt werden.
Caco-2-Zellen sind die am häufigsten verwendeten Zelllinien für orale Absorptionsassays21. Diese Zellen gelten derzeit als das "Goldstandard"-Modell für In-vitro-Intestinalpermeabilitätsassays 2,22,23. Die Caco-2-Zelllinie exprimiert Efflux- und Aufnahmetransporter, die im menschlichen Darmtrakt vorkommen, wenn auch auf unterschiedlichen Expressionsniveaus24,25,26. Caco-2-Zellen werden auch häufig als Modelle verwendet, um festzustellen, ob ein Medikament ein Substrat oder ein Inhibitor von Darmeffluxtransportern ist22,27. Obwohl die Caco-2-Zellen kolonialen Ursprungs sind, ahmen sie eine Enterozytenzelle nach. Leider repräsentieren Caco-2-Zellen nur einen Zelltyp aus der Epithelschicht des Dünndarms9, der die komplexe Zusammensetzung des Darmepithelzelltyps nicht genau rekapituliert. Zum Beispiel fehlen Becherzellen, die der Schleimproduktion gewidmet sind, in Caco-2-Kulturen, so dass Schleim-Arzneimittel-Wechselwirkungen ohne Kokultur mit anderen Zelllinien nicht beurteilt werdenkönnen 28. Darüber hinaus exprimieren Caco-2-Kulturen nicht mehrere der wichtigen Kernrezeptoren, die typischerweise im Darm vorhanden sind, wie der X-Rezeptor der Schwangerschaft (PXR), der Steroid-X-Rezeptor (SXR) und der konstitutive Androstrezeptor (CAR)29. Folglich können Caco-2-Kulturen die Induktion von Wirkstofftransportern und -enzymen durch bestimmte Medikamente, die Induktoren dieser Rezeptoren sind (z. B. Rifampin), nicht modellieren30.
Die 3D-Darmorganoid-Technologie adressiert einige dieser Einschränkungen19. Organoide sind selbstzusammengesetzte Konstrukte, die aus adulten Stammzellen gewonnen werden und aus Gewebeproben gewonnen werden können, die mit mikroinvasiven Techniken entnommen wurden20. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen werden für Darmpermeabilitätsmodelleverwendet 31,32. Canine Organoide bieten eine relevante Alternative zu menschlichen Organoiden, da die Forschung an menschlichen Stammzellen durch ethische Fragen eingeschränktist 33. Darüber hinaus bieten Hundeorganoide ein In-vitro-System zur Erforschung der Arzneimittelpermeabilität von Hunden, des Stoffwechsels, des aktiven Transports und der Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Arzneimitteln. Um diese Technologielücke zu schließen, wurde das konsistente und zuverlässige Wachstum von Darmorganoiden bei Hunden in einem durchlässigen Stützsystem beschrieben34. Ein Permeabilitätsassay mit intestinalen Organoiden bei Hunden kann möglicherweise die Darmpermeabilität des Hundes und den Metabolismus kleiner Wirkstoffmoleküle im Vergleich zu derzeit verwendeten Assays (Caco-2) vorhersagen. Die Bestätigung dieser entscheidenden Merkmale verleiht diesem neuartigen In-vitro-System zukünftige Arbeiten, die den möglichen Einfluss von Induktoren auf den intrazellulären Stoffwechsel und den aktiven Transport untersuchen.
Canine Organoide bestehen aus allen Zelltypen, die typischerweise in der Epithelschicht des Darms vorhanden sind. Aus funktioneller und mikroanatomischer Sicht bilden sie zuverlässig die Umgebung der Epithelschicht des Hundedarmsnach 19,35. Darüber hinaus ist das Vorhandensein von Schleim, hundespezifischen Wirkstofftransportern und -enzymen sowie die zelluläre Gesamtdifferenzierung in Darmorganoiden von Hunden vergleichbar mit dem, was in vivo bei Hundenbeobachtet wird 34. So können Organoide von erkrankten tierärztlichen Patienten isoliert und verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Krankheitsprozesse (z. B. chronische Darmentzündung) auf die orale Arzneimittelpermeabilität von Hunden zu modellieren19,36. Das intestinale Organoidsystem des Hundes kann auch in anderen Umgebungen als Medikamentenpermeabilitätsexperimenten verwendet werden. Diese 3D-Strukturen können auch von erkrankten Patienten isoliert werden, wie zuvor von Chandra et al. für entzündliche Darmerkrankungen, kolorektale Adenokarzinome und gastrointestinale Stromatumoren19 beschrieben.
Das Permeable Support Seeding Protocol beschreibt Verfahren zur Etablierung von intestinalen Organoidkulturen bei Hunden in den Einsätzen. Dieses erste Protokoll beschreibt Methoden zur Dissoziierung etablierter Organoidkulturen bei Hunden, die in der extrazellulären Membranmatrix plattiert sind. Weiterhin wird in diesem Protokoll die Vorbeschichtung der Einsätze mit Kollagen I und der extrazellulären Membranmatrix diskutiert. Die Einbettung von Hundeorganoiden in die durchlässigen Stützeinsätze wird ebenfalls ausführlich beschrieben.
Das zweite Protokoll ist das Monolayer Maintenance Protocol, das die allgemeine Wartung von 3D-Organoiden bei Hunden umfasst, die in einem Einsatz plattiert sind. Die Häufigkeit und das Volumen der Organoidmedien, die zur Auffrischung der Kultur verwendet werden, und Möglichkeiten zur Verhinderung von Zellkulturschäden werden in diesem zweiten Protokoll zusammen mit experimentellen Methoden zur Beurteilung des Zusammenflusses der epithelialen Monoschicht vorgestellt.
Schließlich konzentriert sich das Permeability Experimental Protocol auf Möglichkeiten, um festzustellen, ob die 3D-Organoide des Hundedarms in einem Permeabilitätsassay für den experimentellen Einsatz bereit sind, und auf die Verifizierungsschritte, die vor der Durchführung eines Experiments erforderlich sind. Dieser Abschnitt beschreibt auch den Aufbau und die erfolgreiche Durchführung eines Permeabilitätsexperiments sowie die Inkubation und Probenahme von therapeutischen Wirkstoffkandidaten in den Kammern der Monolayer-Kultur. Die Verwendung des Fluoresceinisothiocyanats mit geringer Permeabilität (FITC-Dextran) zur Überwachung der Integrität der Monoschicht wird ebenfalls diskutiert. Abschließend wird eine in vitro Evaluationsmethode zur Validierung der Ergebnisse nach Abschluss eines Experiments beschrieben. Permeabilitätsexperimente sind ein äußerst umfangreiches Thema und werden von Hubatsch et al.37 sehr gut zusammengefasst. Der Workflow der Protokolle ist in Abbildung 2 zusammengefasst.
