Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Abstract

Micropattern tractiemicroscopie maakt controle van de vorm van enkele cellen en celclusters mogelijk. Bovendien maakt de mogelijkheid om op de micrometerlengteschaal te patroon het gebruik van deze patrooncontactzones mogelijk voor het meten van tractiekrachten, omdat elke microgepatterde stip de vorming van een enkele focale adhesie mogelijk maakt die vervolgens de zachte, onderliggende hydrogel vervormt. Deze aanpak is gebruikt voor een breed scala aan celtypen, waaronder endotheelcellen, gladde spiercellen, fibroblasten, bloedplaatjes en epitheelcellen.

Deze review beschrijft de evolutie van technieken die het mogelijk maken om extracellulaire matrixeiwitten op polyacrylamidehydrogels te printen in een regelmatige reeks stippen van vooraf gespecificeerde grootte en afstand. Omdat patronen op micrometerschaal moeilijk direct op zachte substraten kunnen worden afgedrukt, worden patronen eerst gegenereerd op stijve glazen afdekkingsplaten die vervolgens worden gebruikt om het patroon tijdens de gelation naar de hydrogel over te brengen. Eerst wordt de oorspronkelijke microcontactprintbenadering beschreven om arrays van kleine stippen op de coverslip te genereren. Een tweede stap die het grootste deel van het patroon verwijdert om eilanden van kleine stippen te verlaten, is nodig om de vormen van cellen en celclusters op dergelijke arrays van patroonstippen te regelen.

Vervolgens wordt een evolutie van deze benadering beschreven die het mogelijk maakt om eilanden van stippen te genereren met behulp van een enkele subtractieve patroonstap. Deze aanpak is sterk vereenvoudigd voor de gebruiker, maar heeft het nadeel van een kortere levensduur voor de hoofdmal die nodig is om de patronen te maken. Ten slotte worden de computationele benaderingen beschreven die zijn ontwikkeld voor de analyse van afbeeldingen van verplaatste stippen en daaropvolgende door cellen gegenereerde tractievelden en worden bijgewerkte versies van deze analysepakketten verstrekt.

Introduction

De meeste celfenotypen oefenen tractiekrachten uit op hun omgeving. Deze trekkrachten worden gegenereerd door het contractiele cytoskelet van een cel, een netwerk van actine en myosine, en andere filamenteuze biopolymeren en crosslinking eiwitten 1,2,3,4. Krachten die in de cel worden gegenereerd, kunnen worden overgedragen op de extracellulaire omgeving of aangrenzende cellen, voornamelijk via transmembraaneiwitten zoals respectievelijk integrinen en cadherinen 5,6. Hoe een cel zich verspreidt of samentrekt - en de grootte van de tractiekrachten die met die bewegingen gepaard gaan - is het resultaat van een intiem gesprek met zijn omgeving, dat grotendeels afhangt van het type en de hoeveelheid eiwit dat aanwezig is in de extracellulaire matrix (ECM)7,8 en de stijfheid van de ECM. Tractiekrachtmicroscopie is inderdaad een waardevol hulpmiddel geworden voor het begrijpen van de reactiesnelheid van cellen op lokale stimuli zoals substraatstijfheid, opgelegde mechanische spanningen en spanningen, of contact met andere cellen. Deze informatie is direct relevant voor het begrip van ziekten zoals kanker en astma 9,10,11,12.

Een systeem dat kan worden gebruikt om door kracht geïnduceerde vervorming van een substraat met bekende materiaaleigenschappen te meten, is vereist om tractiekrachten te berekenen. Deze veranderingen moeten in de loop van de tijd worden gevolgd, waarvoor zowel beeldvormings- als beeldverwerkingstechnieken nodig zijn. Een van de eerste methoden die werd gebruikt om cellulaire tractiekrachten te bepalen, was de observatie en analyse van de contractie van collageenhydrogels bezaaid met cellen, hoewel deze methode slechts semikwantitatief was13. Een andere, meer verfijnde methode was het meten van de trekkrachten die door afzonderlijke cellen werden uitgeoefend door de krachten te bepalen die het gevolg waren van de vervorming van een dun vel siliconen14. Later werden meer kwantitatieve meettechnieken ontwikkeld en deze methoden maakten ook het gebruik van zachte hydrogels zoals polyacrylamide (PAA)12,15,16 mogelijk. Bij gebruik van deze zachte materialen konden tractiekrachten worden bepaald uit de door kracht geïnduceerde verplaatsing van willekeurig verplaatste kralen ingebed in de hydrogel en de mechanische eigenschappen van de gel 16,17. Een andere vooruitgang kwam met de ontwikkeling van micropostarrays gemaakt van zacht polydimethylsiloxaan (PDMS), zodat hun afbuiging kon worden gemeten en omgezet in kracht met behulp van de bundeltheorie18.

Ten slotte werden methoden voor micropatterning van zachte hydrogels ontwikkeld, omdat deze benaderingen controle van de contactgebieden voor celadhesie mogelijk maken. Door de vervorming van het micropatroon binnen het contactgebied van een cel te meten, konden tractiekrachten eenvoudig worden berekend omdat een krachtvrij referentiebeeld niet nodig is19. Deze methode is op grote schaal toegepast omdat het de indirecte patroonvorming van een regelmatige reeks micron-sized, discrete fluorescerende eiwitadhesiepunten op PAA-gels mogelijk maakt voor het meten van cellulaire tractiekrachten20. Om deze krachten te berekenen, is een beeldverwerkingsalgoritme ontwikkeld, dat de bewegingen van elke microgepatterde stip kan volgen zonder gebruikersinvoer te vereisen21.

Hoewel deze methode eenvoudig is voor het maken van hele rasters van puntpatronen, is het ingewikkelder wanneer patronen van geïsoleerde patches (of eilanden) van stippen gewenst zijn. Microgepatterde eilanden zijn nuttig wanneer controle van de vorm en tot op zekere hoogte van de grootte van clusters van cellen nodig is. Om deze eilanden te maken, vereist de bovengenoemde methode van microcontactafdrukken twee verschillende stappen: i) het gebruik van één PDMS-stempel om een high-fidelity patroon van stippen op een coverslip te maken, en vervolgens ii) het gebruik van een tweede verschillende PDMS-stempel om de meeste van die stippen te verwijderen, waardoor geïsoleerde eilanden van stippen21 achterblijven. De moeilijkheid om eilanden te creëren met deze originele methode wordt nog verergerd door het feit dat het maken van consistente rasterpatronen in de eerste stap van het proces op zichzelf een uitdaging is. Microprinting stempels zijn samengesteld uit een reeks cirkelvormige microposten, waarvan de diameter overeenkomt met de gewenste puntgrootte. Deze stempels worden vervolgens gecoat met een gelijkmatige laag eiwit en vervolgens met een precieze hoeveelheid druk op behandelde coverslips gestempeld om het gewenste patroon te creëren. Aan de ene kant kan het uitoefenen van te veel druk op de stempel resulteren in ongelijke eiwitoverdracht en slechte patroongetrouwheid als gevolg van knikken of verzakkingen tussen pilaren, wat leidt tot contact met het glas. Aan de andere kant resulteert het uitoefenen van te weinig druk in weinig tot geen eiwitoverdracht en slechte patroongetrouwheid. Om deze redenen is een overdrachtsproces gewenst dat kan worden gebruikt om consequent hoogwaardige micropatronen van geïsoleerde eilanden van stippen in slechts één stap te maken.

Hierin wordt een methode beschreven voor het indirect micropatteren van eilanden van micron-formaat fluorescerende eiwitadhesiepunten op een PAA-gel die consistenter en veelzijdiger is dan eerder ontwikkelde methoden. Terwijl oudere indirecte micropatterningmethoden afhankelijk zijn van de overdracht van eiwitpatronen van een PDMS-stempel naar een tussensubstraat, gebruikt de hier geïntroduceerde methode PDMS-stempels in plaats daarvan als een vat voor eiwitverwijdering, niet voor toevoeging. Dit wordt gedaan door eerst de structuur van de gebruikte PDMS-stempels fundamenteel te veranderen. In plaats van stempels te maken die zijn samengesteld uit een patroon van gelijkmatig verdeelde cirkelvormige pilaren, zijn stempels opgebouwd uit een patroon van gelijkmatig verdeelde cirkelvormige gaten in deze methode.

