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Chemistry

Confronto diretto tra lo scattering Raman stimolato iperspettrale e la microscopia a dispersione raman coerente anti-Stokes per l'imaging chimico

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63677
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Purdue University

Summary

Questo documento confronta direttamente la risoluzione, la sensibilità e i contrasti di imaging dello scattering Raman stimolato (SRS) e dello scattering Raman anti-Stokes coerente (CARS) integrati nella stessa piattaforma del microscopio. I risultati mostrano che CARS ha una migliore risoluzione spaziale, SRS offre migliori contrasti e risoluzione spettrale ed entrambi i metodi hanno una sensibilità simile.

Abstract

Lo scattering Raman stimolato (SRS) e la microscopia a dispersione Raman (CARS) coerente anti-Stokes sono le tecnologie di imaging a dispersione Raman coerente più utilizzate. L'imaging iperspettrale SRS e CARS offre informazioni spettrali Raman su ogni pixel, che consente una migliore separazione di diverse composizioni chimiche. Sebbene entrambe le tecniche richiedano due laser di eccitazione, i loro schemi di rilevamento del segnale e le proprietà spettrali sono molto diversi. L'obiettivo di questo protocollo è quello di eseguire sia l'imaging iperspettrale SRS che CARS su un'unica piattaforma e confrontare le due tecniche di microscopia per l'imaging di diversi campioni biologici. Il metodo di messa a fuoco spettrale viene impiegato per acquisire informazioni spettrali utilizzando laser a femtosecondi. Utilizzando campioni chimici standard, vengono confrontate la sensibilità, la risoluzione spaziale e la risoluzione spettrale di SRS e CARS nelle stesse condizioni di eccitazione (ad esempio, potenza al campione, tempo di permanenza dei pixel, obiettivo, energia dell'impulso). I contrasti di imaging di CARS e SRS per campioni biologici sono giustapposti e confrontati. Il confronto diretto delle prestazioni di CARS e SRS consentirebbe una selezione ottimale della modalità per l'imaging chimico.

Introduction

Il fenomeno dello scattering Raman fu osservato per la prima volta nel 1928 da C. V. Raman1. Quando un fotone incidente interagisce con un campione, può verificarsi spontaneamente un evento di scattering anelastico, in cui il cambiamento di energia del fotone corrisponde a una transizione vibrazionale delle specie chimiche analizzate. Questo processo non richiede l'uso di un tag chimico, rendendolo uno strumento versatile e privo di etichette per l'analisi chimica riducendo al minimo le perturbazioni del campione. Nonostante i suoi vantaggi, lo scattering Raman spontaneo soffre di una bassa sezione trasversale di scattering (tipicamente 1011 inferiore alla sezione trasversale di assorbimento a infrarossi [IR]), che richiede lunghi tempi di acquisizione per l'analisi2. Pertanto, la ricerca di aumentare la sensibilità del processo di scattering Raman è essenziale per spingere le tecnologie Raman per l'imaging in tempo reale.

Un modo efficace per migliorare notevolmente la sensibilità dello scattering Raman è attraverso processi di scattering Raman coerenti (CRS), per i quali due impulsi laser sono tipicamente utilizzati per eccitare le transizioni vibrazionali molecolari 3,4. Quando la differenza di energia fotonica tra i due laser corrisponde alle modalità vibrazionali delle molecole campione, verranno generati forti segnali Raman. I due processi CRS più comunemente usati per l'imaging sono lo scattering raman anti-Stokes coerente (CARS) e lo scattering Raman stimolato (SRS)5. Negli ultimi due decenni, gli sviluppi tecnologici hanno avanzato le tecniche di microscopia CARS e SRS per diventare potenti strumenti per la quantificazione senza etichette e la delucidazione dei cambiamenti chimici nei campioni biologici.

L'imaging chimico mediante microscopia CARS può essere datato al 1982, quando la scansione laser è stata applicata per la prima volta per acquisire immagini CARS, dimostrata da Duncan et al6. La modernizzazione della microscopia CARS è stata notevolmente accelerata dopo le ampie applicazioni della microscopia a fluorescenza multifotone a scansione laser7. I primi lavori del gruppo Xie che utilizzano laser ad alto tasso di ripetizione hanno trasformato CARS in una piattaforma di imaging chimico ad alta velocità, priva di etichette, per la caratterizzazione di molecole in campioni biologici 8,9,10. Uno dei principali problemi per l'imaging CARS è la presenza di uno sfondo non consonante, che riduce il contrasto dell'immagine e distorce lo spettro Raman. Sono stati fatti molti sforzi per ridurre lo sfondo non consonante 11,12,13,14,15 o per estrarre segnali Raman risonanti dagli spettri CARS 16,17. Un altro progresso che ha notevolmente migliorato il campo è l'imaging CARS iperspettrale, che consente la mappatura spettrale di ogni pixel dell'immagine con una migliore selettività chimica 18,19,20,21.

Lo scattering Raman stimolato (SRS) è una tecnologia di imaging più giovane di CARS, sebbene sia stata scoperta prima del22. Nel 2007, la microscopia SRS è stata segnalata utilizzando una sorgente laser a basso tasso di ripetizione23. Ben presto, diversi gruppi hanno dimostrato l'imaging SRS ad alta velocità utilizzando laser ad alto tasso di ripetizione 24,25,26. Uno dei principali vantaggi della microscopia SRS rispetto a CARS è l'assenza dello sfondo non consonante27, sebbene altri sfondi come la modulazione multifase (XPM), l'assorbimento transitorio (TA), l'assorbimento a due fotoni (TPA) e l'effetto fototermico (PT), possano verificarsi con SRS28. Inoltre, il segnale SRS e la concentrazione del campione hanno relazioni lineari, a differenza di CARS, che ha una dipendenza quadratica segnale-concentrazione29. Ciò semplifica la quantificazione chimica e l'unmixing spettrale. L'SRS multicolore e iperspettrale si è evoluto in diverse forme 30,31,32,33,34,35,36, con la messa a fuoco spettrale che è uno degli approcci più popolari per l'imaging chimico 37,38.