Abbildung 1: Darmorganoide bei Hunden auf einem durchlässigen Stützsystem. Der durchlässige Stützeinsatz befindet sich in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte. Die mikroporöse Membran ermöglicht die Aussaat von dissoziierten Darmorganoiden bei Hunden, und diese Zellen bilden schließlich eine organoide 2D-Monoschicht. Diese Technologie ermöglicht den Zugriff sowohl auf die AP- als auch auf die BL-Seite der Monolayer. Organoides Medium wird sowohl in den AP- als auch in den BL-Kammern des durchlässigen Trägers eingeführt. Die Absorption (AP→BL) und Sekretion (BL→AP) des Wirkstoffkandidaten werden ebenso dargestellt wie zwei mögliche Arten des Arzneimitteltransports. Abkürzungen: AP = apikal; BL = basolateral. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Workflow der organoiddurchlässigen Unterstützungsprotokolle für Hunde . Der durchlässige Stützeinsatz wird mit einer Mischung aus extrazellulärer Membranmatrix und Kollagen I vorbeschichtet und für 1 h inkubiert. Während des Inkubationsprozesses wird die Organoidkultur dissoziiert. Einzelne Organoidzellen werden im Insert ausgesät, Medium in der Basolateralkammer wird unmittelbar nach der Aussaat zugegeben, während Medium in die apikale Kammer 24 h nach Abschluss des Aussaatprozesses gegeben wird. Die Wartung und Überwachung der Organoide umfasst regelmäßige Mediumswechsel, TER-Wertmessungen und Lichtmikroskopie zur Bewertung der Integrität der Monoschicht. Vor dem Experiment müssen die Organoide unterschieden werden, indem ROCK-Inhibitor und GSKiβ aus dem Medium entfernt werden. Die TEER-Werte werden am Tag des Experiments gemessen und die Organoid-Monoschicht lichtmikroskopisch auf Schäden an den Zellen untersucht. Das Medium wird dann gegen einen geeigneten Puffer ausgetauscht und vor dem Experiment inkubiert. Der FITC-Dextran-Assay wird während der Darmpermeabilitätsexperimente39 als Marker für die Integrität der Monoschicht verwendet. TEER-Messungen werden nach dem Experiment durchgeführt, und die Lichtmikroskopie validiert die Ergebnisse nach 24 Stunden. Abkürzungen: TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand; ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; F = Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Protocol
Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). Im folgenden Abschnitt (Schritte 1.1-1.3) wird das Permeable Support Seeding Protocol beschrieben, und die Verfahren sind in Abbildung 3 zusammengefasst.
Abbildung 3: Workflow des Permeable-Support-Seeding-Protokolls. Die durchlässigen Stützeinsätze werden mit einer Kombination aus CMGF+ R/G, Kollagen I und der extrazellulären Membranmatrix vorbeschichtet und anschließend inkubiert. Medien aus der Organoidkultur des Hundes werden angesaugt und durch eine Zellwiederherstellungslösung ersetzt, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 4 ° C. Die Kultur wird anschließend in eine Röhre überführt, und die organoide Dissoziation wird mit trypsinartiger Protease durchgeführt. Undissoziierte Organoide werden durch Passage durch ein Sieb entfernt, um eine Einzelzellsuspension zu erreichen, und die Zellkonzentration wird mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler bestimmt. Die Zellen werden auf einem durchlässigen Stützeinsatz gesät, und CMGF+ R/G wird der basolateralen Kammer hinzugefügt. Die Kultur wird dann für 24 h inkubiert, und die verbleibende Flüssigkeit wird aus der apikalen Kammer entfernt und durch CMGF+ R/G ersetzt. Abkürzungen: ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; CMGF + R/G = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, angereichert mit ROCK-Inhibitor und GSKiβ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
1. Permeable Unterstützung Seeding Protokoll
- Vorbeschichtung der durchlässigen Stützeinsätze
- Bereiten Sie ein vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren vor, die mit Rho-assoziiertem Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor und Glykogensynthase-Kinase-Beta-Inhibitor ( GSKiβ) (CMGF + R/G) gemäß den Informationen in Tabelle 1 angereichert sind.
- Bereiten Sie einen Eiskübel vor und beginnen Sie, die extrazelluläre Membranmatrix auf Eis aufzutauen. Legen Sie eine 24-Well-Platte mit der erforderlichen Anzahl von Einsätzen in den Inkubator, um sie vorzuwärmen. Sammeln Sie Rattenschwanzkollagen I (3 mg / ml) und legen Sie es auf Eis, während Sie es vor Licht schützen. Sammeln Sie CMGF + R / G und legen Sie es auf Eis.
- Berechnen Sie die Gesamtzahl der für das Experiment erforderlichen Einsätze und Leerproben, wobei Sie 100 μL der Beschichtungslösung für jeden Einsatz beiseite lassen.
HINWEIS: Bereiten Sie mehr Beschichtungslösung als erforderlich vor. Es wird empfohlen, mindestens 15% mehr als nötig vorzubereiten. - In einem 15-ml-Röhrchen CMGF+ R/G mit der extrazellulären Membranmatrix (1%) und Kollagen I (1%) mischen und vorsichtig pipettieren.
- Beschichten Sie jeden Polyestereinsatz mit 100 μL der Beschichtungslösung und legen Sie die Einsätze für 1 h in den Inkubator (37 °C; 5% CO2-Atmosphäre ).
- Saugen Sie nach der Inkubation die Beschichtungslösung vorsichtig von jedem Einsatz mit einem Vakuumsauger oder einer P1000-Pipette ab, wobei Sie darauf achten, den Einsatzfilter nicht zu stören. Legen Sie eine vorbeschichtete Platte in den Inkubator, um sich warm zu halten.
- Organoiddissoziation bei Hunden
HINWEIS: Verwenden Sie Hundeorganoide, die seit mindestens vier Tagen kultiviert wurden. Bevor Sie mit der Dissoziation beginnen, beziehen Sie sich auf Gabriel et al.38 , um festzustellen, wann eine Probe gesund, dicht und ausreichend für Experimente ist. Es wird empfohlen, für jedes Well-Plating-Verfahren eine zusätzliche Vertiefung von Organoiden zu dissoziieren. Darüber hinaus wird empfohlen, die gewünschte Anzahl von Einsätzen um ~ 20% zu erhöhen, um ungleichmäßiges Organoidwachstum oder Schäden durch unsachgemäße Manipulation zu berücksichtigen. Wenn Sie die Verwendung von FITC-dextran planen, bereiten Sie zusätzliche Vertiefungen vor.- Bereiten Sie einen Eiskübel und eine Durchstechflasche mit kaltem 1x Advanced DMEM/F12-Material in der Biosicherheitskabine vor.
- Legen Sie die extrazelluläre Membranmatrix auf Eis, um mit dem Auftauen zu beginnen, und tauchen Sie sie in Eis, um sich vor schnellem Auftauen zu schützen und eine Erstarrung zu vermeiden. Legen Sie eine Schachtel Pipettenspitzen (P200) in den Gefrierschrank, um die extrazelluläre Membranmatrix zu plattieren.
- Eine gekühlte Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen.
