Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63677
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Purdue University

Summary

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Abstract

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie zijn de meest gebruikte coherente Raman-verstrooiingsbeeldvormingstechnologieën. Hyperspectrale SRS- en CARS-beeldvorming bieden Raman spectrale informatie op elke pixel, wat een betere scheiding van verschillende chemische samenstellingen mogelijk maakt. Hoewel beide technieken twee excitatielasers vereisen, zijn hun signaaldetectieschema's en spectrale eigenschappen heel verschillend. Het doel van dit protocol is om zowel hyperspectrale SRS- als CARS-beeldvorming op één platform uit te voeren en de twee microscopietechnieken voor het afbeelden van verschillende biologische monsters te vergelijken. De spectrale focusmethode wordt gebruikt om spectrale informatie te verkrijgen met behulp van femtosecondelasers. Door standaard chemische monsters te gebruiken, worden de gevoeligheid, ruimtelijke resolutie en spectrale resolutie van SRS en CARS in dezelfde excitatieomstandigheden (d.w.z. vermogen bij het monster, pixel dwell-tijd, objectieve lens, pulsenergie) vergeleken. De beeldcontrasten van CARS en SRS voor biologische monsters worden naast elkaar geplaatst en vergeleken. De directe vergelijking van CARS- en SRS-prestaties zou een optimale selectie van de modaliteit voor chemische beeldvorming mogelijk maken.

Introduction

Het Raman-verstrooiingsfenomeen werd voor het eerst waargenomen in 1928 door C. V. Raman1. Wanneer een invallend foton interageert met een monster, kan spontaan een inelastische verstrooiingsgebeurtenis optreden, waarbij de energieverandering van het foton overeenkomt met een vibrationele overgang van de geanalyseerde chemische soort. Dit proces vereist geen gebruik van een chemische tag, waardoor het een veelzijdig, labelvrij hulpmiddel is voor chemische analyse en tegelijkertijd de verstoring van monsters minimaliseert. Ondanks de voordelen lijdt spontane Raman-verstrooiing aan een lage verstrooiingsdoorsnede (meestal 1011 lager dan de infrarood [IR] absorptiedoorsnede), wat lange acquisitietijden vereist voor analyse2. De zoektocht naar het verhogen van de gevoeligheid van het Raman-verstrooiingsproces is dus essentieel bij het pushen van Raman-technologieën voor realtime beeldvorming.

Een effectieve manier om de gevoeligheid van Raman-verstrooiing aanzienlijk te verbeteren, is door middel van coherente Raman-verstrooiingsprocessen (CRS), waarvoor meestal twee laserpulsen worden gebruikt om moleculaire trillingsovergangen te exciteren 3,4. Wanneer het fotonenergieverschil tussen de twee lasers overeenkomt met de trillingsmodi van monstermoleculen, worden sterke Raman-signalen gegenereerd. De twee meest gebruikte CRS-processen voor beeldvorming zijn coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) en gestimuleerde Raman scattering (SRS)5. In de afgelopen twee decennia hebben technologische ontwikkelingen CARS- en SRS-microscopietechnieken verbeterd om krachtige hulpmiddelen te worden voor labelvrije kwantificering en opheldering van chemische veranderingen in biologische monsters.

Chemische beeldvorming door CARS-microscopie kan worden gedateerd op 1982 toen laserscanning voor het eerst werd toegepast om CARS-beelden te verkrijgen, gedemonstreerd door Duncan et al6. De modernisering van CARS-microscopie werd sterk versneld na de brede toepassingen van laserscanning multifotonenfluorescentiemicroscopie7. Vroeg werk van de Xie-groep met behulp van lasers met een hoge herhalingssnelheid heeft CARS omgevormd tot een snel, labelvrij, chemisch beeldvormingsplatform voor de karakterisering van moleculen in biologische monsters 8,9,10. Een van de belangrijkste problemen voor CARS-beeldvorming is de aanwezigheid van een niet-resonante achtergrond, die het beeldcontrast vermindert en het Raman-spectrum vervormt. Er zijn veel inspanningen geleverd om ofwel de niet-resonante achtergrond11,12,13,14,15 te verminderen of om resonante Raman-signalen uit de CARS-spectra16,17 te halen. Een andere vooruitgang die het veld enorm heeft verbeterd, is hyperspectrale CARS-beeldvorming, die spectrale mapping mogelijk maakt bij elke beeldpixel met verbeterde chemische selectiviteit 18,19,20,21.

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) is een jongere beeldvormingstechnologie dan CARS, hoewel het eerder werd ontdekt22. In 2007 werd SRS-microscopie gerapporteerd met behulp van een laserbron met lage herhalingssnelheid23. Al snel demonstreerden verschillende groepen high-speed SRS-beeldvorming met behulp van lasers met hoge herhalingssnelheid 24,25,26. Een van de belangrijkste voordelen van SRS-microscopie ten opzichte van CARS is de afwezigheid van de niet-resonante achtergrond27, hoewel andere achtergronden zoals cross-phase modulatie (XPM), transiënte absorptie (TA), twee-fotonenabsorptie (TPA) en fotothermisch (PT) effect, kunnen optreden met SRS28. Bovendien hebben het SRS-signaal en de monsterconcentratie lineaire relaties, in tegenstelling tot CARS, dat een kwadratische signaalconcentratieafhankelijkheid heeft29. Dit vereenvoudigt chemische kwantificering en spectrale ontmenging. Multicolor en hyperspectrale SRS is geëvolueerd in verschillende vormen 30,31,32,33,34,35,36, waarbij spectrale focus een van de meest populaire benaderingen is voor chemische beeldvorming 37,38.

Zowel CARS als SRS vereisen de focus van de pomp en Stokes laserstralen op het monster om de trillingsovergang van de moleculen voor signaalexcitatie te matchen. CARS en SRS microscopen hebben ook veel gemeen. De fysica die ten grondslag ligt aan deze twee processen en signaaldetecties die betrokken zijn bij deze microscopietechnologieën hebben echter verschillen 3,39. CARS is een parametrisch proces dat geen netto foton-molecuul energiekoppelingheeft 3. SRS is echter een niet-parametrisch proces en draagt bij aan de energieoverdracht tussen fotonen en moleculaire systemen27. In CARS wordt een nieuw signaal met anti-Stokes-frequentie gegenereerd, terwijl SRS zich manifesteert als de energieoverdracht tussen de pomp en Stokes-laserstralen.

CARS-signaal voldoet aan Eq (1)28.

Equation 1 (1)

Ondertussen kan het SRS-signaal worden geschreven als Eq (2) 28.

Equation 1(2)

Hier zijn Ip, Is, ICARS en ΔISRS de intensiteiten van respectievelijk de pompbundel, Stokes-bundel, CARS-signaal en SRS-signalen. χ(3) is de derde-orde niet-lineaire optische gevoeligheid van het monster en is een complexe waarde die bestaat uit reële en imaginaire delen.

Deze vergelijkingen drukken de spectrale profielen en signaalconcentratieafhankelijkheid van CARS en SRS uit. Verschillen in fysica resulteren in ongelijksoortige detectieschema's voor deze twee microscopietechnologieën. Signaaldetectie in CARS omvat meestal spectrale scheiding van nieuw gegenereerde fotonen en detectie met behulp van een fotomultiplicatorbuis (PMT) of charge-coupled device (CCD); voor SRS wordt de energie-uitwisseling tussen de pomp en stokesbundels meestal gemeten door intensiteitsmodulatie met hoge snelheid met behulp van een optische modulator en demodulatie met behulp van een fotodiode (PD) in combinatie met een lock-in versterker.

Hoewel er de afgelopen jaren veel technologische ontwikkelingen en toepassingen zijn gepubliceerd op zowel CARS- als SRS-gebieden, zijn er geen systematische vergelijkingen van de twee CRS-technieken op hetzelfde platform uitgevoerd, vooral voor hyperspectrale CARS- en SRS-microscopie. Directe vergelijkingen in gevoeligheid, ruimtelijke resolutie, spectrale resolutie en chemische scheidingsmogelijkheden zouden biologen in staat stellen om de beste modaliteit voor chemische kwantificering te selecteren. In dit protocol worden gedetailleerde stappen beschreven om een multimodaal beeldvormingsplatform te bouwen met zowel hyperspectrale CARS- als SRS-modaliteiten op basis van een femtosecondelasersysteem en spectrale focus. De twee technieken zijn vergeleken in de voorwaartse richting voor spectrale resolutie, detectiegevoeligheid, ruimtelijke resolutie en beeldcontrasten van cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Instrumentele setup voor hyperspectrale CRS-beeldvorming

OPMERKING: Het genereren van CRS-signaal vereist het gebruik van krachtige (d.w.z. klasse 3B of klasse 4) lasers. Veiligheidsprotocollen moeten worden aangepakt en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) moeten te allen tijde worden gedragen bij het werken met dergelijke hoge piekvermogens. Raadpleeg de juiste documentatie voordat u gaat experimenteren. Dit protocol richt zich op het ontwerpen van het bundelpad, het tsjilpen van de femtosecondepulsen en het optimaliseren van de beeldvormingsomstandigheden. Een algemene optische lay-out van deze hyperspectrale CRS-microscoop is weergegeven in figuur 1. De hier getoonde configuratie is een van de vele bestaande configuraties voor CRS-microscopie. Het CRS-microscopiesysteem dat in dit protocol wordt gebruikt, is gebouwd op een femtoseconde laserbron met dubbele uitgang en een laserscanmicroscoop.

  1. Zorg ervoor dat de laserbron twee femtoseconde pulstreinen (120 fs breedte) levert met een herhalingsfrequentie van 80 MHz, inclusief een vaste golflengte bij 1.045 nm die wordt gebruikt als de Stokes-bundel en een instelbare golflengte van 680 tot 1.300 nm die als pompstraal wordt gebruikt. Synchroniseer de uitgangspulsen met een optisch vertragingsverschil. Gebruik een microscoopframe om het beeldvormingsplatform te construeren.
  2. Het balkpad ontwerpen
    1. Om het laservermogen op het monster te regelen, gebruikt u een combinatie van een halve golfplaat en polarisatiestraalsplitter (PBS) voor elke laserstraal.
    2. Installeer een acousto-optische modulator (AOM) in het Stokes laserstraalpad. Focus de bundel met een 150 mm brandpuntsafstand lens in de AOM en recollimatiseer de 0e orde output met een 400 mm brandpuntsafstand lens.
    3. Gebruik hetzelfde lenspaar (brandpuntsafstanden van 150 mm en 400 mm) om de pompstraal uit te breiden zodat deze overeenkomt met de laserstraalgrootte met de Stokes.
    4. Plaats de 400 mm brandpuntsafstandlenzen in zowel de pomp- als de Stokes-bundelpaden op afzonderlijke eendimensionale translatiefasen voor het verfijnen van de bundel divergentie en het optimaliseren van de bundelgrootte voordat u de microscoop betreedt.
    5. Richt de pompbundel met een haakse reflecterende spiegel gemonteerd op een gemotoriseerde translatietrap voor optische vertragingsafstemming. Als de Stokes-bundel optische vertraging nodig heeft, plaatst u deze componenten in plaats daarvan in het bundelpad.
    6. Laat beide bundels worden gecombineerd op een dichroïsche spiegel met een cutoff-golflengte op ~ 1.000 nm (tussen de pomp- en Stokes-golflengten), zodat de Stokes-straal door de dichroïsche spiegel wordt verzonden terwijl de pompstraal wordt gereflecteerd door de dichroïsche spiegel. Stuur de collineair gecombineerde laserstralen naar de microscoop.
    7. Om de pomp en Stokes-balken te tsjilpen, plaatst u glazen staven in hun balkpaden. Zie stap 1.5 voor meer informatie.
    8. Om de juiste uitlijning en straalgrootte te bevestigen, gebruikt u irismembranen na de dichroïsche spiegel en vóór de microscoop. Installeer er in het bijzonder een op een positie dicht bij en de andere op een afstand van de dichroïsche spiegel om een goede uitlijning en bundeloverlapping te bevestigen. Gebruik een IR-weergavekaart of IR-viewer om de bundel tijdens de uitlijning te visualiseren.
    9. Gebruik een snelle PD en een oscilloscoop om ongeveer de optische vertraging tussen de pomp en Stokes pulsen te meten. Activeer de oscilloscoop door de laserpulstrein te bemonsteren.
    10. Blokkeer de pompbalk en bemonster de Stokes-balk. Zoom in op een van de pulsen en plaats er een verticale cursor op om de tijdelijke locatie op de oscilloscoop te markeren.
    11. Deblokkeer de pompbalk en blokkeer de Stokes-balk. Vertaal de vertragingsfase totdat de pulsen van de monsterpomp tijdelijk zijn uitgelijnd met de gemarkeerde positie.
  3. De laserscanmicroscoop
    1. Voor een rechtopstaande microscoopconfiguratie stuurt u de gecombineerde laserstralen door een periscoop om naar een geschikt niveau te klimmen voordat u de 2D galvo-scanspiegels bereikt.
    2. Meet de grootte van de laserstraal vóór de microscoop en stel het juiste lenspaar in na de galvo-spiegels om de laserstraal uit te breiden zodat deze het beste overeenkomt met de grootte van de ingangspupil van de objectieflens.
    3. Construeer een 4-f-systeem met behulp van de twee lenzen, waarbij de achteropening van de objectieflens en het midden van de twee galvo-spiegels geconjugeerde vlakken zijn. U kunt ook twee afzonderlijke 1D-galvospiegels gebruiken met twee 4-f-lenssystemen voor laserscanning.
    4. Ontwerp na de condensor een 2-in-klapspiegel om de laserstralen te reflecteren voor signaalverzameling. Plaats een lens met een diameter van 2 in het verzonden bundelpad om transmissiesignalen naar de detectoren volledig te verzamelen en te focussen.
    5. Leid de CARS-signalen naar de PMT met een dichroïsche spiegel met een cutoff bij 776 nm en laat de verzonden SRS-signalen detecteren door de PD. Gebruik een bandpass-filter (655/30 nm) vóór de PMT om resterende excitatielaserpulsen te weigeren. Gebruik een kortdoorlaatfilter (980 nm korte doorgang) vóór de PD om te voorkomen dat de Stokes-straal de detector binnendringt.
    6. Voor CARS-signaaldetectie sluit u een voorversterker en een stroomspanningsomvormer aan na de PMT en voordat u het signaal naar het data-acquisitiesysteem stuurt. Pas de PMT-spanning aan om het signaal- en beeldcontrast te optimaliseren.
    7. Gebruik een functiegenerator om de AOM op 1-10 MHz te moduleren en gebruik dezelfde frequentie als de referentie voor de lock-in demodulatie. Gebruik een lock-in versterker om SRS-signalen te extraheren voordat gegevens worden verzameld.
  4. Data-acquisitie en -weergave
    1. Voer gegevensverzameling uit met behulp van een DAQ-kaart (Digital Data Acquisition) in combinatie met een klemmenblok.
    2. Gebruik de analoge uitgangen van de DAQ om de galvospiegels en de analoge ingangen voor signaalacquisitie te bedienen.
    3. Gebruik lab-geschreven software op basis van LabVIEW met een gelijktijdige meerkanaalsweergave voor het in realtime bekijken en opslaan van afbeeldingen (zie Aanvullend bestand).
  5. Het tsjilpen van de femtosecondebron en het meten van de spectrale resolutie
    OPMERKING: Om een goede spectrale resolutie te bereiken met behulp van spectrale focus, worden glazen staafjes gebruikt om dispersies te introduceren en laserpulsen van femtoseconde tot picoseconde te introduceren. Om de beste spectrale resolutie te bereiken, moet de tjilpsnelheid van de pompbundel gelijk zijn aan die van de Stokes-bundel. Voor dit lasersysteem kan de beste spectrale resolutie worden bereikt door de ~120 fs uitgangslaserpulsen te laten piepen tot 3,4 ps voor de pomp en 1,8 ps voor de Stokes. Dit getjilp wordt bereikt door gebruik te maken van een 4+1 combinatie (vier in de gecombineerde bundel, één alleen in de Stokes balk) van 150 mm glazen staaf (SF-57) combinatie, zoals hieronder beschreven, en zou een spectrale resolutie van 15 cm-1 moeten bereiken. De pulsduur kan worden gemeten met behulp van een autocorrelator.
    1. Steek een glazen staaf van 150 mm in alleen het Stokes-balkpad.
    2. Steek twee glazen staven van 150 mm in het gecombineerde pomp/Stokes-balkpad na de dichroïsche bundelsplitser. Om het getjilp te verhogen, laat u de gecombineerde laserstralen de twee glazen staven dubbel passeren door een diëlektrische spiegel aan het ene uiteinde van de staven te plaatsen.
    3. Om de spectrale resolutie te meten, bereidt u een standaard chemisch (bijv. dimethylsulfoxide [DMSO]) monster dat tussen twee glazen afdekplaten wordt geperst en scant u de vertragingsfase totdat het maximale signaal is bereikt.
    4. Verplaats de optische vertraging 1.000 μm in de rode schakelrichting. Voer vervolgens 200 frames uit op 10 μm / stap in de richting van blauwverschuiving om de hyperspectrale afbeeldingsstack te verzamelen.
    5. Om de framenummers om te zetten in golfnummers, voert u een lineaire regressie uit met behulp van de symmetrische (2.913 cm-1) en asymmetrische (2.994 cm-1) C-H-strekken van DMSO en de bijbehorende framenummers40.
    6. Gebruik het XPM-signaal voor het meten van het spectrale focusintensiteitsprofiel. Sluit het membraan op de condensor half en verplaats de focus naar een lege coverslip. Verzamel hetzelfde aantal stappen als voor hyperspectrale SRS. Om de cars nonresonante achtergrond te meten, richt u zich op de glazen afdekplaat en verzamelt u hetzelfde aantal stappen voor de hyperspectrale CARS-metingen.
  6. Optimaliseren van de signaal-ruisverhouding (SNR) van beelden
    1. Bereid een chemisch monster voor op uitlijning van het systeem. Volg de procedure beschreven in stap 3.1 voor monstervoorbereiding.
      OPMERKING: DMSO is een goede keuze omdat het een veel voorkomende laboratoriumstof is met sterke Raman-signalen en goed gescheiden C-H symmetrische en asymmetrische pieken.
    2. Plaats het monster op het microscoopstadium en voeg indien nodig water of dompelolie toe voor de objectieflens of condensor. Beweeg de rand van de DMSO-druppel goed in het gezichtsveld en pas de objectieflens aan voor de beste scherpstelling. Centreer de condensor met behulp van de Köhler-verlichtingsmethode41. Open het membraan op de condensor volledig.
    3. Stem de golflengte van de pompbundel af op 800 nm (1.045 nm Stokes) om de piek van 2.913 cm-1 CH3 te bereiken. Stel het vermogen van zowel de pomp als de Stokes-straal in op ~ 30 mW vóór de microscoop door de halve golfplaat aan te passen (~ 10 mW vermogen op het monstervlak).
    4. Stel voor SRS de versterking van de lock-in-versterker in op ~10 met een tijdconstante van 7 μs (bij gebruik van een 10 μs pixel dwell time). Zorg ervoor dat de tijdconstante kleiner is dan de pixel dwell-tijd. Gebruik Demod R voor de AUX-uitgang voor SRS-signalen.
    5. Voor CARS stuurt u de PMT-uitgang naar de voorversterker en stroomspanningsomvormer. Gebruik de DAQ om de uitvoer van de converter te verkrijgen.
    6. Stel de parameters voor beeldacquisitie in de acquisitiesoftware in. Gebruik een pixelgetal van 200 x 200 met een scangrootte van ~100 x 100 μm2. Zorg ervoor dat de afbeelding zowel de DMSO-druppel als een leeg gebied bevat.
    7. Scan het voorbeeld en controleer de afbeelding op het computerscherm. Scan de gemotoriseerde vertragingsfase in de Stokes/pompbundel terwijl u de real-time beelden bewaakt. Scan de vertraging totdat het signaal is gemaximaliseerd.
    8. Verplaats de DMSO-druppel om het hele gezichtsveld te bedekken en controleer of het dc-signaalmaximum in het beeld is gecentreerd (signaal is afhankelijk van de pompbundel). Pas de positie van de pompbundel aan via een spiegel of de spanningsverschuiving in de beeldbewerkingssoftware.
    9. Pas na DC-optimalisatie de Stokes-straalspiegels aan totdat het AC-signaal is gemaximaliseerd door de drempelwaarde aan te passen om ~ 50% verzadiging weer te geven. Controleer of de verzadiging is gecentreerd in de afbeelding. Zo niet, verfijn de spiegels dan alleen in de Stokes-straal. Bewaak het signaal tijdens de uitlijning als real-time feedback over de kwaliteit van de uitlijning.
    10. Om de SNR te bepalen, selecteert u een klein gebied van de DMSO-afbeelding en meet u de gemiddelde waarde. Selecteer voor de ruis een klein gebied in het lege gebied van de afbeelding en bepaal zowel de gemiddelde waarde als de standaarddeviatie. Trek de ruisgemiddelde waarde af van de signaalgemiddelde waarde en deel de resultaten door de standaarddeviatie van het lege gebied.
    11. Als de berekende SNR niet hoog genoeg is (typisch 800-1.000 voor SRS en > 10.000 voor CARS bij een PMT-spanning van 0,4 V met deze vermogenscombinatie), controleert en optimaliseert u de bundeloverlapping, bundelgroottes en vertragingsfasepositie, verfijnt u de AOM en wijzigt u de modulatiefrequentie van de functiegenerator totdat de verwachte SNR is verkregen.

2. Beeldanalyse en gegevensverwerking

  1. SNR analyse
    1. Open de ImageJ-software. Als u het opgeslagen DMSO-voorbeeld .txt bestand wilt importeren, klikt u op Bestand | | importeren | Open.
    2. Zodra de afbeelding is geïmporteerd, drukt u op CTRL+shift+C om de helderheids- en contrastfunctie (B&C) weer te geven. Om het maximale monstersignaal te vinden, drukt u op de automatische knop in de B&C totdat een gebied van het DMSO-monster verzadigd lijkt.
    3. Klik op het ovale selectiegereedschap op de ImageJ-interface en markeer een klein gebied van het verzadigde DMSO-gebied. Druk na het markeren op M om het gemiddelde en de standaarddeviatie van het geselecteerde gebied te meten.
    4. Pas voor het meten van de achtergrond de balken in de B&C-functie aan totdat het signaal van het lege gebied kan worden waargenomen. Klik op de ovale selectie en markeer een gebied van de achtergrond dat dezelfde grootte heeft als voor stap 2.1.3. Zorg ervoor dat de geselecteerde regio geen DMSO bevat. Druk op M om de statistieken van het geselecteerde gebied te meten.
    5. Bereken de SNR volgens stap 1.6.10.
  2. Hyperspectrale CRS-beelden verwerken
    1. Importeer het .txt bestand volgens stap 2.1.1. Eenmaal geïmporteerd, klikt u op Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Montage naar Stack... om het bestand te converteren naar een afbeeldingsstapel.
    2. Blader door de montage totdat de eerste DMSO-piek zichtbaar is. Selecteer een regio op de DMSO en klik op Afbeelding | | stapelen Plot Z-asprofiel om het spectrum intensiteit versus framenummer te plotten. Om de ruwe spectrale gegevens te extraheren, klikt u op de lijst en kopieert u de profielgegevens.
    3. Om het herstelde spectrum om te zetten in golfnummereenheden, voert u een lineaire regressie uit zoals beschreven in stap 1.5.5.
  3. Fitting voor het meten van spectrale resolutie
    OPMERKING: Lorentziaanse functies worden gebruikt om de SRS- en CARS-spectra28 te passen.
    1. Open de aanpassingssoftware en kopieer en plak de lineaire regressiegegevens in het programma. Voor het aanpassen van de SRS-gegevens markeert u de gegevens en plot u de gegevens vervolgens als een spreidingsdiagram.
    2. Trek de scatter plot omhoog. Klik op Analyse | Pieken en basislijn | Meerdere Peak Fit | Open Dialoogvenster om de piekanalysator weer te geven. Controleer bij het optrekken of de ingang de huidige plot is en wijzig de piekfunctie in Lorentzian (Lorentz).
    3. Dubbelklik op elk van de twee DMSO-pieken in de grafiek om de aan te passen regio's te markeren. Klik vervolgens op Open NLfit om het pasvenster te openen. Klik op de knop Passen tot geconvergeerd en vervolgens op OK om een samenvatting in tabelvorm van de aanpassingscoëfficiënten te zien (zie Eq (3)).
      OPMERKING: De onderstaande vergelijking toont het Lorentziaanse functieformaat in de software. Een1/2 zijn de amplitudes van de passende pieken, w1/2 zijn de breedtes van de gemonteerde pieken en de x01/02 waarden zijn de middelpunten van de gemonteerde pieken. De onafhankelijke variabele is x en de afhankelijke variabele is y.
      Equation 1 (3)
    4. Voor CARS spectrale aanpassing, klik op Analyse | Montage | Niet-lineaire curve past | Dialoogvenster openen. Selecteer categorie: nieuw om een nieuwe functie voor CARS te definiëren. Gebruik een autofittingsfunctie met twee pieken die hieronder is gedefinieerd (zie Eq (4)) voor spectrale cars-fittingen.
      Equation 1 (4)
  4. Bepalen van de ruimtelijke resolutie
    OPMERKING: Vóór deze stap is het belangrijk om de conversie te kennen tussen de pixelgrootte bij een specifieke vergroting, pixelnummer en de stapgrootte in μm. Dit kan worden uitgevoerd door een monster te gebruiken met een bekende diameter die groter is dan de verwachte beeldresolutie, het lijnprofiel te meten en een Gaussiaanse functie aan te passen om de volledige breedte bij de half maximale (FWHM) waarde te bepalen. Resolutiedoelen of uniforme monsters zoals polymere kralen kunnen worden gebruikt.
    1. Verkrijg een beeld van cellen of polymeerdeeltjes met een diameter van minder dan 200 nm.
    2. Gebruik ImageJ om een lijn te tekenen over het kleinste deeltje in de afbeelding.
    3. Druk op K om het intensiteitsprofiel uit te zetten.
    4. Klik op de lijst in het pop-upvenster en kopieer de informatie naar de geschikte software.
    5. Plot het profiel in de aanpassoftware en gebruik Gaussisch passen (klik op Analyse | Montage | Niet-lineaire curve past | Dialoogvenster openen | Categorie: Basisfuncties; Functie: Gauss).
    6. Lees de piekbreedte na het monteren. Gebruik de conversie van pixel naar grootte om de werkelijke resolutie van de microscoop te verkrijgen.

3. Voorbereiding van monsters voor hyperspectrale CRS-beeldvorming

  1. Voorbereiding van beelddia's en chemische monsters
    1. Plaats een stuk dubbelzijdige tape op een coverslip en knip een kleine rechthoekige vorm van de tape uit het midden van de geplaatste tape om een open gebied te creëren voor het monster dat moet worden geplaatst.
    2. Pipetteer 1-2 μL pure DMSO en doseer de druppel in het midden van de vacature.
    3. Plaats de bovenste coverslip voorzichtig en druk voorzichtig op de randen van de coverslips om de kamer af te dichten, terwijl u ervoor zorgt dat het DMSO-monster geen contact maakt met de randen van de tape.
    4. Bereid voor gevoeligheidsexperimenten seriële verdunningen van DMSO in deuteriumoxide (D2O) om een concentratiebereik van 50%-0% te geven. Neem 1-2 μL van elke oplossing en bereid geperste monsters zoals hierboven beschreven.
  2. Celvoorbereiding
    1. Zaai de cellen in een schaal met glazen bodem van 35 mm (of groter) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine.
    2. Incubeer de cellen in een incubatiekamer bij 37 °C met een CO2-atmosfeer van 5% 's nachts of langer totdat ~50%-80% confluency is bereikt.
    3. Beeld de levende cellen direct af of fixeer de cellen met een 10% formaline-oplossing voor beeldvorming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vergelijkingen van de spectrale resolutie
Figuur 2 vergelijkt de spectrale resolutie van hyperspectrale SRS (figuur 2A) en CARS (figuur 2B) microscopie met behulp van een DMSO-monster. Voor het SRS-spectrum werden twee Lorentziaanse functies (zie protocol stap 2.3) toegepast om in het spectrum te passen, en een resolutie van 14,6 cm-1 werd verkregen met behulp van de 2.913 cm-1 piek. Voor CARS werd een tweepiek-fittingfunctie met een Gaussische achtergrond (zie protocol stap 2.3) gebruikt voor de montage, die de spectrale resolutie van 17,1 cm-1 gaf. Deze resultaten tonen aan dat SRS in dezelfde meetconditie een betere spectrale resolutie heeft dan CARS. De verminderde spectrale resolutie in CARS wordt voornamelijk bijgedragen door de betrokkenheid van de niet-resonante achtergrond. Bovendien bleek dat de symmetrische (2.913 cm-1) en asymmetrische (2.995 cm-1) piekverhoudingen heel verschillend waren voor SRS en CARS. Dit komt door de verschillende signaalcorrelaties met de derde-orde niet-lineaire optische gevoeligheid, zoals beschreven in vergelijkingen (1) en (2). Met de kwadratische afhankelijkheid van CARS wordt het intensiteitsverschil tussen de twee pieken versterkt. De symmetrische lijnvormen van de SRS-pieken en de asymmetrische lijnvormen van de CARS-pieken kunnen in het spectrum worden waargenomen. De asymmetrie in het CARS-signaal is voornamelijk te wijten aan de aanwezigheid van de niet-resonante achtergrondinterferentie. De CARS spectrale pieken lijken licht rood verschoven (1-2 cm-1) naar de SRS-pieken. Dit komt ook voort uit de niet-resonante achtergrondinterferentie met resonante pieken.

Vergelijkingen van de detectiegevoeligheid
Figuur 3 vergelijkt de detectiegevoeligheid van hyperspectrale SRS en CARS-microscopie. De SNR van de DMSO SRS-signalen (2.913 cm-1) als functie van de DMSO-concentratie in D2O bij hoge concentraties worden eerst uitgezet (1%-50%, figuur 3A). De resultaten tonen een lineaire relatie, bevredigende vergelijking (2). Figuur 3B toont de DMSO-spectra bij concentraties van 0,1% en 0,01%, waarbij de piek van 2.913 cm-1 kan worden opgelost in de eerste maar niet in de laatste, wat aangeeft dat de detectiegrens tussen 0,1% en 0,01% DMSO ligt. Met behulp van de limiet van lege criteria schatten we dat de SRS-detectielimiet 0,021% DMSO is. Figuur 3C toont de CARS SNR als de functie van dmso-concentratie (1%-50%), met een kwadratische afhankelijkheid in overeenstemming met vergelijking (1). De fase-opgehaalde CARS-spectra zijn weergegeven in figuur 3D voor de DMSO van 0,1% en 0,01%. Om deze spectra te bereiken, werd een spectrale fase-retrieval methode op basis van Kramers-Kronig relaties gebruikt en aanvullende achtergrondverwijdering uitgevoerd16. Net als bij de SRS-spectra kan de DMSO-piek van 2.913 cm-1 duidelijk worden opgelost voor de DMSO van 0,1% maar niet voor de 0,01%, wat wijst op een detectiegrens tussen deze twee concentraties. Met behulp van de limiet van blanco criteria schatten we dat de SRS-detectielimiet 0,015% DMSO is. De 0,02% DMSO komt overeen met 2,8 mM. Daarom is de detectielimiet van de hyperspectrale CRS-microscoop die hier wordt gebruikt ~ 2,1-2,8 mM DMSO.

Vergelijkingen van de ruimtelijke resolutie
Figuur 4 vergelijkt de resolutie van een klein cellulair kenmerk dat wordt gedetecteerd in SRS-beelden (figuur 4A) en CARS (figuur 4B). De intensiteitsprofielen van dezelfde lijn worden weergegeven en passen met behulp van een Gaussiaanse functie om FWHM-waarden te bepalen voor resolutievergelijking. Het SRS-signaal gaf een resolutie van 398,6 nm (figuur 4C), terwijl het CARS-signaal een resolutie van 330,3 nm gaf (figuur 4D). De resolutie van CARS was ~1,2x beter dan die van de SRS. De reden voor het resolutieverschil ligt ook in vergelijkingen (1) en (2). Zowel pomp- als Stokes-balken hebben een Gaussische puntspreidingsfunctie bij de focus. Het signaal van CARS is dan evenredig met de vermenigvuldiging van drie Gaussische functies, waardoor de breedte ruwweg met een factor √3 wordt verminderd. Evenzo wordt voor SRS de breedte verminderd met een factor √2. Daarom was de resolutie van CARS √3/√2 = 1,2 keer beter dan die van de SRS.

Vergelijkingen van de afbeeldingen van cellen
Figuur 5 vergelijkt SRS- en CARS-beelden van MIA PaCa-2-cellen op verschillende optische vertragingsposities. Figuur 5A toont de SRS-beelden bij de optische vertraging die het sterkste signaal gaf. In deze afbeelding kunnen lipidedruppels (LD's), endoplasmatisch reticulum (ER) en nucleus (NU) worden gedetecteerd, waarbij LD's de sterkste signalen hebben die als heldere stippen worden weergegeven. Figuur 5B toont het CARS-kanaalbeeld met dezelfde optische vertraging, met sterk gereduceerde contrasten voor LD's. De belangrijkste redenen voor dit contrastverschil zijn de aanwezigheid van de niet-resonante achtergrond en de roodverschuiving van dezelfde Raman-piek in CARS-spectra. Bij deze optische vertraging heeft het gegenereerde signaal een grote bijdrage van de niet-resonante achtergrond van water. Om het lipidencontrast in CARS te verbeteren, werd de optische vertraging afgestemd op een rood verschoven waarde. De red-shift verbeterde de lipidencontrasten door meer energie te concentreren op de 2.850 cm-1 voor zowel SRS (figuur 5C) als CARS (figuur 5D), hoewel het algehele signaalniveau werd verlaagd. Voor CARS werd een vergelijkbaar contrast van LD's als SRS bereikt door een roodverschuiving van ~ 98 cm-1 in spectrale scherpstelling (figuur 5D), hoewel er nog steeds een achtergrond hoger was dan die in de SRS-afbeelding. Bij deze optische vertraging toont het SRS-beeld veel minder eiwit- en nucleïnezuurgehaltes, maar sterke lipidegehaltes in LD's, ER en celmembranen (figuur 5C).

CARS is een parametrisch proces, terwijl SRS nietparametrisch is. Een dergelijk verschil draagt ook bij aan contrastverschillen in de twee modaliteiten. De parametrische CARS-signalen worden bepaald door de interferentie van CARS-signalen van verschillende lagen dicht bij de laserfocus, die negatieve contrasten kunnen vertonen zoals aangegeven door pijlen in figuur 5B en figuur 5D (ook in figuur 4B). Dergelijke signaalinterferentie-geïnduceerde negatieve contrasten zijn afwezig in de SRS-beelden. Het negatieve contrast in CARS kan informatie geven over de axiale positie van het doel van belang.

De SRS-signalen hebben een lineaire relatie met de moleculaire concentratie, terwijl de CARS-signalen voldoen aan een bijna kwadratische concentratieafhankelijkheid. Daarom vertonen de CH2-rijke LD's een veel sterker signaal dan de ER en de celmembranen in het CARS-beeld dan in de SRS-afbeelding (figuur 5E, F). De SRS-spectra kunnen worden geëxtraheerd uit hyperspectrale beelden. Figuur 5G toont de typische SRS-spectra van LDs, ER, cytosol (CY) en NU. Zowel de intensiteit als de spectrale vorm zijn verschillend voor verschillende cellulaire compartimenten. LD vertoont een veel sterker signaal bij 2.850 cm-1 dan andere organellen. Wat CARS betreft, kunnen vergelijkbare spectra, hoewel verschillend in vormen, worden verkregen. De ruwe CARS-spectra vertonen een kleine roodverschuiving ten opzichte van de overeenkomstige SRS-spectra. Spectrale fase-retrieval kan verder worden gebruikt om de Raman-reacties te extraheren met behulp van de CARS-spectra.

Figure 1
Figuur 1: Een schema van de hyperspectrale CARS/SRS microscoop. Afkortingen: CARS = coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS = gestimuleerde Raman-verstrooiing; PBS = polarisatiebundelsplitter; PD = fotodiode; PMT = fotomultiplicatorbuis; AOM = acousto-optische modulator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: DMSO-spectra. (A) SRS- en (B) CARS-spectra van DMSO. Stippen zijn experimentele gegevens; curven zijn spectrale aanpassingsresultaten. Afkortingen: CARS = coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS = gestimuleerde Raman-verstrooiing; DMSO = dimethylsulfoxide; w = spectrale resolutie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Signaal-ruisverhoudingen en spectra van DMSO. (A) Signaal-ruisverhouding van de DMSO-symmetrische piek bij 2.913 cm-1 als functie van de concentratie in D2O gemeten met SRS. De stippen zijn experimentele gegevens; de lijn is het lineaire pasresultaat. (B) De SRS-spectra van 0,1% en 0,01% DMSO in D2O. (C) Signaal-ruisverhouding van de DMSO-symmetrische piek bij 2.913 cm-1 als functie van de concentratie in D2O gemeten door CARS. De stippen zijn experimentele gegevens; de curve is het tweedegraads polynomiale aanpassingsresultaat. (D) De CARS-spectra van 0,1% en 0,01% DMSO in D2O. Afkortingen: CARS = coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing; SRS = gestimuleerde Raman-verstrooiing; DMSO = dimethylsulfoxide; SNR = signaal-ruisverhouding; D2O = deuteriumoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: SRS- en CARS-afbeeldingen en intensiteitsprofielen van een MIA PaCa-2-cel. (A) Een SRS-afbeelding van een MIA PaCa-2-cel. (B) Een CARS-afbeelding van een MIA PaCa-2-cel in hetzelfde gezichtsveld als paneel A. (C) Intensiteitsprofiel van SRS langs de gele lijn in paneel A. (D) Intensiteitsprofiel van CARS langs de gele lijn in paneel B. Stippen zijn experimentele gegevens; curven zijn Gaussiaanse functie-aanpassingsresultaten. Schaalstaven = 5 μm. Afkortingen: CARS = coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS = gestimuleerde Raman-verstrooiing; w = resolutie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Afbeeldingen en intensiteitsprofiel van MIA PaCa-2-cellen. (A) Een SRS-beeld van MIA PaCa-2-cellen met de geoptimaliseerde tijdsvertraging voor SRS-intensiteit. (B) Een CARS-afbeelding met dezelfde vertraging als in paneel A. (C) Een SRS-afbeelding bij de rood verschoven vertragingen van 98 cm-1 zoals in paneel A. (D) Een CARS-afbeelding met dezelfde optische vertraging als in paneel C. (E,F) De SRS- en CARS-intensiteitsprofielen uitgezet langs de stippellijnen in de panelen A en D. (G) Typische SRS-spectra van de lipidedruppels, endoplasmatisch reticulum, cytosol en kern. (H) Typische CARS-spectra van de vier cellulaire samenstellingen. De groene en rode stippellijnen zijn vertragingsposities voor respectievelijk de panelen A/B en C/D. Schaalstaven = 10 μm. Afkortingen: CARS = coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS = gestimuleerde Raman-verstrooiing; LD = lipidedruppels; ER = endoplasmatisch reticulum; CY = cytosol; NU = kern. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand: Lab-geschreven software op basis van LabVIEW met een gelijktijdige meerkanaals weergave voor real-time bekijken en opslaan van afbeeldingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de constructie van een multimodale CRS-microscoop en de directe vergelijking tussen CARS- en SRS-beeldvorming. Voor de microscoopconstructie zijn de kritieke stappen ruimtelijke en temporele bundeloverlapping en optimalisatie van de bundelgrootte. Het wordt aanbevolen om een standaardmonster zoals DMSO te gebruiken vóór de biologische beeldvorming voor het optimaliseren van SNR en het kalibreren van Raman-verschuivingen. Directe vergelijking tussen CARS- en SRS-beelden laat zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, terwijl SRS een betere spectrale resolutie en minder ingewikkelde chemische contrasten geeft. Zowel CARS als SRS hebben vergelijkbare detectielimieten.

CARS- en SRS-beeldvorming gebruiken hoogenergetische pulslasers voor excitatie. Hierdoor kan het platform andere niet-lineaire optische beeldvormingsmodaliteiten integreren, zoals multifotonen excitatiefluorescentie, harmonische generatie en voorbijgaande absorptie voor extra chemische contrasten28,39.

CARS en SRS zijn op grote schaal gebruikt om de lipidensamenstelling met een hoge chemische selectiviteit te bestuderen. De technologieën zijn echter niet beperkt tot het kwantificeren van lipiden. SRS is toegepast om medicijndistributie42, eiwitsynthese43 en DNA44 in kaart te brengen. CARS en SRS zijn ook toegepast op beeld farmaceutische ingrediënten en hulpstoffen in tabletten 45,46,47,48. Hyperspectrale CARS en SRS hebben toepassingen gevonden in kankerdiagnose49, evaluatie van hart- en vaatziekten50 en neurale beeldvorming51. Ze kunnen ook worden toegepast voor COVID-19-studies52. Breedband CARS, die spectrale vensters zo breed als 3.000 cm-1 kunnen bedekken, kunnen rijke chemische structuren in biologische monsters ophelderen53. Vanwege de trage uitleessnelheid van de CCD is de pixelverblijftijd echter op het niveau van milliseconden, veel langzamer dan de microseconde pixelverblijftijd voor SRS-microscopie34. Hyperspectrale SRS-microscopie heeft momenteel een typische bandbreedte van 200-300 cm-1, beperkt door de laserbandbreedte en het ontbreken van lock-in-geïntegreerde arraydetectoren34. Fouriertransformatie SRS-microscopie is een alternatieve manier om de spectrale SRS-dekking mogelijk te verbreden35.

Hoewel CARS en SRS rijke chemische informatie bieden zonder de noodzaak van etikettering, ligt de chemische selectiviteit in chemische bindingen, waardoor het moeilijk is om specifieke eiwitten te onderscheiden. Raman-tags hebben het potentieel aangetoond om de chemische selectiviteit van CARS en SRS54,55 te verbeteren. Coherente Raman-beeldvorming heeft echter nog steeds een veel lagere gevoeligheid in vergelijking met fluorescentiedetectie. Oppervlakteverbetering werd gebruikt voor spontane Raman-verstrooiingsspectroscopie om de signaalniveaus56 te verbeteren. Het werd ook toegepast op CARS en SRS voor signaalversterking 57,58,59. Hoewel de versterkingsfactor niet zo hoog is als spontane Raman-verstrooiing, tonen oppervlakte-verbeterde CARS en SRS-microscopie nog steeds het potentieel om afzonderlijke moleculen te detecteren59,60. Toch ontneemt het gebruik van metaaldeeltjes of oppervlakken het voordeel van de labelvrije aanpak. Het verbeteren van de gevoeligheid van coherente Raman-microscopie zonder metalen oppervlakken te gebruiken, zou de toepassing van de technologie in de biologische wetenschap aanzienlijk uitbreiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door het start-upfonds van de Purdue University Department of Chemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25x36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619 (1928).
  2. Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515 (2020).
  3. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 883-909 (2008).
  4. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 507-530 (2011).
  5. Suhalim, J. L., Boik, J. C., Tromberg, B. J., Potma, E. O. The need for speed. Journal of Biophotonics. 5 (5-6), 387-395 (2012).
  6. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Optics Letters. 7 (8), 350-352 (1982).
  7. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  8. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  9. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: instrumentation, theory, and applications. The Journal of Physical Chemistry B. 108 (3), 827-840 (2004).
  10. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807 (2005).
  11. Cheng, J. -X., Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. An epi-detected coherent anti-Stokes Raman scattering (E-CARS) microscope with high spectral resolution and high sensitivity. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (7), 1277-1280 (2001).
  12. Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. Time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Imaging based on Raman free induction decay. Applied Physics Letters. 80 (9), 1505-1507 (2002).
  13. Marks, D. L., Boppart, S. A. Nonlinear interferometric vibrational imaging. Physical Review Letters. 92 (12), 123905 (2004).
  14. Ganikhanov, F., Evans, C. L., Saar, B. G., Xie, X. S. High-sensitivity vibrational imaging with frequency modulation coherent anti-Stokes Raman scattering (FM CARS) microscopy. Optics Letters. 31 (12), 1872-1874 (2006).
  15. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241-243 (2006).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  17. Masia, F., Karuna, A., Borri, P., Langbein, W. Hyperspectral image analysis for CARS, SRS, and Raman data. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (8), 727-734 (2015).
  18. Knutsen, K. P., Johnson, J. C., Miller, A. E., Petersen, P. B., Saykally, R. J. High spectral resolution multiplex CARS spectroscopy using chirped pulses. Chemical Physics Letters. 387 (4-6), 436-441 (2004).
  19. Okuno, M., Kano, H., Leproux, P., Couderc, V., Hamaguchi, H. -o Ultrabroadband multiplex CARS microspectroscopy and imaging using a subnanosecond supercontinuum light source in the deep near infrared. Optics Letters. 33 (9), 923-925 (2008).
  20. Masia, F., Glen, A., Stephens, P., Borri, P., Langbein, W. Quantitative chemical imaging and unsupervised analysis using hyperspectral coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 85 (22), 10820-10828 (2013).
  21. Pegoraro, A. F., Slepkov, A. D., Ridsdale, A., Moffatt, D. J., Stolow, A. Hyperspectral multimodal CARS microscopy in the fingerprint region. Journal of Biophotonics. 7 (1-2), 49-58 (2014).
  22. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  23. Ploetz, E., Laimgruber, S., Berner, S., Zinth, W., Gilch, P. Femtosecond stimulated Raman microscopy. Applied Physics B. 87 (3), 389-393 (2007).
  24. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  25. Nandakumar, P., Kovalev, A., Volkmer, A. Vibrational imaging based on stimulated Raman scattering microscopy. New Journal of Physics. 11 (3), 033026 (2009).
  26. Slipchenko, M. N., Le, T. T., Chen, H., Cheng, J. -X. High-speed vibrational imaging and spectral analysis of lipid bodies by compound Raman microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (21), 7681-7686 (2009).
  27. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  28. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 415-445 (2015).
  29. Prince, R. C., Frontiera, R. R., Potma, E. O. Stimulated Raman scattering: from bulk to nano. Chemical Reviews. 117 (7), 5070-5094 (2017).
  30. Lu, F. -K., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Physics. 110 (15-16), 1927-1932 (2012).
  31. Ozeki, Y., et al. High-speed molecular spectral imaging of tissue with stimulated Raman scattering. Nature Photonics. 6 (12), 845-851 (2012).
  32. Wang, P., et al. Label-free quantitative imaging of cholesterol in intact tissues by hyperspectral stimulated raman scattering microscopy. Angewandte Chemie International Edition. 125 (49), 13280-13284 (2013).
  33. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  34. Liao, C. -S., et al. Microsecond scale vibrational spectroscopic imaging by multiplex stimulated Raman scattering microscopy. Light: Science & Applications. 4 (3), 265 (2015).
  35. Liao, C. -S., et al. Spectrometer-free vibrational imaging by retrieving stimulated Raman signal from highly scattered photons. Science Advances. 1 (9), 1500738 (2015).
  36. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  37. Andresen, E. R., Berto, P., Rigneault, H. Stimulated Raman scattering microscopy by spectral focusing and fiber-generated soliton as Stokes pulse. Optics Letters. 36 (13), 2387-2389 (2011).
  38. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  39. Zhang, C., Aldana-Mendoza, J. A. Coherent Raman scattering microscopy for chemical imaging of biological systems. Journal of Physics: Photonics. , (2021).
  40. Martens, W. N., Frost, R. L., Kristof, J., Theo Kloprogge, J. Raman spectroscopy of dimethyl sulphoxide and deuterated dimethyl sulphoxide at 298 and 77 k. Journal of Raman Spectroscopy. 33 (2), 84-91 (2002).
  41. Gill, G. W. Cytopreparation: Principles & Practice. Gill, G. W. , Springer. New York. 309-323 (2013).
  42. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  43. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  44. Lu, F. -K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Slipchenko, M. N., et al. Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy. Analyst. 135 (10), 2613-2619 (2010).
  46. Slipchenko, M. N., Zhou, B., Pinal, R., Teresa Carvajal, M., Cheng, J. -X. RAMAN-chemical imaging of solid dosage forms based on stimulated Raman scattering. American Pharmaceutical Review. 15 (3), 66 (2012).
  47. Sarri, B., et al. Discriminating polymorph distributions in pharmaceutical tablets using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 50 (12), 1896-1904 (2019).
  48. Fussell, A. L., Kleinebudde, P., Herek, J., Strachan, C. J., Offerhaus, H. L. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy visualizes pharmaceutical tablets during dissolution. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (89), e51847 (2014).
  49. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging). Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  50. Lim, R. S., et al. Multimodal CARS microscopy determination of the impact of diet on macrophage infiltration and lipid accumulation on plaque formation in ApoE-deficient mice [S]. Journal of Lipid Research. 51 (7), 1729-1737 (2010).
  51. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  52. Tabish, T. A., Narayan, R. J., Edirisinghe, M. Rapid and label-free detection of COVID-19 using coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Mrs Communications. 10 (4), 566-572 (2020).
  53. Camp, C. H., et al. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nature Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  54. Wei, L., et al. Live-cell bioorthogonal chemical imaging: stimulated Raman scattering microscopy of vibrational probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
  55. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  56. Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
  57. Steuwe, C., Kaminski, C. F., Baumberg, J. J., Mahajan, S. Surface enhanced coherent anti-Stokes Raman scattering on nanostructured gold surfaces. Nano Letters. 11 (12), 5339-5343 (2011).
  58. Fast, A., Kenison, J. P., Syme, C. D., Potma, E. O. Surface-enhanced coherent anti-Stokes Raman imaging of lipids. Applied Optics. 55 (22), 5994-6000 (2016).
  59. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  60. Yampolsky, S., et al. Seeing a single molecule vibrate through time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering. Nature Photonics. 8 (8), 650-656 (2014).

Tags

Chemie Nummer 182
Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clark, M. G., Brasseale III, K. A.,… More

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter