Summary
CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 뇌 제거를 결합하면 많은 수의 뉴런과 성상세포를 동시에 조사할 수 있습니다.
Abstract
CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 조직 제거를 결합하면 여러 유형의 뇌 세포와 그 상호 작용을 동시에 조사 할 수 있습니다. 바이러스 벡터 형질도입은 동일한 조직 내에서 상이한 형광 색상으로 다양한 세포 유형의 마킹을 가능하게 한다. 세포는 활성 또는 돌출에 의해 유전적으로 확인될 수 있다. 변형된 CLARITY 프로토콜을 사용하여, 성상세포 및 뉴런의 잠재적 표본 크기는 2-3배 정도 성장하였다. CLARITY의 사용은 조각에 전체적으로 들어가기에는 너무 큰 완전한 성상 세포의 이미징과 모든 과정으로 소마타를 검사 할 수있게합니다. 또한, 성상세포와 상이한 뉴런 세포 유형 사이의 공간적 상호작용, 즉 각 성상세포 도메인에서 피라미드형 뉴런의 수 또는 성상세포와 특정 억제 뉴런 집단 사이의 근접성을 조사할 수 있는 기회를 제공한다. 이 백서에서는 이러한 방법을 어떻게 적용해야 하는지 자세히 설명합니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 성상 세포 기능에 대한 지식과 그들이 신경 회로와 상호 작용하는 방법이 극적으로 증가했습니다. 성상세포는 가소성1,2에 영향을 미치고, 신경 손상 후 회복을 돕고, 3,4를 돕고, 심지어 드노보 뉴런 강화를 유도할 수 있으며, 최근 연구들은 기억 획득 및 보상에서 성상세포의 중요성을 보여주었으며, 이전에는 순전히 신경 기능으로 간주되었다 5,6,7 . 성상세포 연구에 특히 관심을 갖는 특징은 해마 및 기타 뇌 구조8,9,10에서 독특한 공간 조직을 유지하는 세포의 공간 배열입니다. 세포 소마타 사이에 얽혀있는 뉴런 수상 돌기와는 달리, 해마 성상 세포는 시각적으로 구별 가능한 영역에 서식하며 과정 사이에 약간의 겹침이 생겨 별개의 도메인 8,11,12,13을 만듭니다. 뉴런 회로에서 성상세포의 참여를 뒷받침하는 증거는 그러한 집단 및 뉴런의 도메인14에 대한 상세한 해부학적 설명의 부족을 지지하지 않는다.
바이러스 벡터 형질도입 절차는 형질전환 동물(TG)과 함께 뇌 구조, 기능 및 세포 상호작용을 조사하기 위한 도구 세트로서 대중화되었다(15,16). 상이한 프로모터의 이용은 그들의 유전적 특성, 활성화 수준17,18, 또는 프로젝션 표적에 따라 특정 세포의 표적화를 허용한다. 다른 바이러스는 다른 집단에서 다른 색깔의 형광단을 발현할 수 있다. 바이러스는 TG에서 형광단의 내인성 발현과 조합될 수 있거나, 또는 TG 동물은 바이러스를 필요로 하지 않고 사용될 수 있다. 이러한 기술은 뉴런 마킹에 널리 사용되며, 일부 실험실에서는 성상 세포 5,9,19와 같은 다른 세포 유형을 타겟팅하는 데 특화된 변형과 함께 사용하기 시작했습니다.
2013 20,21에서 처음 설명 된 CLARITY 기술은 미세한 구조를 그대로 유지하면서 전체 뇌를 투명하게 만들어 두꺼운 뇌 조각을 연구 할 수있게합니다. 바이러스 벡터 형질도입과 조직 제거라는 두 가지 방법을 조합함으로써 서로 다른 세포 유형 집단 간의 공간적 상호작용을 조사하는 옵션이 이제 이용가능하다. 대부분의 성상세포-뉴런 상호작용 연구는 얇은 뇌 조각에 대해 수행되었으며, 그 결과 큰 도메인으로 인해 불완전한 성상세포의 이미지가 생성되어 분석된 세포의 수가 근본적으로 제한되었다. CLARITY 기술을 사용하면 대규모 부피의 세포 집단의 단일 세포 분해능 특성화를 동시에 수행할 수 있습니다. 맑은 뇌에서 형광으로 태그가 붙은 세포 집단을 이미징하는 것은 시냅스 분해능을 전달하지 않지만 성상세포와 다양한 신경 세포 유형 사이의 공간적 상호 작용을 철저히 특성화할 수 있습니다.