- Bewegen Sie CMGF+ R/G aus dem Gefrierschrank/Kühlschrank in ein 37 °C warmes Wasserbad. Vermeiden Sie nach Möglichkeit direkte Lichteinwirkung.
- Entfernen Sie das gesamte Medium aus der 24-Well-Platte mit Organoidkultur für eine angemessene Anzahl von Wells (1 Well einer 24-Well-Platte pro 2-4 Einsätze), wobei Sie darauf achten, die extrazelluläre Membranmatrix nicht zu stören.
HINWEIS: Das Volumen kann je nach verwendetem Zellzählsystem variieren. - Fügen Sie 0,5 ml vorgekühlte Zellwiederherstellungslösung pro Vertiefung hinzu, um die extrazellulären Membranmatrixkuppeln aufzulösen.
- Den Teller im Kühlschrank (4 °C) für 30 min inkubieren.
- Pipettieren Sie die Suspension, sammeln Sie alle Organoide und die gelöste extrazelluläre Membranmatrix und übertragen Sie sie in eine 15-ml-Röhre.
- Zentrifugieren Sie (700 × g für 5 min bei 4 °C) und entfernen Sie den Überstand, bis der Pegel die 0,5 ml-Marke erreicht, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören.
- 1 ml der trypsinartigen Protease zugeben und im 37 °C warmen Wasserbad 8 min inkubieren. Streichen Sie die Röhre mehrmals während der Inkubationszeit, um die Zellen zu mischen.
- Bringen Sie das Röhrchen mit der Probe zurück in eine Biosicherheitskabine und fügen Sie langsam 7 ml vorgekühltes Advanced DMEM/F12 hinzu, um die Trypsin-ähnliche Protease zu inaktivieren und die Zelldissoziation zu stoppen.
- Prewet ein 40 μm Zellsieb mit 1 ml Advanced DMEM/F12. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig und filtern Sie die Suspension durch; Pipetten Sie zusätzliches Advanced DMEM/F12 zum Spülen des Siebes.
- Das Röhrchen zentrifugieren (700 × g für 5 min bei 4 °C) und den Überstand entfernen. Stören Sie das Pellet nicht.
- Resuspendiert das Zellpellet in ~ 50-100 μL Kulturmedium (CMGF + R / G) für jede Welle von Organoiden, die dissoziiert wurde.
- Zählen Sie eine Teilprobe der Suspension (~10 μL) mit einem Hämozytometer oder einer geeigneten Maschine und bestimmen Sie die Gesamtzellzahl in der Suspension.
- Organoid-Aussaat bei Hunden
- Verdünnen oder konzentrieren Sie die Zellsuspension, um eine Zellkonzentration von ~ 75.000 Zellen pro ml zu erhalten.
- Samen Sie 100 μL der Suspension in jeden Einsatz mit BSA (1%) vorbeschichteten Spitzen, um eine Zelladhäsion während des Transfers zu vermeiden. Fügen Sie einen beschichteten Einsatz als zellfreien Rohling hinzu, ohne dass Organoide wachsen, während Sie weiterhin regelmäßige Medienwechsel erhalten.
- Schwenken Sie die Platte vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung für ~ 30 s, um die ausgesäten Zellen über den Einsatz zu verteilen. Bestätigen Sie mittels Lichtmikroskopie die gleichmäßige Verteilung der Zellen.
- 700 μL CMGF + R/G in die basolaterale Kammer geben und die Platte für 24 h in den Inkubator (37 °C; 5% CO2-Atmosphäre ) geben.
- Entfernen Sie nach 24 h vorsichtig die Zellsuspension aus der apikalen Kammer und ersetzen Sie sie durch 200 μL CMGF + R/G. Bringen Sie die Platte in den Inkubator zurück.
2. Monolayer-Wartungsprotokoll für Organoidzellen
HINWEIS: Im folgenden Abschnitt (Schritte 2.1-2.2) wird das Organoid-Zell-Monolayer-Wartungsprotokoll beschrieben. Der Workflow der in diesem Protokoll dargestellten Verfahren ist in Abbildung 4 zusammengefasst. Eine Tabelle zur Notizenerstellung, die bei der Standardisierung von TER-Wertmessungen helfen kann, ist in der Ergänzenden Tabelle 1 dargestellt.
Abbildung 4: Workflow der Aufrechterhaltung der durchlässigen Supportkultur. TER-Werte werden mit Elektroden (Sonden) und einem Volt/Ohm-Meter gemessen. Sonden müssen vor dem Einführen in die Brunnen chemisch mit 70% Alkohol sterilisiert werden. Die leeren und organoiden Zelleinsätze werden gemessen und TEER-Werte berechnet. Das Medium wird anschließend sowohl in apikalen als auch in basolateralen Kammern aufgefrischt, und die Organoidkultur des Hundes auf dem Einsatz wird mittels Lichtmikroskopie visualisiert. Risse in entweder Organoidkultur oder mikroporöser Membran werden notiert und gemäß dem Protokoll behandelt. Abkürzung: TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- TEER-Wert-Messung
HINWEIS: TEER-Wertmessungen werden mit einem Epithelvolt/Ohm-Messgerät mit Essstäbchenaufsatz durchgeführt. Siehe Gebrauchsanweisung des Herstellers. TEER-Werte geben Aufschluss über die Integrität der Organoid-Monoschicht des Hundes.- Nehmen Sie TEER-Wertmessungen an jedem alternativen Tag während des Zellkulturwachstums vor.
- Bringen Sie das Epithelialvolt/Ohm-Messgerät und seine Elektroden in die Biosicherheitswerkbank. Sterilisieren Sie die Elektroden vor Gebrauch chemisch in 70% Alkohol. Setzen Sie die Funktion auf Ohm. Warten Sie mindestens eine Minute, bis die Elektroden getrocknet sind.
- Bevor Sie die erste Messung durchführen, stecken Sie die Drahtelektrode in den Anschluss und schalten Sie die Stromversorgung ein. Stellen Sie sicher, dass das Messgerät 1.000 Ω mit dem Drahtelektrodeneinsatz anstelle von Messstäbchen anzeigt. Ist dies nicht der Fall, passen Sie das Gerät an.
- Führen Sie die Elektroden in die apikale und basolaterale Kammer des zellfreien Einsatzes ein (leer), so dass die apikale Kammer die kürzere Elektrode und die basolaterale Kammer die längere Elektrode enthält (wie in Abbildung 4 dargestellt). Berühren Sie nicht die Membran, sondern stellen Sie gleichzeitig sicher, dass die Elektroden in das Medium eingetaucht werden.
- Warten Sie einige Sekunden, bis sich der Wert stabilisiert hat, und notieren Sie sich den Wert in einem Laborbuch. Messen Sie die verbleibenden Organoid-Monoschichten des Hundes und stellen Sie sicher, dass die Elektroden bei der Messung verschiedener Proben mit 70% Alkohol sterilisiert werden. Achten Sie darauf, die Organoid-Monoschicht nicht mit der Elektrode zu berühren.
