Summary
İnfrapatellar yağ yastığı mezenkimal kök hücreleri (IFP-MSC'ler) diz ekleminin infrapatellar yağ pedinden kolayca izole edilebilir. İn vitro olarak iyi çoğalırlar, CFU-F kolonileri oluştururlar ve adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylara farklılaşırlar. Burada, IFP-MSC'lerin keçi boğucu ekleminden izolasyonu, genişlemesi ve farklılaşması için metodoloji sağlanmaktadır.
Abstract
Diz ekleminde bulunan IFP, umut verici bir MSC kaynağı olarak hizmet eder. IFP, artroskopik prosedürler ve diz protezi ameliyatları sırasında rutin olarak rezeke edildiği ve atıldığı için kolay erişilebilir bir dokudur. Ek olarak, çıkarılması minimal donör bölge morbiditesi ile ilişkilidir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, IFP-MSC'lerin in vitro genişleme sırasında proliferasyon kapasitelerini kaybetmediklerini ve yaştan bağımsız osteojenik farklılaşma potansiyeline sahip olduklarını göstermiştir. IFP-MSC'ler, kemik iliği kaynaklı MSC'lere (BMSC'ler) ve adipoz kaynaklı kök hücrelere (ADSC'ler) kıyasla üstün kondrojenik farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bu hücreler yaşlı ve hastalıklı hastalardan kolayca elde edilebilse de, etkinlikleri sınırlıdır. Bu nedenle, sağlıklı donörlerden IFP-MSC'lerin kullanılması, biyomedikal uygulamalardaki etkinliklerini belirlemek için önemlidir. Sağlıklı bir insan donörüne erişim zor olduğundan, hayvan modelleri temel anlayışı sağlamak için daha iyi bir alternatif olabilir. Köpekler, atlar, koyunlar ve keçiler gibi büyük hayvanlar çeviri araştırmalarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Bunlar arasında, keçinin boğucu eklemi insan diz eklemine en yakın anatomiye sahip olduğu için keçi tercih edilen bir model olabilir. Dahası, keçi-IFP, doku rejenerasyon uygulamaları için gereken daha yüksek MSC sayılarını karşılayabilir. Ayrıca, düşük maliyet, kullanılabilirlik ve hayvan araştırmaları için 3R ilkelerine uygunluk, onları çekici bir model haline getirmektedir. Bu çalışma, IFP-MSC'leri keçilerin boğucu ekleminden ve in vitro kültür koşullarından genişlemeleri ve farklılaşmaları için izole etmek için basit bir protokol göstermektedir. Keçiden aseptik olarak izole edilmiş IFP yıkandı, kıyıldı ve enzimatik olarak sindirildi. Filtrasyon ve santrifüjlemeden sonra, toplanan hücreler kültürlendi. Bu hücreler yapışıktı, MSC benzeri morfolojiye sahipti ve olağanüstü klonojenik yetenek gösterdi. Ayrıca, adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylara farklılaştılar ve çok etkili olduklarını gösterdiler. Sonuç olarak, çalışma, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp uygulamalarında potansiyel gösteren MSC'lerin izolasyonunu ve genişlemesini göstermektedir.
Introduction
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) rejeneratif tıpta hücre bazlı tedaviler için cazip bir adaydır 1,2. Kemik iliği, göbek kordonu, plasenta, diş pulpası ve deri altı yağ dokusu gibi çeşitli doku kaynaklarından toplanabilirler3. Bununla birlikte, yetişkinlerde kök hücrelerin mevcudiyeti sınırlı olduğundan ve izolasyon prosedürleri genellikle invaziv olduğundan (donör bölge morbiditesine neden olduğundan), bu zorlukları aşabilecek alternatif bir kök hücre kaynağına sahip olmak arzu edilir.
Diz eklemi, infrapatellar yağ yastığı kaynaklı MSC'ler, sinovyal membran kaynaklı MSC'ler, sinovyal sıvı kaynaklı MSC'ler, ligament fibroblastları, eklem kondrositleri vb. 4,5,6 gibi çeşitli hücre tiplerinin bir deposudur. Bu hücreler, kas-iskelet sistemi doku mühendisliğine dayalı araştırmalarda yaygın olarak araştırılma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, diz eklemi birden fazla MSC tipinin olası ve güvenilir bir kaynağı olabilir. İnfrapatellar yağ yastığı (IFP) veya Hoffa'nın yağ yastığı olarak bilinen diz ekleminde bulunan yağ deposu, MSC deposunun umut verici ve alternatif bir seçimidir. IFP, diz artroskopisi veya açık diz cerrahisi sırasında rutin olarak rezeke edildiği ve cerrahi atık olarak atıldığı için nispeten kolay erişilebilir ve klinik olarak elde edilebilir bir MSC kaynağıdır. IFP'nin çıkarılması minimal donör bölgesi morbiditesi ile ilişkilidir ve bu da onu çekici bir doku kaynağı haline getirir. Benzer bir fenotipik profile sahip olmakla birlikte, IFP'den (IFP-MSC'ler) MSC'ler, kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerle (BM-MSC'ler)6 karşılaştırıldığında klonojenik potansiyeli arttırmış ve deri altı adipoz türevi kök hücrelere (ADSC'ler)7 kıyasla daha iyi proliferatif kapasiteye sahiptir. İlginç bir şekilde, sinovyal sıvı kaynaklı MSC'lerle (SF-MSC'ler) karşılaştırıldığında, IFP-MSC'ler geç pasajlarda proliferatif kapasitelerini kaybetmez ve geç pasajlarda iki katına çıkma süresi artmaz. Bu, hücre genişlemesi sırasında, IFP-MSC'lerin proliferasyon hızlarından ödün vermeden in vitro doku mühendisliği uygulamaları için yeterince fazla sayıda hücre elde edebileceğini düşündürmektedir8. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, IFP-MSC'lerin, kemik iliği kaynaklı MSC'lere (BMSC'ler) ve adipoz kaynaklı MSC'lere (ADSC'ler) kıyasla, muhtemelen eklem kıkırdağına anatomik yakınlıklarından dolayı, kıkırdak doku mühendisliği için uygunluklarını gösteren 6,7,9,10 ile karşılaştırıldığında üstün kondrojenik farklılaşma potansiyeline sahip olduklarını ileri sürmüştür. Ayrıca, yaştan bağımsız osteojenik farklılaşma potansiyeline de sahiptirler11. IFP-MSC'lerin eklem içi enjeksiyonunun osteoartritli (OA) hastalarda ağrıyı azalttığı ve diz eklemi fonksiyonlarını iyileştirdiği gösterilmiştir 12,13. Ayrıca, patolojik durumlar sırasında inflamatuar sitokinlerin varlığında IFP-MSC'lerin güçlü immünosupresif yanıtları ve gelişmiş immünomodülatör özellikleri de bildirilmiştir6.