이러한 이유로 우리는 이러한 최첨단 기술을 활용하여 등쪽 CA1 전체에 걸친 성상 세포의 특성을 조사하고 모든 라미나 (Stratum Radiatum, pyramidal layer 및 Stratum Oriens)를 이미징했습니다. 우리는 수만 개의 성상 세포 (바이러스 침투율 >96 % 5)를 측정하여 CA1 주변의 전체 성상 세포 집단의 정보를 분석했습니다. 뉴런 마커의 효율적인 침투를 통해, 우리는 CA1 성상세포의 전체 집단과 네 가지 유형의 뉴런 세포 - 파브알부민 (PV), 소마토스타틴 (SST), VIP 억제 뉴런 및 흥분성 피라미드 세포9 사이의 상호 작용을 기록 할 수있었습니다.
몇몇 실험은 TG 동물로부터의 형광과 상이한 착색된 바이러스 벡터 (모든 억제 세포)의 조합을 사용하여 수행되었고, 다른 것들 (흥분성)은 상이한 프로모터9 하에서 상이한 형광단을 발현하는 두 개의 바이러스 벡터를 이용하였다. 이 논문은 뇌에서 원하는 세포의 태깅, 수정 된 CLARITY 절차를 사용하여 뇌를 투명하게 만드는 것, 다양한 절차와 소프트웨어를 사용하여 완전한 뇌 구조를 이미징 및 분석하는 등 상세한 프로토콜을 제시합니다.
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Protocol
실험 프로토콜은 히브리 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건 연구소 가이드의 지침을 충족했습니다.
1. 바이러스 벡터 형질도입
참고: 바이러스 벡터 형질도입은 뇌에서 형광단을 발현하는 데 사용됩니다.
- 아틀라스 (예 : Allen Brain Atlas)를 사용하여 대상 영역의 관련 조정을 찾으십시오.
참고: 3D 아틀라스는 온라인에서 찾을 수 있습니다(예: http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - 입체 수술을 사용하여 바이러스 벡터를 관련 뇌 구조에 주입하십시오. 자세한 프로토콜은 9 를 참조하십시오.
- 형광단 발현을 위해 3-6 주 동안 기다리십시오.
참고 : 세포체 만 표시해야하는 경우 짧은 시간이면 충분합니다. 축삭 투영이 문제와 관련이 있다면 형광단이 축삭으로 표현되는 데 더 오래 걸리기 때문에 오랜 시간이 필요할 것입니다.이 길이는 수 밀리미터 일 수 있습니다. - 형광단 발현(바이러스 발현 및 TG 동물 둘 다)의 특이성 및 침투성을 미리 검증한다(도 1A). CLARITY 절차를 진행하기 전에 적어도 하나의 뇌를 얇은 조각으로 지정하고 형광단 발현이 표적 세포 기능에 강하고 특이적인지 확인하십시오.
2. 명확성
참고 :이 방법은 2-6 주 이내에 뇌를 투명하게 만듭니다.
- 차가운 인산완충식염수(PBS)를 사용하여 동물에 대해 경두개 관류를 수행하고, PBS 중의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용한다. 뇌를 제거하고 50 mL 튜브 또는 유사한 용기에서 4°C에서 하룻밤 동안 PFA에 보관한다.
참고 : 경두개 관류가 수행되기 전에 동물은 깊이 마취되어야합니다. 이 프로토콜에 제시된 실시예에서, 모든 동물은 케타민 및 자일라진(각각 90% 및 10%)을 사용하여 마취되었다. - PFA를 4°C에서 48시간 동안 하이드로겔 용액(HS; 표 1 참조)으로 교체한다.
참고: 이 단계에서 재료가 냉동 온도 (4-8 °C)보다 따뜻해지지 않도록하십시오. 이 프로토콜에 사용 된 HS는 4 % 22 또는 1 % 17을 제안하는 이전 프로토콜과 달리 2 % 아크릴 아미드를 포함합니다. 2 %의 이점은 토론 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. HS를 준비 할 때 얼음처럼 차가운 표면에서 작업하십시오. -20 °C에서 보관하십시오. - 탈기
참고: 이 단계의 목적은O2가 중합 과정을 방해하므로 조직으로부터 모든 자유 산소를 제거하는 것입니다. 임의의 nonO2 가스(예를 들어, N2,CO2)가 사용될 수 있고; N2를 사용하는 것이 좋습니다.- 탱크에서N2 를 5mm(내부) 유연한 튜브를 통해 전달하고, 끝에 있는 19G 바늘에 연결합니다(그림 1B).
- 튜브의 뚜껑에 두 개의 작은 구멍(바늘 넓이)을 만듭니다: 하나는 가스를 도입하고 다른 하나는 공기가 튜브를 떠날 수 있도록 합니다(그림 1C).
- N2 가스의 파이프를 튜브에 부착하고 상온(RT)에서 약 30분 동안 가스를 교체합니다.
- 파이프를 제거하고 모든 튜브에 모델링 점토로 구멍을 즉시 밀봉합니다(그림 1D).
- 탈기된 밀봉된 튜브를 3.5 h 동안 37°C 배쓰로 이송하여 HS를 중합하고, 이는 겔이 될 것이다. 튜브가 흔들리지 않도록 주의하십시오(그림 1E).
- 튜브에서 뇌를 추출하고 실험실 물티슈를 사용하여 중합 된 젤을 주변에서 부드럽게 제거하십시오. 다음 단계에서 용액과 반응할 수 있으므로 조직 표면에 잔류 겔이 부착되어 있지 않은지 확인하여 조직 제거 과정을 억제합니다(그림 1F).
참고 : 젤에는 PFA가 포함되어 있기 때문에 추출은 흄 후드 아래에서 수행되어야합니다. - 당면한 질문에 그것의 일부만 필요한 경우 뇌를 슬라이스하십시오. 반으로 나누거나 관심 있는 모든 영역을 포함하는 매우 두꺼운 조각으로 나눕니다(그림 1G).
- 슬라이스를 새로운 용기에 제1 클리어링 용액 (CS1, 표 2 참조)에 넣고 37°C에서 24시간 동안 70 rpm에서 진탕한다.
- 아래 설명 된 단계에 따라 CS1에서 두 번째 클리어링 솔루션 (CS2, 표 2 참조)으로 뇌를 옮깁니다.
- 뇌용 천공 튜브를 미리 준비합니다(그림 1H).
- CS2를 튜브를 담을만큼 충분히 큰 비이커에서 40-45 °C로 예열하십시오. 교반기가있는 핫 플레이트에서이 작업을 수행하십시오. 발현된 단백질의 표백을 방지하기 위해 온도가 55°C에 도달하지 않도록 보장한다.
- CS2로 채워진 비이커 및 천공된 튜브를 교반 장치 상에 놓는다( 도 1I의 2 L 비이커). 조직을 왜곡하지 않고 액체가 흐르게하는 적당한 교반 속도를 설정하십시오.
참고 : 2-6 주 이내에 조직이 투명해질 것입니다 (과정은 주변에서 시작하여 중앙 뇌 구조를 향해 안쪽으로 움직입니다). 조직이 "충분히 명확한"시기에 대한 결정은 개인적인 판단에 달려 있습니다. 뇌는 간섭없이 현미경으로 이미징하기에 충분히 투명해야합니다 (그림 1J는 충분히 명확하지 않습니다. 그림 1K는 충분히 명확합니다). 조직이 충분히 맑은 지점을 능가하면 조직 강성이 손실 될 수 있습니다.
- CS2로부터 PBST (PBS 중 0.5% 트리톤 X-100, 표 2 참조)로 새로운 용기에서 37°C에서 24시간 동안 가볍게 진탕(70 rpm)하면서 전사하였다.
참고: PBST에서는 조직이 희끄무레하게 됩니다(그림 1L). 굴절률 정합 용액에 내장될 때 선명도는 복귀(및 개선)됩니다(RIMS, 단계 2.14 참조). - PBST를 새 PBST로 바꿉니다. 동일한 조건(경미한 흔들림으로 37°C)에서 24시간 동안 유지하십시오.
- PBST를 새 PBST로 다시 교체하고 24시간 동안 RT를 유지하십시오.
- 24 시간 동안 RT에서 PBS로 전송하십시오.
- PBS를 교체하고 추가 24시간 동안 RT에 둡니다.
- PBS로부터 뇌를 제거하고 하룻밤 사이에 37°C에서 RIMS로 옮긴다.
참고 : 처음에는 RIMS의 파문이 뇌를 둘러싸고 있습니다. 이 프로토콜은 두 개의 특정 상용 RIMS를 사용하여 설계되고 검증되었습니다 ( 표 3 참조). 그러나 다른 RIMS (상업용 또는 자체 제작)를 사용할 때 프로토콜이 다르지 않아야합니다. - 조직을 또 다른 24시간 동안 또는 용액이 완전한 평형에 도달할 때까지, 즉 조직이 투명해지고 용액에 더 이상 가시적인 리플이 없을 때까지 RT에 보관하십시오(그림 1M).
- 조직이 투명하면 챔버 준비를 진행하십시오. 이 시점에서, 조직이 투명해지는 대신에 (잔류 SDS 분자의 응집체로 인해) 백색이 되면, 단계 2.9 및 2.10을 반복함으로써 샘플을 다시 세척하고, 조직을 며칠 동안 CS2로 옮기고(단계 2.8), 이어서 단계 2.15까지의 모든 단계를 수행하였다.
3. 챔버 준비
참고: 각 샘플에는 샘플이 배치될 이미징 챔버가 있는 슬라이드가 필요합니다.
- 샘플을 슬라이드 중간에 놓습니다.
- 뜨거운 접착제 총을 사용하여 슬라이드의 가장자리에 조직만큼 높은 벽을 만듭니다. 모서리 중 하나에 작은 간격(약 5mm)을 남겨 두어야 합니다(그림 2A,B).
- 시료에 RIMS를 1-2방울 떨어뜨려 윗면을 촉촉하게 유지하고 커버슬립과 조직 사이에 기포가 형성되지 않도록 합니다.
- RIMS 방울을 적용한 직후 뜨거운 접착제의 마지막 층을 벽에 추가하고 (뇌 / 슬라이스의 높이에 도달하도록) 즉시 (뜨거운 접착제가 여전히 액체인 동안) 3.5 단계로 진행하십시오.
- 덮개 슬립으로 상단을 밀봉하고 여전히 따뜻한 뜨거운 접착제 층 상단에 가능한 한 고르게 놓습니다(그림 2C).
- 뜨거운 접착제 벽에 남아 있는 틈새를 통해 RIMS로 챔버를 채웁니다(그림 2D,E).
- 뜨거운 접착제로 틈을 닫으십시오. 내부에 공기를 넣지 마십시오(그림 2F).
- 핫 접착제 벽이 슬라이드의 테두리 너머로 확장되면 연장 모서리를 자릅니다(그림 2G).
- 이미징에 사용된 물체가 잠겨 있는 경우 커버슬립 위의 벽에 2-3mm의 접착제를 더 추가하여 침지 용액이 더 오랜 기간 동안 지속되도록 합니다(그림 2H).
4. 이미징 (공초점 또는 이광자)
- 챔버의 두께가 수 밀리미터에 도달 할 수 있으므로 스테이지가 챔버를 보유 할 수 있는지 확인하십시오.
참고: 예를 들어, 이 프로토콜에 사용되는 공초점 현미경( 재료 표 참조)에는 여러 단계(예: 원형, 직사각형)가 장착되어 있습니다. 챔버를 보유하도록 선택된 단계는 매개 변수가 챔버 크기에 맞는 한 관련이 없습니다. - 관심있는 뇌 영역의 깊이가 수 밀리미터 일 수 있고 커버 슬립이 수동으로 배치 된 것처럼 커버 슬립이 완전히 직선적이지 않을 수 있으므로 충분한 작동 거리, 즉 최소 작동 거리 ≥3mm의 목표를 사용하여 작업하십시오.
참고: 데모로서, 도 1, 비디오 1 및 비디오 2 에 제시된 결과는 3 mm 작동 거리 및 2.4의 배율을 갖는 물 침지 16x 대물렌즈를 사용하여 2광자 현미경 하에서 얻어졌으며, 652 x 483 μm 시야각과 평면들 사이에 0.937 μm 간격을 갖는 z-스택을 얻었다. - 몇 시간 또는 며칠이 걸릴 수 있는 다중 영역 이미징을 수행합니다. 각 이미지의 크기가 최대 수십 기가비트에 도달 할 수 있으므로 컴퓨터에 충분한 여유 저장 공간이 있는지 확인하십시오.
참고: CLARITY 이미징으로 인해 이미지 섹션이 훨씬 더 깊어질 수 있습니다. 따라서 표현식을 캡처하는 데 사용되는 강도는 이미지 합산 중에 과발현을 방지하기 위해 상대적으로 낮아야 합니다. - 침수 목표를 위해, 이미징하는 동안 정기적으로 액체를 확인하고 필요한 경우 추가 액체로 보충하십시오.
참고 : 비디오 3에 제시된 데이터를 이미징하는 동안 증발을 방지하기 위해 6-8 시간마다 챔버 표면에 물을 첨가했습니다. - 이미지를 획득한 후 여러 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 이미지를 보고 분석합니다.
참고: 권장 소프트웨어에는 시각화와 분석을 위한 Imaris 및 SyGlass가 포함되어 있습니다. Imaris 소프트웨어를 사용하여 성상세포의 최적화된 재구성을 위한 정확한 파이프라인은 앞서9에 기술되었다. 요컨대, 본 연구에 사용된 이마리스의 특징은 세포 구조를 완전히 재구성하는 필라멘트와 모든 소마타의 공간에서의 위치를 추출하는 스팟이었다.
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Representative Results
두꺼운 뇌 조직 조각을 성공적으로 제거하면 단일 세포 또는 이웃 세포 그룹의 특성과는 달리 큰 세포 집단의 특성에 관해 질문 할 수있는 새로운 범위의 질문이 생깁니다. 성공적인 결과를 얻기 위해서는 샘플 간의 분산을 줄이기 위해 고려해야 할 광범위한 매개 변수 (예 : 선명도, 형광 정보, 팽윤도 매개 변수)가 있으므로 CLARITY 프로토콜을 엄격하게 준수해야합니다.
도 1은 클리어링 방법의 모든 단계를 통한 형광 단백질 발현 검증으로부터의 전체 클리어링 과정을 설명한다. 도 2는 이 광자 또는 공초점 현미경 하에서 이미징에 최적으로 정화된 조직을 위한 챔버를 제조하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜에 필요한 재료는 챔버 준비의 다른 프로토콜에 비해 매우 저렴합니다.
도 3 은 비디오 1에 기술된 큐브를 제시하며, 여기서 300개 이상의 성상세포는 마우스 해마의 CA1 부분의 클리어된 섹션에 도시되어 있다. 도 4는 비디오 2에 기술된 큐브를 제시하며, 여기서 성상세포와 흥분성 뉴런 소마타 둘 모두는 두꺼운 투명한 조직에 도시되어 있다. 도 5는 비디오 3에 설명된 바와 같이 전체 반구를 제시한다. 뇌 전체 뉴런 돌출부는 등쪽 CA1 (녹색, GFP) 및 복부 CA1 (빨간색, TdTomato)에서 표시됩니다.
비디오 1 은 CLARITY 절차 후 이광자 현미경으로 획득한 해마 성상세포(>300)의 두꺼운 이미지를 제시한다. 형광은 성상세포에 특이적인 바이러스 벡터 형질도입에 의해 제공되었다. 비디오 2는 성상세포와 해마 피라미드 세포의 핵 사이의 공간적 근접성을 제시한다. 비디오 3은 전체 반구에 걸쳐 축삭 다발을 추적합니다. 축삭은 일차 운동 피질에서 투사되고 척수에서 다시 추적됩니다. 또 다른 번들은 등쪽 해마에서 Supra Mammillary 몸체쪽으로 추적됩니다. 마지막으로, 그것은 Mammillary body에서 복부 해마에서 기원을 향해 축삭의 빨간 묶음을 추적합니다. 표시된 모든 세포는 독점적으로 흥분됩니다.
그림 1: 클리어링 공정에 대한 자세한 설명. (A) 형광단 발현의 검증. 이 예에서, 마우스 해마의 CA1 부분 내의 모든 성상세포는 적색 단백질(TdTomato, 마젠타로 이미지화됨)을 발현하고, 모든 흥분성 뉴런은 그들의 핵에서 녹색 단백질(H2B-GFP)을 발현한다. 이 이미지는 2-광자 현미경을 사용하여 획득되었습니다. 이미지는 2.4의 배율로 16x 대물(0.8NA)의 물 침지물을 사용하여 촬영하여 15.5프레임/s에서 652 x 483μm 시야각과 평면 사이에 0.937μm 간격의 z-스택을 얻었다. 특이성 및 침투성을 면역조직화학9에 의해 검증하였다. (B) 탱크에서 뇌를 지탱하는 튜브로N2 가스를 이송하려면 끝에 바늘이있는 파이프가 필요합니다. (c) 튜브 내부의 공기는 가스 탱크로부터 배관에 연결된 바늘을 통해 N2의 유입을 위한 하나(위쪽 화살표)와 유출을 위한 다른 하나(하단 화살표)의 2개의 구멍을 생성함으로써N2로 대체된다. (D) 탈기 직후 모델링 점토로 구멍을 덮으면N2가 튜브를 빠져 나가는 것을 방지합니다. (e) 탈기된 용액을 따뜻한 욕조에서 3.5 h 동안 가열한다. (f) 성공적인 중합은 겔화된 HS에 매립된 뇌를 초래한다. 가스 기포는 중합체 내에 갇힐 수 있다. (g) 겔로부터 추출 직후는 뇌가 원하는 두께로 절단되는 가장 좋은 지점이다. (H) 천공된 튜브는 교반기 상의 용액의 흐름이 샘플에 도달하도록 허용한다. (I) 천공 튜브 내부의 두뇌는 핫플레이트 교반기 위에 서 있는 2L 비커에 맞게 만들어진 크기의 자체 제작 홀더에 의해 수직으로 유지된다. (J) 충분히 명확하지 않은 뇌의 예. 샘플은 대략 일주일 더 CS2에서 교반되어야 한다. (K) 충분히 맑은 뇌의 예. (L) 맑은 뇌를 PBST에 삽입하면 조직이 이전보다 더 희어진다. 이러한 색상 변화는 트리톤 (Triton) 때문이며이 솔루션에서 다음 용액으로 이동하면 사라집니다. (M) RIMS에서 >24 시간 후, 뇌는 다시 완전히 투명해질 것입니다. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; NA = 수치 개구; HS = 하이드로겔 용액; CS2 = 솔루션 지우기 2; PBST = 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 포스페이트 완충 식염수; RIMS = 굴절률 일치 솔루션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 챔버 준비. (A) 뜨거운 접착제 벽의 첫 번째 층은 슬라이드의 가장자리를 덮고 벽을 만지지 않고 뇌를 포함 할만큼 충분히 넓은 공간을 남깁니다. 슬라이드의 왼쪽 위 모서리에 구멍 하나가 남아 있습니다. (b) 층이 조직의 높이에 도달하기 위해 층 후에 층을 첨가한다. (C) 직선 커버 슬립 (흰색 화살표)은 챔버를 밀봉합니다. (d) 챔버 벽의 구멍을 통해 RIMS로 채워진 챔버. (e) 챔버는 RIMS로 채워져 기포를 남기지 않는다. (F) 누출을 방지하기 위해 뜨거운 접착제로 챔버의 구멍을 밀봉합니다. 측면보기. (G) 이 단계에서 슬라이드의 가장자리 위로 뻗어있는 뜨거운 접착제 잔재물은 챔버에서 차단되어야합니다. (H) 현미경으로 이미징 할 준비가되어있는 완전히 준비된 챔버. 약어 : RIMS = 굴절률 일치 솔루션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 클리어 해마에서 모든 이미지화된 성상세포(AAV1-GFAP::TdTomato, 빨간색). 비디오 1의 단일 프레임은 클리어 해마에서 모든 이미지 된 성상 세포 (AAV1-GFAP::TdTomato, 빨간색)를 캡처합니다. 이미지 속성의 모든 세부 정보는 비디오 1에 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 두꺼운 투명 조직에서 성상세포(AAV1-GFAP::TdTomato, 빨간색)와 해마 피라미드 세포 핵(AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, 녹색). 두꺼운 투명한 조직에서 성상세포 (AAV1-GFAP::TdTomato, 빨간색)와 해마 피라미드 세포 핵(AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, 녹색)을 모두 보여주는 비디오 2의 단일 프레임. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 녹색 축삭(AAV5-CaMKII::eGFP, 녹색) 및 빨간색 축삭(AAV5-CaMKII::TdTomato) 비디오 3의 단일 프레임은 전체 반구에서 추적 할 수있는 마우스 뇌의 여러 위치에서 파생 된 두 가지 유형의 축삭을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 : 해마 등쪽 CA1 성상 세포 (AAV1-GFAP::TdTomato, 빨간색)의 >1mm 두께 조각의 영상. 비디오는 CLARITY 절차에 따라 2.4의 배율로 16x 대물(0.8 NA)을 사용하여 이광자 현미경으로 획득되었습니다. 도 1A와 유사하게, z-스택 간격은 0.937 μm로 설정되었다. 형광은 성상세포에 특이적인 바이러스 벡터 형질도입에 의해 제공되었다. 이 큐브의 성상 세포 수는 >300 개이며, 대부분의 공정은 대부분의 세포에서 분석 할 수 있습니다. 약어: NA = 숫자 조리개; AAV = 아데노-관련 바이러스; GFAP = 신경교세포 세동 산성 단백질. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2 : 3D 큐브의 성상 세포와 흥분성 뉴런 핵. 큐브에는 그림 1A 및 비디오 1에 대해 언급 된 광학 조건 하에서 dCA1의 모든 라미나가 포함되어 있습니다. 이 큐브는 성상세포 (AAV1-GFAP::TdTomato, 빨간색)와 해마 피라미드 세포의 핵 (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, 녹색) 사이의 공간적 근접성을 나타낸다. 약어: AAV = 아데노-관련 바이러스; GFAP = 신경교세포동산성 단백질; CAMKII = 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II; eGFP = 강화된 녹색 형광 단백질; H2B = 히스톤 2B. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 3 : 전체 반구에 걸쳐 축삭 번들 추적. 척수에서 끝나는 녹색 축삭 (AAV5-CaMKII::eGFP, 녹색)은 일차 운동 피질 (7mm 이상 떨어져 있음)으로 쉽게 추적됩니다. 해마 (등쪽)에서 또 다른 번들이 Supra Mammillary body (뇌의 대부분의 복부 쪽)쪽으로 추적되며, 이는 거의 3mm 길이의 흔적입니다. 비디오의 후반부에는 맘밀러리 바디의 목표 위치에서 복부 해마에서 유래 한 축삭 돌기 (AAV5-CaMKII : : tdTomato)의 빨간색 번들을 추적합니다. 이 이미지는 4x 대물(0.16 NA)을 사용하여 올림푸스 스캐닝 레이저 공초점 현미경 FV1000으로 촬영되었으며, MATL FluoView-feature를 사용하여 여러 ROI를 결합하여 반구 전체를 제시했습니다. 약어: AAV = 아데노-관련 바이러스; CAMKII = 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II; eGFP = 강화된 녹색 형광 단백질; NA = 수치 개구; MATL = 다중 영역 시간 경과. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 하이드로겔 용액 (1 L) | |
| 재료 | 분량 |
| VA-044 이니시에이터 | 2.5 지 |
| PFA 4% | 900 mL |
| 아크릴아미드 (40%) | 50 mL |
| 비스아크릴아미드 (2%) | 50 mL |
표 1: 하이드로겔 용액(1 L)의 제조. 하이드로겔 용액은 얼음처럼 차가운 표면에 준비되어야 합니다. 성분이 혼합되는 순서는 중요하지 않습니다. 아크릴 아미드의 총 비율은 1 % 17 또는 4 % 22를 사용하는 유사한 프로토콜과 달리 2 %입니다.
| 클리어링 솔루션 (1L) | ||
| 재료 | 분량 | |
| CS1 | CS2 | |
| 붕산 (M.W. = 61.83 g / mol) | 12.366 지 | 3.4 지 |
| 증권 시세 표시기 | 80 지 | 80 지 |
| 트리스 베이스 (M.W. = 121.14 g / mol) | 0 | 12.1 지 |
| 증류수 (DW) | 1 L로 채우기 | 1 L로 채우기 |
| 나오 | pH 8.5 | |
| 인산염 완충 식염수 1 L, 0.5% 트리톤 X-100 | ||
| 재료 | 분량 | |
| 증권 시세 표시기 | 995 mL | |
| 트리톤 X-100 | 5 mL | |
표 2: 0.5% 트리톤 X-100을 갖는 클리어링 용액 1 및 2(1 L) 및 포스페이트 완충 식염수 1 L의 제조. 클리어링 용액은 사전에 준비하고 오랜 기간 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 붕산 및 SDS를 함유 한 모든 용액은 SDS 또는 붕산과의 흡입 또는 피부 접촉을 피하기 위해 흄 후드 아래에서 처리해야합니다. CS1 중의 NaOH는 pH를 8.5로 설정하기 위해 마지막으로 첨가되어야 한다. 각 뇌 샘플은 적어도 5-25 mL의 CS1에 넣고 충분한 확산을 위해 밤새 보관해야합니다. 약어: CS1 = 클리어링 솔루션 1; SDS = 소듐 도데실 설페이트; M.W. = 분자량.
| 제품 이름 | 주요 이점 | 주요 단점 |
| 라피클리어 | 샘플은 투명하게 유지됩니다. | 조직 팽창 |
| 라피클리어 CS | 표본이 다시 정상 크기로 축소됩니다. | 샘플의 투명성이 떨어질 수 있음 |
표 3 : 장점과 단점이있는 RIMS 옵션. 라피클리어(RC, RI = 1.47) 또는 CLARITY 특정 라피클리어(CSRC, RI = 1.45). 이 두 솔루션의 주요 차이점은 CSRC가 맑은 뇌를 원래 크기로 축소하지만 RC 솔루션은 그렇지 않아 클리어 된 샘플이 약간 부어 오르는 것입니다. 약어: RI = 굴절률.
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Discussion
조직 제거 방법은 뇌 연구에서 혁신적인 도구를 제시하여 이전에는 질문 할 수 없었던 질문을 초대합니다. 작은 세포 그룹, 단일 세포 또는 심지어 단일 시냅스의 특성을 표적화하는 것으로부터, CLARITY는 이제 관련 형광단을 사용하여 전체 세포 집단 또는 장거리 연결 특징의 표적화를 가능하게 한다.
형광단 발현 및 CLARITY 절차 조합의 결과는 바이너리가 아니며; 많은 요인들이 차선책의 결과로 이어지는 절차를 방해 할 수 있습니다. 첫째, 형광단 발현은 사전에 검증되어야 한다. CLARITY 절차가 일부 정보 손실을 야기하기 때문에, 충분한 형광단 단백질 발현은 CLARITY 프로세스의 끝에서 이미지의 유효성에 결정적이다. 둘째, 혈액의 자동 형광은 두꺼운 조각에서 신뢰할 수없는 데이터로 이어질 수 있기 때문에 모든 혈액이 뇌에서 빠져 나오도록주의 깊게 다루어야합니다. 셋째, 프로토콜에서 논의된 모든 파라미터는 클리어링 공정의 각 단계에서 정밀하게 처리되어야 하며, 예를 들어, 중합 전에 HS 내의O2 잔기 또는 각 단계에서 온도 부정확성은 활성 물질 사이의 화학 반응이 발생하는 것을 방지할 것이다.
이전 프로토콜17,22는 HS에서 아크릴아미드의 상이한 농도를 추천한다. 아크릴 아미드의 주요 목적은 분자를 아민 잔기 (단백질 및 핵산)로 더 잘 고정시키는 것입니다. 농도에 대한 약간의 변화는 전체 클리어링 과정에 큰 영향을 미칩니다 : 고정이 너무 작 으면 지질 분자가 조직과 분리되지 않으며 제거 과정이 불필요하게 연장되거나 불투명 한 뇌가 발생합니다. 그러나 아크릴 아미드의 농도가 낮을수록 지질이없는 뇌 구조를 적절하게 유지하지 못합니다. 이 프로토콜에서, 아크릴아미드 백분율은 고정된, 그러나 명확한 조직의 섬세한 균형을 제공하도록 설정된다.
대부분의 클리어링 과정은 CS2에서 이루어지며 조직 선명도 수준은 매일 테스트해야합니다. PBST 정리는 RIMS와 상호 작용할 수있는 잔류 SDS 분자를 세척하기 때문에 클리어링 용액과 굴절률 매칭 용액 사이의 필수적인 단계입니다. 또한 챔버 준비가 아직 필요하지 않은 경우 PBST (0.5 %)에서 맑은 조직을 무기한으로 유지할 수도 있습니다.
RIMS에 뇌를 배치 할 때 솔루션의 이점과 한계에 익숙해 져야합니다. 예를 들어, RapiClear는 거의 제거 된 조직에서도 완전한 투명성을 유발하지만 데이터를 분석 할 때 무시해서는 안되는 약간의 붓기를 유발합니다. 이전의 측정치(9 )는 모든 축(즉, 등쪽 복부, 전후부 및 측-내측 축)을 따라 동일한 확장을 제안하며, 동일한 뇌 영역의 얇은 조각과 비교하여 팽창 지수를 계산할 수 있게 한다. CLARITY 특정 RapiClear를 사용하면 붓기가 제거됩니다. 그러나 SDS 잔여물이 조직에 남아 있으면 투명하지 않은 덩어리로 응집됩니다.
이 수정 된 프로토콜의 또 다른 이점은 비용입니다. 이전 프로토콜은 RIMS에서 뇌를 보유 할 수있는 챔버를 만들기 위해 다른 접착제 유형을 제안합니다. 이 프로토콜에서는 단순히 핫 접착제를 사용합니다. 그것은 솔루션과 반응하지 않으며, 어디에서나 구입할 수 있으며, 사용하기 쉽고, 이전에 제안 된 접착제보다 훨씬 저렴합니다.
두꺼운 뇌 샘플의 이미징에서 얻은 데이터는 전체 세포 집단, 뇌 구조 간 연결성 또는 먼 거리에서 단일 축삭의 추적을 설명 할 수 있습니다 (비디오 3). 이러한 특성에 관한 질문은 이전에 제기되었지만 두꺼운 두뇌 조각을 사용하여 달성 할 수있는 데이터의 타당성은 이전에 실수하기 쉬운 얇은 슬라이스 이미지 오버레이 방법에 따라 크게 향상됩니다.
CLARITY 프로세스는 수 밀리미터에서 전체 뇌 이미징에 이르기까지 두꺼운 조각을 성공적이고 균일하게 지울 수 있습니다. 수동 클리어링 (즉, ETC를 사용하지 않음)은 조직에 해를 끼칠 위험을 줄이고 샘플이 클리어링 용액에 잠겨 단백질 보존의 높은 효율에 영향을 미치지 않도록하는 시간을 줄입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램 (보조금 계약 No 803589), 이스라엘 과학 재단 (ISF 보조금 번호 1815/18) 및 캐나다 - 이스라엘 보조금 (CIHR-ISF, 보조금 번호 2591/18)에 따라 유럽 연구위원회 (ERC)로부터 자금을 지원받았습니다. 전체 원고에 대해 의견을 주신 Nechama Novick에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
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