- Nachdem die Messungen durchgeführt wurden, sterilisieren Sie die Elektroden zum letzten Mal mit 70% Alkohol. Achten Sie darauf, sie vor Schäden zu schützen, die durch unangemessene Manipulation verursacht werden, und lagern Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Berechnen Sie die TEER-Werte für jedes Bohrloch mit Eq (1), wobeiR-Stichprobe und R-Rohling die Ohm-Werte (Ω) aus den Monolayer- bzw.Blank-Wells und die Fläche (cm²) die der Einfügung ist.
(1)
- Monolayer-Wartung
HINWEIS: Überprüfen Sie den empfohlenen mittleren Änderungsplan in Tabelle 2.- Mit sterilen 9" Pasteur-Einwegpipetten und einem Vakuumsauger saugen Sie das Medium vorsichtig aus den apikalen und dann aus den basolateralen Kammern ab. Neigen Sie die Platte, um die mittlere Oberfläche deutlich zu sehen. Vermeiden Sie es, zu nahe an der mikroporösen Membran in der apikalen Kammer zu aspirieren, um eine Schädigung der Zellmonoschicht zu vermeiden.
HINWEIS: Verwenden Sie eine neue Pasteurpipette, wenn Sie zwischen den Proben wechseln. Pipetten sind auch ein möglicher Ersatz für dieses Verfahren. - Fügen Sie langsam CMGF+ R/G mit P1000-Pipetten hinzu, die auf eine Wand der apikalen oder basolateralen Kammer abzielen. Führen Sie den Mediumswechsel in der apikalen Kammer sehr sorgfältig durch, um eine Beschädigung der Monoschicht zu vermeiden.
- Überprüfen Sie die Vertiefungen jeden zweiten Tag unter einem Lichtmikroskop, bewerten Sie den Zustand der Kultur und überwachen Sie Risse in der Organoid-Monoschicht oder der mikroporösen Membran. Verwenden Sie die Phasenkontrastmikroskopie, um Details der Kultur hervorzuheben.
HINWEIS: Im Falle von organischen Monolayer-Rissen bei Hunden wird der Monoschicht Zeit gegeben, sich zu erholen und nachzuwachsen. Bei mikroporösen Membranrissen muss der Brunnen vom Experiment ausgeschlossen werden.
- Mit sterilen 9" Pasteur-Einwegpipetten und einem Vakuumsauger saugen Sie das Medium vorsichtig aus den apikalen und dann aus den basolateralen Kammern ab. Neigen Sie die Platte, um die mittlere Oberfläche deutlich zu sehen. Vermeiden Sie es, zu nahe an der mikroporösen Membran in der apikalen Kammer zu aspirieren, um eine Schädigung der Zellmonoschicht zu vermeiden.
(1)Tabelle 2: Empfehlung zum Medienwandel für organoide Kulturen. CMGF+ R/G wird in der apikalen und basolateralen Kammer der Brunnen jeden zweiten Tag an jedem alternativen Tag gewechselt. Die längere Kulturperiode am Wochenende erfordert ein erhöhtes Volumen an Medium sowohl in basolateralen als auch in apikalen Kammern, das an einem Freitagnachmittag angewendet und am Montag gewechselt wird. Abkürzungen: ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; CMGF + R/G = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, angereichert mit ROCK-Inhibitor und GSKiβ. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
3. Permeabilitäts-Experimentalprotokoll
HINWEIS: Im folgenden Abschnitt (Schritte 3.1-3.5) wird das Permeabilitäts-Experimentierprotokoll beschrieben. Der experimentelle Protokoll-Workflow zur Messung der In-vitro-Permeabilität eines Arzneimittels ist in Abbildung 5 zusammengefasst.
Abbildung 5: Workflow des experimentellen Protokolls. Das Organoidmedium muss zwischen acht und zwölf Tagen nach dem Aussäen der Einsätze von CMGF+ R/G auf CMGF+ gewechselt werden, um eine zelluläre Differenzierung zu ermöglichen. Nach dem Wechsel des Mediums (sowohl apikal als auch basolateral) zu CMGF+ sollten die TEER-Werte immer noch steigen, wobei die organische Monoschicht des Hundes fast zusammenfließen könnte. Mindestens vier Tage nach dem Wechsel des Mediums auf CMGF+ wird die Bereitschaft der Monolayer bewertet. Wenn die Monoschicht vollständig gebildet ist und die TER-Werte eine Plateauphase erreichen (typischerweise zwischen 1.500 und 2.500 Ω.cm2), wird das Medium für 30 min gegen den Transportpuffer ausgetauscht, damit sich die Monoschicht an die neue Umgebung anpassen kann. Zum Zeitpunkt von 0 Minuten des Experiments wird der FITC-Dextran-Assay durchgeführt und die 20-minütige basolaterale Probe wird gesammelt. Die Ergebnisse werden anschließend auf einem Plattenleser analysiert. Nach dem Experiment werden die apikalen und basolateralen Kammerinhalte wieder auf CMGF+ geändert und TEER-Wertwerte werden gemessen. Die Monolayer werden 24 h lang inkubiert und die Integrität der Monolayer durch wiederholte TEER-Messungen bewertet. Abkürzungen: TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand; ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; CMGF + R/G = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, angereichert mit ROCK-Inhibitor und GSKiβ; CMGF+ = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, aber ohne ROCK-Inhibitor oder GSKiβ; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; F = Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Bewertung der Bereitschaft für organoide Monoschichten
HINWEIS: Dieser Schritt erfolgt 8-14 Tage nach der Aussaat.- Überprüfen Sie die Monoschicht mindestens jeden zweiten Tag unter dem Lichtmikroskop (verwenden Sie Phasenkontrast, um die Integrität der Monoschicht zu visualisieren). Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Zellmonoschicht ohne Lücken oder offensichtliche Anzeichen von Tränen vollständig gebildet ist.
- Ändern Sie das Organoidmedium von CMGF+ R/G in CMGF+ (ohne ROCK-Inhibitor und GSKiβ aus der Mediumszusammensetzung). Es wird empfohlen, das Medium mindestens vier Tage vor dem Experiment auszutauschen.
HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht eine korrekte Differenzierung der Organoid-Monoschicht. - Messen Sie die TEER-Werte ungefähr jeden zweiten Tag weiter. Wenn die TEER-Werte bei etwa 1.500 bis 2.000 Ω × cm² zu stagnieren beginnen (Abbildung 6), messen Sie die TEER-Werte täglich.
HINWEIS: Dieser stationäre Zustand kann für ungefähr 2-3 Tage aufrechterhalten werden, was das optimale Zeitfenster für die Durchführung von Permeabilitätstests ist (normalerweise an den Tagen 11 bis 13). Die Plateau-TEER-Werte können aufgrund der Darmlokalisation der Organoide, der Messtemperatur, der Rasse, des Alters und des Krankheitszustands des Hundes leicht oszillieren. - Planen Sie den Medikamentenpermeabilitätstest sofort, um eine schnelle Abnahme der TEER-Werte oder ein Überwachsen der Organoid-Monoschicht auf mehrere Zellschichten zu vermeiden.