IFP-MSC'ler, MSC'lerin umut verici ve alternatif bir kaynağıdır; Bununla birlikte, doku mühendisliği ve rejeneratif tıptaki terapötik yararları nispeten daha az araştırılmıştır. IFP-MSC'ler üzerine yapılan mevcut çalışmalar, insan donörlerinden gelen hücreleri büyük ölçüde kullanmıştır. Bunlar arasında, yakın zamanda yapılan birkaç çalışma, IFP-MSC'leri sağlıklı insan donörlerinden (artritik olmayan hastalar, 17-60 yaş arası)6,14 araştırırken, çalışmaların çoğunda IFP-MSC'ler total diz protezi ameliyatı geçiren yaşlı hastalardan (hastalıklı hastalar, 70-80 yaş) kullanılmıştır. Hem yaşın hem de hastalığın kök hücrelerin normal işleyişini değiştirdiği bilindiğinden (azalmış sayı ve fonksiyonel potansiyel kaybı), bu potansiyel olarak MSC tabanlı çalışmaların sonucunda tutarsızlıklara yol açabilir 7,15,16,17. Buna ek olarak, patofizyolojik koşulları olan hastalardan (örneğin, artrit ve obezite) IFP-MSC'lerin kullanımı da in vitro sağlıklı hücrelerin temel özelliklerini anlamada zorluk çekmekte ve böylece MSC'lere dayalı tedavilerin geliştirilmesinde sınırlayıcı bir faktör olarak işlev görmektedir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, IFP-MSC'lerin sağlıklı donörlerden kullanılması hayati önem taşımaktadır. Sağlıklı bir insan donörüne erişim zor olduğundan, hayvan modelleri daha iyi bir alternatif olabilir. Bu bağlamda, IFP'nin farelerden izole edildiği birkaç çalışma vardır18. Bununla birlikte, normal farelerde yağ yastığının küçük boyutu nedeniyle, ayrıntılı deneysel prosedürleri uygulamak için yeterli doku elde etmek için birden fazla hayvandan elde edilen yağ dokuları birleştirilmiştir19. Bu nedenle, daha fazla sayıda hücre gereksinimini karşılayabilecek ve aynı zamanda hayvan araştırmalarında 3R ilkelerine (rafine etme, değiştirme ve azaltma) uyabilecek büyük bir hayvan modeline ihtiyaç vardır20. Büyük hayvanların kullanımı, translasyonel araştırmalarda önemli etkilere sahiptir. Spesifik olarak, kas-iskelet sistemi doku mühendisliğinde, köpekler, domuzlar, koyunlar, keçiler ve atlar gibi bir dizi büyük hayvan araştırılmıştır21. Keçi (Capra aegagrus hircus), boğucu eklemi insan diz eklemine en yakın anatomiye sahip olduğundan büyük hayvanların mükemmel bir seçimidir22,23,24. Keçilerin subkondral kemik trabeküler yapısı ve subkondral kemik kalınlığı insanlara benzer, kıkırdağın kemiğe oranının da insanlara yakın olduğu bildirilmektedir21. Ek olarak, keçiler dünya çapında yaygın olarak evcilleştirilmiştir, bu da iskeletsel olarak olgunlaştıklarında kolayca kullanılabilir hale getirilmiştir. Ayrıca, düşük bakım maliyetleri ve kolay kullanım, onları araştırma için çekici bir hayvan modeli haline getirmiştir22.
Bu çalışmada, IFP-MSC'lerin Capra aegagrus hircus'un (keçi) boğucu ekleminden izolasyonu ve in vitro kültür koşullarının genişlemesi ve farklılaşması için basit bir protokol gösterilmiştir. İzole hücreler yapışıktır, MSC benzeri morfolojiye sahiptir, CFU-F (koloni oluşturan birim-fibroblast) kolonileri oluşturur ve adipojenik, kondrojenik ve osteojenik farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, IFP-MSC'ler biyomedikal uygulamalar için alternatif bir MSC kaynağı olarak potansiyel göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, IFP-MSC'lerin keçilerden izole edilmesine dayanmaktadır. Keçi IFP ve kanı yerel bir mezbahadan toplandı. Bu tür doku koleksiyonları Kurumsal Hayvan Etiği Kurulu'nun görev alanı dışında olduğundan, etik onay gerekmemiştir.
1. IFP-MSC'lerin keçi dizinin femorotibial ekleminden izolasyonu
- Arka bacakların femoral ve tibial bölgelerinin her birini ~ 15 cm kapsayan keçi femorotibial eklemini (örnek) toplayın. Numuneyi derhal sterilize edilmiş bir numune toplama kutusuna yerleştirin ve daha sonraki işlemler için laboratuvara nakledilmek üzere 4 °C'de saklayın. Numuneleri, prosedür boyunca sterilize edilmiş cerrahi aletler kullanarak bir biyogüvenlik kabininde aseptik olarak işleyin (Şekil 1, Adım 1).
- Numuneyi 150 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve kontaminasyonu önlemek için antibiyotiklerle (5 μg / mL amfoterisin B, 200 U / mL penisilin-streptomisin ve 50 μg / mL siprofloksasin) desteklenmiş otoklavlanmış fosfat tamponlu salin (PBS) ile iyice durulayın. Her zaman numunenin PBS kullanılarak hidratlı tutulduğundan emin olun.
- Numunenin anatomik bölgelerini dikkatlice inceleyin. Eklem kapsülüne erişim kolaylığı için, her iki uzun kemikten gelen ekstra dokuların tamamen çıkarıldığından emin olun (Şekil 1, Adım 2).
