Summary
该协议描述了一种通过使用易出错的PCR和反向遗传学结合全长突变RNA合成在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法为表型选择提供了一个模型，可用于10 kb长的正义RNA病毒基因组。
Abstract
由于缺乏一种方便的方法来迭代生成不同的全长病毒变异，阻碍了RNA病毒定向进化的研究。通过整合全RNA基因组易出错的PCR和反向遗传学，可以诱导随机全基因组替换诱变。我们开发了一种使用这种技术合成不同文库的方法，以鉴定具有目标表型的病毒突变体。这种方法称为全长突变RNA合成（FL-MRS），具有以下优点：（i）能够通过高效的一步法PCR创建大型文库;（ii）通过操纵DNA聚合酶的保真度来创建具有不同遗传多样性水平的文库组的能力;（iii）创建可直接作为突变RNA合成模板的全长PCR产物;（iv）能够产生可作为非选择输入池递送至宿主细胞的RNA，以筛选所需表型的病毒突变体。我们发现，使用反向遗传学方法，FL-MRS是研究丙型肝炎病毒JFH1分离株生命周期各个阶段病毒定向进化的可靠工具。该技术似乎是利用定向进化来了解病毒基因在正义RNA病毒的发病机制和抗病毒耐药性中的适应、复制以及作用的宝贵工具。
Introduction
正向遗传筛选从感兴趣的病毒表型开始，然后通过对其基因组进行测序并将其与原始菌株的基因组进行比较，尝试鉴定导致该表型的突变。相反，在反向遗传筛选中，在靶基因中引入随机突变，然后检查产生的表型1。对于反向遗传学方法，体外诱变是最广泛使用的技术，可以创建一组变异，随后筛选感兴趣的表型。已经报道了多种遗传工具用于实现 RNA 病毒的全基因组随机诱变，包括易出错 PCR （ep-PCR）2,3、环状聚合酶延伸4 和 Mu-转座子插入诱变 5,6,7。后两种方法产生的文库具有有限的序列多样性，并且容易引入大量的插入和缺失，这对病毒是高度致命的，并严重限制了传染性病毒变异的恢复。
ep-PCR 是一种众所周知的强大诱变技术，广泛用于蛋白质工程中，以产生突变酶，用于选择具有所需特性的表型，例如增强的热稳定性、底物特异性和催化活性 8,9,10。这种技术易于执行，因为它需要简单的设备，不涉及繁琐的操作，使用市售试剂，并且速度快;此外，它还生成高质量的库。
在这里，我们开发了一种全长突变RNA合成（FL-MRS）的新方法，通过整合ep-PCR产生丙型肝炎病毒（HCV）的完整基因组，诱导随机全基因组替换诱变和反向遗传学。即使是单个核苷酸的插入或缺失，对正义RNA病毒（[+]ssRNA）也是高度有害的;因此，基于PCR的替代诱变是迭代生成具有良好活力的完整（+）ss RNA病毒基因组的大型、多样化文库的首选方法。
FL-MRS 是一种简单的方法，通过精心设计与病毒 cDNA 克隆结合的引物组，可以应用于任何基因组长度为 ~10 kb 的正义 RNA 病毒。pJFH1 是一种传染性 cDNA 克隆，编码 HCV 基因型 2a，可以概括病毒生命周期的所有步骤。通过使用 FL-MRS 方法，我们展示了随机诱变全基因组文库（突变文库 [ML]）的合成，以产生具有复制能力的 JFH1 变体，这些变体事先不知道与突变相关的特性。在暴露于抗病毒药物后，一些病毒变体迅速克服了药物压力，并发生了所需的表型变化。使用此处描述的方案，可以产生大量的病毒变体，从而为研究（+）ssRNA病毒的进化创造机会。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：这里使用的JFH1菌株（WT）是国立传染病研究所Takaji Wakita的善意礼物。人类肝癌细胞系Huh7.5是洛克菲勒大学查尔斯·赖斯（Charles Rice）的一份礼物。该方法的原理图如图 1所示。
1. 使用易出错PCR的JFH1全基因组替换诱变
- 为了进行ep-PCR，用引物J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3'和J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3'（图1A）以及 表1 中描述的反应组分（从JFH1菌株分离的质粒）制备用于四组实验的预混液。
- 将预混液分装到四个试管中，将 100 ng、50 ng、25 ng 和 10 ng 模板加入各个试管中，并将反应的总体积调节至 50 μL。 应用 表 2 中描述的循环条件扩增包含 T7 启动子和全长 HCV 基因组的 9736 碱基对 （bp） 片段（图 2）。
注意：ep-PCR产物必须包含T7启动子序列，以促进病毒基因组的 体外 转录。因此，正向引物必须位于病毒cDNA克隆的T7启动子的上游，反向引物序列应终止于病毒基因组的3'-末端，以促进转录径流。在Taq DNA聚合酶制造商推荐的范围内优化ep-PCR反应的各组分，实现高产量扩增。除了不同的模板量外，不平衡的 dNTP（尤其是低 dATP 和/或 dGTP 浓度）也可用于增加 6-8 kb 长的病毒基因组长度的多样性3。 - 通过加载等体积的PCR产物（5μL）并通过运行0.8%Tris-乙酸酯-EDTA（TAE）的琼脂糖凝胶电泳11，与已知量的1千碱基（kb）DNA分子量标准进行比较，估计扩增的ep-PCR产物。按照制造商的指示使用色谱柱纯化试剂盒纯化产品。
- 通过使用微量分光光度计12测量260nm处的吸光度来估计纯化产物的浓度。如果需要，对ep-PCR产物进行真空浓缩，以获得产物浓度≥100ng/μL。
注：通过加载ep-PCR产物的两倍连续稀释液并将其强度与已知量的1 kb DNA分子量标准进行比较，可以进行更准确的估计。
2. 病毒RNA合成
- 设置40μL反应，在37°C下用4U的 XbaI 酶消化5μg克隆-pJFH122小时，然后进行柱纯化并在微量分光光度计12中测量260nm处的吸光度。根据制造商的说明，使用市售的大规模RNA生产系统对柱纯化的ep-PCR产物或克隆-pJFH1（WT）进行20μL 体外 转录反应。
- 在 200 μL 微量离心管中，混合约 1 μg 纯化的 ep-PCR 产物（突变文库）或 XbaI 消化的克隆 pJFH1、10 μL 含有核糖核苷酸的 2x 缓冲液和 2 μL T7 酶混合物。混合所有成分并短暂旋转成分。将反应混合物在37°C孵育45分钟，然后加入1U无RNase的DNase酶，并在37°C孵育30分钟（图1C）。
- 按照制造商的说明使用RNA纯化试剂盒纯化体 外 合成的RNA，在40μL无RNase和DNase的水中洗脱，并通过使用微量分光光度计12测量260nm处的吸光度来估计纯化RNA的浓度。根据需要（5μg或2μg）制备等分试样以避免冻融并将其储存在-80°C。 通过使用 2 μg RNA 进行 MOPS 甲醛 0.8% 琼脂糖凝胶电泳13 来验证病毒转录物的完整性和大小（图 3）。
3. ep-PCR产物（突变文库）突变比例的估计
注：在此步骤中，通过亚克隆在步骤2中获得的产物而突变的核苷酸比例。据估计，使用两个全基因组突变文库（ML50 和 ML25）和克隆 pJFH1 衍生的病毒 RNA 证明了使用 ep-PCR 创建遗传异质性的优势。估计了HCV NS5A基因的突变比例，该基因也是本研究中的表型读出基因（耐药性）。
- 根据制造商的建议，通过加入步骤2中合成的约1μg病毒RNA，5μM反向引物5'-GTGTACCTAGTGTGTGTGCCGCTCTA-3'和200U逆转录酶来建立20μL cDNA合成反应。
- 使用 cDNA，扩增包含完整 NS5A 基因的 2571 bp 片段。为此，制备含有0.5μM的反应混合物，用于5272F和7848R引物（终浓度; 表3）、1.5 mM MgCl2、1x PCR缓冲液和1 U高保真Taq聚合酶，总体积为50μL，并使用 表4中描述的条件运行扩增循环。
- 在基于0.8%TAE的琼脂糖凝胶上运行产品以确认产品大小为2571 bp，然后按照制造商的指示使用柱纯化试剂盒纯化产品。在 40 μL 无菌水中洗脱柱纯化产物。
- 要向产物中添加3'A突出端，加入0.5μM dATP和1U低保真Taq DNA聚合酶，并将整个PCR产物在70°C下与1x PCR缓冲液和1.5mM MgCl2 （终浓度）一起孵育30分钟。按照制造商的指示使用色谱柱纯化试剂盒纯化混合物
注意：或者，从步骤1.4的凝胶中切除~9.7 kb长的产物。并根据制造商的说明使用市售试剂盒进行长链PCR产物的克隆，或使用Illumina平台对ep-PCR产物进行NGS2。 - 通过加入 5 μL 的 2x 连接缓冲液、50 ng 的 T 载体 DNA、步骤 3.4 中合成的插入 DNA 的约 3 倍摩尔过量、3 Weiss 单位的 T4 DNA 连接酶和无核酸酶的水来建立连接反应，总体积为 10 μL。 将该反应在室温下孵育3小时，然后加入100μL 大肠杆菌 DH5α与连接的DNA;在42°C下对细胞进行热冲击35秒（图1B）。
- 加入1mL Luria-Bertani（LB）培养基（不含抗生素），并在37°C下轻轻摇动孵育1小时以恢复。将细胞悬液以13,800× g离心，弃去上清液，重悬于200μL新鲜LB培养基中。
- 将100μL转化 的大肠杆菌 DH5α细胞铺在含有50μg/ mL氨苄青霉素的LB板上，并在37°C下孵育16小时。在5mL LB培养基+ 50μg/ mL氨苄青霉素中建立25-30个菌落的小量制备物，并在37°C下生长过夜。
- 第二天，根据制造商的说明，用质粒纯化试剂盒提取质粒，并在10μL体积中用200ng分离的质粒，2U的 EcoR1 和1x限制性缓冲液进行限制性内切酶消化。
- 将消化混合物在37°C孵育3小时后，在0.8%TAE基琼脂糖凝胶上分离产物以确认质粒DNA插入。
- 使用M13正向，M13反向，6208-SPF和6748-SPF引物对25个阳性克隆的质粒进行Sanger测序（表3），以确定突变的比例（表示为突变的核苷酸比例）来自文库和克隆pJFH1的病毒RNA中（图1B 和 图4）。
4. Huh7.5细胞系的病毒RNA转染
注意：使用不含RNase / DNase的组织培养材料，并在无菌的II类生物安全柜中工作。根据组织的生物安全指南，在推荐的收容设施中工作。
- 通过在37°C的5%CO2 培养箱中在T75cm2 组织培养瓶中孵育来维持Huh7.5细胞，该培养瓶含有15mL补充有10%（体积/体积）胎牛血清，青霉素（100U / mL）和链霉素（100μg/ mL; 图1D）。
- 当汇合度达到 90% 时，以 1：3 的比例拆分细胞。用1x预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS;pH 7.4）洗涤细胞。加入5mL 1x胰蛋白酶-EDTA溶液以完全覆盖细胞层，轻轻旋转烧瓶，然后将烧瓶在37°C孵育5分钟。
注意：孵育时间可能会有所不同;孵育细胞，直到细胞层与细胞培养瓶表面完全分离。 - 加入 10 mL 1x 预热的完全 DMEM，通过重复移液分散细胞，并将细胞悬液收集在 15 mL 或 50 mL 无菌离心管中。在室温下以252× g离心细胞悬浮液5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于6mL完全DMEM中，并将细胞在37°C下在含有5%CO2的湿润培养箱中孵育。
- 要持续维持幼稚、转染或病毒感染的 Huh7.5 细胞，请重复步骤 4.2。和步骤 4.3。
- 转染前1天，按照步骤4.1-4.3中所述分裂细胞，使用血细胞计数器计数活细胞数，在35mm培养皿中以0.6×106 的密度接种Huh7.5细胞在2mL完全DMEM中，并将细胞在37°C下在含有5%CO2的湿润培养箱中孵育。
- 第二天，准备转录本 - 脂质复合物。为此，在 50 μL 最低必需培养基中稀释 10 μL 转染试剂，并在 50 μL 最低必需培养基中分别稀释 5 μg 病毒转录本。
- 将两种混合物在室温下孵育10分钟，然后将它们混合在单个无菌微量离心管中，并进一步将混合物在室温下孵育30分钟以形成转录本 - 脂质复合物。
- 细胞孵育16小时后，从培养皿中取出培养基，用预热的1x PBS洗涤细胞2次，并加入1.5mL最小必需培养基。慢慢地将转录脂质复合物加入培养皿中，并用手轻轻旋转以确保复合物的均匀分布。
- 将细胞在37°C的5%CO2 培养箱中孵育10小时。然后，除去培养基，用 1 mL 预热的 1x PBS 洗涤转染细胞 2 次，并加入 2 mL 完全 DMEM。
5. 病毒生产
- 每 2 天或 3 天在转染的 Huh7.5 细胞达到 90% 汇合度时分裂一次。在每次分裂时收集病毒上清液，并将其储存在-80°C以供进一步分析。
- 在每次拆分时，使用步骤6.2中所述的焦点形成测定（FFA）监测病毒的传播。收获病毒，直到病毒扩散达到转染细胞的>80%（图1D）。
注意：在前几次传代中以 1：1 的比例拆分转染细胞，以挽救最大数量的病毒变异。随着全基因组ML中突变比例的增加，病毒传播速度减慢，活力下降2。
6. 病毒滴度的定量
- 病毒RNA的定量
- 根据制造商的说明，使用病毒 RNA 分离试剂盒从 140 μL 培养上清液中分离病毒 RNA。
- 根据制造商的说明，使用商业 qRT-PCR 试剂盒设置 10 μL qRT-PCR 反应。使用正向引物R6-130-S17，反向引物R6-290-R19（每个终浓度0.2μM）和探针R9-148-S21FT（终浓度0.3μM）进行HCV RNA定量（表3）。将运行条件设置为48°C20分钟，95°C10分钟，然后45次95°C循环15秒和60°C1分钟。
注：探针应分别在 5' 和 3' 端含有荧光报告染料 6-羧基荧光素 （FAM） 和淬灭染料 6-羧基-四甲基-罗丹明 （TAMRA）。 - 在实时荧光定量PCR仪中运行反应。设置阴性对照，即同时从模拟感染细胞的上清液和无核酸酶水中提取RNA，以确保没有交叉污染。
- 同时，使用10倍连续稀释的已知拷贝数的HCV转录本（1×10,8至0）生成标准曲线，用于病毒RNA的定量。一式三份进行定量（图1D）。
- 使用 50% 组织培养感染剂量 （TCID50） 进行感染性病毒滴度定量
- 在加入病毒前约16小时，在96孔板中接种6.5×103 Huh 7.5细胞/孔，并将细胞在37°C下在5%CO2 培养箱中孵育。
- 在生物安全 II 类柜中，进行 10 倍连续稀释（每个 1 mL），覆盖 1 x 10-1 至 1 x 10-6 稀释（8 稀释）收获的病毒（当病毒扩散达到 >80% 的细胞时获得，如步骤 5 所述。加入100μL/孔（重复8次）稀释的病毒以感染Huh7.5细胞，并将板保持在37°C和5%CO2的培养箱中3天。
- 3天后，每次用0.1mL PBS洗涤感染细胞3次，并在-20°C下用0.1mL冰冷甲醇固定和透化细胞20分钟。用1x PBS 3x洗涤孔，然后用PBS-T（1x PBS / 0.1%[v / v] Tween-20）洗涤孔。
- 去除PBS-T后，在室温下用0.1mL含有0.2%脱脂牛奶的1%牛血清白蛋白（BSA）在PBST中封闭细胞30分钟。除去封闭溶液，用0.1mL在1x PBS中制备的3%H 2O2处理细胞5分钟。
- 再次，用 1x PBS 洗涤细胞 2 次，用 PBS-T 洗涤 1 次，然后加入 50 μL/孔的抗 NS5A 9E10 mAb（1：10000，原液 1 mg/mL;洛克菲勒大学 Charles Rice 的善意礼物），并在室温下孵育 1 小时。用1x PBS再次洗涤孔3次，用PBS-T洗涤1次。
- 加入 50 μL/孔的 HRP 偶联山羊抗小鼠二 IgG （1：4000），在室温下孵育 30 分钟，然后用 0.1 mL 的 1x PBS 洗涤孔去除未结合的抗体。
- 加入 30 μL DAB（二氨基联苯胺四盐酸盐）着色底物，并在室温下轻轻摇动孵育板 10 分钟。底物在孔表面形成棕色沉淀，表明HCV NS5A抗原。取出DAB溶液，用1x PBS洗涤孔2次，用蒸馏水洗涤孔1次。加入 100 μL 含有 0.03% 叠氮化钠的 PBS。
- 使用10倍物镜在倒置光学显微镜下检查每个孔。计算阳性孔的数量。如果孔中含有一个或多个NS5A阳性细胞，则为阳性;如果孔显示没有NS5A阳性细胞，则为阴性。使用Reed和Muench计算器估计感染50%孔（TCID50）的终点稀释度14,15。产生 TCID50 所需的稀释度的倒数是每单位体积的病毒感染滴度（病灶形成单位）。
注：不同突变文库的病毒感染滴度不同。
7. 耐药病毒变异选择
- 将NS5A抑制剂pibrentasvir（PIB）溶解在100%DMSO中至1mM的浓度，并在完全DMEM中进一步稀释至10nM的浓度。
- 为了确定PIB的50%有效浓度，在6孔板中以0.6×106 /孔的密度接种Huh7.5细胞，并将细胞在37°C下在5%CO2 培养箱中孵育。细胞孵育16小时后，加入病毒剂量的ML50或克隆JFH1病毒以感染50%的细胞，然后在感染后12小时（h p.i.），用0.5-100pM的PIB的两倍稀释系列处理细胞。测量 FFA 并量化 FFU，如步骤 6.2 所示。孵育 3 天后。
- 在统计分析软件中使用FFU还原测定值绘制剂量反应曲线。从S形曲线中，获得50%有效浓度（EC50; 图5）。
注：有效浓度范围可能因类别、同一类别的HCV抗病毒药物之间以及突变体库而异。 - 对于实验，用ML50病毒（源自ML50 RNA的变体）剂量以70%汇合感染幼稚Huh7.5细胞，以感染50%的细胞12小时，然后在感染后24小时将感染的细胞转移到6孔板上。
- 细胞分裂16小时后，向感染细胞中加入1x EC50PIB （47.3pM）。在每个细胞分裂六次连续传代（18天）后进行此操作，然后是三个无药物传代循环，并使用FFA监测病毒传播，如步骤6.2所述。根据生长区域扩大 FFA 试剂的规模。在每次传代时收获病毒上清液并将其储存在-80°C直至使用。
注意：在治疗随访期间病毒扩散到超过 50% 的细胞可定义为突破性进展，停药期间的病毒传播可定义为病毒复发16。 - 如步骤6.1.1所述，在第18天从上清液中提取病毒RNA，然后合成cDNA，如步骤3.1所示。使用 5 μL 1：5 稀释的 cDNA 和步骤 3.2 中描述的 PCR 组分扩增 NS5A 基因。然后，按照步骤 3.3.-3.5 操作。使用 NS5A 测序引物 6186F、6862F 和 6460R 测定 6-8 个阳性细菌质粒中的 NS5A 耐药突变（表 3 和 表 4）。
注意：在这项研究中，我们报告了 NS5A 中 1x EC50 在 PIB 治疗期间选择的变体的替代。这将排除除 NS5A 以外的替代物在降低对 PIB 易感性方面的贡献。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
按照 图 1 中描述的程序，可以生成大量全长 HCV 变体并筛选感兴趣的耐药表型。如图 2所示，使用克隆-pJFH1以递减量（100-10 ng）合成全基因组突变文库。ep-PCR产物（突变文库）的平均产量范围为3.8-12.5 ng/μL。 图3 显示了从克隆-pJFH1和代表性突变文库（使用50 ng克隆-pJFH1合成的ML50）合成的病毒转录本。克隆-pJFH1通过 XbaI 酶切进行线性化，而ML50直接用于 体外 转录反应。在ep-PCR反应中，突变文库（突变病毒RNA）中的突变比例随着起始pJFH1的减少而增加， 如图4所示。使用 50 ng 模板 （clonal-pJFH1） 合成的 ML50 每复制 10,000 bp 有 4 个取代，而使用 25 ng 模板合成的 ML25 有 9 个取代。在克隆-pJFH1中测序的核苷酸数量中没有发现取代。 如图 5 所示，与克隆 JFH1 病毒相比，ML50 病毒变体对 NS5A 抑制剂 pibrentasvir 的敏感性较低（12.7 倍）。 表5 在ML50病毒变体中鉴定出NS5A替代，这些变体与pibrentasvir治疗的1x EC50 相比。在8个NS5A无性系中，有4个有D7V+F28C的组合，而V8A+F28C和F36L各有1个无性系。这些突变位于 NS5A 的 N 末端区域，已知该区域含有临床相关的 NS5A 耐药突变17。
图1：FL-MRS策略和耐药表型选择示意图。 （A） pJFH1 cDNA（野生型）克隆携带全长基因型 2a 病毒基因组和 T7 启动子。引物 J-For 位于 T7 启动子的上游，引物 J-Rev 位于 HCV 基因组的 3' 末端。（B） 使用容易出错的 PCR 对 Clonal-pJFH1 进行随机诱变，以设计遗传变异并创建全基因组突变文库。Clonal-pJFH1 通过 XbaI 酶切线性化。（C）全基因组ep-PCR产物和线性化克隆-pJFH1是 体外 转录的模板。通过NS5A的TA亚克隆和阳性TA克隆的Sanger测序来确定MLs和克隆-JFH1病毒RNA的突变比例。（D） 用 pibrentasvir（一种 NS5A 抑制剂）处理 Huh7.5 细胞突变病毒 RNA 转染后产生的具有复制能力的变体，以选择 NS5A 耐药表型。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：ep-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。 使用0.8%TAE琼脂糖凝胶电泳分离使用不同模板量（100 ng、50 ng、25 ng和10 ng pJFH1）合成的HCV全基因组ep-PCR产物。ep-PCR产物的预期大小为9.7 kb。分离产物通过溴化乙锭染色观察。泳道 1 是 1 kb DNA 分子量标准;泳道 6 为无模板对照（标记为 H2O）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：MOPS甲醛琼脂糖凝胶电泳病毒转录本。 使用线性化的pJFH1（泳道2）和用50 ng（ML50）含有ep-PCR（泳道3）的pJFH1获得的突变体文库作为 体外 转录反应的模板。使用用溴化乙锭染色的MOPS甲醛0.8%琼脂糖凝胶分析转录本的完整性。泳道 1 是 1 kb RNA 分子量标准。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：突变文库中的替换比例。 在高保真PCR中扩增克隆pJFH1、ML50和ML25 RNA的NS5A基因，然后添加3' A突出端，将产物与T载体连接，并用连接产物转化 大肠杆菌 DH5α。大约 40,000 个核苷酸/文库或克隆 pJFH1 进行了 Sanger 测序。图中显示了每 10,000 bp 复制突变的平均比例。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：pibrentasvir 对 ML50 变体的 EC50 估计值。 Huh7.5 细胞感染克隆性 JFH1 病毒或 ML50 变体，并从 100 pM pibrentasvir 开始连续两倍稀释液处理，3 天后进行 FFA 处理。在统计分析软件中绘制使用FFU还原测定值的S形剂量反应曲线，以估计50%有效浓度。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 用于 50 μL 的组分 | 所需库存价值 | 最终浓度/反应 |
| 10x PCR缓冲液 | 5.0微升 | 1 倍 |
| 氯化镁2 （50毫米） | 1.5微升 | 1.5毫米 |
| KB 扩展器 | 2.0微升 | - |
| dNTP（10 mM） | 1.0微升 | 0.2 毫米 |
| 正向引物（10μM） | 1.0微升 | 0.2微米 |
| 反向引物（10μM） | 1.0微升 | 0.2微米 |
| Taq DNA 聚合酶 （10 U/μL） | 0.5 μL（1：4 稀释） | 1 U |
| 模板（pJFH1,20 ng/μL） | 0.5 至 5.0 μL | 10 至 100 ng |
| 水 | 32.5 至 37.5 μL | 调整至最终体积为 50 μL |
表 1.用于扩增HCV全基因组的Ep-PCR组分。
| 温度 | 时间 | 周期 |
| 95 摄氏度 | 3 分钟 | 1 |
| 95 摄氏度 | 30 秒 | 30 |
| 60 摄氏度 | 25 秒 | |
| 72 摄氏度 | 8 分钟 | |
| 72 摄氏度 | 10 分钟 | 1 |
| 4 摄氏度 | 拿 |
表 2.HCV全基因组ep-PCR的循环条件。
| 测定 | 底漆 | 序列 （5'-3'） |
| 部分NS4B-NS5A-部分NS5B的扩增 | 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R型 | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| cDNA合成 | 9464R型 | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR检测 | R9-148-S21FT（TaqMan 探针） | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6-130-S17型 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| R6-290-R19型 | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| 测序引物以确定ep-PCR产物中突变的比例 | 6208-防晒 | CCCAACTACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-防晒剂 | GACGGTGTGCAGATCCATAG的 | |
| NS5A基因测序（并确定ep-PCR产物中突变的比例） | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R型 | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
表 3.测定中使用的引物和序列。
| 温度 | 时间 | 周期 |
| 95 摄氏度 | 4 分钟 | 1 |
| 95 摄氏度 | 30 秒 | 5 |
| 68 摄氏度 | 30 秒 | |
| 72 摄氏度 | 2 分钟 | |
| 95 摄氏度 | 30 秒 | 5 |
| 66 摄氏度 | 30 秒 | |
| 72 摄氏度 | 2 分钟 | |
| 95 摄氏度 | 30 秒 | 5 |
| 64 摄氏度 | 30 秒 | |
| 72 摄氏度 | 2 分钟 | |
| 95 摄氏度 | 30 秒 | 5 |
| 62 摄氏度 | 30 秒 | |
| 72 摄氏度 | 2 分钟 | |
| 95 摄氏度 | 30 秒 | 10 |
| 60 摄氏度 | 30 秒 | |
| 72 摄氏度 | 2 分钟 | |
| 72 摄氏度 | 10 分钟 | 1 |
| 4 摄氏度 | 拿 |
表 4.NS5A扩增的循环条件。
| 替换 | 不。克隆数 （n=6） |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C系列 | 1 |
| F36L系列 | 1 |
表 5.NS5A 的 Pibrentasvir 耐药性替代。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这项研究中，我们详细介绍了一种简单快速的 FL-MRS 程序，该程序集成了 ep-PCR18 和反向遗传学来合成 HCV 全基因组文库，然后可以在细胞培养系统中使用，以产生具有复制能力的变异，用于筛选耐药表型。使用低保真Taq DNA聚合酶是ep-PCR的先决条件，它允许在全长病毒基因组的PCR扩增过程中掺入取代物。我们测试了几种低保真 Taq DNA 聚合酶，发现 Platinum Taq DNA 聚合酶产生了 ~10 kb 大小的 ep-PCR 产物，产量很高（数据未显示）。我们建议使用固定数量的热循环并改变输入模板量来控制全基因组文库中突变的比例。由于FL-MRS利用错误的全基因组作为全长病毒RNA的模板，因此仔细设计引物组对于确保RNA合成反应产生规定长度的病毒转录本至关重要：（i）正向引物必须位于cDNA克隆的T7启动子的上游（~50个核苷酸），以促进T7聚合酶与ep-PCR产物的结合;（ii）反向引物序列必须在病毒基因组的3'端结束，以促进 体外 RNA合成过程中的转录径流。
然而，该方法相对粗糙，并且无法控制在基因组中感兴趣的区域合并所需的替换数量和类型。FL-MRS的一个主要优点是合成的全长转录本可以直接用于转染细胞，这使得该方法在生成大量病毒变异库时变得简单而有效。相比之下，环状聚合酶延伸和Mu-转座子插入诱变方法需要在选择所需表型之前克隆PCR产物并筛选转化体，这严重限制了突变体库的多样性。尽管我们的方法大大增加了产生几种所需表型的机会，但在筛选中通常需要对单个病毒变异进行评估。
ep-PCR与病毒反向遗传学的整合使我们能够快速产生HCV突变体。这种方法有可能产生数百种转基因病毒，这是目前可用的 体外 诱变技术似乎不可能实现的壮举。这里详述的方法很容易适用于携带任何（+）ssRNA病毒的cDNA克隆，这些病毒的基因组长度可达~10 kb。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究的资金支持（资助号BT/PR10906/MED/29/860/2014）由印度政府生物技术部提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U.
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R.
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