- Vorbereitung auf das Experiment
HINWEIS: Inkubator-Shaker können während des Experiments verwendet werden, um die Auswirkungen der ungerührten Wasserschicht zu vermeiden. Messen Sie TEER-Werte bei konstanten Temperaturen.- Messen Sie am Tag des Experiments die TER-Werte und bestätigen Sie, dass die Werte einen stabilen Zustand erreicht haben und nicht schnell abnehmen.
- Wählen Sie die besten Monoschichten (über Lichtmikroskopie und TER-Werte) aus dem Überschuss von 20% Einsätzen, um das Experiment durchzuführen.
- Beobachten Sie die Monoschichten unter einem Lichtmikroskop und schließen Sie unvollständige, zerrissene oder überwucherte organoide Monoschichten aus.
- Bereiten Sie den Transportpuffer vor und stellen Sie seinen pH-Wert auf die gewünschten Werte ein.
HINWEIS: Die Zusammensetzung des Versuchspuffers unterscheidet sich je nach Versuchsaufbau. Ein häufig verwendeter Puffer besteht aus Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Glucose (12,5 mM) und 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES, 25 mM). Diese Zusammensetzung gewährleistet die Lebensfähigkeit der Organoidkultur während eines Experiments. - Saugen Sie das Medium vorsichtig aus den apikalen und basolateralen Kammern der ausgewählten Vertiefungen ab.
- 200 μL Transportpuffer in die apikale Kammer und 800 μL in die basolaterale Kammer geben.
HINWEIS: Transportpuffer sollte zuerst in die apikale Kammer und dann in die basolaterale Kammer gegeben werden, um eine Ablösung der Monoschicht von der mikroporösen Membran zu vermeiden. - Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C; 5% CO2 Atmosphäre) für 30 Minuten, um sich auszugleichen.
HINWEIS: Die Organoid-Monoschichten des Hundes sind jetzt bereit für das Wirkstoffpermeabilitätsexperiment.
- Typische experimentelle Layout-IgY-Konzentrationslösung
HINWEIS: Das experimentelle Design und Layout kann sich je nach Forschungsfrage ändern. Die Permeabilität von Immunglobulin Y (IgY) durch eine organoide Monoschicht wird im Protokoll als Beispiel verwendet und kann modifiziert werden. Der Begriff Spenderkammer bezieht sich auf die Kammer, in der das Medikament ursprünglich angewendet wird, während sich die Empfängerkammer auf die Kammer bezieht, die das Medikament von der Spenderkammer annimmt. Ein typisches Experiment sammelt Proben in den Empfängerkammern über 2 h (z. B. 15, 30, 60, 90, 120 min).- Bereiten Sie die IgY-Lösung (Arzneimittel oder gelöster Stoff Ihrer Wahl) vor, indem Sie sie im Transportpuffer auf die gewünschte Endkonzentration auflösen. Bereiten Sie mehr Arzneimittellösung als erforderlich vor.
HINWEIS: Arzneimittel mit geringer wässriger Löslichkeit können zuerst in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Ethanol, DMSO) gelöst werden, bevor sie dem Puffer hinzugefügt werden. Die Endkonzentration des Lösungsmittels sollte weniger als 1% betragen, um die Zellmonoschicht nicht zu beschädigen. - Entfernen Sie den Puffer aus der Spenderkammer (entweder apikale oder basolaterale Kammer) jedes Bohrlochs.
- Fügen Sie die IgY-Lösung (Arzneimittellösung) allen Spenderkammern hinzu. Verwenden Sie die verbleibende Lösung als Zeit 0 Spenderlösung für die Messung der anfänglichen Arzneimittelkonzentration.
- Entfernen Sie zu den erforderlichen Zeitpunkten 50 μL aus der Aufnahmekammer und legen Sie sie in ein markiertes Röhrchen. Entnehmen Sie zum letzten Zeitpunkt eine Probe aus der Spenderkammer. Am Ende des Experiments werden die Aliquots des Spenders und des Empfängers in einen Gefrierschrank von -20 °C überführt.
HINWEIS: Wenn viele Zeitpunkte benötigt werden, kann der Austausch des Puffers in der Empfangskammer erfolgen, muss jedoch bei der Berechnung der scheinbaren Permeabilität berücksichtigt werden. Die Konzentration in der Empfängerkammer sollte am Ende des Experiments nicht mehr als 10% der Spenderkammer erreichen, um die Sinkbedingungen aufrechtzuerhalten44.
- Bereiten Sie die IgY-Lösung (Arzneimittel oder gelöster Stoff Ihrer Wahl) vor, indem Sie sie im Transportpuffer auf die gewünschte Endkonzentration auflösen. Bereiten Sie mehr Arzneimittellösung als erforderlich vor.
- Qualitätskontrolle der monologen Zellschicht
HINWEIS: FITC-Dextran-Lösung kann verwendet werden, um die Integrität der Monoschicht während des Experiments zu bestätigen. FITC-dextran wird als Beispiel für einen monolagigen Integritätsassay verwendet. Andere sind Luzifergelb, PEG-4000, radioaktiv markiertes Mannitol und Inulin44.- Zum Zeitpunkt 0 min wird der Inhalt der apikalen Kammer abgesaugt und durch 250 μL FITC-Dextran-Lösung (5 mg/ml, 4 kDa) in dreifacher Ausfertigung für jede Versuchsgruppe ersetzt.
HINWEIS: Setzen Sie FITC-dextran nicht dem Licht aus. - Nach 20 min den Puffer aus der basolateralen Kammer entfernen.
- Messen Sie die Fluoreszenzintensität der basolateralen Probe mit einem Fluoreszenzplattenleser (verwenden Sie eine Kalibrierkurve; Anregung auf 485 nm und Emissionswert auf 528 nm eingestellt).
HINWEIS: DieP-App von FITC kann auch mit der in der Diskussion beschriebenen Methode berechnet werden. - Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, aspirieren Sie vorsichtig überschüssigen Puffer aus den apikalen und basolateralen Kammern.
- 200 μL CMGF+ in die apikale Kammer und 700 μL in die basolaterale Kammer geben.
- Messen Sie TEER-Werte in den einzelnen Bohrlöchern.
- Legen Sie die Platte für 24 h in den Inkubator (37 °C; 5% CO2 -Atmosphäre).
- Falls zutreffend, messen Sie nach 24 h die TER-Werte, um mögliche Schäden an der Monoschicht während des Qualitätskontrollteils des Experiments zu bewerten. Verwenden Sie Lichtmikroskopie, um die Integrität der Organoid-Monoschicht des Hundes zu visualisieren.
- Zum Zeitpunkt 0 min wird der Inhalt der apikalen Kammer abgesaugt und durch 250 μL FITC-Dextran-Lösung (5 mg/ml, 4 kDa) in dreifacher Ausfertigung für jede Versuchsgruppe ersetzt.
- Fixierung von Zellmonolagen für die nachgelagerte Analyse
- Es wird eine Formalin-Essigsäure-Alkohol-Lösung (FAA, Zusammensetzung in Tabelle 1) hergestellt.