- Bunu başarmak için, önce femur kemiğinin uç yüzeyini bir elinizle tutun ve keskin makasla eklem yönünde uzunlamasına kesin. İşlem sırasında çevredeki kasları ve yağ dokusunu kemikten çıkarın. Acil eklem kapsülünü çevreleyen dokunun başlangıçta bozulmadan kalmasına dikkat edin.
- Benzer şekilde, numunenin tibial ucunda başka bir kesi yapın ve kasları ve yağ dokusunu tibial kemikten çıkarın. Hem uzun kemiklerin tamamen açığa çıktığından hem de eklem kapsülünün bu adımdan sonra açıkça görülebildiğinden emin olun (Şekil 1, Adım 3).
- Daha sonra, eklemli eklemi kesmek için sinovyum zarının her iki tarafından bir kesi yapın (Şekil 1, Adım 4). Patellayı hem sinovyum membranından hem de patellar bağlardan taze bir sterilize makas ve forseps partisi kullanarak kesin. Ayrılmış patellayı derhal PBS içeren bir Petri kabında saklayın (Şekil 1, Adım 5).
- Patellanın iç yüzeyinde bulunan tüm yağ yastığını makas ve forseps kullanarak çıkarın ve yağ yastığını başka bir taze Petri kabında toplayın (Şekil 1, Adım 6). Toplanan yağ yastığını bir neşter kullanarak doğrayın. ~2-3 mm'lik mümkün olan en küçük yağ parçalarını/segmentlerini elde etmek için gereken diğer cerrahi aletleri (örneğin, makas veya cerrahi bıçaklar) dahil edin.
NOT: İyi kıyma, iyi bir hücre verimi ile sonuçlanmak için kritik öneme sahiptir. Dokuyu daima nemli tutun ve izolasyon prosedürünün herhangi bir aşamasında kurumasına izin vermeyin. - Bir spatula kullanarak kıyılmış dokuyu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir test tüpü karıştırıcısında 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) antibiyotiklerle desteklenmiş PBS ile yıkayın. Yıkama adımını 3x, her biri 15 dakika tekrarlayın.
- Enzimatik sindirim için, kıyılmış dokuyu (~ 5 g) 1.5 mg / mL tip II kollajenaz (20 mL) içeren ve 12-16 saat boyunca 37 ° C'de% 2 FBS ile takviye edilen Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM düşük glikoz) inkübe edin.
NOT: Çürütmeyi bir test tüpü karıştırıcısında dakikada ~ 15 dönüşte (RPM) gerçekleştirin. - Sindirilmiş dokuyu dikkatlice aspire edin ve sindirilmemiş dokuları çıkarmak için bir hücre süzgecinden (70 μm) süzün. Filtrazı 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 150 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peleti DMEM düşük glikoz ile en az 2x yıkayın.
NOT: Dökülmeyi önlemek için sindirilmiş dokuyu yavaşça süzgecin içine dökün. İyi bir pelet elde etmek için düşük hacimli bir santrifüj tüpü (15 mL) kullanın. - Sonraki adımlarda protokolde genişleme ortamı olarak adlandırılan tam DMEM ortamında (DMEM düşük glukoz takviyeli DMEM düşük glukoz [2.5 μg / mL amfoterisin, 100 U / mL penisilin-streptomisin ve 25 μg / mL siprofloksasin]) yeniden askıya alın.
- Hücreleri 150 mm Petri kapları üzerine tohumlayın ve 5 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve 50 μg / mL 2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzu ile desteklenmiş genleşme ortamında kültürleyin. Hücrelerin yapışmasını ve çoğalmasını sağlamak için% 5'lik bir CO2 inkübatöründe hücreleri 37 ° C'de inkübe edin. Hücrelerin bağlanmasını ve büyümesini günlük olarak izleyin.
2. İzole hücrelerin bakımı ve genişletilmesi
- Hücreler birleşene kadar medyayı her 3 günde bir değiştirin. Ortam her değiştirildiğinde taze 5 ng/mL bFGF ve 50 μg/mL 2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzunu doğrudan Petri kabına ekleyin. Hücreler% 80 -% 90 oranında birleştikten sonra, hücreleri alt kültüre alın.
NOT: Her ortam değişikliği sırasında bağlı olmayan varlıkları kaldırın. 3 günlük inkübasyondan sonra yağ damlacıkları görülürse, hücreleri PBS 1x ile yıkayın ve ardından Petri kabına taze ortam ekleyin. Her ortam değişikliğinden önce yağ damlacıkları tamamen temizlenene kadar PBS yıkama işlemine devam edin. - Hücrelerin alt kültürlenmesi: Genleşme ortamını Petri kabından çıkarın ve hücreleri PBS ile 1x yıkayın. Yemeğe 4 mL% 0.25 tripsin / EDTA ekleyin ve hücreleri% 5 CO 2 inkübatöründe 4 dakika boyunca% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Temas (% 80-% 90) 7 gün içinde elde edilir. Tripsin/EDTA solüsyonunu tripsinizasyon sırasında Petri kabının tüm yüzeyine eşit olarak dağıtın. - Yan taraftaki plakaya dokunarak ve tüm hücrelerin ayrıldığını doğrulamak için mikroskop altında gözlemleyerek hücreleri yerinden çıkarın. Eşit hacimli (4 mL) bir genleşme ortamı ekledikten sonra tripsini nötralize edin.
- Ayrışmış hücreleri taze bir 15 mL polipropilen tüp içinde bir pipet kullanarak toplayın ve RT'de 5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj yapın.
- Daha fazla genişleme için 150 mm Petri kaplarında standart hücre sayma yöntemini ve alt kültürü kullanarak hücreleri 1 x 104 hücre /cm2'lik bir tohumlama yoğunluğunda sayın. Tüm tahliller için, P2-P5 geçiş numarasına sahip hücrelerin birleştirilmiş bir tek katmanını kullanın.
NOT: Kriyoproteksiyon fazla hücreleri korur.
3. IFP-MSC'lerin klonojenik yeteneğinin koloni oluşturma testi (CFU-F) kullanılarak değerlendirilmesi
- CFU-F testi için, genleşme ortamındaki hücreleri, 50-100 hücre /cm2'lik bir tohumlama yoğunluğunda 6 delikli bir doku kültürü plakasında tohumlayın. 3 mL'lik bir son hacim elde etmek için ortam ekleyin.
NOT: Tahliller ve tedavi için hücre konsantrasyonunu optimize edin. - Hücrelerin koloniler oluşturmasına izin vermek için standart kültür koşulları altında% 5'lik bir CO 2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreleri12 gün boyunca kültürleyin. Medyayı her 3 günde bir değiştirin. Medyayı değiştirirken nazik olun.
- 12 gün sonra, kolonileri PBS ile 1x durulayın ve RT'de 20 dakika boyunca% 20 metanol kullanarak% 20 metanol kullanarak sabitleyin.
NOT: Bir koloni, 50'den fazla hücreden oluşan bir küme olarak tanımlanır.
4. IFP-MSC'lerin farklılaşma potansiyeli
- IFP-MSC'lerin adipojenik farklılaşmasının indüklenmesi
- Adipogenezi indüklemek için, hücreleri 24 kuyucuklu bir doku kültürü plakasında 25 x 103 hücre /cm2 yoğunlukta tohumlayın. 500 μL'lik bir son hacim elde etmek için ortam ekleyin. hücreleri% 5'lik bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de kültürleyin.
- Kesinti sonrası bir gün, genleşme ortamını 500 μL adipojenik farklılaşma ortamı ile değiştirin. Hücrelerin akıcılığa ulaşması yaklaşık 2 gün sürer.
- Genişleme ortamını (DMEM +% 10 FBS + 2.5 μg / mL amfoterisin, 100 U / mL penisilin-streptomisin ve 25 μg / mL siprofloksasin) 25 mM D (+)-glikoz, 10 μg / mL insülin, 1 μM deksametazon ve 100 μM indometasin ile destekleyerek adipojenik farklılaşma ortamını hazırlayın.
NOT: Farklılaşma ortamı 1 ay sonra 4 °C'de kararsızdır; Bu nedenle, medyayı gerektiği gibi ve gerektiğinde hazırlayın. - 25 mM D (+) glikoz ile desteklenmiş genleşme ortamında kültürlenmiş hücreleri, indüklenmemiş kontroller olarak düşünün. Medyayı 14 gün boyunca her 3 günde bir değiştirin. 14 günün sonunda, hücreleri PBS ile 1x yıkayın. Hücreleri nötr tamponlu formalin (NBF; PBS'de %4 formaldehit) kullanarak 4 °C'de 15 dakika boyunca sabitleyin.
- Fiksasyonu takiben, kuyucukları 1x damıtılmış suyla yıkayın ve daha sonra RT'de 5 dakika boyunca% 60 izopropanol ile hücreleri inkübe edin. İzopropanolü çıkardıktan sonra, hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 5 dakika boyunca Yağ Kırmızı O boyasının çalışma çözeltisinin 500 μL'si ile inkübe ederek lipit damlacıklarını lekeleyin.
NOT: 100 mL% 99 izopropanol içinde 300 mg ORO'yu çözerek Yağ Kırmızı O (ORO) stok çözeltisini hazırlayın. Çalışma çözeltisini hazırlamak için, üç parça stok ORO ve iki parça damıtılmış suyu karıştırın ve RT'de 10 dakika boyunca karışmasına izin verin. Karışımı 0,2 μm filtre kağıdı kullanarak filtreleyin. Çalışma çözümü kullanıma hazırdır. Stok çözeltisi karanlıkta 1 ay boyunca RT'de hazırlanabilir ve saklanabilirken, çalışma çözeltisinin her kullanım/lekelemeden önce taze olarak hazırlanması gerekir.
- IFP MSC'lerin kondrojenik farklılaşmasının indüklenmesi
- Keçi plazmasının izolasyonu:
- Damıtılmış suda% 3.4 (w / v) sodyum-sitrat hazırlayın. Hazırlanan sodyum sitrat çözeltisinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 5 mL ekleyin.
- Aynı tüpte taze izole edilmiş keçi kanının 45 mL'sini toplayın. Pıhtılaşmayı önlemek için kanı sodyum sitratla iyice karıştırmak için tüpü hemen eğin ve 4 ° C'de laboratuvara taşıyın.
- Toplanan keçi kanını 1000 x g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı (plazma) bir biyogüvenlik kabini içindeki taze bir tüpe aktarın. Plazmayı 0,2 μm filtrelerden, aliquottan süzün ve daha fazla kullanım için -20 ° C'de saklayın.
NOT: Numuneleri tutarken sıcaklığı 2-8 °C olarak koruyun. Plazmanın donma-çözülme döngülerini en aza indirmek önemlidir.
- Genişlemiş hücreleri% 80-90 akıcılığa kadar kültürleyin, tripsin / EDTA çözeltisi kullanarak hücreleri ayırın ve hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 5 dakika boyunca 150 x g'de topaklayın. Peleti keçi plazmasında 50 μL plazma çözeltisi başına 2 x 106 hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın.
- Sterilize edilmiş 90 mm'lik bir Petri kabına bir damla plazma içeren hücre (50 μL) ekleyin ve ardından% 0.3'lük (w / v) son konsantrasyonda kalsiyum klorür ekleyin. Çapraz bağlı plazma hidrojeli üretmek için iyice karıştırın.
- Fabrikasyon hidrojeli 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hidrojelleri kondrojenik ortam içeren 24 delikli doku kültürü plakalarına aktarın.
- DMEM düşük glukozunu 10 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 1.25 mg / mL sığır serum albümini (BSA), 1 mM prolin, 50 μg / mL 2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzu, 100 nM deksametazon, 1x insülin, transferrin, sodyum selenit + linoleik-BSA (ITS + 1), antibiyotikler (2.5 μg / mL amfoterisin, 100 U / mL penisilin-streptomisin ve 25 μg / mL siprofloksasin ile destekleyerek kondrojenik ortam hazırlayın, ve 10 ng/mL dönüştürücü büyüme faktörü- β1 (TGF-β1).
- TGF-β1 olmadan tam DMEM ortamında (% 10 FBS ve antibiyotik [2.5 μg / mL amfoterisin, 100 U / mL penisilin-streptomisin ve 25 μg / mL siprofloksasin] ile DMEM düşük glukoz) kültürlenen hidrojeller indüklenmemiş kontroller olarak kabul edilir. Medyayı 14 gün boyunca her 3 günde bir değiştirin.