Sia CARS che SRS richiedono la messa a fuoco della pompa e dei raggi laser Stokes sul campione per abbinare la transizione vibrazionale delle molecole per l'eccitazione del segnale. Anche i microscopi CARS e SRS hanno molto in comune. Tuttavia, la fisica alla base di questi due processi e le rilevazioni di segnali coinvolte in queste tecnologie di microscopia hanno disparità 3,39. CARS è un processo parametrico che non ha un accoppiamento netto di energia fotone-molecola3. SRS, tuttavia, è un processo non parametrico e contribuisce al trasferimento di energia tra fotoni e sistemi molecolari27. In CARS, viene generato un nuovo segnale alla frequenza anti-Stokes, mentre SRS si manifesta come il trasferimento di energia tra la pompa e i raggi laser Stokes.

Il segnale CARS soddisfa Eq (1)28.

Equation 1 (1)

Nel frattempo, il segnale SRS può essere scritto come Eq (2)28.

Equation 1(2)

Qui, Ip, Is, ICARS e ΔISRS sono rispettivamente le intensità del fascio della pompa, del fascio di Stokes, del segnale CARS e dei segnali SRS. χ(3) è la suscettibilità ottica non lineare del terzo ordine del campione ed è un valore complesso composto da parti reali e immaginarie.

Queste equazioni esprimono i profili spettrali e la dipendenza dalla concentrazione del segnale di CARS e SRS. Le differenze nella fisica si traducono in schemi di rilevamento disparati per queste due tecnologie di microscopia. Il rilevamento del segnale in CARS di solito comporta la separazione spettrale di fotoni di nuova generazione e il rilevamento utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) o un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD); per SRS, lo scambio di energia tra la pompa e i fasci di Stokes viene solitamente misurato mediante modulazione di intensità ad alta velocità utilizzando un modulatore ottico e demodulazione utilizzando un fotodiodo (PD) abbinato a un amplificatore lock-in.

Sebbene molti sviluppi tecnologici e applicazioni siano stati pubblicati negli ultimi anni sia in ambito CARS che SRS, non sono stati eseguiti confronti sistematici delle due tecniche CRS sulla stessa piattaforma, in particolare per la microscopia iperspettrale CARS e SRS. Confronti diretti in sensibilità, risoluzione spaziale, risoluzione spettrale e capacità di separazione chimica consentirebbero ai biologi di selezionare la migliore modalità per la quantificazione chimica. In questo protocollo, vengono forniti passaggi dettagliati per costruire una piattaforma di imaging multimodale con entrambe le modalità CARS iperspettrale e SRS basate su un sistema laser a femtosecondi e messa a fuoco spettrale. Le due tecniche sono state confrontate in avanti per la risoluzione spettrale, la sensibilità di rilevamento, la risoluzione spaziale e i contrasti di imaging delle cellule.

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Protocol

1. Configurazione strumentale per l'imaging CRS iperspettrale

NOTA: La generazione del segnale CRS richiede l'uso di laser ad alta potenza (ad esempio, classe 3B o classe 4). I protocolli di sicurezza devono essere affrontati e devono essere indossati in ogni momento adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) quando si lavora a potenze di picco così elevate. Consultare la documentazione appropriata prima della sperimentazione. Questo protocollo si concentra sulla progettazione del percorso del fascio, sul cinguettio degli impulsi a femtosecondi e sull'ottimizzazione delle condizioni di imaging. Un layout ottico generale di questo microscopio CRS iperspettrale è mostrato nella Figura 1. La configurazione mostrata qui è una delle tante configurazioni esistenti per la microscopia CRS. Il sistema di microscopia CRS utilizzato in questo protocollo è costruito su una sorgente laser a femtosecondi a doppia uscita e un microscopio a scansione laser.