- Entfernen Sie den Transportpuffer oder CMGF+ aus den apikalen und basolateralen Kammern mit einer P1000-Pipette oder sterilen 9-Zoll-Einwegpipetten und einem Vakuumsauger.
- Füllen Sie die apikalen und basalen Kammern mit FAA.
- Nach 24 h den FAA absaugen und durch 70% Ethanol ersetzen.
- Umwickeln Sie die Platte mit flexibler Laborfolie, um Verdunstung zu verhindern, und blockieren Sie die Vorbereitung.
Abbildung 6: TEER-Werte über experimentelle Gruppen hinweg. TEER-Werte wurden in fünf Gruppen von intestinalen Organoid-Monoschichten bei Hunden gemessen. Drei Gruppen bestanden aus kaninen jejunalen Enteroiden, und zwei Gruppen bestanden aus Kolonoiden. Jede Gruppe umfasste 12 bis 22 Replikate. Die TEER-Werte für jejunale enteroide Kulturen werden von Tag 4 bis Tag 14 und Kolonoidkulturen von Tag 4 bis Tag 12 gezeigt (Messungen endeten, als die Organoid-Monoschicht stationäre Werte erreichte, was darauf hindeutet, dass die Monoschicht für den experimentellen Einsatz bereit war). Fehlerbalken drücken das SEM der Messungen aus. Abkürzung: TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Representative Results
Standardarbeitsanweisungen für die Kultur von Canine-Organoiden wurdenzuvor 33 beschrieben, und das Canine Organoid Protocol wurde auch in dieser Sonderausgabe38 ausführlich diskutiert. Hundeintestinale Organoide, die auf durchlässigen Stützen kultiviert wurden, wurden fixiert und in Paraffin eingebettet, um die Mikroanatomie der Monoschicht und der Zellpopulationen zu untersuchen. Der Paraffin-Einbettungsprozess wurde zuvor von Gabriel et al.38 diskutiert. Es wurde eine routinemäßige Färbung (Hämatoxylin und Eosin) durchgeführt, und die Alcian Blue-Färbetechnik wurde verwendet, um Becherzellen in der organischen Monoschicht des Hundes nachzuweisen (siehe Abbildung 7).
Abbildung 7: Einschichtige Organoid-Monolayer-Färbung des Darms bei Hunden. Hundeintestinale Organoide kolonialen Ursprungs in der durchlässigen Stütze wurden in Paraffin eingebettet und mit H & E und AB gefärbt. Repräsentative Bilder wurden mittels Lichtmikroskopie bei 40-facher (A) und 60-facher (B) Vergrößerung aufgenommen. Die H & E-Färbung zeigt eine säulenförmige Epithel-Monoschicht, und die Mikrovilli im apikalen Teil der Zellen können bei 60-facher Vergrößerung beobachtet werden. Die AB-Färbung enthüllt das Vorhandensein von Kelchzellen (dunkelblau) in der Organoid-Monoschicht des Hundedarms. Maßstabsstäbe = 20 μm (A), 50 μm (B). Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; AB = Alcian Blau. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Organoidkultur auf dem permeablen Träger sollte für 10 bis 14 Tage gezüchtet werden, um für ein Permeabilitätsexperiment bereit zu sein. Die Lichtmikroskopie wird in Verbindung mit TER-Wertmessungen eingesetzt, um die Bereitschaft der Organoidkultur für Permeabilitätstests von Wirkstoffkandidaten zu bestätigen. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen verschiedener intestinaler Organoid-Monoschichten von gesunden und kranken Tieren sind in Abbildung 8 dargestellt.
Abbildung 8: Canine intestinal organoid monolayer microscopy. Bilder von wachsenden Monolayern, wie sie unter Lichtmikroskopie zu sehen sind. Organoid-Monoschichten, die von gesunden Spendern stammen, werden durch jejunale enteroide (10x; 40x) und colonoide (20x; 40x) Kulturen dargestellt. Organoide Monoschichten erkrankter Spender werden durch zwölffingerdarmige (5x; 10x) und ileale (5x; 10x) Enteroide dargestellt, die von einem Hundepatienten stammen, bei dem PLE diagnostiziert wurde. Beide PLE-Organoidkulturen sind Beispiele für eine unsachgemäße Zellisolierung während der Aussaat von Organoiden, und diese Kulturen konnten aufgrund des Vorhandenseins von 3D-Organoiden nicht für Wirkstoffpermeabilitätstests verwendet werden. Beispiele für Abweichungen von der richtigen Monolayer-Bildung, wie z.B. Monolayer-Risse (5x), werden durch unvorsichtige Manipulation der biologischen Proben verursacht. Die verlängerte Kultur von Organoiden (10x; 20x) wird durch die lange Aufrechterhaltung der Organoide auf dem Einsatz verursacht, wenn die Organoide beginnen, ihrer ursprünglichen 3D-Struktur zu ähneln. Zum Vergleich werden Bilder von traditionellen 2D-Zelllinien auf den permeablen Trägern gezeigt, die üblicherweise für Arzneimittelpermeabilitätsstudien verwendet werden (MDCK-10x; 40x und Caco-2-10x; 20x). Abkürzungen: PLE = proteinverlierende Enteropathie; MDCK = Madin-Darby-Hundeniere. Maßstäbe = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Organoid-Monoschichten wurden auch in 3% Paraformaldehyd-3% Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um die Ultrastruktur der Organoidkultur auf den durchlässigen Trägern zu charakterisieren. Mikroanatomische Strukturen von Mikrovilli und Tight Junctions sind in Abbildung 9 zu sehen.
Abbildung 9: TEM-Bilder von gesunden intestinalen Organoid-Monoschichten bei Hunden. TEM wurde verwendet, um die zelluläre Mikroarchitektur von jejunalen (A), ilealen (B) und kolonen (C) organoiden Monoschichten aufzudecken. Die mikroporöse Membran des durchlässigen Stützeinsatzes ist mit einem gelben Pfeil gekennzeichnet. Das Vorhandensein von Mikrovilli (blauer Pfeil) und Tight Junctions (roter Pfeil) ist in den Bildern dargestellt. Abkürzung: TEM = Transmissionselektronenmikroskopie. Maßstabsstäbe = 5 μm (A), 2 μm (B, C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Sowohl TER-Messungen als auch Lichtmikroskopie sollten durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das System für Permeabilitätstests bereit ist. Der Assay ist einsatzbereit, wenn TEER einen stationären Zustand erreicht, während die Lichtmikroskopie dazu beiträgt, Schäden oder Überwucherungen der Organoide auszuschließen. Eine Zusammenfassung typischer TEER-Messungen von fünf Gruppen, bestehend aus kaninen jejunalen Enteroiden und Kolonoiden, ist in Abbildung 6 dargestellt.
