Summary
Le protocole décrit une méthode permettant d’introduire une diversité génétique contrôlable dans le génome du virus de l’hépatite C en combinant la synthèse d’ARN mutant sur toute la longueur à l’aide de la PCR sujette aux erreurs et de la génétique inverse. La méthode fournit un modèle pour la sélection phénotypique et peut être utilisée pour les génomes de virus à ARN à sens positif de 10 kb de long.
Abstract
L’absence d’une méthode pratique pour la génération itérative de divers variants viraux pleine longueur a entravé l’étude de l’évolution dirigée dans les virus à ARN. En intégrant une PCR complète du génome de l’ARN sujette aux erreurs et une génétique inverse, une mutagénèse de substitution aléatoire à l’échelle du génome peut être induite. Nous avons développé une méthode utilisant cette technique pour synthétiser diverses banques afin d’identifier des mutants viraux avec des phénotypes d’intérêt. Cette méthode, appelée synthèse d’ARN mutant pleine longueur (FL-MRS), offre les avantages suivants : (i) la possibilité de créer une grande bibliothèque via une PCR très efficace en une seule étape sujette aux erreurs ; (ii) la capacité de créer des groupes de banques avec différents niveaux de diversité génétique en manipulant la fidélité de l’ADN polymérase ; (iii) la création d’un produit de PCR complet pouvant directement servir de modèle pour la synthèse d’ARN mutant ; et (iv) la capacité de créer de l’ARN qui peut être délivré dans les cellules hôtes en tant que pool d’entrée non sélectionné pour dépister les mutants viraux du phénotype souhaité. Nous avons constaté, à l’aide d’une approche de génétique inverse, que la FL-MRS est un outil fiable pour étudier l’évolution dirigée par le virus à tous les stades du cycle de vie de l’isolat JFH1 du virus de l’hépatite C. Cette technique semble être un outil inestimable pour utiliser l’évolution dirigée afin de comprendre l’adaptation, la réplication et le rôle des gènes viraux dans la pathogenèse et la résistance aux antiviraux chez les virus à ARN de sens positif.
Introduction
Le criblage génétique direct commence par un phénotype viral d’intérêt, puis, en séquençant son génome et en le comparant à celui de la souche d’origine, tente d’identifier la ou les mutations à l’origine de ce phénotype. En revanche, dans les criblages génétiques inversés, des mutations aléatoires sont introduites dans un gène cible, suivies d’un examen du ou des phénotypes résultants1. Pour l’approche de la génétique inverse, la mutagénèse in vitro est la technique la plus largement utilisée pour créer un pool de variants qui sont ensuite criblés pour les phénotypes d’intérêt. Divers outils génétiques ont été rapportés pour réaliser la mutagénèse aléatoire à l’échelle du génome des virus à ARN, y compris la PCR sujette aux erreurs (ep-PCR)2,3, l’extension circulaire de la polymérase4 et la mutagénèse par insertion de mu-transposons 5,6,7. Ces deux dernières méthodes permettent d’obtenir des bibliothèques abritant une diversité de séquences limitée et sont sujettes à l’introduction d’insertions et de délétions importantes, qui sont hautement létales pour les virus et limitent considérablement la récupération des variants viraux infectieux.
L’ep-PCR est une technique de mutagenèse puissante bien connue largement utilisée dans l’ingénierie des protéines pour générer des enzymes mutantes pour la sélection de phénotypes ayant les propriétés souhaitées, telles qu’une stabilité thermique améliorée, une spécificité du substrat et une activité catalytique 8,9,10. Cette technique est facile à réaliser car elle nécessite un équipement simple, n’implique pas de manipulations fastidieuses, utilise des réactifs disponibles dans le commerce et est rapide ; De plus, il génère des bibliothèques de haute qualité.
Ici, nous avons développé une nouvelle méthode de synthèse d’ARN mutant pleine longueur (FL-MRS) pour générer des génomes complets du virus de l’hépatite C (VHC) en intégrant l’ep-PCR, qui induit une mutagenèse de substitution aléatoire à l’échelle du génome et une génétique inverse. Même l’insertion ou la délétion d’un seul nucléotide est très délétère pour les virus à ARN à sens positif ([+]ssRNA) ; par conséquent, la mutagenèse de substitution basée sur la PCR est la méthode préférée pour la génération itérative de grandes banques diversifiées de génomes complets de virus à ARN (+)ss avec une bonne viabilité.
FL-MRS est une approche simple qui peut être appliquée à n’importe quel virus à ARN de sens positif avec une longueur de génome de ~10 kb grâce à la conception méticuleuse d’un ensemble d’amorces qui se lie au clone d’ADNc viral. pJFH1 est un clone d’ADNc infectieux qui code pour le génotype 2a du VHC et peut récapituler toutes les étapes du cycle de vie du virus. En utilisant l’approche FL-MRS, nous avons démontré la synthèse de banques de génomes complets mutagènes aléatoirement (banques de mutants [MLs]) pour produire des variants de JFH1 compétents pour la réplication pour lesquels il n’y avait aucune connaissance préalable des propriétés associées aux mutations. Lors de l’exposition à un antiviral, certaines des variantes virales ont rapidement surmonté la pression du médicament avec le changement phénotypique souhaité. En utilisant le protocole décrit ici, une pléthore de variants viraux peuvent être générés, créant des opportunités pour étudier l’évolution des virus à (+)ARNss.
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Protocol
REMARQUE : La souche JFH1 (WT) utilisée ici est un cadeau de Takaji Wakita, de l’Institut national des maladies infectieuses. La lignée cellulaire de l’hépatome humain, Huh7.5, était un cadeau de Charles Rice, de l’Université Rockefeller. Un schéma de la méthode est présenté à la figure 1.
1. Mutagénèse par substitution pangénomique de JFH1 à l’aide de la PCR sujette aux erreurs
- Pour réaliser l’ep-PCR, préparer le mélange maître pour quatre séries d’expériences avec les amorces J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTTGAAAACGACGGC-3' et J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACTACCACTCTC -3' (Figure 1A), ainsi que les composants de réaction décrits dans le tableau 1 sans le modèle pJFH1 (plasmide isolé de la souche JFH1).
- Aliquotez le mélange maître dans quatre tubes, ajoutez 100 ng, 50 ng, 25 ng et 10 ng de matrice dans les tubes individuels et ajustez le volume total de la réaction à 50 μL. Appliquer les conditions de cyclage décrites dans le tableau 2 pour amplifier un fragment de 9736 paires de bases (pb) comprenant le promoteur T7 et le génome complet du VHC (Figure 2).
REMARQUE : Le produit ep-PCR doit contenir la séquence du promoteur T7 pour faciliter la transcription in vitro du génome viral. Par conséquent, l’amorce directe doit être située en amont du promoteur T7 du clone d’ADNc viral, et la séquence d’amorce inverse doit se terminer à l’extrémité 3' du génome du virus pour faciliter l’écoulement de la transcription. Optimisez chaque composant de la réaction ep-PCR dans la plage recommandée par le fabricant de l’ADN polymérase Taq pour obtenir une amplification à haut rendement. En plus des quantités variées de matrices, des dNTP déséquilibrés (en particulier une faible concentration de dATP et/ou de dGTP) peuvent également être utilisés pour augmenter la diversité de la longueur des génomes viraux de 6 à 8 kb de long3. - Estimez le produit ep-PCR amplifié en chargeant des volumes égaux de produits PCR (5 μL) et en les comparant à des quantités connues d’échelle d’ADN de 1 kilobase (kb) en exécutant une électrophorèse sur gel d’agarose à base de tris-acétate-EDTA (TAE) à 0,8 %11. Purifiez le produit à l’aide d’un kit de purification à colonne selon les directives du fabricant.
- Estimer la concentration du produit purifié en mesurant l’absorbance à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume12. Concentrez le produit ep-PCR sous vide si nécessaire pour obtenir une concentration de produit ≥100 ng/μL.
REMARQUE : Une estimation plus précise peut être faite en chargeant des dilutions en série de deux fois du produit ep-PCR et en comparant leurs intensités aux quantités connues de l’échelle d’ADN de 1 kb.
2. Synthèse de l’ARN viral
- Mise en place d’une réaction de 40 μL pour digérer 5 μg de clonal-pJFH1 avec 4 U d’enzyme XbaI à 37 °C pendant 2 h, suivie d’une purification en colonne et d’une mesure de l’absorbance à 260 nm dans un spectrophotomètre à microvolume12. Mettre en place une réaction de transcription in vitro de 20 μL du produit ep-PCR purifié en colonne ou clonal-pJFH1 (WT) à l’aide d’un système de production d’ARN à grande échelle disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
- Dans un tube de microcentrifugation de 200 μL, mélanger environ 1 μg du produit ep-PCR purifié (banques mutantes) ou de la pJFH1 clonale digérée par XbaI , 10 μL de tampon 2x contenant des ribonucléotides et 2 μL de mélange enzymatique T7. Mélangez tous les composants et essorez brièvement les composants. Incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 45 min, suivi de l’ajout de 1 enzyme DNase sans RNase U et de l’incubation à 37 °C pendant 30 min (Figure 1C).
- Purifier l’ARN synthétisé in vitro à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ARN selon les instructions du fabricant, éluer dans 40 μL d’eau exempte de RNase et de DNase, et estimer la concentration de l’ARN purifié en mesurant l’absorbance à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume12. Préparez les aliquotes au besoin (5 μg ou 2 μg) pour éviter le gel-dégel et conservez-les à −80 °C. Vérifier l’intégrité et la taille des transcrits viraux en utilisant 2 μg d’ARN pour une électrophorèse sur gel d’agarose MOPS formaldéhyde0,8 % 13 (Figure 3).
3. Estimation de la proportion de mutations dans les produits ep-PCR (banques mutantes)
NOTA : Dans cette étape, la proportion de nucléotides mutés par sous-clonage du produit obtenu à l’étape 2. a été estimé pour démontrer l’avantage de l’utilisation de l’ep-PCR pour créer une hétérogénéité génétique en utilisant deux banques de mutants du génome complet (ML50 et ML25) et des ARN viraux clonaux dérivés de pJFH1. La proportion de mutations a été estimée dans le gène NS5A du VHC, qui était également le gène phénotypique de lecture (résistance aux médicaments) dans cette étude.
- Mettre en place une réaction de synthèse d’ADNc de 20 μL en ajoutant environ 1 μg de l’ARN viral synthétisé à l’étape 2., 5 μM d’amorce inverse 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3' et 200 U de transcriptase inverse selon les recommandations du fabricant.
- À l’aide de l’ADNc, amplifier un fragment de 2571 pb qui comprend le gène NS5A complet. Pour ce faire, préparer un mélange réactionnel contenant 0,5 μM pour les amorces 5272F et 7848R (concentration finale ; Tableau 3), 1,5 mM de MgCl2, 1 tampon PCR et 1 U de polymérase Taq haute fidélité dans un volume total de 50 μL et exécuter un cycle d’amplification en utilisant les conditions décrites dans le tableau 4.
- Exécutez le produit sur un gel d’agarose à base de TAE à 0,8 % pour confirmer la taille du produit de 2571 pb, puis purifiez le produit à l’aide d’un kit de purification en colonne selon les instructions du fabricant. Éluer le produit purifié en colonne dans 40 μL d’eau stérile.
- Pour ajouter un porte-à-faux de 3' A au produit, ajoutez 0,5 μM de dATP et 1 U d’ADN polymérase Taq basse fidélité et incubez l’ensemble du produit PCR à 70 °C pendant 30 min avec 1x tampon PCR et 1,5 mM MgCl2 (concentration finale). Purifier le mélange à l’aide d’un kit de purification à colonne selon les directives du fabricant
REMARQUE : Vous pouvez également retirer le produit long de ~9,7 ko du gel à partir de l’étape 1.4. et effectuer le clonage à l’aide d’un kit disponible dans le commerce pour le clonage d’un produit à PCR longue conformément aux instructions du fabricant ou effectuer le NGS du produit ep-PCR à l’aide d’une plate-forme Illumina2. - Mettre en place une réaction de ligature en ajoutant 5 μL de tampon de ligature 2x, 50 ng d’ADN vecteur T, environ 3 fois l’excès molaire de l’ADN inséré synthétisé à l’étape 3.4., 3 unités Weiss d’ADN ligase T4 et de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume total de 10 μL. Incuber cette réaction à température ambiante pendant 3 h, puis ajouter 100 μL d’Escherichia coli DH5α avec l’ADN ligaturé ; choc thermique des cellules à 42 °C pendant 35 s (Figure 1B).
- Ajouter 1 mL de milieu Luria-Bertani (LB) (sans antibiotique) et incuber en agitant doucement pendant 1 h à 37 °C pour la récupération. Centrifuger la suspension cellulaire à 13 800 x g, jeter le surnageant et remettre en suspension dans 200 μL de milieu LB frais.
- Plaquer 100 μL de cellules d’E. coli DH5α transformées sur une plaque LB contenant 50 μg/mL d’ampicilline et incuber à 37 °C pendant 16 h. Mettre en place des minipréparations de 25 à 30 colonies dans 5 mL de milieu LB + 50 μg/mL d’ampicilline et cultiver pendant la nuit à 37 °C.
- Le lendemain, extrayez les plasmides à l’aide d’un kit de purification de plasmides selon les instructions du fabricant et effectuez une digestion enzymatique de restriction dans un volume de 10 μL avec 200 ng de plasmides isolés, 2 U d’EcoR1 et 1x tampon de restriction pour toutes les colonies.
- Après avoir incubé les mélanges de digestion à 37 °C pendant 3 h, résolvez les produits sur un gel d’agarose à base de TAE à 0,8 % pour confirmer l’insertion de l’ADN plasmidique.
- Effectuer le séquençage de Sanger des plasmides de 25 clones positifs à l’aide des amorces M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF et 6748-SPF (Tableau 3) pour déterminer la proportion de mutations (exprimée en proportion de nucléotides mutés) dans les ARN viraux dérivés des banques et de la pJFH1 clonale (Figure 1B et Figure 4).
4. Transfection de l’ARN viral de la lignée cellulaire Huh7.5
REMARQUE : Utiliser du matériel de culture tissulaire exempt de RNase/DNase et travailler dans une enceinte de sécurité biologique stérile de classe II. Travailler dans l’installation de confinement recommandée conformément aux lignes directrices de l’organisation en matière de biosécurité.
- Maintenir les cellules Huh7,5 en incubant dans un incubateur à 5 % de CO 2 à 37 °C dans un flacon de culture tissulaire T75 cm2 contenant 15 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) complet de Dulbecco complété par du sérum de veau fœtal à 10 % (vol/vol), de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (100 μg/mL ; Graphique 1D).
- Divisez les cellules dans un rapport de 1 :3 lorsque la confluence atteint 90 %. Lavez les cellules avec 1x solution saline tamponnée au phosphate préchauffée (PBS ; pH 7,4). Ajouter 5 mL de solution 1x trypsine-EDTA pour recouvrir complètement la couche cellulaire, agiter doucement le flacon, puis incuber le flacon à 37 °C pendant 5 min.
REMARQUE : Le temps d’incubation peut varier ; incuber les cellules jusqu’à ce que la couche cellulaire soit complètement détachée de la surface du flacon de culture cellulaire. - Ajouter 10 mL de 1x DMEM complet préchauffé, disperser les cellules par pipetage répété et recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL ou 50 mL. Centrifuger la suspension cellulaire à 252 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 6 mL de DMEM complet et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2.
- Pour un maintien continu des cellules Huh7.5 naïves, transfectées ou infectées par un virus, répétez l’étape 4.2. et l’étape 4.3.
- 1 jour avant la transfection, diviser les cellules comme décrit aux étapes 4.1.-4.3., compter le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre, ensemencer les cellules Huh7.5 à une densité de 0,6 x 106 dans des boîtes de 35 mm dans 2 mL de DMEM complet, et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.
- Le lendemain, préparez le complexe transcription-lipide. Pour ce faire, diluer 10 μL de réactif de transfection dans 50 μL de milieu essentiel minimal, et diluer séparément 5 μg de transcrits viraux dans 50 μL de milieu essentiel minimal.
- Incubez les deux mélanges à température ambiante pendant 10 minutes, puis mélangez-les dans un seul tube de microcentrifugation stérile et incubez à nouveau le mélange à température ambiante pendant 30 minutes pour former le complexe transcription-lipide.
- Après 16 h d’incubation cellulaire, retirez le milieu de culture de la boîte de culture, lavez les cellules 2 fois avec du PBS 1x préchauffé et ajoutez 1,5 mL de milieu essentiel minimal. Ajoutez lentement le complexe transcrit-lipide dans le plat et remuez doucement avec les mains pour assurer une répartition uniforme des complexes.
- Incuber les cellules dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C pendant 10 h. Ensuite, retirez le milieu, lavez les cellules transfectées 2 fois avec 1 mL de PBS 1x préchauffé et ajoutez 2 mL de DMEM complet.
5. Production de virus
- Divisez les cellules Huh7,5 transfectées tous les 2 jours ou 3 jours lorsqu’elles atteignent 90% de confluence. Collectez les surnageants de virus à chaque fractionnement et stockez-les à −80 °C pour une analyse plus approfondie.
- À chaque fractionnement, surveillez la propagation du virus à l’aide d’un test de formation de foyer (FFA) tel que décrit à l’étape 6.2. Récoltez le virus jusqu’à ce que la propagation du virus atteigne >80 % des cellules transfectées (Figure 1D).
REMARQUE : Divisez les cellules transfectées dans un rapport de 1 :1 pour les premiers passages afin de sauver le plus grand nombre de variants viraux. La propagation du virus ralentit et la viabilité diminue avec l’augmentation des proportions de mutations dans les ML du génome complet2.
6. Quantification des titres viraux
- Quantification de l’ARN viral
- Isolez l’ARN viral de 140 μL de surnageants de culture à l’aide d’une trousse d’isolement d’ARN viral selon les instructions du fabricant.
- Mettez en place une réaction qRT-PCR de 10 μL à l’aide d’un kit qRT-PCR commercial selon les instructions du fabricant. Utiliser l’amorce directe R6-130-S17, l’amorce inverse R6-290-R19 (concentration finale de 0,2 μM chacune) et la sonde R9-148-S21FT (concentration finale de 0,3 μM) pour la quantification de l’ARN du VHC (tableau 3). Réglez les conditions de fonctionnement sur 48 °C pendant 20 min, 95 °C pendant 10 min, puis 45 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min.
REMARQUE : La sonde doit contenir le colorant rapporteur fluorescent 6-carboxyfluorescéine (FAM) et le colorant de trempe 6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine (TAMRA) aux extrémités 5' et 3', respectivement. - Exécutez des réactions dans une machine de PCR en temps réel. Mettre en place simultanément des témoins négatifs, c’est-à-dire de l’ARN extrait des surnageants de cellules infectées fictives et de l’eau exempte de nucléase pour garantir l’absence de contamination croisée.
- En parallèle, générer une courbe standard à l’aide d’un nombre de copies connu dilué en série de 10 fois des transcrits du VHC (1 x 10,8 à 0) pour la quantification de l’ARN viral. Effectuez la quantification en trois exemplaires (Figure 1D).
- Quantification du titre du virus infectieux à l’aide d’une dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID50)
- Environ 16 h avant l’ajout du virus, plaquer 6,5 x 103 Huh7,5 cellules/puits dans une plaque de 96 puits et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .
- Dans une armoire de classe de biosécurité II, effectuer 10 dilutions en série (1 mL chacune) couvrant 1 x 10−1 à 1 x 10−6 dilutions (huit dilutions) du virus récolté (obtenues lorsque la propagation du virus atteint >80 % des cellules, comme décrit à l’étape 5). Ajouter 100 μL/puits (avec huit répétitions) du virus dilué pour infecter les cellules Huh7,5 et conserver la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 3 jours.
- Après 3 jours, lavez les cellules infectées 3 fois avec 0,1 mL de PBS à chaque fois, et fixez et perméabilisez les cellules avec 0,1 mL de méthanol glacé à −20 °C pendant 20 min. Lavez les puits avec 1x PBS 3x puis 1x avec PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
- Après avoir retiré le PBS-T, bloquez les cellules pendant 30 minutes à température ambiante avec 0,1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % contenant du lait écrémé à 0,2 % dans du PBST. Retirer la solution bloquante et traiter les cellules pendant 5 min avec 0,1 mL de H 2 O2à 3 % préparé dans 1x PBS.
- Encore une fois, lavez les cellules 2 fois avec 1 x PBS et 1 x avec du PBS-T, puis ajoutez 50 μL/puits d’anticorps monoclonaux anti-NS5A 9E10 (1 :10000, stock 1 mg/mL ; un cadeau aimable de Charles Rice, de l’Université Rockefeller), et incubez à température ambiante pendant 1 h. Lavez à nouveau les puits 3x avec 1x PBS et 1x avec PBS-T.
- Ajouter 50 μL/puits d’IgG secondaires anti-souris de chèvre conjuguées HRP (1 :4000), incuber pendant 30 min à température ambiante, puis retirer l’anticorps non lié en lavant les puits avec 0,1 mL de PBS 1x.
- Ajouter 30 μL de substrat de couleur DAB (tétrachlorhydrate de diaminobenzidine) et incuber la plaque en la balançant doucement pendant 10 min à température ambiante. Le substrat développe un précipité brun à la surface du puits qui indique l’antigène NS5A du VHC. Retirez la solution DAB et lavez les puits 2x avec 1x PBS et 1x avec de l’eau distillée. Ajouter 100 μL de PBS contenant 0,03 % d’azoture de sodium.
- Examinez chaque puits au microscope à lumière inversée à l’aide d’un objectif 10x. Comptez le nombre de puits positifs. Si le puits contient une ou plusieurs cellules NS5A positives, alors il est positif ; si le puits montre une absence de cellules NS5A positives, alors il est négatif. Utiliser un calculateur de Reed et Muench pour estimer la dilution finale qui infecte 50 % des puits (TCID50)14,15. Une inverse de la dilution nécessaire pour obtenir le TCID50 est le titre d’infectivité du virus (unités formant foyers) par unité de volume.
REMARQUE : Les titres d’infectiosité virale varient selon les banques mutantes.
7. Sélection des variants viraux résistants aux médicaments
- Dissoudre le pibrentasvir (PIB), un inhibiteur de la NS5A, dans du DMSO à 100 % jusqu’à une concentration de 1 mM et le diluer davantage dans du DMEM complet jusqu’à une concentration de 10 nM.
- Pour déterminer la concentration efficace de 50 % de PIB, ensemencer des cellules Huh7,5 à une densité de 0,6 x 10 6/puits dans une plaque à6 puits et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 . Après 16 h d’incubation cellulaire, ajouter une dose virale de ML50 ou de virus clonal JFH1 pour infecter 50 % des cellules, puis, 12 h après l’infection (h p.i.), traiter les cellules avec une série de dilution double de PIB allant de 0,5 à 100 pM. Mesurez l’AGL et quantifiez l’UFE comme à l’étape 6.2. après 3 jours d’incubation.
- Tracez les courbes dose-réponse à l’aide des valeurs de dosage de réduction FFU dans un logiciel d’analyse statistique. À partir de la courbe sigmoïdale, obtenir la concentration efficace de 50 % (EC50 ; Graphique 5).
REMARQUE : La plage de concentration efficace peut varier selon la classe, entre les antiviraux anti-VHC de la même classe et selon la bibliothèque de mutants. - Pour l’expérience, infecter des cellules Huh7.5 naïves à 70 % de confluence avec une dose de virus ML50 (variants dérivés de l’ARN ML50) pour infecter 50 % des cellules pendant 12 h, puis transférer les cellules infectées sur des plaques à 6 puits 24 h après l’infection.
- Ajouter 1x EC50 PIB (47,3 pM) aux cellules infectées après 16 h de fractionnement cellulaire. Faites-le après chaque division cellulaire pendant six passages consécutifs (18 jours), suivis de trois cycles de passage sans médicament, et surveillez la propagation du virus à l’aide d’AGL comme décrit à l’étape 6.2. Mise à l’échelle des réactifs FFA en fonction de la zone de croissance. Récoltez les surnageants viraux à chaque passage et conservez-les à −80 °C jusqu’à leur utilisation.
REMARQUE : La propagation virale à plus de 50 % des cellules pendant le suivi du traitement peut être définie comme une percée, et la propagation virale pendant la période d’arrêt du médicament peut être définie comme une rechute virale16. - Extraire l’ARN viral du surnageant au jour 18, comme décrit à l’étape 6.1.1., puis synthétiser l’ADNc, comme indiqué à l’étape 3.1. Amplifier le gène NS5A à l’aide de 5 μL d’ADNc dilué 1 :5 et des composants PCR décrits à l’étape 3.2. Ensuite, suivez les étapes 3.3.-3.5. pour déterminer les mutations de résistance aux médicaments NS5A dans 6 à 8 plasmides bactériens positifs à l’aide des amorces de séquençage NS5A 6186F, 6862F et 6460R (Tableau 3 et Tableau 4).
REMARQUE : Ici, dans cette étude, nous avons rapporté des substitutions dans NS5A de variants sélectionnés pendant le traitement PIB à 1x EC50. Cela permettra d’exclure la contribution des substitutions autres que NS5A à la réduction de la sensibilité au PIB.
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Representative Results
Une pléthore de variants complets du VHC peuvent être générés et dépistés pour les phénotypes résistants aux médicaments d’intérêt en suivant les procédures décrites à la figure 1. Des banques de mutants du génome complet ont été synthétisées à l’aide de clonal-pJFH1 en quantités décroissantes (100-10 ng), comme le montre la figure 2. Les rendements moyens des produits ep-PCR (banques de mutants) variaient de 3,8 à 12,5 ng/μL. La figure 3 montre les transcrits viraux synthétisés à partir de la pJFH1 clonale et de la banque de mutants représentatifs (ML50 synthétisée à l’aide de 50 ng de pJFH1 clonal). Le clonal-pJFH1 a été linéarisé par digestion XbaI , tandis que ML50 a été utilisé directement dans la réaction de transcription in vitro . La proportion de mutations dans les banques mutantes (ARN viraux mutants) augmentait avec la diminution de l’entrée pJFH1 dans la réaction ep-PCR, comme le montre la figure 4. Le ML50 synthétisé à l’aide de 50 ng du modèle (clonal-pJFH1) avait 4 substitutions par 10 000 pb copiés, tandis que le ML25 synthétisé à l’aide de 25 ng de modèle comportait 9 substitutions. Aucune substitution dans le nombre de nucléotides séquencés n’a été trouvée dans le clonal-pJFH1. Les variants viraux ML50 étaient moins sensibles (12,7 fois) au pibrentasvir, un inhibiteur de la NS5A, qu’au virus clonal-JFH1, comme le montre la figure 5. Le tableau 5 présente les substitutions de NS5A identifiées dans les variants viraux ML50 sélectionnés contre 1x EC50 du traitement par pibrentasvir. Sur les huit clones de NS5A, quatre avaient une combinaison de D7V + F28C, tandis que V8A + F28C et F36L se produisaient dans un clone chacun. Ces mutations se trouvaient dans la région N-terminale de NS5A, qui est connue pour abriter des mutations de résistance à NS5A cliniquement pertinentes17.
Figure 1 : Schéma de la stratégie FL-MRS et sélection du phénotype pharmacorésistant. (A) Le clone d’ADNc pJFH1 (de type sauvage) porte un génome complet du virus de génotype 2a et un promoteur T7. L’amorce J-For se trouve en amont du promoteur T7, et l’amorce J-Rev est située à l’extrémité 3' du génome du VHC. (B) Clonal-pJFH1 est mutagène au hasard à l’aide d’une PCR sujette aux erreurs pour modifier les variations génétiques et créer des banques de mutants génomiques complets. Clonal-pJFH1 est linéarisé par digestion XbaI. (C) Les produits ep-PCR du génome complet et la pJFH1 clonale linéarisée sont les modèles de transcription in vitro. La proportion de mutations dans les ARN viraux des MLs et du clonal-JFH1 a été déterminée par le sous-clonage TA de NS5A et le séquençage Sanger des clones TA positifs. (D) Les variants compétents pour la réplication générés après la transfection d’ARN viral mutant de cellules Huh7.5 ont été traités avec du pibrentasvir (un inhibiteur de NS5A) pour la sélection de phénotypes résistants à NS5A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Électrophorèse sur gel d’agarose de produits ep-PCR. Les produits d’ep-PCR du génome complet du VHC synthétisés à l’aide de différentes quantités de matrices (100 ng, 50 ng, 25 ng et 10 ng de pJFH1) ont été séparés à l’aide d’une électrophorèse sur gel d’agarose TAE à 0,8 %. La taille attendue du produit ep-PCR est de 9,7 kb. Les produits séparés ont été visualisés par coloration au bromure d’éthidium. La voie 1 est une échelle d’ADN de 1 kb ; La voie 6 est une voie de contrôle sans gabarit (étiquetée H2O). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Électrophorèse sur gel d’agarose formaldéhyde MOPS des transcrits viraux. La pJFH1 linéarisée (voie 2) et la banque mutante obtenue avec 50 ng (ML50) de pJFH1 contenant de l’ep-PCR (voie 3) ont été utilisées comme modèles pour la réaction de transcription in vitro. L’intégrité des transcrits a été analysée à l’aide d’un gel d’agarose MOPS formaldéhyde à 0,8 % coloré au bromure d’éthidium. La voie 1 est une échelle d’ARN de 1 kb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Proportion de substitutions dans les banques mutantes. Les gènes NS5A des ARN clonaux-pJFH1, ML50 et ML25 ont été amplifiés dans des PCR haute-fidélité, suivis de l’ajout d’un surplomb 3' A, de la ligature du produit avec le vecteur T et de la transformation d’E. coli DH5α avec le produit ligaturé. Environ 40 000 nucléotides/bibliothèque ou clonal-pJFH1 ont été séquencés par Sanger. Une proportion moyenne de mutations pour 10 000 pb copiés est indiquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Estimation de la EC50 du pibrentasvir par rapport aux variants ML50. Les cellules Huh7.5 ont été infectées par le virus clonal-JFH1 ou les variants ML50 et traitées par des dilutions en série de deux fois à partir de 100 pM de pibrentasvir, suivies d’un FFA après 3 jours. Des courbes dose-réponse sigmoïdales utilisant des valeurs de dosage de réduction de FFU ont été tracées dans un logiciel d’analyse statistique pour estimer la concentration efficace de 50 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composants pour 50 μL | Valeur de stock requise | Concentration/réaction finale |
| Tampon PCR 10x | 5,0 μL | 1 fois |
| MgCl2 (50 mM) | 1,5 μL | 1,5 millimètre métrique |
| Extension KB | 2,0 μL | - |
| dNTP (10 mM) | 1,0 μL | 0,2 mM |
| Amorce directe (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Apprêt inversé (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| ADN polymérase Taq (10 U/μL) | 0,5 μL (dilué 1 :4) | 1 U |
| Gabarit (pJFH1, 20 ng/μL) | 0,5 à 5,0 μL | 10 à 100 ng |
| Eau | 32,5 à 37,5 μL | Ajuster pour un volume final de 50 μL |
Tableau 1. Composants Ep-PCR pour l’amplification du génome complet du VHC.
| Température | Heure | Cycle(s) |
| 95 °C | 3 min (en anglais) | 1 |
| 95 °C | 30 secondes | 30 |
| 60 °C | 25 secondes | |
| 72 °C | 8 min (en anglais) | |
| 72 °C | 10 min (en anglais) | 1 |
| 4 °C | Tenir |
Tableau 2. Conditions de cycle pour l’ep-PCR du génome complet du VHC.
| Test | Amorce | Séquence (5'-3') |
| Amplification de NS4B-NS5A partiel-NS5B partielle | N° 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| Synthèse de l’ADNc | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR | R9-148-S21FT (sonde TaqMan) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6-130-S17 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| Réf. R6-290-R19 | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| Amorces de séquençage pour déterminer les proportions de mutations dans les produits ep-PCR | 6208-FPS (FPS) | CCCAACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-FPS | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| Séquençage du gène NS5A (et détermination des proportions de mutations dans les produits ep-PCR) | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
Tableau 3. Amorces et séquences utilisées dans les essais.
| Température | Heure | Cycle(s) |
| 95 °C | 4 min (en anglais) | 1 |
| 95 °C | 30 secondes | 5 |
| 68 °C | 30 secondes | |
| 72 °C | 2 min (en anglais) | |
| 95 °C | 30 secondes | 5 |
| 66 °C | 30 secondes | |
| 72 °C | 2 min (en anglais) | |
| 95 °C | 30 secondes | 5 |
| 64 °C | 30 secondes | |
| 72 °C | 2 min (en anglais) | |
| 95 °C | 30 secondes | 5 |
| 62 °C | 30 secondes | |
| 72 °C | 2 min (en anglais) | |
| 95 °C | 30 secondes | 10 |
| 60 °C | 30 secondes | |
| 72 °C | 2 min (en anglais) | |
| 72 °C | 10 min (en anglais) | 1 |
| 4 °C | Tenir |
Tableau 4. Conditions de cyclage pour l’amplification NS5A.
| Remplacement(s) | Non. Nombre de clones (n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36L | 1 |
Tableau 5. Substitutions de NS5A par résistance au pibrentasvir.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons détaillé une procédure simple et rapide de FL-MRS qui intègre l’ep-PCR18 et la génétique inverse pour synthétiser des banques de génomes complets du VHC, qui peuvent ensuite être utilisées dans un système de culture cellulaire pour générer des variants compétents en réplication pour le criblage de phénotypes résistants aux médicaments. L’utilisation de l’ADN polymérase Taq basse fidélité est une condition préalable à l’ep-PCR qui permet l’incorporation de substitutions lors de l’amplification par PCR d’un génome viral pleine longueur. Nous avons testé plusieurs ADN polymérases Taq basse fidélité et avons constaté que l’ADN polymérase Platinum Taq donnait un produit ep-PCR de taille ~10 kb avec un rendement élevé (données non présentées). Nous recommandons d’utiliser un nombre fixe de cycles thermiques et de faire varier la quantité de modèle d’entrée pour contrôler la proportion de mutations dans les banques de génomes complets. Étant donné que la FL-MRS utilise des génomes complets erronés comme modèles pour les ARN viraux pleine longueur, une conception minutieuse de l’ensemble d’amorces est essentielle pour s’assurer que la réaction de synthèse de l’ARN produit des transcrits viraux de longueur définie : (i) l’amorce directe doit être située en amont (~50 nucléotides) du promoteur T7 du clone d’ADNc pour faciliter la liaison de la polymérase T7 au produit ep-PCR ; et (ii) la séquence d’amorce inverse doit se terminer à l’extrémité 3' du génome du virus pour faciliter l’écoulement de la transcription lors de la synthèse de l’ARN in vitro .
Cependant, la méthode est relativement rudimentaire et il n’y a aucun contrôle sur l’incorporation du nombre et du type requis de substitutions dans les régions d’intérêt du génome. L’un des principaux avantages de la FL-MRS est que les transcrits pleine longueur synthétisés peuvent être directement utilisés pour transfecter les cellules, ce qui rend l’approche simple et efficace pour générer un grand nombre de variants viraux. En revanche, les méthodes d’extension circulaire de la polymérase et de mutagénèse par insertion de mu-transposons nécessitent le clonage du produit de PCR et le criblage des transformants avant la sélection du phénotype souhaité, ce qui limite considérablement la diversité du pool de mutants. Bien que notre méthode augmente considérablement les chances d’obtenir plusieurs phénotypes souhaités, l’évaluation des variantes virales individuelles est normalement requise dans le criblage.
L’intégration de l’ep-PCR à la génétique inverse du virus nous a permis de générer rapidement des mutants du VHC. Cette méthode a le potentiel de générer des centaines de virus génétiquement modifiés, un exploit apparemment impossible avec les techniques de mutagénèse in vitro actuellement disponibles. La méthode détaillée ici est facilement adaptable aux clones d’ADNc porteurs de tout virus à ARNss (+)ss contenant des génomes jusqu’à ~10 kb de longueur.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le financement de cette étude (numéro de subvention BT/PR10906/MED/29/860/2014) a été fourni par le Département de biotechnologie du gouvernement de l’Inde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
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