  1. Assicurarsi che la sorgente laser fornisca due treni di impulsi a femtosecondi (larghezza 120 fs) con una frequenza di ripetizione di 80 MHz, tra cui una lunghezza d'onda fissa a 1.045 nm utilizzata come raggio di Stokes e una lunghezza d'onda sintonizzabile da 680 a 1.300 nm utilizzata come raggio della pompa. Sincronizzare gli impulsi di uscita con una differenza di ritardo ottico. Utilizzare un telaio per microscopio per costruire la piattaforma di imaging.
  2. Progettazione del percorso del fascio
    1. Per controllare la potenza del laser sul campione, utilizzare una piastra a mezza onda e una combinazione pbS (Polarization Beam Splitter) per ciascun raggio laser.
    2. Installare un modulatore acusto-ottico (AOM) nel percorso del raggio laser Stokes. Focalizza il fascio con un obiettivo di lunghezza focale di 150 mm nell'AOM e ricorda l'uscita diordine 0 con un obiettivo di lunghezza focale di 400 mm.
    3. Utilizzare la stessa coppia di obiettivi (lunghezze focali di 150 mm e 400 mm) per espandere il raggio della pompa in modo che corrisponda alle dimensioni del raggio laser con lo Stokes.
    4. Posizionare gli obiettivi di lunghezza focale di 400 mm sia nei percorsi della pompa che in quelli del fascio stokes su stadi di traslazione unidimensionali separati per mettere a punto la divergenza del fascio e ottimizzare le dimensioni del fascio prima di entrare nel microscopio.
    5. Dirigere il fascio della pompa con uno specchio riflettente ad angolo retto montato su uno stadio di traslazione motorizzato per la regolazione del ritardo ottico. Se il raggio di Stokes ha bisogno di ritardo ottico, posizionare invece questi componenti nel suo percorso del fascio.
    6. Consentire la combinazione di entrambi i fasci a uno specchio dicroico con una lunghezza d'onda di taglio a ~ 1.000 nm (tra la pompa e le lunghezze d'onda di Stokes), in modo che il fascio di Stokes trasmetta attraverso lo specchio dicroico mentre il fascio della pompa viene riflesso dallo specchio dicroico. Inviare i raggi laser combinati in modo collineare al microscopio.
    7. Per cinguettare la pompa e le travi di Stokes, posiziona le aste di vetro nei loro percorsi delle travi. Vedere il passaggio 1.5 per i dettagli.
    8. Per confermare il corretto allineamento e la dimensione del fascio, utilizzare i diaframmi dell'iride dopo lo specchio dicroico e prima del microscopio. In particolare, installarne uno in una posizione vicina e l'altro a una distanza dallo specchio dicroico per confermare un buon allineamento e la sovrapposizione del fascio. Utilizzare una scheda di visualizzazione IR o un visualizzatore IR per visualizzare il raggio durante l'allineamento.
    9. Utilizzare un PD veloce e un oscilloscopio per misurare approssimativamente il ritardo ottico tra la pompa e gli impulsi di Stokes. Attivare l'oscilloscopio campionando il treno di impulsi laser.
    10. Bloccare il fascio della pompa e campionare il raggio di Stokes. Ingrandisci uno degli impulsi e posiziona un cursore verticale su di esso per contrassegnarne la posizione temporale sull'oscilloscopio.
    11. Sblocca il raggio della pompa e blocca il raggio di Stokes. Traslare lo stadio di ritardo fino a quando la pompa campione non si allinea temporalmente con la posizione contrassegnata.
  3. Il microscopio a scansione laser
    1. Per una configurazione al microscopio verticale, inviare i raggi laser combinati attraverso un periscopio per salire a un livello appropriato prima di raggiungere gli specchi di scansione galvo 2D.
    2. Misurare la dimensione del raggio laser prima del microscopio e impostare la coppia di lenti corretta dopo gli specchi galvo per espandere il raggio laser per adattarsi al meglio alle dimensioni della pupilla d'ingresso della lente dell'obiettivo.
    3. Costruisci un sistema 4-f usando i due obiettivi, con l'apertura posteriore dell'obiettivo e il centro dei due specchi galvo che sono piani coniugati. In alternativa, utilizzare due specchi galvo 1D separati con due sistemi di lenti 4-f per la scansione laser.
    4. Dopo il condensatore, progettare uno specchio flip da 2 pollici per riflettere i raggi laser per la raccolta del segnale. Posizionare una lente con un diametro di 2 nel percorso del fascio trasmesso per raccogliere e focalizzare completamente i segnali di trasmissione ai rilevatori.
    5. Dirigere i segnali CARS al PMT con uno specchio dicroico con un cutoff a 776 nm e consentire il rilevamento dei segnali SRS trasmessi dal PD. Utilizzare un filtro passa-banda (655/30 nm) prima del PMT per respingere gli impulsi laser di eccitazione residua. Utilizzare un filtro a passaggio corto (passaggio corto di 980 nm) prima del PD per impedire al raggio di Stokes di entrare nel rilevatore.
    6. Per il rilevamento del segnale CARS, collegare un preamplificatore e un convertitore di corrente-tensione dopo il PMT e prima di inviare il segnale al sistema di acquisizione dati. Regolare la tensione PMT per ottimizzare il contrasto del segnale e dell'immagine.
    7. Utilizzare un generatore di funzioni per modulare l'AOM a 1-10 MHz e utilizzare la stessa frequenza del riferimento per la demodulazione lock-in. Utilizzare un amplificatore lock-in per estrarre i segnali SRS prima dell'acquisizione dei dati.
  4. Acquisizione e visualizzazione dei dati
    1. Eseguire l'acquisizione dei dati utilizzando una scheda di acquisizione dati digitale (DAQ) in combinazione con una morsettiera.
    2. Utilizzare le uscite analogiche del DAQ per controllare gli specchi galvo e gli ingressi analogici per l'acquisizione del segnale.
    3. Utilizzare un software scritto in laboratorio basato su LabVIEW con un display multicanale simultaneo per la visualizzazione e il salvataggio delle immagini in tempo reale (vedere File supplementare).
  5. Cinguettio della sorgente di femtosecondi e misurazione della risoluzione spettrale
    NOTA: per ottenere una buona risoluzione spettrale utilizzando la messa a fuoco spettrale, le aste di vetro vengono utilizzate per introdurre dispersioni e impulsi laser chirp da femtosecondo a picosecondo. Per ottenere la migliore risoluzione spettrale, la velocità di cinguettio del fascio della pompa deve essere uguale a quella del raggio di Stokes. Per questo sistema laser, la migliore risoluzione spettrale può essere ottenuta cinguettando gli impulsi laser di uscita ~ 120 fs a 3,4 ps per la pompa e 1,8 ps per lo Stokes. Questo cinguettio si ottiene utilizzando una combinazione 4 + 1 (quattro nel raggio combinato, uno solo nel raggio stokes) di 150 mm di asta di vetro (SF-57), come descritto di seguito, e dovrebbe raggiungere una risoluzione spettrale di 15 cm-1 . La durata dell'impulso può essere misurata utilizzando un autocorrelatore.
    1. Inserire un'asta di vetro da 150 mm solo nel percorso della trave stokes.
    2. Inserire due aste di vetro da 150 mm nel percorso combinato pompa/fascio Stokes dopo lo splitter a fascio dicroico. Per aumentare il cinguettio, lasciare che i raggi laser combinati passino due volte le due aste di vetro posizionando uno specchio dielettrico a un'estremità delle aste.
    3. Per misurare la risoluzione spettrale, preparare un campione chimico standard (ad esempio, dimetilsolfossido [DMSO]) premuto tra due coperchi di vetro e scansionare lo stadio di ritardo fino a raggiungere il segnale massimo.
    4. Spostare il ritardo ottico di 1.000 μm nella direzione di spostamento verso il rosso. Quindi, esegui 200 fotogrammi a 10 μm / passo verso la direzione blueshift per raccogliere lo stack di immagini iperspettrali.
    5. Per convertire i numeri di fotogramma in numeri d'onda, eseguire una regressione lineare utilizzando il C-H simmetrico (2.913 cm-1) e asimmetrico (2.994 cm-1) che si estende da DMSO e i corrispondenti numeri di fotogramma40.
    6. Utilizzare il segnale XPM per misurare il profilo di intensità di messa a fuoco spettrale. Chiudere a metà il diaframma sul condensatore e spostare lo stato attivo su una coverlip vuota. Raccogliere lo stesso numero di passaggi dell'SRS iperspettrale. Per misurare lo sfondo non risonante di CARS, concentrati sul coperchio di vetro e raccogli lo stesso numero di passaggi per le misurazioni iperspettrali di CARS.
  6. Ottimizzazione del rapporto segnale-rumore (SNR) delle immagini
    1. Preparare un campione chimico per l'allineamento del sistema. Seguire la procedura descritta nel passaggio 3.1 per la preparazione del campione.
      NOTA: DMSO è una buona scelta perché è una sostanza chimica di laboratorio comune con forti segnali Raman e picchi simmetrici e asimmetrici C-H ben separati.
    2. Posizionare il campione sul palco del microscopio e aggiungere acqua o olio per immersione, se necessario, per la lente dell'obiettivo o il condensatore. Spostare correttamente il bordo della goccia DMSO nel campo visivo e regolare l'obiettivo per la migliore messa a fuoco. Centrare il condensatore utilizzando il metodo di illuminazione Köhler41. Aprire completamente il diaframma sul condensatore.
    3. Regolare la lunghezza d'onda del fascio della pompa a 800 nm (1.045 nm Stokes) per indirizzare il picco CH 3 di 2.913 cm-1. Impostare la potenza sia della pompa che del fascio di Stokes a ~ 30 mW prima del microscopio regolando la piastra a mezza onda (~ 10 mW di potenza sul piano del campione).
    4. Per SRS, impostare il guadagno dell'amplificatore lock-in su ~10 con una costante di tempo di 7 μs (quando si utilizza un tempo di permanenza di pixel di 10 μs). Assicurati che la costante di tempo sia inferiore al tempo di permanenza dei pixel. Utilizzare Demod R per l'uscita AUX per i segnali SRS.
    5. Per CARS, inviare l'uscita PMT al preamplificatore e al convertitore di corrente-tensione. Utilizzare il DAQ per acquisire l'output dal convertitore.
    6. Impostare i parametri di acquisizione delle immagini nel software di acquisizione. Utilizzare un numero di pixel di 200 x 200 con una dimensione di scansione di ~100 x 100 μm2. Assicurati che l'immagine contenga sia il droplet DMSO che un'area vuota.
    7. Scansiona il campione e controlla l'immagine sullo schermo del computer. Scansiona lo stadio di ritardo motorizzato nel fascio Stokes/pump mentre monitori le immagini in tempo reale. Scansiona il ritardo fino a quando il segnale non viene massimizzato.
    8. Spostare la goccia DMSO per coprire l'intero campo visivo e verificare se il massimo del segnale CC è centrato nell'immagine (il segnale dipende dal fascio della pompa). Regolare la posizione del fascio della pompa tramite uno specchio o l'offset di tensione nel software di imaging.
    9. Dopo l'ottimizzazione DC, regolare gli specchi del fascio Stokes fino a quando il segnale CA non viene massimizzato regolando il valore di soglia per visualizzare una saturazione di ~ 50%. Controllare se la saturazione è centrata nell'immagine. In caso contrario, mettere a punto gli specchi solo nel raggio di Stokes. Monitorare il segnale durante l'allineamento come feedback in tempo reale sulla qualità dell'allineamento.
    10. Per determinare l'SNR, selezionare una piccola regione dell'immagine DMSO e misurare il valore medio. Per il rumore, selezionate una piccola area nella regione vuota dell'immagine e determinate sia il valore medio medio che la deviazione standard. Sottrarre il valore medio del rumore dal valore medio del segnale e dividere i risultati per la deviazione standard della regione vuota.
    11. Se l'SNR calcolato non è abbastanza alto (in genere 800-1.000 per SRS e >10.000 per CARS con una tensione PMT di 0,4 V con questa combinazione di potenza), controllare e riottimizzare la sovrapposizione del fascio, le dimensioni del fascio e la posizione dello stadio di ritardo, mettere a punto l'AOM e modificare la frequenza di modulazione del generatore di funzioni fino a ottenere l'SNR previsto.

2. Analisi delle immagini ed elaborazione dei dati

  1. Analisi SNR
    1. Aprire il software ImageJ. Per importare il file di .txt di esempio DMSO salvato, fare clic su File | Importare | | immagine di testo Apri.
    2. Una volta importata l'immagine, premere CTRL+MAIUSC+C per visualizzare la funzione luminosità e contrasto (B&C). Per trovare il segnale di campionamento massimo, premere il pulsante automatico nel B&C fino a quando una regione del campione DMSO appare satura.
    3. Fare clic sullo strumento di selezione ovale sull'interfaccia ImageJ ed evidenziare una piccola area della regione DMSO satura. Una volta evidenziato, premere M per misurare la deviazione media e standard dell'area selezionata.
    4. Per misurare lo sfondo, regolare le barre nella funzione B&C fino a quando non è possibile osservare il segnale della regione vuota. Fare clic sulla selezione ovale ed evidenziare un'area dello sfondo delle stesse dimensioni del passaggio 2.1.3. Assicurarsi che l'area selezionata non contenga DMSO. Premere M per misurare le statistiche dell'area selezionata.
    5. Calcolare l'SNR in base al passaggio 1.6.10.
  2. Elaborazione di immagini CRS iperspettrali
    1. Importare il file .txt in base al passaggio 2.1.1. Una volta importato, fai clic su Immagine | Stack | Strumenti | Montaggio a Stack... per convertire il file in uno stack di immagini.
    2. Scorrere il montaggio fino a visualizzare il primo picco DMSO. Seleziona una regione sul DMSO e fai clic su Immagine | | stack Traccia il profilo dell'asse Z per tracciare l'intensità rispetto allo spettro del numero di fotogrammi. Per estrarre i dati spettrali grezzi, fare clic sull'elenco e copiare i dati del profilo.
    3. Per convertire lo spettro recuperato in unità di numero d'onda, eseguire una regressione lineare come descritto nel passaggio 1.5.5.
  3. Raccordo per la misurazione della risoluzione spettrale
    NOTA: le funzioni lorentziane vengono utilizzate per adattarsi agli spettri SRS e CARS28.
    1. Aprire il software di fitting, quindi copiare e incollare i dati di regressione lineare nel programma. Per adattare i dati SRS, evidenziare i dati e quindi tracciare i dati come grafico a dispersione.
    2. Tirare su il grafico a dispersione. Fare clic su Analisi | Picchi e | di base | Multiple Peak Fit Apri finestra di dialogo per visualizzare l'analizzatore di picco. Quando si tira su, controllare che l'input sia il grafico corrente e modificare la funzione di picco in Lorentzzian (Lorentz).
    3. Fare doppio clic su ciascuno dei due picchi DMSO sul grafico per evidenziare le regioni da montare. Quindi, fare clic su Apri NLfit per visualizzare la finestra di raccordo . Fare clic sul pulsante Adatta fino a convergenza , quindi su OK per visualizzare un riepilogo tabulato dei coefficienti di raccordo (vedere Eq (3)).
      NOTA: l'equazione seguente mostra il formato della funzione lorentziana nel software. A1/2 sono le ampiezze dei picchi di raccordo, w1/2 sono le larghezze dei picchi montati e i valori x01/02 sono i centri dei picchi montati. La variabile indipendente è x e la variabile dipendente è y.
      Equation 1 (3)
    4. Per il raccordo spettrale CARS, fare clic su Analisi | Raccordo | Curva non lineare adatta | Apri finestra di dialogo. Selezionare categoria: nuovo per definire una nuova funzione per CARS. Utilizzare una funzione di raccordo CARS a due picchi definita di seguito (vedere Eq (4)) per il montaggio spettrale CARS.
      Equation 1 (4)
  4. Determinazione della risoluzione spaziale
    NOTA: prima di questo passaggio, è importante conoscere la conversione tra la dimensione dei pixel a un ingrandimento specifico, il numero di pixel e la dimensione del passo in μm. Questo può essere eseguito utilizzando un campione di un diametro noto che è più grande della risoluzione di imaging prevista, misurando il suo profilo di linea e adattando una funzione gaussiana per determinare l'intera larghezza al valore FWHM (Half Maximum). È possibile utilizzare obiettivi di risoluzione o campioni uniformi come perline polimeriche.
    1. Acquisire un'immagine di cellule o particelle polimeriche di diametro inferiore a 200 nm.
    2. Usa ImageJ per disegnare una linea attraverso la particella più piccola dell'immagine.
    3. Premere K per tracciare il profilo di intensità.
    4. Fare clic sull'elenco dalla finestra pop-up e copiare le informazioni nel software di adattamento.
    5. Tracciare il profilo nel software di raccordo e utilizzare il raccordo gaussiano (fare clic su Analisi | Raccordo | Curva non lineare adatta | Apri finestra di dialogo | Categoria: Funzioni di base; Funzione: Gauss).
    6. Leggere la larghezza di picco dopo il montaggio. Utilizzare la conversione da pixel a dimensione per ottenere la risoluzione effettiva del microscopio.

3. Preparazione di campioni per l'imaging CRS iperspettrale

  1. Preparazione di vetrini di imaging e campioni chimici
    1. Posizionare un pezzo di nastro biadesivo su una copertina e ritagliare una piccola forma rettangolare del nastro dal centro del nastro posizionato per creare un'area aperta per il posizionamento del campione.
    2. Pipettare 1-2 μL di DMSO puro ed erogare la goccia al centro del posto vacante.
    3. Posizionare con attenzione il coperchio superiore e premere delicatamente i bordi dei coperchi per sigillare la camera, assicurandosi che il campione DMSO non contatti i bordi del nastro.
    4. Per gli esperimenti di sensibilità, preparare diluizioni seriali di DMSO in ossido di deuterio (D2O) per dare un intervallo di concentrazione del 50% -0%. Prelevare 1-2 μL di ogni soluzione e preparare i campioni pressati come descritto sopra.
  2. Preparazione cellulare
    1. Semina le cellule in un piatto di fondo di vetro da 35 mm (o più grande) nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina / streptomicina.
    2. Incubare le cellule in una camera di incubazione a 37 °C con un'atmosfera di CO2 del 5% durante la notte o più a lungo fino a raggiungere una confluenza del ~50%-80%.
    3. Immagina direttamente le cellule vive o fissa le cellule con una soluzione di formalina al 10% per l'imaging.

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Representative Results

Confronti della risoluzione spettrale
La Figura 2 confronta la risoluzione spettrale della microscopia iperspettrale SRS (Figura 2A) e CARS (Figura 2B) utilizzando un campione DMSO. Per lo spettro SRS, sono state applicate due funzioni lorentziane (vedi fase di protocollo 2.3) per adattarsi allo spettro e una risoluzione di 14,6 cm-1 è stata ottenuta utilizzando il picco di 2.913 cm-1 . Per CARS, per il montaggio è stata utilizzata una funzione di fitting a due picchi con uno sfondo gaussiano (vedi protocollo passo 2.3), che ha dato la risoluzione spettrale di 17,1 cm-1. Questi risultati mostrano che, nelle stesse condizioni di misurazione, SRS ha una risoluzione spettrale migliore rispetto a CARS. La ridotta risoluzione spettrale in CARS è principalmente favorita dal coinvolgimento dello sfondo non consonante. Inoltre, è stato riscontrato che i rapporti di picco simmetrici (2.913 cm-1) e asimmetrici (2.995 cm-1) erano molto diversi per SRS e CARS. Ciò è dovuto alle diverse correlazioni del segnale con la suscettibilità ottica non lineare del terzo ordine, come descritto nelle equazioni (1) e (2). Con la dipendenza quadratica di CARS, la differenza di intensità tra i due picchi è amplificata. Le forme simmetriche delle linee dei picchi SRS e le forme asimmetriche delle linee dei picchi CARS possono essere osservate nello spettro. L'asimmetria nel segnale CARS è dovuta principalmente alla presenza dell'interferenza di fondo non risonante. I picchi spettrali CARS appaiono leggermente spostati verso il rosso (1-2 cm-1) ai picchi SRS. Ciò deriva anche dall'interferenza di fondo non consonante con i picchi risonanti.

Confronti della sensibilità di rilevamento
La Figura 3 confronta la sensibilità di rilevamento della microscopia iperspettrale SRS e CARS. L'SNR dei segnali DMSO SRS (2.913 cm-1) come funzione della concentrazione di DMSO in D2O ad alte concentrazioni viene tracciato per primo (1%-50%, Figura 3A). I risultati mostrano una relazione lineare, un'equazione soddisfacente (2). La figura 3B traccia gli spettri DMSO a concentrazioni dello 0,1% e dello 0,01%, in cui il picco di 2.913 cm-1 può essere risolto nel primo ma non nel secondo, indicando che il limite di rilevamento è compreso tra lo 0,1% e lo 0,01% dmSO. Utilizzando il limite di criteri vuoti, abbiamo stimato che il limite di rilevamento SRS è dello 0,021% DMSO. La Figura 3C traccia l'SNR CARS come funzione della concentrazione di DMSO (1%-50%), mostrando una dipendenza quadratica in accordo con l'equazione (1). Gli spettri CARS recuperati in fase sono mostrati nella Figura 3D per il DMSO dello 0,1% e dello 0,01%. Per ottenere questi spettri, è stato utilizzato un metodo di recupero della fase spettrale basato sulle relazioni Kramers-Kronig ed è stata eseguita un'ulteriore rimozione dello sfondo16. Simile agli spettri SRS, il picco DMSO 2.913 cm-1 può essere chiaramente risolto per il DMSO dello 0,1% ma non per lo 0,01%, indicando un limite di rilevamento tra queste due concentrazioni. Utilizzando il limite di criteri vuoti, abbiamo stimato che il limite di rilevamento SRS è dello 0,015% DMSO. Il DMSO dello 0,02% corrisponde a 2,8 mM. Pertanto, il limite di rilevamento del microscopio CRS iperspettrale utilizzato qui è ~ 2,1-2,8 mM DMSO.

Confronti della risoluzione spaziale
La Figura 4 confronta la risoluzione di una piccola caratteristica cellulare rilevata nelle immagini SRS (Figura 4A) e CARS (Figura 4B). I profili di intensità della stessa linea vengono visualizzati e adattati utilizzando una funzione gaussiana per determinare i valori FWHM per il confronto della risoluzione. Il segnale SRS ha dato una risoluzione di 398,6 nm (Figura 4C), mentre il segnale CARS ha dato una risoluzione di 330,3 nm (Figura 4D). La risoluzione di CARS era ~ 1,2 volte migliore di quella dell'SRS. La ragione della differenza di risoluzione risiede anche nelle equazioni (1) e (2). Sia la pompa che i fasci di Stokes hanno una funzione di diffusione puntiforme gaussiana al centro dell'attenzione. Il segnale di CARS è quindi proporzionale alla moltiplicazione di tre funzioni gaussiane, che riduce approssimativamente la larghezza di un fattore di √3. Analogamente, per SRS, la larghezza è ridotta di un fattore di √2. Pertanto, la risoluzione di CARS è stata √3/√2 = 1,2 volte migliore di quella dell'SRS.

Confronti delle immagini delle cellule
La Figura 5 confronta le immagini SRS e CARS delle celle MIA PaCa-2 in diverse posizioni di ritardo ottico. La Figura 5A mostra le immagini SRS al ritardo ottico che ha dato il segnale più forte. In questa immagine, è possibile rilevare goccioline lipidiche (LD), reticolo endoplasmatico (ER) e nucleo (NU), con LD che hanno i segnali più forti mostrati come punti luminosi. La figura 5B mostra l'immagine del canale CARS con lo stesso ritardo ottico, con contrasti molto ridotti per gli LCD. Le ragioni principali di questa differenza di contrasto sono la presenza dello sfondo non consonante e il red-shift dello stesso picco Raman negli spettri CARS. A questo ritardo ottico, il segnale generato ha un grande contributo dallo sfondo non consonante dell'acqua. Per migliorare il contrasto lipidico in CARS, il ritardo ottico è stato sintonizzato su un valore spostato verso il rosso. Il red-shift ha migliorato i contrasti lipidici concentrando più energia ai 2.850 cm-1 sia per SRS (Figura 5C) che per CARS (Figura 5D), sebbene il livello complessivo del segnale sia stato ridotto. Per CARS, un contrasto simile di LD come SRS è stato ottenuto da uno spostamento in rosso di ~ 98 cm-1 nella messa a fuoco spettrale (Figura 5D), sebbene sia stato ancora osservato uno sfondo superiore a quello dell'immagine SRS. A questo ritardo ottico, l'immagine SRS mostra molto meno contenuto di proteine e acidi nucleici ma un forte contenuto lipidico in LD, ER e membrane cellulari (Figura 5C).

CARS è un processo parametrico mentre SRS non è parametrico. Tale differenza contribuisce anche a contrastare le differenze nelle due modalità. I segnali parametrici CARS sono determinati dall'interferenza dei segnali CARS provenienti da diversi strati vicini alla messa a fuoco del laser, che potrebbero mostrare contrasti negativi come indicato dalle frecce in Figura 5B e Figura 5D (anche in Figura 4B). Tali contrasti negativi indotti da interferenze di segnale sono assenti nelle immagini SRS. Il contrasto negativo in CARS potrebbe fornire informazioni sulla posizione assiale del target di interesse.

I segnali SRS hanno una relazione lineare con la concentrazione molecolare, mentre i segnali CARS soddisfano una dipendenza dalla concentrazione quasi quadratica. Pertanto, gli LD ricchi di CH2 mostrano un segnale molto più forte dell'ER e delle membrane cellulari nell'immagine CARS rispetto all'immagine SRS (Figura 5E, F). Gli spettri SRS possono essere estratti da immagini iperspettrali. La Figura 5G mostra i tipici spettri SRS di LD, ER, citosol (CY) e NU. Sia l'intensità che la forma spettrale sono diverse per i diversi compartimenti cellulari. LD mostra un segnale molto più forte a 2.850 cm-1 rispetto ad altri organelli. Per quanto riguarda le CARS, si possono ottenere spettri simili, anche se di forme diverse. Gli spettri CARS grezzi mostrano un piccolo spostamento verso il rosso rispetto ai corrispondenti spettri SRS. Il recupero di fase spettrale può essere ulteriormente utilizzato per estrarre le risposte Raman utilizzando gli spettri CARS.

Figure 1
Figura 1: Schema del microscopio iperspettrale CARS/SRS. Abbreviazioni: CARS = coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS = scattering Raman stimolato; PBS = splitter a fascio polarizzatore; PD = fotodiodo; PMT = tubo fotomoltiplicatore; AOM = modulatore acusto-ottico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Spettri DMSO. (A) Spettri SRS e (B) CARS di DMSO. I punti sono dati sperimentali; le curve sono risultati di adattamento spettrale. Abbreviazioni: CARS = coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS = scattering Raman stimolato; DMSO = dimetilsolfossido; w = risoluzione spettrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rapporti segnale-rumore e spettri del DMSO. (A) Rapporto segnale-rumore del picco simmetrico DMSO a 2.913 cm-1 in funzione della concentrazione in D2O misurata da SRS. I punti sono dati sperimentali; la linea è il risultato del raccordo lineare. (B) Gli spettri SRS dello 0,1% e dello 0,01% DMSO in D2O. (C) Rapporto segnale-rumore del picco simmetrico DMSO a 2.913 cm-1 in funzione della concentrazione in D2O misurata da CARS. I punti sono dati sperimentali; la curva è il risultato di raccordo polinomiale di secondo grado. (D) Gli spettri CARS dello 0,1% e dello 0,01% DMSO in D2O. Abbreviazioni: CARS = coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS = scattering Raman stimolato; DMSO = dimetilsolfossido; SNR = rapporto segnale/rumore; D2O = ossido di deuterio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagini SRS e CARS e profili di intensità di una cella MIA PaCa-2. (A) Un'immagine SRS di una cella MIA PaCa-2. (B) Un'immagine CARS di una cella MIA PaCa-2 allo stesso campo visivo del pannello A. (C) Profilo di intensità di SRS lungo la linea gialla nel pannello A. (D) Profilo di intensità delle AUTOMOBILI lungo la linea gialla nel pannello B. I punti sono dati sperimentali; le curve sono risultati di adattamento delle funzioni gaussiane. Barre di scala = 5 μm. Abbreviazioni: CARS = coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS = scattering Raman stimolato; w = risoluzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Immagini e profilo di intensità delle cellule MIA PaCa-2. (A) Un'immagine SRS delle celle MIA PaCa-2 al ritardo di tempo ottimizzato per l'intensità SRS. (B) Un'immagine CARS con lo stesso ritardo del pannello A. (C) Un'immagine SRS ai ritardi spostati in rosso di 98 cm-1 come nel pannello A. (D) Un'immagine CARS con lo stesso ritardo ottico del pannello C. (E,F) I profili di intensità SRS e CARS tracciati lungo le linee tratteggiate nei pannelli A e D. (G) Spettri SRS tipici delle goccioline lipidiche, del reticolo endoplasmatico, del citosol e del nucleo. (H) Spettri TIPICI CARS delle quattro composizioni cellulari. Le linee tratteggiate verde e rossa sono posizioni di ritardo per i pannelli A/B e C/D, rispettivamente. Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: CARS = coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS = scattering Raman stimolato; LD = goccioline lipidiche; ER = reticolo endoplasmatico; CY = citosol; NU = nucleo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo qui presentato descrive la costruzione di un microscopio CRS multimodale e il confronto diretto tra CARS e SRS imaging. Per la costruzione del microscopio, i passaggi critici sono la sovrapposizione del fascio spaziale e temporale e l'ottimizzazione delle dimensioni del fascio. Si consiglia di utilizzare un campione standard come DMSO prima dell'imaging biologico per ottimizzare l'SNR e calibrare gli spostamenti Raman. Il confronto diretto tra le immagini CARS e SRS rivela che CARS ha una migliore risoluzione spaziale, mentre SRS offre una migliore risoluzione spettrale e contrasti chimici meno contorti. Sia CARS che SRS hanno limiti di rilevamento simili.

CARS e SRS imaging utilizzano laser a impulsi ad alta energia per l'eccitazione. Ciò consente alla piattaforma di integrare altre modalità di imaging ottico non lineare come la fluorescenza di eccitazione multifotonica, la generazione di armoniche e l'assorbimento transitorio per ulteriori contrasti chimici28,39.

CARS e SRS sono stati ampiamente utilizzati per studiare la composizione lipidica con elevata selettività chimica. Tuttavia, le tecnologie non si limitano a quantificare i lipidi. SRS è stato applicato per mappare la distribuzione dei farmaci42, la sintesi proteica43 e il DNA44. CARS e SRS sono stati applicati anche a ingredienti ed eccipienti farmaceutici di immagini in compresse 45,46,47,48. Hyperspectral CARS e SRS hanno trovato applicazioni nella diagnosi del cancro49, nella valutazione delle malattie cardiovascolari50 e nell'imaging neurale51. Possono anche essere applicati per gli studi COVID-1952. I CARS a banda larga, che possono coprire finestre spettrali larghe fino a 3.000 cm-1, possono chiarire ricche strutture chimiche in campioni biologici53. Tuttavia, a causa della lenta velocità di lettura del CCD, il tempo di permanenza dei pixel è a livello di millisecondi, molto più lento del tempo di permanenza dei pixel al microsecondo per la microscopia SRS34. La microscopia iperspettrale SRS ha attualmente una larghezza di banda tipica di 200-300 cm-1, limitata dalla larghezza di banda laser e dalla mancanza di rivelatori array integrati lock-in34. La microscopia SRS a trasformata di Fourier è un modo alternativo per ampliare potenzialmente la copertura spettrale SRS35.

Sebbene CARS e SRS forniscano ricche informazioni chimiche senza la necessità di etichettatura, la selettività chimica risiede nei legami chimici, rendendo difficile distinguere proteine specifiche. I tag Raman hanno mostrato il potenziale per migliorare la selettività chimica di CARS e SRS54,55. Tuttavia, l'imaging Raman coerente ha ancora una sensibilità molto più bassa rispetto al rilevamento della fluorescenza. Il miglioramento della superficie è stato utilizzato per la spettroscopia spontanea di scattering Raman per migliorare i livelli di segnale56. È stato applicato anche a CARS e SRS per l'amplificazione del segnale 57,58,59. Sebbene il fattore di potenziamento non sia così alto come lo scattering Raman spontaneo, la microscopia CARS e SRS potenziata in superficie mostra ancora il potenziale per rilevare singole molecole59,60. Tuttavia, l'uso di particelle o superfici metalliche priva il vantaggio dell'approccio senza etichette. Migliorare la sensibilità della microscopia Raman coerente senza l'uso di superfici metalliche espanderebbe notevolmente l'applicazione della tecnologia nelle scienze biologiche.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata supportata dal fondo di avvio del Dipartimento di Chimica della Purdue University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25x36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110

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Chimica Numero 182
Confronto diretto tra lo scattering Raman stimolato iperspettrale e la microscopia a dispersione raman coerente anti-Stokes per l'imaging chimico
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Clark, M. G., Brasseale III, K. A.,… More

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).

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