Tabelle 1: Zusammensetzung der Organoidmedien und FAA. Die vollständige Zusammensetzung von CMGF+, CMGF+ R/G und FAA ist in dieser Tabelle zusammengefasst. Abkürzungen: ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; CMGF + R/G = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, angereichert mit ROCK-Inhibitor und GSKiβ; CMGF+ = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, aber ohne ROCK-Inhibitor oder GSKiβ; FAA = Formalin-Essigsäure-Alkohol; EGF = epidermaler Wachstumsfaktor. Diese Tabelle ist von 38 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Tabelle für die Notizen zum Organoid von Hunden, dem durchlässigen Unterstützungssystem. Abkürzungen: TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand; ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; CMGF + R/G = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, angereichert mit ROCK-Inhibitor und GSKiβ; CMGF+ = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, aber ohne ROCK-Inhibitor oder GSKiβ. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
Canine intestinale Organoidkulturen im permeablen Stützapparat sind ein einzigartiges Konzept, das traditionelle Wirkstoffpermeabilitätstests40 mit einem neuartigen In-vitro-Hundemodell 41 verbindet. Verschiedene Arten von intestinalen Organoiden bei Hunden können verwendet und basierend auf dem Ziel des Experiments mit minimalen Anpassungen bewertet werden. Es wird empfohlen, mehrere Konzentrationen des interessierenden Arzneimittels in 3-4 Vertiefungen pro Gruppe zu testen. Die Konzentrationen können auf der erwarteten Darmkonzentration des Arzneimittels basieren. Darüber hinaus kann die Verwendung früherer Forschungsergebnisse dazu beitragen, geeignete Zeitpunkte für das Studiendesign zu bestimmen. Eine angemessene Dokumentation des Studiendesigns sollte vorgenommen werden, um die Replizierbarkeit zu erhöhen und die Fehlerbehebung zu unterstützen.
Diese Technologie hat aufgrund der Neuheit der Methode42 mehrere Einschränkungen, hauptsächlich aufgrund der mangelnden Standardisierung bei der experimentellen Planung und Ausführung des Protokolls in allen Labors. Dieser Mangel an Standardisierung wurde von anderen Gruppen43 anerkannt, und die Canine 3D Organoid Monolayer Protocols werden zu einer Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien führen und die Standardisierung in dieses System einführen. Standardisierte Ansätze zur Datenanalyse verbessern die Replizierbarkeit und können die Ergebnisse vorläufiger Arzneimitteltests mit den Canine-Organoiden im permeablen Trägersystem in verschiedenen Labors verbessern. Dem 3D-Organoidmodell des Hundes fehlen auch Datensätze, die die In-vitro-P-App-Werte von Modellarzneimitteln mit ihrer bekannten in-vivo-Darmabsorption beim Menschen oder Hund vergleichen, ähnlich wie bei Caco-2-Zellen44,45,46. Sobald solche Daten generiert wurden, kann dieses Organoidmodell für Hunde verwendet werden, um die Darmpermeabilität während der Arzneimittelentwicklung zu bewerten.
Es ist wichtig, dass beim Aussäen der Organoide auf dem durchlässigen Unterstützungssystem darauf geachtet wird, eine ausreichend hohe Dichte an entsprechend dissoziierten Zellen zu säen. Die TEER-Werte des Systems sind zuverlässiger und reproduzierbarer, wenn sie in strengen Monolagen gezüchtet werden. Eine längere Kultur der Monoschichten kann zu einem exponentiellen Anstieg der TEER-Werte führen, der weiter von den physiologischen Werten des Darms entfernt ist. H & E-Abschnitte solcher 3D-Strukturen zeigen dann mehrere Zellschichten übereinander mit veränderten Strukturen von Enterozyten, die näher an der Membran liegen.
Nach erfolgreicher Expansion der intestinalen Organoid-Monoschicht des Hundes können die Ergebnisse auf die gleiche Weise wie herkömmliche 2D-Zellassays analysiert werden, indem der scheinbare Permeabilitätskoeffizient (PApp) eines Arzneimittels Formel44 berechnet wird. DerP-App-Wert (siehe Eq (2)) beschreibt die Transportrate über die zelluläre Monoschicht47.
(2)
Die ist 
die Anfangssteigung der Konzentration gegenüber der Zeitkurve (z. B. nmol/s). A ist die Fläche des Einsatzes (cm2) und C0 ist die Anfangskonzentration des Arzneimittels oder der Verbindung in der Spenderkammer37. Die zuverlässige Erkennung der Integrität der Monoschicht ist ein entscheidender Bestandteil des Permeabilitätsassays, der eine Standardisierung erfordert. Lichtmikroskopie und TEER-Messungen werden empfohlen, um Hundeorganoide in einem durchlässigen Stützsystem zu beurteilen und den richtigen Zeitpunkt des Experiments zu bestimmen. Zusätzlich können Null-Molekularpermeabilitätsmarker (z. B. FITC-Dextran, Lucifer Yellow, PEG-400) verwendet werden, um die Integrität der Organoid-Monoschicht funktionell zu bewerten. Es ist darauf zu achten, ob die getestete Verbindung von einem Transporter beeinflusst wird. P-Glykoprotein (P-gp) wird als häufiges Austrittspumpenbeispiel verwendet. Es muss ein Austrittsverhältnis erzeugt werden (Papp,BL-AP/P app,AP-BL) im Vergleich zu einem bekannten P-gp Sondensubstrat.
Die Lichtmikroskopie (glatt oder mit Phasenkontrast verstärkt) ist eine unschätzbare Methode, um die Integrität der 2D- oder 3D-Monoschicht und des Filtereinsatzes zu überprüfen und gleichzeitig ein mögliches zelluläres Überwachsen zu beurteilen. Abbildung 7 kann als Leitfaden für die Erkennung gesunder Organoid-Zellkulturen des Hundedarms dienen. TEER-Werte sind ein wichtiges Maß für die Bildung interzellulärer Verbindungen und die Differenzierung der Organoidkulturen zu einem intakten Darmepithel. Die intestinalen Organoide des Hundes differenzieren sich in Enterozyten und Becherzellen (Abbildung 6). Diese schleimproduzierenden Zellen ermöglichen die Untersuchung von Arzneimittel-Schleim-Interaktionen, was mit herkömmlichen 2D-Zellkulturen nur schwer zu erreichenwar 48. Das Vorhandensein enteroendokriner Zellen wurde zuvor in intestinalen Organoiden von Hunden durch Chandra et al.33 bestätigt.
Eine weitere Charakterisierung der kaninen Organoid-Monoschichten, die von jejunalen, ilealen und kolonalen Organoiden unter Verwendung von TEM abgeleitet sind, wird bereitgestellt. TEM-Bilder zeigen zelluläre Mikroarchitektur, einschließlich Tight Junctions und Mikrovilli-Bildung, was die Komplexität und Nützlichkeit dieser Organoidmodelle in der translationalen Medizin weiter veranschaulicht. Basierend auf den experimentellen Ergebnissen waren die Organoidkulturen auf dem permeablen Träger zwischen den Tagen 11 und Tag 13 nach der Aussaat experimentierbereit (Abbildung 9). Die TEER-Werte lagen zu diesem Zeitpunkt zwischen 1.500 und 2.500Ω,cm 2. Die Plateauphase der TEER-Werte dauert ein sehr begrenztes Zeitfenster, in dem das Experiment gestartet werden muss, bevor die TEER-Werte langsam sinken. TEER-Werte können auch ein entscheidender Bestandteil der Anzeige wichtiger experimenteller Ergebnisse sein, da einige Arzneimittel oder Hilfsstoffe für Arzneimittel mit der Monoschicht interagieren können (z. B. Engstellen), was sich stark auf die TEER-Wertauslesungen auswirken kann. Dies allein kann als Daten für ein Experiment dienen.
Canine Darmorganoide in einem Zweikammer-Zellkulturapparat können aufgrund der einzigartigen Architektur der resultierenden Zellmonoschicht in anderen Bereichen als der oralen Arzneimittelpermeabilität eingesetzt werden. Zum Beispiel können sie in der mikrobiologischen Forschung (z. B. die Auswirkungen der Veränderung der mikrobiellen Gi-Flora), viralen Aufnahmestudien, Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen und Arzneimitteltransportmechanismenverwendet werden 49. Die Spenderkammer ist typischerweise mit dem Testmedikament oder der Verbindung Ihrer Wahl gefüllt, und Aliquots aus der Empfängerkammer werden zu verschiedenen Zeitpunkten eingenommen. Diese Aliquots können mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie, enzymgebundenem Immunsorbensassay oder anderen Techniken analysiert werden, um die Menge und Geschwindigkeit zu bestimmen, mit der der gelöste Stoff die Monoschicht durchdringt.
Diese Studien erfordern eine intakte Monoschicht, um die Arzneimittelpermeabilität genau zu beurteilen. Dies erfordert in der Regel wachsende Monoschichten, die über die zur Berücksichtigung unbrauchbarer Bohrlöcher erforderlichen hinausgehen. Organoidzell-Monoschichten können auch verwendet werden, um die Virusaufnahme entweder von der apikalen oder basalen Seite einer Monoschicht aus zu messen, wobei Auslesungen einschließlich Immunfluoreszenz-Assays enthalten sind, bei denen Antikörper verwendet werden, um die zelluläre Aufnahme des Virus nachzuweisen. Schließlich können mehrere Medikamente (d. H. Substrat und Inhibitor) auf die Spenderkammer aufgetragen werden, um transporterbasierte Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen zu identifizieren.
Basierend auf den aktuellen Beobachtungen werden diese Methoden nicht nur auf Hundeorganoide in Kultureinlagen anwendbar sein, sondern auch für andere veterinärmedizinische Spezies und Organsysteme, wobei geringfügige Änderungen erforderlich sind, um der Spezies oder dem Organmodell der Wahl am besten zu entsprechen. Protokolle für das Organoidwachstum des Hundedarms mussten basierend auf den einzigartigen Eigenschaften der Kultur angepasst werden. So kann das Protokoll an eine andere Spezies angepasst werden, erfordert jedoch subtile Änderungen am Protokoll. Modifikationen können mit Änderungen der Zellaussaatdichte beginnen und sich auf Änderungen in der Medienzusammensetzung ausdehnen, um die interessierenden Organoide richtig zu differenzieren.
Die Standardisierung, die detaillierte Dokumentation der experimentellen Verfahren und die konsistente Überwachung der Zellmonoschichten sind entscheidende Praktiken, die für die durchlässigen Unterstützungsassays erforderlich sind und nicht auf das Hundesystem beschränkt sind. Diese möglichen Spezies- oder Organmodifikationen sind entscheidend für die Dokumentation und Berichterstattung für weitere Fortschritte auf diesem Gebiet. Dieses Modell hat mehrere Einschränkungen, z. B. seine Kostenanforderungen, die Variabilität zwischen den Ringen und begrenzte Daten über die Fähigkeit, die Darmabsorption in vivo vorherzusagen. Hunde besitzen in einigen Fällen andere Drogentransporter und metabolisierende Enzyme als Menschen50.
Darüber hinaus muss das Canine-Organoid-System an einer Vielzahl anderer Zweikammergeräte anderer Hersteller getestet werden, um die Eignung eines solchen Modells zu bestimmen (z. B. muss die Eignung verschiedener Filtermembranzusammensetzungen bestimmt werden). Ein weiterer Nachteil ist, dass der Teil des Drogenpermeabilitätsexperiments des Manuskripts weniger beschreibend ist als die vorherigen Teile. Dies wird durch einen Überschuss an Informationen in diesem Bereich verursacht. Das Ziel für diesen Teil des Manuskripts war es, diese Methoden auf modifizierbare Weise zu beschreiben, ohne die Eckpfeiler dieser Experimente zu schneiden. Detailliertere Informationen zu Permeabilitätsexperimenten wurden von Hubatsch et al.37 gesammelt. Darüber hinaus können durchlässige Einsätze in Kokultur-, Zellmigrations- und Invasionsassay-Experimentenverwendet werden 4.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die intestinalen Organoide des Hundes in Zweikammerkulturapparaten das Potenzial haben, in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt zu werden, einschließlich biomedizinischer Bereiche und translationaler Medizin, um nur einige zu nennen. Die Protokolle schaffen mehrere Strategien, um ein Experiment zu planen und die Zuverlässigkeit von Ringdaten für Organoidmodelle im gesamten Bereich der Biologie zu fördern.
Disclosures
K. Allenspach ist Mitbegründer von LifEngine Animal Health und 3D Health Solutions. Sie ist als Beraterin für Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics und Mars tätig. J.P. Mochel ist Mitbegründer von LifEngine Animal Health und 3D Health Solutions und als Berater für Ceva Animal Health und Ethos Animal Health tätig. Dieser Artikel spiegelt die Ansichten der Autoren wider und sollte nicht so ausgelegt werden, dass er die Billigung, Ansicht oder Politik der Food and Drug Administration darstellt. Andere Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Wir möchten uns bei den Mitarbeitern des Veterinary Diagnostic Laboratory der Iowa State University, nämlich Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green und Jennifer Groeltz-Thrush, für die rechtzeitige Verarbeitung der Proben bedanken. Wir möchten uns auch bei Jodi Smith und Bethann Valentine für die Bereitstellung von Material für die Permeabilitätsexperimente bedanken. Wir möchten auch David Diaz-Reganon für seine Hilfe bei Abbildung 9 danken. Mit Ausnahme von Abbildung 6 wurden alle Zahlen im BioRender.com erstellt. Die Autoren möchten die Unterstützung des Faculty Startup, des ISU VPR Miller Award, des ISU VPR Miller Award und des NSF SBIR Subaward für ISU # 1912948 anerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid media | |||
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (trimethoprim sulfate) | Sigma | T7883-5G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous | Acros Organics | 170080010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-Dextran | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Materials and Equipment | |||
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 9" Pasteur Pipets | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning | 3470 | Permeable Support |
| Millicell ERS (Probes) | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 Voltohmmeter | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Flexible Laboratory Film |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
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