- Plazma hidrojellerindeki hücrelerin 14 günlük kondrojenik farklılaşmasından sonra, hidrojelleri PBS 3x ile her biri 5 dakika boyunca yıkayın ve ardından örnekleri NBF'de 3 saat sabitleyin.
DİKKAT: Formaldehit potansiyel bir kanserojendir ve inhalasyon sırasında burun, boğaz ve akciğerlerde tahrişe neden olabilir. Formaldehit ile ilgili tüm prosedürleri bir duman davlumbazında uygulayın. - NBF'yi çıkarın, hidrojelleri PBS 3x ile her biri 5 dakika boyunca yıkayın ve daha sonra çözeltinin numunelere tamamen emilmesini sağlamak için gece boyunca RT'de% 35 (w / v) sakkarozda inkübe edin. Hidrojelleri 3 saat boyunca optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğinde iklimlendirin. Sıvı azot altında silikon kalıplar kullanarak numuneleri OCT bileşiğine gömün.
- Numuneleri jelatin kaplı cam slaytlar üzerinde 10-12 μm kalınlığında bir kriyotom kullanarak kesin ve ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın. Kondrojenik farklılaşmadan sonra hücre dışı matriksin varlığını veya birikimini incelemek için, bölümleri sülfatlanmış glikozaminoglikanlara bağlanan Alcian Blue ve Safranin-O boyası ile boyayın.
NOT: Alcian Blue boyasını hazırlamak için, 1 g Alcian Blue boyasını 100 mL'lik 0.1 N HCl içinde çözün ve gece boyunca bir test tüpü karıştırıcısında iyice karıştırın. Çözüm, karanlıkta 1 ay boyunca RT'de saklanabilir. Safranin-O boyasını hazırlamak için, 0.1 g Safranin-O boyasını 100 mL damıtılmış suda çözün ve gece boyunca bir test tüpü karıştırıcısında iyice karıştırın. - Alcian Blue boyama için, hidrojel bölümlerini 1x, 5 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın. Bölümleri düzeltmek için, slaytlara% 4 NBF ekleyin ve 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- Bölümleri 1x'i 5 dakika boyunca damıtılmış suyla ve daha sonra her biri 30 s için 0,1 N HCl ile 2x'i yıkayın. HCl'yi çıkarın ve slaytları kağıt mendille nazikçe kurulayın. Hazırlanan Alcian Blue lekesini bölümlere ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Bağlanmamış boyayı 0,1 N HCl ile yıkayın ve ardından 3 dakika boyunca damıtılmış su ile yıkayın. Bölümleri mutlak etanolde kurutun, ksilen içinde temizleyin ve son olarak lekeli bölümleri görüntüleme için reçineli bir ortama monte edin.
- Safranin-O boyama için, hidrojel bölümlerini 5 dakika boyunca 1x damıtılmış suyla yıkayın. Bölümleri düzeltmek için, slaytlara% 4 NBF ekleyin ve 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. 1x numaralı bölümleri 5 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın ve ardından slaytları 10-15 s boyunca% 1 asetik aside batırın. Slaytları kağıt mendille nazikçe kurulayın.
- Hazırlanan Safranin-O boyasını bölümlere ekleyin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. Slaytları 5 dakika boyunca% 100 etanol içine batırın. Slaytları hava ile kurutun, ksilen içinde temizleyin ve son olarak lekeli bölümleri görüntüleme için reçineli bir ortama monte edin.
- Keçi plazmasının izolasyonu:
- IFP MSC'lerin osteojenik farklılaşmasının indüklenmesi
- Osteojenik farklılaşmayı indüklemek için, daha önce belirtildiği gibi hücreleri tripsinize edin (Adım 2.2.). Hücreleri 24 kuyucuklu bir doku kültürü plakasında 3 x 103 hücre /cm2 yoğunlukta tohumlayın. 500 μL'lik bir son hacim elde etmek için ortam ekleyin. hücreleri% 5'lik bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de kültürleyin. Tohumlamadan 1 gün sonra, genleşme ortamını 500 μL osteojenik farklılaşma ortamı ile değiştirin.
- Osteojenik ortamı, genleşme ortamını (DMEM +% 10 FBS +2.5 μg / mL amfoterisin, 100 U / mL penisilin-streptomisin ve 25 μg / mL siprofloksasin) 25 mM D (+)-glikoz, 10 nM deksametazon, 10 mM β-gliserofosfat, 50 μg / mL 2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzu ve 10 nM vitamin D3 ile destekleyerek hazırlayın.
NOT: 25 mM D (+) glikoz ile desteklenmiş genleşme ortamında kültürlenen hücreler, indüklenmemiş kontroller olarak kabul edilir. - Osteojenik medyayı 14 gün veya 28 gün boyunca her 3 günde bir değiştirin. 14 günün sonunda, osteogenezin derecesini alkali fosfataz (ALP) boyama ile ölçün.
NOT: Substratı ALP boyamaya hazırlamak için, bir adet 5-Bromo-4- Kloro-3-İndolil Fosfat (BCIP)/Nitroblue Tetrazolium (NBT) tabletini 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 mL damıtılmış suda çözün. Tabletin tamamen çözünmesine izin verin. Substrat çözeltisi kullanıma hazırdır. Substrat çözeltisi daha uzun süre saklanamadığından, ihtiyaca göre, tableti ikiye bölün ve 5 mL damıtılmış suda çözün. Geçirgenlik tamponunu hazırlamak için, damıtılmış suya Tris tamponu (100 mM) ve magnezyum klorür (5 mM) ekleyin. Çözeltiye Triton X100 (% 0.1) ekleyin ve çözünmesine izin verin. Çözeltinin pH'ını 9.25-9.75'e ayarlayın. - ALP boyama için, 14 günlük indüksiyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreleri 1 dakika boyunca NBF (% 4) kullanarak sabitleyin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve hazırlanan lizis tamponunu kullanarak 2-3 dakika boyunca geçirgenlik yapın.
- Hazırlanan substrat çözeltisinden 500 μL'yi hücrelere ekleyin ve ekspresyon seviyesine bağlı olarak 15 dakika ila 1 saat boyunca inkübe etmesine izin verin. Aradaki mor / mavi rengin gelişimini kontrol edin.
- Substrat çözeltisini çıkarın ve damıtılmış suyla yıkayın. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak lekelenmiş hücreleri görüntüleyin.
- 28 günün sonunda, Alizarin Red-S boyama ile osteojenik indüksiyondan sonra kalsifikasyonun derecesini ölçün.
NOT: Alizarin Red-S boyama çözeltisini (40 mM) hazırlamak için, 2 g Alizarin Red-S'yi 100 mL damıtılmış suda çözün ve pH'ı HCl veya NH 4 OH ile 4.1-4.3'e ayarlayın. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir membrandan süzün ve karanlıkta 4 °C'de saklayın. Çözeltinin pH'ı önemlidir; bu nedenle, taze bir çözelti yapılması veya 1 aydan daha eskiyse çözeltinin pH'ının yeniden ölçülmesi önerilir. - Alizarin Red-S boyama için, 28 günlük indüksiyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri soğuk PBS ile 1 kat yıkayın. Hücreleri 4 °C'de 1 saat boyunca% 70 etanol kullanarak sabitleyin.
- Fiksatifi çıkarın ve hücreleri 2 kat damıtılmış suyla yıkayın. Suyu tamamen çıkarın ve her bir kuyucuğa 1 mL Alizarin Red-S çözeltisi ekleyin.
- Hücreleri RT'de 1 saat boyunca çözelti ile inkübe edin ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücreleri görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IFP-MSC'lerin keçinin femorotibial ekleminden izolasyonu
IFP-MSC'lerin bir keçinin boğucu ekleminden izole edilmesinde yer alan adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Patellanın iç eklemlenmeyen yüzeyinde bulunan yağ yastığı çıkarıldı, kıyıldı ve enzimatik olarak sindirildi. IFP-MSC'ler in vitro olarak başarılı bir şekilde izole edildi ve kültürlendi (Şekil 2A).
IFP-MSC'lerin genleşme ve klonojen yeteneği
İzole edilen hücreler in vitro in expansion media olarak kültürlendi. Hücreler, tohumlamadan sonraki 12 saat içinde doku kültürü plakasına yapışmaya başladı ve çoğunlukla 0. günde yuvarlak şekilliydi. Plakaya homojen olarak yapıştılar ve 24 saat içinde uzatılmış morfolojiye ulaştılar. Bu morfoloji, kültür süresince korunmuştur. Hücreler kültürde etkili bir şekilde çoğaldı ve genişlemeden sonraki 6 gün içinde% 80-90 oranında kaynaştı (Şekil 2A). Ek olarak, izole hücreler, koloni oluşturan birim-fibroblast (CFU-F) testi ile değerlendirilen klonojenik kapasite gösterdi (Şekil 2B). Bu sonuçlar, izole hücrelerin in vitro olarak etkili proliferatif ve kendini yenileme yeteneklerine sahip olduğunu göstermektedir.
IFP-MSC'lerin farklılaşma potansiyeli
İzole edilen hücrelerin multipotent olup olmadıklarını ve MSC'lerin karakteristik özelliklerine sahip olup olmadıklarını karakterize etmek için, çoklu soylara farklılaşmaya teşvik edildiler. İzole edilen hücreler, adipojenik soya doğru indüklendiğinde, parlak alan görüntülerinden gözlemlenebileceği gibi, lipit damlacıkları ürettiler (Şekil 3A). Bu, 14. ve 21. günlerde Yağ Kırmızı O boyaması ile daha da doğrulandı ve bu hücrelerin adipositlere farklılaşma yeteneğini düşündürdü. Öte yandan, adipojenik indükleyici faktörlerin yokluğunda kültürlenen hücrelerde gözle görülür bir yağ damlacığı gözlenmemiştir (Şekil 3B,C).
İzole edilen hücrelerin kondrojenik potansiyelini belirlemek için, hücreler plazma hidrojeli içinde kapsüllendi ve kondrojenik soya farklılaşmasına izin verildi. Plazma hidrojelinin brüt görüntülerinden (Şekil 4A) gösterildiği gibi, indüklenen grupta 14 gün sonra oluşan neodoku beyaz ve parlak (eklem kıkırdağına benzer) görünürken, indüklenmemiş grupta soluk beyazdı ve parlaklığın azalması gözlendi. Ek olarak, indüklenen gruptaki hücreler, Alcian Blue (Şekil 4B) ve Safranin O (Şekil 4C) için pozitif histolojik boyama ile kanıtlanan kıkırdak matrisinin (yani, sülfatlanmış glikozaminoglikanlar) ana bileşenlerinden birini salgılayabildiler. Buna karşılık, indüklenmemiş gruplardan gelen hidrojel bölümleri Safranin O ve Alcian Blue boyama için negatifti. Bu sonuçlar toplu olarak MSC'lerin kondrojenik farklılaşma potansiyelini sadece kondrojenik uyaranların varlığında göstermektedir.
İzole hücreler ayrıca osteojenik farklılaşma potansiyeli gösterdi. Kültürde 14 gün 21 gün sonra, spontan mineralizasyon gözlenmedi (indüklenmemiş grup). Bununla birlikte, osteojenik medya ile indüklendiğinde, mineralizasyon, 14 günün sonunda alkalen fosfataz (ALP) için pozitif boyama ile belirgindi (Şekil 5A). Ayrıca, osteojenik ortamda 28 günlük kültürden sonra, kalsifiye birikimler pozitif Alizarin Red-S boyaması ile görselleştirildi (Şekil 5B). Bu sonuçlar, keçi infrapatellar yağ yastığından izole edilen hücrelerin, indüklendiğinde, adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylara farklılaşma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir.
Resim 1: IFP-MSC'nin keçi dizinin boğucu ekleminden izolasyonu için şematik. 1. Adım. Keçi diz örneğini mezbahadan toplayın ve bir biyogüvenlik kabininde diseksiyona devam edin; 2. Adım. Dokunun anatomisini dikkatlice inceleyin ve çevresindeki kasları ve yağ dokusunu çıkarın; 3. Adım. Eklem kapsülünü rahatsız etmeden, hem uzun kemikleri (femur hem de tibia) tamamen açığa çıkarmak için kasları ve yağ dokularını çıkarın; 4. Adım. Sinovyum zarında bir kesi yapın ve patella ve troklear kıkırdak açığa çıkarmak için eklem eklemini kesin; 5. Adım. Patella'yı, infrapatellar yağ yastığını (IFP) rahatsız etmeden eklemli eklemden dikkatlice çıkarın ve PBS içeren bir petri kabı üzerinde tutun; 6. Adım. Tüm yağ yastığını patelladan yavaşça çıkarın ve kıyma ve enzimatik sindirim için taze bir petri kabında saklayın. (a. Femur, b. Tibia, c. Patella, d. Troklear kıkırdak, e. İnfrapatellar yağ yastığı). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: IFP-MSC'lerin morfolojisi ve klonojenik potansiyeli . (A) Mikrograflar, 10x büyütmede ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu kullanılarak 3. pasajda alınmıştır. Tohumlamadan hemen sonra (0. gün), hücreler yuvarlak şekilli kaldı, 3. günde hücrelerin çoğu uzamış morfolojiye ulaştı ve 6. günde IFP-MSC'ler% 80-90 oranında akıcılık haline geldi (Ölçek çubuğu = 100 μm). (B) 12 günlük tohumlamadan sonra kristal menekşe boya ile boyanmış CFU-F kolonilerinin temsili resimleri (n = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: IFP-MSC'lerin adipojenik farklılaşması. Üst panel, indüklenmemiş IFP-MSC'lerin mikrograflarını gösterir ve alt panel, adipojenik soya indüklenen IFP-MSC'leri temsil eder. (A) Adipogenez sırasında lipid vakuol oluşumunu gösteren temsili parlak alan görüntüleri (Ölçek çubuğu = 100 μm). Lipid damlacıklarının (B) 14. gününde ve (C) 21. günde farklılaşmanın Kırmızı O boyamasının temsili görüntüleri (Ölçek çubuğu = 20 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: IFP-MSC'lerin kondrojenik farklılaşması. Üst panel, indüklenmemiş hidrojelden hidrojel yapılarını / bölümlerini gösterir ve alt panel, kondrogeneze maruz kalan hidrojeli temsil eder. (A) TGF-β1 ile desteklenmiş kondrojenik ortamın yokluğunda (indüklenmemiş) veya varlığında (indüklenmiş) kültürde 14 gün sonra plazma hidrojel yapılarının brüt görüntüleri. sGAG bağlayıcı boya (B) Alcian Blue (mavi) ve (C) Safranin O (kırmızı) (Ölçek çubuğu = 100 μm) ile boyanmış 10 μm hidrojel kesitlerinin temsili görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: IFP-MSC'lerin osteojenik farklılaşması. Üst panel indüklenmemiş hücreleri, alt panel ise osteojenik ortamla indüklenen hücreleri gösterir. 14 gün sonra (A) BCIP-NBT (alkali fosfataz) ve (B) 28 günlük farklılaşmadan sonra (B) Alizarin Red-S (kalsiyum birikimi) ile boyanmış IFP-MSC'lerin mikrografları ve temsili görüntüleri (Ölçek çubuğu = 100 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokolde, MSC'lerin keçi IFP'den izolasyonu için basit, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlanmıştır. Bu yöntemle izole edilen hücreler, in vitro doku rejenerasyonu için önceki çalışmalarımızda başarıyla kullanılmıştır. İzole edilen hücrelerin proliferatif oldukları, çeşitli büyüme faktörlerine yanıt verdikleri ve elektrospun lifleri ve iskeleler üzerine tohumlandıklarında biyolojik aktivitelerini korudukları gözlenmiştir25,26. Ayrıca, eklem kıkırdağının in vitro 27,28,29 mühendisliğini yapmak için enjekte edilebilir hidrojellerde kondrositlerle birlikte çok sayıda yüksek kaliteli MSC'nin elde edilebileceği ve birlikte kültürlenebileceği gözlenmiştir. Hücrelerin diseksiyonu ve izolasyonu prosedürü basit olsa da, MSC'lerin IFP'den başarılı bir şekilde izole edilmesi ve genişletilmesi için dikkatle izlenmesi gereken birkaç adım vardır. İlk olarak, numuneyi mezbahadan getirirken gerçekten aseptik koşulları korumak mümkün olmadığından, izolasyon prosedürüne başlamadan önce dokuyu sterilize etmek için dış dokunun% 70 etanol ile silinmesi önerilir. Bir sonraki önemli adım, yağ yastığının diz ekleminden çıkarılmasıdır. IFP, diz eklemindeki patellanın altında bulunur. IFP'nin proksimal ucu patella30,31'in distal ucuna bağlanır. Bu nedenle, izolasyon prosedürünü uygularken patellanın doğru yerini belirlemek çok önemli hale gelir. Daha sonra, IFP femurdaki troklear kıkırdak ile eklemlendiğinden ve sinovyum membran30,31 ile kaplandığından, diz eklemini açmak için sinovyum zarına bir kesi yapmak gereklidir. Toplanan infrapatellar yağ yastığının genel sağlığını gözlemlemek de çok önemlidir. IFP, adipositlerden (hücreler) ve kollajen ve glikozaminoglikanlar gibi yağ bağ dokusundan oluştuğundan, dokuhücreleri serbest bırakmak için kollajenaz enzimi kullanılarak kıyılır ve sindirilir 9,32. Yüzen adipositler, homojen bir MSC kültürüne sahip olmak için yavaş bir hızda santrifüjleme ile ayrılır. Stromal vasküler fraksiyonda kalan adipositler, taze ortam eklenmeden önce hücre tek katmanının PBS ile yıkanmasıyla her ortam değişiminde doku kültürü plakasından çıkarılmalıdır. Bu adımın tüm görünür adipositler çıkarılana kadar devam etmesi gerekir. P0 hücreleri, plaka duvarına yapışmış olabilecek ve çıkarılması zor olan kalan adipositlerden kurtulmak için akıcılığa ulaştıktan sonra hücrelerin yeni bir plakada yeniden tohumlanması önerilmektedir. Son olarak, keçi örnekleri çoğunlukla bir mezbahadan elde edildiğinden, keçinin tam yaşını izlemek zordur ve bu nedenle, hücreleri izole ederken, numuneler arasındaki varyasyonun dikkatlice gözlemlenmesi ve belgelenmesi gerekir. Çeşitli uygulamalar ve mekanik çalışmalar için kullanılmadan önce hücrelerin her izolasyondan sonra kendini yenileme (CFU-F), proliferasyon ve farklılaşma potansiyeli açısından karakterize edilmesi önerilmektedir. Hücre bazlı doku mühendisliği uygulamalarında çok sayıda hücreye ihtiyaç duyulması nedeniyle, çoğalmayı kolaylaştıran, yaşlanmayı geciktiren ve hücrelerin köklülüğünü koruyan kültür koşulları merkezi olarak önem kazanmaktadır. 2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzu (PAA) ve bazik fibroblast büyüme faktöründe (bFGF) kültürlenen MSC'lerin, yalnızca bFGF'de kültürlenen MSC'lere kıyasla sayılarında ~ 42 kat artış gösterdiği gözlenmiştir. Ek olarak, PAA ve bFGF'nin birlikte tedavisi, kök hücrelerde reaktif oksijen türlerinin üretimini (antioksidan özelliklerinden dolayı) ve yaşlanmayı azaltmıştır. Bu nedenle, MSC'lerin in vitro genişlemesi sırasında PAA kullanımı arzu edilir33.
Dokuların enzimatik sindirimi evrensel olarak kullanılırken ve MSC'leri izole etmek için etkili bir yöntem iken, kollajenazlar gibi enzimlerin kullanımı zaman alıcı ve pahalıdır34. Bu çalışmada, kollajenaz kullanılarak dokunun tamamen sindirimi 12-16 saat (bir gecede) sürdü, bu da hücrelerin canlılığının azalmasına veya yüzey fenotipinin değişmesine neden olabilir35. Bu nedenle, yöntem doku sindirimi için kollajenaz tedavisinin süresini azaltmak için daha da optimize edilebilir. Alternatif olarak, adipoz türevi MSC'lerin lipoaspiratlardan veya inguinal yağ yastıklarından izolasyonu için kullanılan enzimsiz bir eksplant kültürü yöntemi de IFP-MSC'lerin izolasyonu için araştırılabilir34,36,37.
IFP-MSC'ler, kondrojenik, adipojenik ve osteojenik soylara farklılaşma yetenekleri nedeniyle geniş terapötik potansiyele sahiptir. Önceki raporlar, IFP-MSC'lerin diğer kök hücrelerden daha iyi kondrojenik potansiyel sergilediğini göstermiştir 6,7,9,10. Bu nedenle, IFP-MSC'ler ilgi kazanmıştır ve osteoartritte kıkırdak defektlerinin onarımı ve kıkırdak yıkımının hafifletilmesi için hücre bazlı tedavi için daha iyi bir aday olarak kabul edilmektedir. Klinik öncesi bir çalışmada, IFP-MSC'lerin eklem içi enjeksiyon yoluyla kıkırdak hücre dışı matriks bileşenleri ile birlikte verilmesi, osteokondral defektlerde kıkırdak rejenerasyonunun artmasına neden olmuştur38. Benzer şekilde, tavşan osteoartriti (OA) modelinde IFP-MSC'lerin eklem içi enjeksiyonu, aşağıdaki hastalık parametrelerinde bir azalmaya yol açmıştır: kıkırdak yıkımı, osteofit oluşumu, subkondral kemik kalınlaşması ve sinovit39. Ayrıca, daha önce bildirilen randomize bir klinik çalışma13 ve yakın zamanda yayınlanan açık seviye faz 1 klinik çalışma40'tan elde edilen sonuçlar, diz osteoartritli hastalarda IFP-MSC'lerin eklem içi enjeksiyonlarının güvenli olduğunu ve ağrının azalmasına ve eklem fonksiyonunun iyileşmesine neden olduğunu göstermiştir. IFP-MSC'lerin ayrıca, bir enflamatuar düzenleyici olan P Maddesinin (SP) bozulmasını kolaylaştırarak, proinflamatuar ve katabolik moleküllerde bir azalmaya yol açarak proinflamatuar ipuçlarının varlığında artırılmış immünomodülatör özellikler geliştirdiği ve sonuç olarak, sinovyum ve IFP6'nın inflamasyon ve fibrozunun tedavisinin iyileştirilmesine yol açtığı gösterilmiştir. . Daha da önemlisi, düzenleyici uyumlu koşullarda işlenen IFP-MSC'ler, standart in vitro kültür koşullarına kıyasla daha iyi proliferasyon, farklılaşma kapasitesi ve immünomodülatör özellikler göstermiştir; bu, mezenkimal kök hücre (MSC) tabanlı tedavi için kullanıldığında klinik başarı potansiyellerini göstermektedir41.
Sonuç olarak, mevcut protokol, infrapatellar yağ yastığı (IFP) kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) keçi boğucu ekleminden enzimatik sindirim ile izole edilmesini ve kültürde bakımını açıklamaktadır. İzole hücreler proliferatif ve kendini yenileme potansiyeline sahiptir ve adipojenik, osteojenik ve kondrojenik soylara farklılaşabilir. IFP-MSC'ler umut verici bir MSC kaynağıdır ve rejeneratif tıp uygulamaları için translasyonel potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
SH, IIT Kanpur Enstitüsü Doktora Sonrası Bursu ve DST'den (SEED Bölümü) SYST hibesinin desteğini kabul etmektedir (SP / YO / 618 / 2018). , Hindistan Teknoloji Enstitüsü-Kanpur'u (IIT-Kanpur) bir Enstitü bursu için kabul eder. DSK, Gireesh Jankinath Başkan Profesörlüğünü ve Hindistan Biyoteknoloji Bölümü'nü finansman için kabul etti (BT/PR22445/MED/32/571/2016). , SH ve DSK, IIT-Kanpur'daki Mehta Tıp Mühendisliği Aile Merkezi'ne cömert destekleri için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
References
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22 (2019).
- Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349 (2020).
- Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
- Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
- Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864 (2019).
- Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
- Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295 (2016).
- Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873 (2016).
- Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
- Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
- Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
- Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
- Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44 (2021).
- Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323 (2019).
- Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
- Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
- Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
- Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
- Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
- Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19 (2016).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
- Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256 (2021).
- Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
- Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
- Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
- Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
- Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
- Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
- Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
- Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
- Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
- Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013 (2020).