Met deze nieuwe structuur kan het oppervlak van deze PDMS-stempels vervolgens worden behandeld met glutaaraldehyde zoals eerder beschreven 20,29,30, waardoor de stempel covalent kan binden met eiwit. Bij gebruik op een glazen afdekplaat gelijkmatig gecoat met fluorescerend eiwit, worden deze met glutaaraldehyde behandelde PDMS-stempels gebruikt om het grootste deel van het eiwit op het oppervlak van de coverslip te verwijderen, waardoor alleen het gewenste patroon van stippen achterblijft dat vooraf wordt bepaald door de locatie van gaten ter grootte van micron op de stempel. Deze verandering verhoogt het slagingspercentage voor het genereren van patronen die bestaan uit een bijna continu raster van stippen en voor het creëren van geïsoleerde eilanden van stippen door slechts één stap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Creatie van siliconen masters

OPMERKING: Het grootste deel van het proces van het ontwerp, de creatie en het oplossen van problemen met siliciummasters voor het herhaaldelijk vormen van PDMS-stempels is eerder behandeld21, dus alleen belangrijke verschillen in deze nieuwe aanpak zullen hier worden beschreven.

  1. Maak het ontwerp voor het fotomasker met Behulp van AutoCAD of soortgelijke ontwerpsoftware. Bedek één kant van het fotomasker, een dun stuk glas, met een dunne laag chroom om de verstrooiing van UV-licht te beheersen. Ontwerp het fotomasker zo dat het schijnen van UV-licht erdoorheen op de gekozen fotoresist een siliconenmaster creëert met het omgekeerde van de gewenste functies op de uiteindelijke PDMS-stempels. Zie figuur 1 voor het ontwerp van dit masker.
    OPMERKING: Of de gewenste functies of het gebied daarbuiten transparant moeten worden gemaakt op het fotomasker, hangt af van de gekozen fotoresist. De fotoresist die hier wordt gebruikt is SU-8 2005 (LET OP: brandbaar, huid- en oogirritant; uit de buurt houden van hitte / vlammen / vonken en beschermende handschoenen en brillen gebruiken bij het hanteren), een negatieve fotoresist die in staat is om 5 μm hoge functies te maken met bijna verticale zijwanden.
    1. Hard de negatieve fotoresist uit door deze bloot te stellen aan UV-licht en de niet-uitgeharde SU-8 te verwijderen met een chemisch oplosmiddel. Ontwerp daarom de primaire kenmerken van het masker om transparant te zijn terwijl de omgeving van het masker ondoorzichtig is.
    2. Ontwerp voor deze nieuwe verwijderingsmethode het fotomasker zo dat het is samengesteld uit twee vierkanten van 1,5 x 1,5 cm (figuur 1A), een vol met een even raster van 2 μm cirkels van 6 μm van midden tot midden, en een andere bestaande uit vele vierkante eilanden die kleinere, geïsoleerde versies van datzelfde rasterpatroon zijn (figuur 1B). Maak eilanden van de volgende groottes: 6 x 6 stippen, 12 x 12 stippen, 25 x 25 stippen en 42 x 42 stippen.
      OPMERKING: De diameter van de adhesiepunten (2 μm) werd gekozen op basis van eerdere studies die cellulaire tractiekrachtenvan 22,23 maten. Het masker dat hier wordt gebruikt, is 101,6 x 101,6 mm en is aan één kant bedekt met een 0,06 μm dikke laag chroom, wat wordt aanbevolen vanwege de kleine kenmerken van de master. Het hier gebruikte fotomasker is gemaakt in opdracht van een externe fotomaskerdrukkdrukkerij.
  2. Bekleed in een cleanroom de gekozen siliconenwafer gelijkmatig met fotoresist. Als een optionele stap, behandel de wafer aan het oppervlak in een plasma-asher voordat u deze bedekt met resist.
    OPMERKING: Hier worden wafers met een diameter van 100 mm gebruikt. Behandeling in een plasma-asher maakt de wafer vatbaarder voor binding aan SU-8 en helpt delaminatie van SU-8 uit de wafer te voorkomen.
  3. Voer de volgende stappen uit volgens de instructies van de fabrikant van de fotoresist:
    1. Draai aan de gecoate wafer om de gewenste functiedikte te creëren, waarbij de spintijd wordt gevarieerd op basis van de gewenste dikte en het type weerstand. Voor een 5 μm dikke SU-8 2005, verdeel het aanbevolen spinprogramma in de volgende drie stappen:
      1. Bekleed de wafer met fotoresist door gedurende 10 s met een helling van 100 RPM/s bij 500 RPM te draaien.
      2. Verminder de weerstandsdikte tot ongeveer 5 μm door de wafer met 3.000 RPM te laten draaien met een helling van 300 RPM/s gedurende 30 s.
      3. Vertraag de wafer langzaam na het draaien door de snelheid te verlagen tot 0 RMP met een helling van 500 RPM / s gedurende 1 s.
    2. Bereid de resist voor op UV-blootstelling door het kort te bakken op een hete plaat van 95 °C. Wijzig de tijd die op de kookplaat wordt doorgebracht volgens de gewenste dikte van de weerstand; baktijd is 2 min voor een 5 μm dikke SU-8 2005.
    3. Stel de weerstand bloot aan UV-licht om de gewenste functies volledig uit te harden. Wees op uw hoede voor overbelichting, omdat dit SU-8 broos kan maken en de algehele kwaliteit van de resulterende master kan beïnvloeden.
      1. Gebruik blootstellingsenergie van 105 mJ/cm2 voor een 5 μm dikke SU-8 2005. Bereken op basis van het vermogen van de beschikbare UV-lamp de belichtingstijd door de blootstellingsenergie te delen door het vermogen van de lamp in mW.
        OPMERKING: Aangezien de lamp die hier wordt gebruikt een vermogen van 8 mW heeft, moet de belichtingstijd 13,1 s zijn.
    4. Om de SU-8-functies na ontwikkeling in te stellen, bak je opnieuw op een hete plaat van 95 °C, dit keer gedurende 3 minuten. Wacht tot de gewenste kenmerken van de master binnen 1 minuut tijdens deze bakstap verschijnen als de weerstand goed is blootgesteld.
    5. Verwijder de niet-uitgeharde SU-8 uit de siliciumwafer met behulp van su-8 developer. Wees grondig bij het verwijderen van de niet-uitgeharde SU-8, omdat deze vast kan komen te zitten tussen de micron-formaat en gespreide functies op de wafer.
      LET OP: SU-8 ontwikkelaar is een brandbare huid en oog irriterend; houd het uit de buurt van hitte / vlammen / vonken en gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren ervan.
    6. Spoel na de ontwikkeling af met aceton om overtollige ontwikkelaar op de wafer te verwijderen en droog deze volledig met een stikstofspuitpistool.
      LET OP: Aceton is een brandbare huid- en oogirritant; houd het uit de buurt van vlammen /vonken en gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren ervan.
    7. Optioneel, voor SU-8 2005, bakken op een 200 °C hete plaat gedurende 10 min.
      OPMERKING: Deze harde bak voegt mechanische sterkte toe aan de fotoresist.
  4. Nadat u hebt laten afkoelen, plaatst u de wafer in een waferdragerlade en giet u deze vervolgens in PDMS. Voltooi eerst een silanisatiebehandeling op de wafer om de SU-8-kenmerken van de siliciummaster minder snel te binden aan PDMS en dus minder snel van het oppervlak van de wafer te verwijderen.
    1. Om de silanisatie-oppervlaktebehandeling te voltooien, plaatst u de master en een kleine glazen afdekplaat in een exsiccator die alleen is bedoeld voor gebruik met silaan. Plaats 1-2 kleine druppels trichloorf (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan op de afdekplaat, sluit de exsiccator en laat deze gedurende 30 minuten onder vacuüm lopen bij een druk van 4.500 Pa24.
      LET OP: Trichloorm (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan is een ontvlambare huid- en oogirritant; houd het uit de buurt van hitte / vlammen / vonken, gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren en werk onder een zuurkast.
    2. Zet het vacuüm uit en laat de master en coverslip nog 30 minuten in de exsiccator zitten.
      OPMERKING: De master is nu klaar voor casting in PDMS.

2. Subtractief microcontact printen

  1. Meng PDMS in de juiste verhouding van uithardingsmiddel tot basis op basis van de instructies van de fabrikant. Laat het 15 minuten op kamertemperatuur en druk staan; ontgass vervolgens onder vacuüm gedurende 15 minuten.
  2. Giet het PDMS in de master en plaats het in een incubator die 's nachts op 37 °C is ingesteld om uit te harden.
  3. Haal de master uit de couveuse en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur.
  4. Terwijl de master afkoelt, soniceer je 25 mm coverslips in ethanol gedurende 10 minuten. Gebruik evenveel coverslips als het aantal postzegels dat wordt voorbereid.
  5. Spoel 25 mm coverslips grondig af met gedeïoniseerd (DI) water en droog met een gefilterd luchtpistool.
  6. Plasma behandel de coverslips gedurende 1 min met behulp van een plasmareiniger onder vacuüm op hoog (radiofrequentievermogen van 30 W). Zorg ervoor dat u het vacuüm na de behandeling langzaam loslaat om te voorkomen dat de dekenslips in de kamer bewegen.
    OPMERKING: Plasmabehandeling van het glasoppervlak dient twee doelen: het reinigt het oppervlak van het glas om verontreinigingen te verwijderen en genereert op zuurstof gebaseerde polaire groepen op het oppervlak van het glas om het hydrofoob te maken25. Deze hydrofobiciteit maakt het oppervlak van het glas vatbaarder voor eiwitbinding.
  7. In een ruimte zonder direct zonlicht/bovenlicht, bedekt u elke afdekplaat met 100 μL fluorescerend gelabelde eiwitoplossing in een concentratie van ten minste 100 μg/ml, dek af voor extra bescherming tegen licht en laat u deze 20 minuten zitten.
    OPMERKING: Hier wordt fibronectine geïsoleerd uit menselijk plasma en geverfd met AlexaFluor 488 gebruikt.
    1. Om fibronectine te verven, combineert u ongelabelde fibronectine met een bekende concentratie en volume met de juiste hoeveelheid fluorescerende kleurstof in een buis van 1,5 ml. Bedek de buis met aluminiumfolie om de kleurstof tegen licht te beschermen en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, meng voorzichtig elke 10 minuten door de buis 5-10 keer ondersteboven te draaien.
      OPMERKING: De benodigde hoeveelheid kleurstof varieert op basis van de gebruikte kleurstof en de massa eiwit die wordt gebruikt. Zie Aanvullend bestand 1 voor de rekenmachine die wordt gebruikt om de juiste hoeveelheid kleurstof voor fibronectine te bepalen die is gelabeld met Alexa 488. Volgens de instructies van de fabrikant kan overtollige kleurstof worden uitgefilterd met behulp van ontzoutingskolommen (zie de tabel met materialen).
  8. Spoel elke coverslip grondig af met DI-water en verwijder overtollig water van het oppervlak door voorzichtig op de zijkanten van elke coverslip op een papieren handdoek of vergelijkbaar absorberend materiaal te tikken. Laat de dekens minstens 30 minuten onbedekt in het donker om ze volledig te laten drogen.
  9. Terwijl de met eiwitten gecoate coverslips drogen, verwijdert u de PDMS-stempel van de master door deze te snijden met een scalpel of een ander scherp mes.
    OPMERKING: Het is het beste om niet te proberen het PDMS bij de eerste poging door te snijden, omdat het toepassen van zoveel druk de siliciumwafer zal kraken en de master zal beschadigen.
  10. Plasma behandel de PDMS-stempels gedurende 2 minuten onder vacuüm op hoog (radiofrequentievermogen van 30 W).
  11. Plaats de stempels in een container met deksel in een zuurkast en bekleed elke stempel met een zeer dunne laag (<100 μL) van 10% (3-aminopropyl)trimethoxysilaan (3-APTMS) verdund in 100% ethanol.
    LET OP: 3-APTMS is een brandbare huid- en oogirritant; houd het uit de buurt van vlammen /vonken, gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren en werk onder een zuurkast. Overmatige coating van 3-APTMS-oplossing zal ervoor zorgen dat zich later in dit proces een oranje film vormt. Deze 3-APTMS-oppervlaktebehandeling integreert de amine-functionaliteit in het oppervlak van de PDMS-stempel, waardoor het oppervlak van de stempel later op26 verder kan worden gederivatiseerd.
  12. Bedek de container met de stempels en laat ze 5 minuten op kamertemperatuur staan.
  13. Spoel met DI-water elke stempel aan beide zijden grondig af.
  14. Leg de stempels in een schone container en bestrijk ze royaal met 2,5% glutaaraldehyde in DI-water.
    LET OP: Glutaaraldehyde is giftig; gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren en werken onder een zuurkast). Deze glutaaraldehydebehandeling naast de vorige 3-APTMS-behandeling biedt aldehydefunctionaliteiten op het oppervlak van de PDMS-stempels, die kunnen reageren met de aminegroepen in de eiwitten om een secundaire aminekoppeling te creëren, wat van cruciaal belang is voor het eiwitverwijderingsproces27.
  15. Dek de stempels af, laat ze 30 minuten op kamertemperatuur staan en spoel ze vervolgens opnieuw grondig af met DI-water. Verwijder overtollig water van het oppervlak van stempels op dezelfde manier als de coverslips en laat de stempels onbedekt drogen gedurende ~ 30 minuten.
  16. Controleer na 30 minuten of zowel de eiwit-gecoate coverslips als de stempels droog zijn. Als een van beide niet volledig droog is, gebruik dan een gefilterd luchtpistool om ze volledig te drogen, zodat de coverslips gedurende een langere periode niet aan licht worden blootgesteld.
  17. Zodra zowel de coverslips als de stempels droog zijn, duwt u het stempelpatroon met de zijkant naar beneden op de coverslips met voldoende druk zodat de stempels volledig in contact komen met het oppervlak van de coverslip. Laat de stempels 15 min in contact met de coverslips.
    OPMERKING: Vanwege de covalente amidebinding tussen de glutaaraldehydestempel en de eiwitlaag op de glazen coverslip - die veel sterker is dan de zwakke hydrofobe interacties tussen de eiwitlaag en de glazen coverslip - moeten de eiwitten het glas afbladderen volgens het patroon op de PDMS-stempel zodra het is verwijderd.
  18. Na 15 minuten pelt u voorzichtig de PDMS-stempels van de coverslips.
    OPMERKING: Als het verwijderingsproces correct werkte, mogen de stempels niet zonder weerstand van de coverslips komen, maar mogen ze ook niet zo stevig op de coverslips worden geplakt dat ze niet zonder overmatige kracht kunnen worden verwijderd.
  19. Controleer de getrouwheid van de patroondeksels met behulp van het juiste filter op een fluorescerende microscoop (afhankelijk van met welke fluorescerende kleurstof de eiwitten zijn gemarkeerd).
  20. Gebruik de patroondeksels onmiddellijk of bewaar ze uit de buurt van direct licht.

3. Geactiveerde coverslips

OPMERKING: De onderste coverslips voor gebruik in de experimentele kamer voor PAA-gels worden in deze stap gemaakt. Deze bottom coverslip is speciaal behandeld om de PAA-gel stevig vast te houden terwijl de coverslip met het bovenste patroon tijdens het patroonproces wordt verwijderd. Soortgelijke technieken worden ook elders beschreven 10,12,15,28.

  1. Soniceer 30 mm coverslips in 100% ethanol gedurende 10 minuten, spoel af met DI-water en droog vervolgens grondig met een gefilterd luchtpistool. Bereid tot 6 coverslips per keer per batch in een 6-well plaat.
  2. Plasma behandel de coverslips gedurende 1 min op hoog (radiofrequentievermogen van 30 W) en plaats vervolgens elke coverslip in een put van een 6 putplaat.
  3. Bestrijk elke afdekplaat met een zeer dunne laag van 5% APTMS in ethanol in een zuurkast.
    OPMERKING: Een oranje residu zal zich vormen in geval van overmatige coating in dit proces.
  4. Dek de 6-well plaat af en laat de coverslips 5 min zitten.
  5. Spoel de coverslips (beide zijden) en de binnenkant van elke put grondig af met DI-water en verwijder overtollig water in de putten.
  6. Plaats de afdekplaten terug in de 6-putplaat en voeg ongeveer 2 ml 0,5% glutaaraldehyde toe in DI-water.
  7. Dek de 6-well plaat af en laat de coverslips 30 min in de glutaaraldehyde-oplossing zitten; spoel vervolgens zowel de coverslips als de putten van elke plaat grondig af met DI-water.
  8. Bewaar de behandelde coverslips in DI-water in de 6-well platen gedurende maximaal twee weken of gebruik ze onmiddellijk. Zorg ervoor dat de coverslips volledig droog zijn voor gebruik.

4. PAA gel fabricage en patroon overdracht

OPMERKING: Zodra patroondeksels zijn gemaakt, moeten ze worden gebruikt om die eiwitpatronen kort daarna (<24 uur) over te brengen naar de PAA-hydrogel 1,29,30. Het volgende recept is voor een PAA gel met een Young's modulus van 3,6 kPa. De hoeveelheden bis-acrylamide, acrylamide en DI-water kunnen worden gevarieerd om de stijfheid van de PAA-gels aan te passen12.

  1. Vlak voordat u begint met het maken van de PAA hydrogel precursor, verwijdert u het acrylzuur N-hydroxysuccinimide (NHS)-ester uit de koelkast zodat het op kamertemperatuur kan komen voordat het wordt geopend. Bereid een verwisselbare coverslip schotelset door deze voor gebruik te steriliseren met 70% ethanol en deze ten minste 30 minuten onder UV-licht in een bioveiligheidskast te laten staan.
    LET OP: NHS is een giftige huid- en oogirritant; gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren ervan en werk onder een zuurkast.
    1. Voeg 1,25 ml 40% acrylamide in DI-water toe aan een conische buis van 15 ml.
      LET OP: Acrylamide is een giftige huid- en oogirritant; gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren ervan en werk onder een zuurkast.
    2. Voeg 175 μL bis-acrylamideoplossing in DI-water toe aan dezelfde buis (stap 4.1.1).
      LET OP: Bis-acrylamide is een giftige huid- en oogirritant; gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren ervan en werk onder een zuurkast.
    3. Voeg 500 μL 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe.
      LET OP: PBS is een oogirritant; gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren.
    4. Voeg 2.915 ml DI-water toe.
  2. Pipetteer 969 μL van deze precursor in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar de rest bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
  3. Meet ~ 50-100 mg ammoniumperssulfaat (APS) in een andere microcentrifugebuis en verdun het in DI-water tot 100 mg / ml; zet het opzij voor later gebruik. Open de NHS-ester (nu bij kamertemperatuur) in de kap en meet voorzichtig tot 3 mg NHS in een microcentrifugebuis. Verdun de NHS-ester tot 1 mg/ml in 1x PBS.
    LET OP: APS is een huid- en oogirritant; gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren ervan en werk onder een zuurkast. Zowel APS als NHS-ester zullen na verloop van tijd hydrolyseren, waardoor de activiteit van de chemicaliën in de voorraadoplossing varieert. Daarom moeten beide oplossingen elke keer vers worden bereid (in tegenstelling tot de rest van de voorloper).
  4. Voer de volgende drie stappen uit in een zuurkast:
    1. Voeg 2 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe aan de microcentrifugebuis die de 969 μL aliquot PAA-precursor bevat.
      LET OP: TEMED is een brandbare huid- en oogirritant; houd het uit de buurt van hitte / vlammen / vonken, gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren en werk onder een zuurkast. TEMED is een van de twee crosslinking-middelen die cruciaal zijn voor de polymerisatie van de PAA-hydrogel, de andere is APS.
    2. Voeg 15 μL zoutzuur van 1 M toe om de pH van de hydrogeloplossing te verlagen en hydrolyse van de NHS-ester te voorkomen.
      LET OP: Zoutzuur is een bijtende huid- en oogirritant; gebruik beschermende handschoenen en brillen bij het hanteren ervan en werk onder een zuurkast.
    3. Voeg 10 μL van de NHS-esteroplossing toe aan de buis.
      OPMERKING: De NHS is van cruciaal belang voor het patroonproces. Het zal reageren met aminegroepen in de eiwitten op de patroondekselslip om een stabiele amidebinding te vormen, waardoor het patroon kan worden overgebracht van de glazen afdekkingslip naar het oppervlak van de PAA-gel terwijl hetpolymeriseert 31.
  5. Voer deze laatste stappen uit in een bioveiligheidskast:
    1. Plaats de 30 mm coverslip voorzichtig in het metalen deel van de coverslip schotelset (3-APTMS en met glutaaraldehyde behandelde kant naar boven) en schroef de plastic ring erop. Stel de patroondekplaat zo in dat deze gemakkelijk kan worden bereikt in de volgende stap, maar bescherm deze nog steeds zoveel mogelijk tegen licht.
    2. Pipetteer 5 μL APS-oplossing in de rest van de PAA-precursor in de microcentrifugebuis, keer deze om om te mengen en pipetteer vervolgens onmiddellijk 35 μL van die oplossing op de 30 mm afdekplaat.
    3. Laat het patroondekseleiwit met de zijkant naar beneden op de oplossing vallen en pas op dat er geen luchtbellen in de hydrogel ontstaan. Bescherm de hydrogel tegen licht en laat hem 90 minuten polymeriseren.
    4. Zodra de hydrogel is gepolymeriseerd, gebruikt u een scheermesje of scalpel om de bovenste coverslip te verwijderen, zodat de coverslip niet van de gel glijdt of terugvalt op de gel zodra deze is verwijderd, omdat dit het patroon op het oppervlak van de gel zal verpesten.
      OPMERKING: Laat de gel niet onbedekt in een gebied met een aanzienlijke luchtstroom (zoals een bioveiligheidskast).
    5. Om de resterende NHS-ester in de hydrogel te passiveren, voegt u 2 ml steriel PBS toe aan de gel en incubeert u gedurende 45 minuten bij 37 °C. Bereid de gels onmiddellijk voor op experimenten of bewaar ze een nacht in steriel PBS bij 4 °C tot gebruik.

5. Beeldvorming

  1. Om u voor te bereiden op experimenten met cellen, schakelt u de warmte (37 °C) en vochtigheid (70%) in de microscoop de middag voor een gepland experiment in om de apparatuur in de microscoopkamer in staat te stellen te balanceren naar de hogere temperatuur.
    OPMERKING: Deze stap minimaliseert de z-drift veroorzaakt door temperatuurschommelingen.
  2. Schakel vlak voor het begin van het experiment de CO2-bron van de kamer in.
  3. Om x-y-drift veroorzaakt door de herhaalde beweging van de microscooptrap tijdens het experiment te voorkomen, bevestigt u de verwisselbare coverslip-schotelset die de hydrogel met celzaad aan het podium vasthoudt met dubbelzijdige tape.
  4. Kijk over de gel om frames te vinden die interessant zijn voor de afbeelding, waarbij elke fasepositie van de secties die moeten worden afgebeeld, wordt opgeslagen.
  5. In zowel de brightfield-weergave als de fluorescerende weergave die overeenkomt met het gelabelde eiwit, stelt u de microscoopsoftware in om elk frame eenmaal per 5 minuten gedurende 2 uur in beeld te brengen.

6. Beeldanalyse

OPMERKING: Er is een systeem ontwikkeld dat de vervorming van de PAA-gels met patroon kan meten door de locatie van de tractiepunten te bepalen, de beginlocaties van de vervormde punten te interpoleren en vervolgens de cellulaire tractiekrachten op elke locatie te berekenen. Elk softwaresysteem dat in staat is om beeldverwerking en numerieke berekeningen uit te voeren, kan worden gebruikt. Het programma is bedoeld om snel tractiekrachten te bepalen, waarbij gebruikersinvoer en voorbewerkingsprocedures worden geëlimineerd die zouden bijdragen aan gebruikersgerelateerde fouten. De code die hier wordt gebruikt, is hier beschikbaar als Supplemental Files 2-10 en deze bestanden, samen met een paar oefenafbeeldingen, zijn toegankelijk op www.bu.edu/mml/downloads.

  1. Open in een beeldverwerkingssoftware alle afzonderlijke afbeeldingen die tijdens een timelapse-experiment zijn gemaakt vanuit elke gebruikte microscoopweergave in volgorde, van de eerste tot de laatste vastgelegde afbeelding, en verander ze in een enkele afbeeldingsstapel (klik op Afbeelding | Stapels | Afbeeldingen om te stapelen). Zorg ervoor dat er twee afzonderlijke afbeeldingsstapels zijn: een van de brightfield-weergave van de cellen en een van de fluorescerende weergave van het patroon waaraan ze zijn bevestigd.
    1. Als er drift is in de fluorescerende beelden (d.w.z. het eiland van belang beweegt zich in de x- en / of y-richting tussen elk frame met >1-2 μm), verwerk dan eerst de beeldstapel met de StackReg-plug-in (P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne) om elke afbeelding in de stapel te recenter op basis van de positie van de eerste (klik op Plugins | StackReg | Vertaling | Oké).
      OPMERKING: Dit is van cruciaal belang omdat zelfs sub-μm drift de uiteindelijke berekening van de trekkrachten aanzienlijk kan beïnvloeden, vooral op stijvere gels waar deze x-y drift buiten het bereik van het verwachte geluid ligt. Deze code slaat de afbeeldingen op nadat drift is verwijderd, die vervolgens kan worden omgezet in een nieuwe afbeeldingsstapel die moet worden geanalyseerd.
  2. Voer de brightfield- en fluorescerende beeldstapels in CTFTimelapse.m (aanvullend bestand 2) in.
    1. Geef de bestandsmap op waar de afbeeldingsstapels zich op regel 7 bevinden.
    2. Geef op de regels 8 en 9 respectievelijk de namen op van de fluorescerende beeldstapel en de bijbehorende brightfield-fluorescerende stapel.
    3. Specificeer PAA-gelstijfheid (Pa):
      1. In de regels 11-14, die een paar verschillende elastische moduli van PAA-hydrogels bevatten die het vaakst worden gebruikt, wordt commentaar gegeven (type % aan het begin van de lijn) alles behalve de elastische modulus van de gel in de afbeeldingen die worden geanalyseerd. U kunt ook de elastische modulus toevoegen als deze nog niet aanwezig is en de rest becommentariëren (3658.19 Pa voor testafbeeldingen).
    4. Geef een puntstraal (m) op regel 15 (1 × 10-6 m voor testafbeeldingen).
    5. Specificeer de maximaal mogelijke puntdiameter (μm) op regel 16 (2,5 μm voor testbeelden).
    6. Geef de pixelverhouding (μm/pixel) op:
      1. In de regels 17-20, die een paar verschillende pixelverhoudingen voor afbeeldingen bevatten op basis van eerder gebruikte beeldinstellingen, geeft u commentaar (typ % aan het begin van de regel) alles behalve de pixelverhouding van de afbeeldingen die worden geanalyseerd. U kunt ook de gebruikte pixelverhouding toevoegen als deze nog niet aanwezig is en de rest becommentariëren (0,1613 μm/pixel voor testafbeeldingen).
    7. Geef op de regels 35 en 87 de bestandsmap op waar de benodigde beeldverwerkingsbestanden zich bevinden.
      OPMERKING: Vanuit de fluorescerende afbeeldingsstapel bepaalt de code de locatie van elke fluorescerende stip en volgt de beweging van elke stip tussen elke afbeelding in de stapel20. De beginpositie van de microcontactgeprinte punten is bekend omdat ze niet vervormen wanneer ze op de juiste manier worden overgebracht naar de hydrogel32.
  3. Wacht tot twee figuren en een dialoogvenster verschijnen zodra het programma de stippen heeft gevonden. Gebruik figuur 1 om ervoor te zorgen dat het programma de juiste stippen heeft gevonden en niet veel stippen heeft gevonden waar er geen waren. Gebruik figuur 2 om het rechthoekige raster te kiezen waarmee het programma cellulaire tractiekrachten kan lokaliseren en berekenen.
    OPMERKING: Figuur 1 is het heldere beeld van de cel met de stippen gevonden door het programma (die rood zullen zijn) eroverheen (zie figuur 3A). Figuur 2 is een afbeelding met dezelfde stippen die in figuur 1 worden weergegeven, maar zonder het brightfield-beeld op de achtergrond.
    1. Wacht tot het dialoogvenster vraagt om op Enter te drukken na het selecteren van punt - waarin elk punt een van de rode stippen is die door het programma worden gevonden - en er een grote knop in zit met het label Enter.
    2. Kies vier verschillende stippen in figuur 2 om een rechthoekig raster rond te maken en de cel/cluster in dat patroon op te nemen. Selecteer elke stip één voor één met een linkermuisklik en bevestig deze door op Enter te drukken op de knop in het bovengenoemde dialoogvenster. Houd bij hoeveel stippen zich tussen de eerste en tweede stip bevinden, evenals de eerste en derde stip, omdat het programma om deze waarden zal vragen zodra alle vierhoekige stippen zijn geselecteerd. Voer deze waarden in het opdrachtvenster in (typ het aantal stippen en klik op de enter-knop op het toetsenbord wanneer daarom wordt gevraagd).
  4. Zodra het rechthoekige raster is gekozen, wacht u tot het script de tractiekrachten berekent die het binnen het raster vindt op basis van de locaties van de fluorescerende stippen. Merk op dat het script eerst de verplaatsingsvector (u) van het geometrische centrum van elke punt vindt en vervolgens de overeenkomstige tractiekrachtvector (F) berekent met Eq (1):
    Equation 1(1)
    Waar E de Young's modulus van het PAA-substraat is, is a de straal van de fluorescerende puntmarkers en ν de Poisson-verhouding van het PAA-substraat32. Eq (1) gaat ervan uit dat het substraat een oneindige elastische halve ruimte is, dat tractiekrachten worden uitgeoefend in het midden van elke cirkelvormige puntmarkering en dat de afstand tussen de puntmarkeringen voldoende groot is zodat hun respectieve verplaatsingen niet met elkaar interageren23.
    OPMERKING: In de hier beschreven experimenten worden puntmarkers van straal a = 1 μm en 6 μm center-to-center afstand gebruikt. Tractiekrachtpijlen in de cel/cluster die naar binnen wijzen naar het midden van de cel moeten aanwezig zijn, terwijl het gebied buiten de cel/cluster geen tractiepijlen mag hebben (zie figuur 3C-E). Tractiepijlen die van binnenuit de cel/cluster naar buiten wijzen of veel grote tractiepijlen die buiten de cel aanwezig zijn, wijzen op een slecht gekozen rechthoekig raster.
  5. Zodra het juiste tractieveld is gevonden, selecteert u een geschikt interessegebied (ROI) rond de cel/cluster, dat alle tractiepijlen in de cel bevat met behulp van de cursor.
    1. Om de ROI te tekenen, klikt u zo vaak als nodig met de linkermuisknop om een polygoonvorm met zoveel zijden als gewenst te tekenen, de vorm aan te passen of de ROI te verplaatsen nadat deze is getekend door met de linkermuisknop op respectievelijk de hoeken of randen te klikken. Zodra de ROI is getekend, dubbelklikt u met de linkermuisknop om door te gaan naar de volgende afbeelding in de stapel. Herhaal dit voor alle afbeeldingen in de brightfield-stapel.
      OPMERKING: De code slaat tractiekracht- en verplaatsingsgegevens op voor elk tijdstip in dezelfde map als de oorspronkelijke afbeeldingsstapels, die vervolgens verder kunnen worden geanalyseerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PAA-hydrogels met de Young's modulus van E = 3,6 kPa en de Poisson's ratio van ν = 0,445 werden gemaakt voor gebruik door deze subtractieve micropatterning methode. De hydrogels zijn gemaakt om ~ 100 μm dik te zijn, waardoor ze kunnen worden afgebeeld met de beeldvormingsopstelling die hier wordt gebruikt, terwijl ook wordt voorkomen dat de cellen de stijve coverslip onder de gel detecteren, wat problemen zou veroorzaken in studies gericht op cellulaire stijfheidsdetectie23,33. Gels van vele andere stijfheidsniveaus (tot 30 kPa) zijn met succes gemaakt en afgebeeld met behulp van de indirecte micropatterningmethode34, dus de methode is niet beperkt tot het gebruik van slechts 3,6 kPa hydrogels. De coverslips worden van tevoren behandeld met glutaaraldehyde, zodat de gel aan de onderste coverslip kan blijven vastzitten wanneer de coverslip met het bovenste patroon wordt verwijderd (figuur 2C, D).

Om cellulaire tractiekrachten binnen clusters te visualiseren en te meten, werden de 3,6 kPa-hydrogels indirect gemodelleerd met fluorescerend fibronectine (figuur 2A-D) om eilandpatronen van vooraf bepaalde grootte en vorm te creëren (figuur 2E). Andere soorten eiwitten kunnen ook worden gemodelleerd naar deze zachte hydrogels 21,35,36,37,38. De kwaliteit van het overgedragen patroon is direct gerelateerd aan de getrouwheid van de hoofdmal waaruit de PDMS-stempel is gegoten. Mallen die SU-8 delaminatie hebben gehad, zullen een verslechtering zien in de kwaliteit van de patronen gemaakt van stempels gegoten uit deze gelamineerde mallen. Schimmels met gelamineerde SU-8 zullen bijvoorbeeld vaak micropatronen maken die secties van ongepatterd fibronectine bevatten tussen de vooraf bepaalde eilanden. Als ze op een gel worden gegoten, maken deze patronen celaanhechting aan de gel mogelijk in gebieden buiten het eilandmicropattern. Hierdoor was het in beeld brengen van celclusters die vastzitten aan volledig of grotendeels intacte eilandpatronen de prioriteit.

Bovine vascular smooth muscle cells (BVSMC's) werden op deze hydrogels gezaaid met een dichtheid van ongeveer 60-80 × 103 cellen / gel om clustervorming te bevorderen en mochten zich 18-24 uur hechten voorafgaand aan beeldvorming. Vlak voor de experimenten werden cellen gekleurd met een levende celkernvlek om levende cellen te kunnen identificeren en het aantal cellen in elk cluster te bepalen. Micropattern eilanden met en zonder cellen werden in beeld gebracht en geanalyseerd. Het afbeelden van eilanden zonder cellen maakte het mogelijk om het geluid te berekenen dat aanwezig was in tractiekrachtberekeningen voor 3,6 kPa-gels. Deze fout-positieve verplaatsingsmetingen kunnen vervolgens worden gebruikt om een geschikte drempelwaarde te bepalen waaronder verplaatsingen moeten worden uitgesloten.

Het is gebleken dat 0,3 μm meestal voldoende is om patroonontrouw te elimineren die leidt tot vals-positieve verplaatsingsmetingen. Dit kan leiden tot het verlies van tractie met lage kracht, maar is essentieel voor het verwijderen van vals-positieve tracties. Bij beeldvorming kregen celclusters op meestal intacte eilandpatronen prioriteit (d.w.z. die niet veel of geen stippen misten) en meestal intacte patronen zonder cellen. Elke ROI werd eenmaal per 5 minuten gedurende 2 uur in beeld gebracht. De microscoop die werd gebruikt om beelden van beide cellen en de PAA-gels met patroon vast te leggen tijdens uitgebreide timelapse-experimenten was een fluorescentiemicroscoop met een automatische fase, een fluorescentielichtbron, een camera en standaard microscoopsoftware. Deze microscoop heeft een aangepaste set filters om veel verschillende kleuren fluorescentie te observeren. Het doel dat wordt gebruikt om de cellen en de hydrogel met patroon te bekijken, is een 40x wateronderdompelingsdoelstelling, NA = 1,15. Deze microscoop is ook uitgerust met een aangepast temperatuur (37 °C)-, vochtigheid (70%)- en CO2 (5%)-gereguleerd systeem om cellen levensvatbaar te houden tijdens lange experimenten.

Om de trekkrachten van de beelden van de micropatterneilanden te berekenen, werd beeldanalysesoftware gebruikt om de verplaatsingen van de fluorescerende fibronectinepunten in de loop van de tijd te volgen. Door de verplaatsingen van de fluorescerende stippen en de stijfheid van de PAA-gel waarop de stippen zijn gemodelleerd, te kennen, kan het programma de waarden bepalen van de tractiekrachten die door zowel individuele cellen als clusters op het PAA-substraat worden overgedragen. Er zijn echter twee manieren waarop het programma niet in staat is om tractiewaarden te bepalen. Als te veel stippen binnen een bepaald interessekader worden vervormd, heeft het programma moeite om krachten te berekenen, omdat het programma erop vertrouwt dat de meeste stippen in een geanalyseerde afbeelding niet worden vervormd. Bovendien, als twee stippen te dicht bij elkaar liggen (hart-op-hart afstand van ≤2 μm20), kunnen de verplaatsingen van de afzonderlijke stippen elkaar verstoren, wat een nauwkeurige bepaling van hun werkelijke verplaatsingswaarden en dus hun tractiewaarden verhindert. Zolang de micropatronen zijn ontworpen met stippen die goed uit elkaar liggen, zouden cellen de stippen niet zozeer moeten kunnen verplaatsen dat ze zo dicht bij elkaar komen, zelfs op zachtere substraten.

Figuur 3 toont de mogelijkheden van de verwijderingsmethode. Hier wordt het vermogen van deze methode om geïsoleerde, goed gedefinieerde eilandpatronen van vooraf bepaalde vorm te fabriceren weergegeven in figuur 3B-E, waar de fibronectine-adhesiepunten alleen aanwezig zijn binnen het gewenste gebied van het eiland. Deze geïsoleerde eilanden van adhesiepunten zorgen verder voor een betere controle van de clustervorm, zoals weergegeven in figuur 3A. Omdat de vorm en grootte van de eilanden consistent zijn, zullen de celclusters die zich eraan hechten en erop groeien ook de neiging hebben om een consistente vorm te hebben, omdat de eilandpatronen het clustergroeigebied beperken. Ten slotte toont figuur 3B-E ook het vermogen van deze eilanden om te worden gebruikt om cellulaire tractiekrachten te berekenen en de neiging van deze tractiekrachten om in de loop van de tijd te veranderen. Hier zijn de trekkrachten van de cluster het grootst rond de randen van het eiland. Dit wordt verwacht omdat de cellen aan de randen van een cluster minder interacties hebben met andere cellen in het cluster dan die in het binnenste van het cluster. Deze cellen aan de randen oefenen dus grotere krachten uit op het substraat als reactie op cytoskeletcontractie dan de cellen in het binnenste.

Figure 1
Figuur 1: Ontwerp van fotomasker. (A) Een weergave van de eerste helft van het fotomaskerontwerp dat hier wordt gebruikt, een discreet raster van stippen met een diameter van 2 μm op 6 μm van midden tot midden. Hoewel de afbeelding hier slechts een klein deel van het ontwerp is, vult dit raster een ruimte van 1,5 x 1,5 cm op het fotomasker. (B) Een weergave van de tweede helft van het fotomaskerontwerp; hiernaast staan zes kleine eilandjes van 6 x 6 stippen. Op het fotomasker staan meerdere verschillende eilandformaten: 6 x 6 (hier afgebeeld), 12 x 12, 25 x 25 en 42 x 42 stippen. Een even verdeelde (50 μm tussen eilanden) array van elke eilandgrootte neemt een ruimte in beslag van 1,5 x 0,375 cm, en de arrays van verschillende eilanden worden gescheiden door 50 μm. De stippen in elk eiland hebben een diameter van 2 μm en zijn 6 μm van midden tot midden verdeeld. De twee delen van het masker beschreven in A en B zijn gescheiden door 0,75 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Subtractief microcontact printen. (A) Een PDMS-stempel wordt behandeld met glutaaraldehyde en in contact gebracht met een glazen afdekplaat die gelijkmatig is bedekt met fluorescerende fibronectine-oplossing. (B) Na verwijdering van de coverslip verwijdert de PDMS-stempel het grootste deel van de fluorescerende fibronectine op het oppervlak van de coverslip, waardoor microngrote stippen eiwit alleen overblijven op locaties die vooraf zijn bepaald door het ontwerp van de PDMS-stempel. (C) De patroondeksellip wordt in contact gebracht met een PAA-prepolymeer en NHS-oplossing. (D) Zodra de PAA-gel volledig heeft laten polymeriseren, wordt de bovenste coverslip verwijderd en wordt een patroon van fibronectine op het PAA-geloppervlak gedrukt. (E) Een voorbeeld van een discreet eilandpatroon bestaande uit gelijkmatig verdeelde stippen op een PAA hydrogel met een Young's modulus van 3,6 kPa. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: PDMS = polydimethylsiloxaan; PAA = polyacrylamide; NHS = N-hydroxysuccinimide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Analyse van cellen op eilandmicropatronen. (A) Een brightfield-afbeelding van een cluster van 3 BVSMC's bedekt op een fluorescerend fibronectine-eilandmicropattern op een PAA-hydrogel met een Young's modulus van 3,6 kPa wordt getoond. Stippen hebben een diameter van 2 μm en worden van 6 μm van centrum tot midden gescheiden. (B) Het fluorescerende patroon laat zien dat een aantal van de fibronectinepunten op het eiland zijn verplaatst als gevolg van de toepassing van krachten door de BVSMC's. (C) De tractiekrachten die op de adhesiepunten worden uitgeoefend op tijdstip 1 (begin van een 2 uur-experiment). De richting van deze krachtvectoren wordt aangegeven door de richting van de gekleurde pijlen. Hun grootte wordt aangegeven door de pijlkleur en de bijbehorende waarde op de kleurenbalk (alle krachtwaarden zijn in nN). Vectorlengte is relatief op basis van de minimale en maximale krachten berekend door het programma voor elk tijdspunt. D) Trekkrachten van hetzelfde cluster op tijdstip 13 (halverwege een experiment van 2 uur) (E) Trekkrachten van hetzelfde cluster op tijdstip 25 (einde van een experiment van 2 uur). Afkortingen = BVSMC's = rundervaat gladde spiercellen; PAA = polyacrylamide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Rekenmachine voor het labelen van fibronectine Dit is een hulpmiddel voor het berekenen van de juiste hoeveelheid Alexa488 fluorescerende kleurstof om te gebruiken bij het labelen van fibronectine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: CTFTimelapse.m Dit is het beeldverwerkingsbestand, waarmee cellulaire tractiekrachten kunnen worden berekend zoals beschreven in sectie 5 (Beeldanalyse). Dit omvat het selecteren van een gewenst raster van punten (stappen 6.3-6.3.2) en het kiezen van het gewenste gebied voor de CTF-berekeningen (stappen 6.5 en 6.5.1). Alle volgende aanvullende bestanden worden rechtstreeks aangeroepen door dit script of een van de andere functies die erin worden gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: analyze_initial_image_4 Deze functie wordt aangeroepen door CTFTimelapse.m en heeft tot doel de fluorescerende stippen op een raster te lokaliseren en uit te lijnen vanaf het eerste frame van de afbeeldingsstapel van het vervormde rasterpatroon om overeen te komen met het oorspronkelijke ongedeformeerde rasterpatroon. Dit maakt tractiekrachtberekeningen mogelijk voor het eerste frame in de beeldstapel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 4: analyze_subsequent_images Deze functie wordt aangeroepen door CTFTimelapse.m en heeft als doel de fluorescerende stippen op een raster te lokaliseren en uit te lijnen uit alle frames van de afbeeldingsstapel van het vervormde rasterpatroon na de eerste. Dit maakt tractiekrachtberekeningen mogelijk voor alle frames in de beeldstapel na de eerste. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: bpass.m Deze functie wordt aangeroepen door zowel analyze_initial_image_4.m. als subsequent_images analyseren, en het doel is om een real-space bandpass-filter te implementeren dat de afbeeldingsstapel van het vervormde rasterpatroon verwerkt. Dit filter onderdrukt pixelruis en beeldvariaties met lange golflengten met behoud van informatie van een karakteristieke grootte. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: CellBoundary.m Deze functie wordt aangeroepen door CTFTimelapse.m en het doel ervan is dat het de programmagebruiker in staat stelt een interessegebied rond de cel / cluster te tekenen waarvoor tractiekrachten moeten worden berekend. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 7: pkfnd.m Deze functie wordt aangeroepen door zowel analyze_initial_image_4.m als analyze_subsequent_images,m, en het doel is om lokale maxima in een afbeelding te vinden met nauwkeurigheid op pixelniveau. Deze pieken worden door cntrd.m gebruikt om het fluorescerende rasterpatroon voor CTFTimelapse.m te lokaliseren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 8: cntrd.m Deze functie wordt aangeroepen door zowel analyze_initial_image_4.m als analyze_subsequent_images,m, en het doel is om het middelpunt van heldere vlekken in een afbeelding te lokaliseren tot subpixelnauwkeurigheid. Dit maakt de locatie van het fluorescerende rasterpatroon door CTFTimelaspe.m mogelijk, zoals beschreven in stap 6.3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 9: FourCorners.m Deze functie wordt aangeroepen door zowel analyze_initial_image_4.m als analyze_subsequent_images.m. en het doel is om het door de gebruiker gekozen raster te nemen (stappen 6.3-6.3.2) en de afstand tussen elke hoekpunt in twee orthogonale assen te berekenen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 10: track.m Deze functie wordt aangeroepen door zowel analyze_initial_image_4.m als analyze_subsequent_images,m, en het doel is om de beweging van de stippen in het fluorescerende rasterpatroon tussen frames te volgen, wat essentieel is voor het berekenen van de overeenkomstige tractiekrachten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een verbeterde methode voor het indirect patroon van PAA-hydrogels wordt in dit artikel beschreven. Deze aanpak bouwt voort op methoden die eerder zijn gebruikt 20,35,36,37,38,39,40,41,42. De belangrijkste verandering is dat PDMS-stempels nu worden gebruikt om eiwitten te verwijderen en het gewenste patroon achter te laten op het tussensubstraat in plaats van het patroon er direct op te stempelen. Dit zorgt voor een veel consistentere creatie van high-fidelity micropatronen en de creatie van geïsoleerde microgepatterde eilanden die voorheen twee productiestappen vereisten. De vorm en grootte van de eilandpatronen die met deze methode zijn gemaakt, zijn ook gemakkelijker te controleren dan die gemaakt met de vorige tweestapsmethode. De nieuwe techniek is minder gevoelig voor de hoeveelheid druk die wordt uitgeoefend tijdens het microprinten dan de oude techniek. Een tweede voordeel is dat deze verwijderingsmethode eilandpatronen van gecontroleerde vorm en grootte in slechts één stap kan maken. Eerdere methoden vereisten daarentegen twee stappen om eilanden te maken, inclusief stempelen voor afzetting en vervolgens stempelen voor verwijdering, en de vormen van deze eilanden zijn minder nauwkeurig dan die gemaakt met de verwijderingsmethode.

Het grootste nadeel van deze methode is dat de levensduur van de masters die worden gebruikt om de nieuwe stijl van PDMS-stempels te vormen korter lijkt te zijn dan die gebruikt in de vorige stempelmethode. Dit kan waarschijnlijk worden toegeschreven aan de vorm van de nieuwe masters die worden gebruikt in de verwijderingsmethode. De oude meesters waren samengesteld uit een 1,5 x 1,5 cm gebied van SU-8 bestaande uit gelijk verdeelde 5 μm diepe cirkelvormige gaten, die, wanneer gegoten in PDMS, stempels zouden creëren die bestonden uit gelijkmatig verdeelde cilindrische palen van dezelfde hoogte. Omgekeerd bestaan de nieuwe meesters uit een gebied van 1,5 x 1,5 cm van 5 μm hoge SU-8 cilindrische palen, die, wanneer ze in PDMS worden gegoten, stempels maken die zijn opgebouwd uit gelijkmatig verdeelde gaten.

Met deze verandering in de structuur van de meesters is gebleken dat de SU-8 de neiging heeft om veel gemakkelijker van het oppervlak te worden gelamineerd dan in de oude methode. Voorzorgsmaatregelen werden genomen om dit te voorkomen, zoals het behandelen van de siliciumwafers in een plasma-asher om ze vatbaarder te maken voor binding aan SU-8. Het oppervlak van de wafers werd ook gesilutiniseerd vóór het eerste gieten in PDMS om te voorkomen dat de SU-8 aan het PDMS zou blijven plakken bij het verwijderen van de stempels. Desondanks is SU-8-delaminatie van de siliciumwafers waargenomen na herhaald gieten in PDMS, en voorzichtigheid is geboden om ervoor te zorgen dat nieuwe siliciumwafers worden gemaakt voordat de huidige master verloren gaat. Een mogelijke manier om deze delaminatie te voorkomen, is door de PDMS double-cast-methode te gebruiken, die eerder is beschreven43, hoewel deze andere methode zijn beperkingen heeft.

Een andere tekortkoming van deze methode (en andere methoden die vervormbare hydrogels gebruiken om tractiekrachten te meten44) is dat het tractieveld niet in mechanisch evenwicht is als gevolg van experimentele ruis. Er is dus een nabewerkingsanalyse nodig om een evenwichtsveld te verkrijgen nadat de tractiekrachten zijn berekend. Een manier om tractiekrachten in evenwicht te brengen, is door de krachten te verkrijgen die het dichtst bij de metingen liggen en die aan het evenwicht voldoen met behulp van een kleinste-kwadratenmethode. Als gevolg hiervan veranderen de grootte en oriëntatie van de gemeten tractiekrachten45.

Er zijn beperkingen aan deze methode voor het berekenen van cellulaire tractiekrachten. Om de cellulaire tractiekrachten nauwkeurig te bepalen met behulp van Eq. (1) (stap 5.4), moet het patroon zo zijn ontworpen dat de verplaatsing van één adhesiepunt de verplaatsing van degenen die er direct naast liggen niet significant beïnvloedt. Theoretisch neemt de verplaatsing van een cirkelvormig adhesiegebied op het oppervlak van een oneindige halve ruimte als gevolg van een tangentiële kracht die in het centrum werkt af naarmate een radiale afstand tot het middelpunt van de cirkel toeneemt23. Specifiek, voor een substraat waarvan de Poisson-verhouding ~ 0,445 is (zoals die hier worden beschreven), is de verplaatsing aan de rand van het cirkelvormige gebied ongeveer tweederde van de verplaatsing in het midden van het gebied. Theoretische voorspellingen reiken echter niet verder dan het circulaire gebied. Er wordt dus aangenomen dat de dalende trend in verplaatsingsgrootheid, theoretisch bepaald23, zich voortzet voorbij de rand van de adhesiecirkel. In het hier beschreven micropatternontwerp worden 2 μm cirkelvormige stippen gebruikt met een afstand van 6 μm van midden tot midden. De reden voor deze afstand is dat een verplaatsing op de 6 μm afstand van het centrum van een stip wordt geschat op ongeveer 1/12van de verplaatsing in het midden van de stip, waarvan wordt aangenomen dat deze klein genoeg is om de verplaatsingswaarden van aangrenzende stippen te beïnvloeden. Het is echter mogelijk dat de trekkrachten die door cellen worden uitgeoefend, de adhesiepunten op een substraat zozeer kunnen verplaatsen dat de hart-op-hartafstand tussen hen minder dan 2 μm wordt. In dit geval gaat de aanname over de verplaatsing van aangrenzende adhesiepunten die niet met elkaar interfereren niet op en kunnen de trekkrachten niet nauwkeurig worden berekend met de vergelijking in stap 6.4 (Eq (1))).

De voorgestelde techniek biedt een krachtig hulpmiddel voor het meten van cellulaire tractiekrachten. Deze krachten geven inzicht in de mechanische omgeving van zowel individuele cellen als clusters en kunnen helpen begrijpen of en hoe verschillende soorten cellen mechanische stabiliteit behouden. Het handhaven van een homeostatisch niveau van celspanning is essentieel voor veel cellulaire processen, en verlies van deze spanningshomeostase is in verband gebracht met verschillende ziekten, zoals atherosclerose, astma en kanker 9,10,12. Tensionele homeostase wordt gedefinieerd als het vermogen van een cel of een cluster van cellen om een consistent spanningsniveau te handhaven, met een lage temporele variabiliteit rond een bepaald punt46.

Deze indirecte micropatterningmethode kan worden gebruikt om het vermogen van verschillende celtypen te bepalen om spanningshomeostase te behouden, zowel op individueel als op meercellig niveau. Dit wordt gedaan door veranderingen in de waarden van het cellulaire tractieveld in de loop van de tijd te volgen en vervolgens de temporele fluctuatie van het tractieveld te kwantificeren met behulp van de variatiecoëfficiënt (CV), die die verhouding van de standaarddeviatie van de grootte van het tractieveld tot de gemiddelde waarde vertegenwoordigt. De som van de grootheden van de tractiekrachten en de grootte van het contractiele moment (het eerste moment van de trekkrachten) worden gebruikt als scalaire metrieken van de grootte van het tractieveld46. Als het CV van het tractieveld gedurende een timelapse-experiment dicht bij nul blijft, toont dit aan dat de cel / cluster in de loop van de tijd spanningshomeostase handhaafde46.

Kortom, deze nieuwe methode voor indirecte micropatterning van zachte hydrogels biedt een eenvoudigere en efficiëntere methode om hydrogels met patronen te maken dan eerdere methoden. Er zijn bepaalde stappen die kunnen worden genomen om deze methode te verbeteren en uit te breiden. In de eerste plaats zou het verbeteren van het fabricageproces van de siliciummasters op een manier die hun levensduur verlengt, het primaire nadeel van deze micropatterningmethode elimineren. Wat betreft manieren om deze methode uit te breiden, zou het verkennen van verschillende eilandvormen die verder gaan dan alleen de vierkante eilanden die hier worden beschreven, de veelzijdigheid van deze methode verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen Dr. Paul Barbone van het Boston University Department of Mechanical Engineering bedanken voor nuttige discussies en hulp bij data-analyse. Deze studie werd ondersteund door NSF-subsidie CMMI-1910401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923 (2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Tags

Bio-engineering Nummer 180
Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bunde, K. A., Stamenović, D.,… More

Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter