Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

रिवर्स जेनेटिक्स से मिलेगा पॉजिटिव सेंस आरएनए वायरस वेरिएंट

Published: June 9, 2022 doi: 10.3791/63685
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Virology Section, Department of Life Sciences, Shiv Nadar University, 2Gastroenterology, Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences

Summary

प्रोटोकॉल त्रुटि-प्रवण पीसीआर और रिवर्स जेनेटिक्स का उपयोग करके पूर्ण लंबाई वाले उत्परिवर्ती आरएनए संश्लेषण के संयोजन से हेपेटाइटिस सी वायरस जीनोम में नियंत्रणीय आनुवंशिक विविधता पेश करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विधि फेनोटाइप चयन के लिए एक मॉडल प्रदान करती है और इसका उपयोग 10 केबी लंबे सकारात्मक-सेंस आरएनए वायरस जीनोम के लिए किया जा सकता है।

Abstract

विविध पूर्ण लंबाई वाले वायरल वेरिएंट की पुनरावृत्ति पीढ़ी के लिए एक सुविधाजनक विधि की कमी ने आरएनए वायरस में निर्देशित विकास के अध्ययन को बाधित किया है। एक पूर्ण आरएनए जीनोम त्रुटि-प्रवण पीसीआर और रिवर्स जेनेटिक्स को एकीकृत करके, यादृच्छिक जीनोम-व्यापक प्रतिस्थापन म्यूटेनेसिस को प्रेरित किया जा सकता है। हमने इस तकनीक का उपयोग करके विभिन्न पुस्तकालयों को संश्लेषित करने के लिए एक विधि विकसित की है ताकि रुचि के फेनोटाइप के साथ वायरल म्यूटेंट की पहचान की जा सके। यह विधि, जिसे पूर्ण लंबाई उत्परिवर्ती आरएनए संश्लेषण (एफएल-एमआरएस) कहा जाता है, निम्नलिखित लाभ प्रदान करता है: (i) अत्यधिक कुशल एक-चरण त्रुटि-प्रवण पीसीआर के माध्यम से एक बड़ी लाइब्रेरी बनाने की क्षमता; (ii) डीएनए पोलीमरेज़ की निष्ठा में हेरफेर करके आनुवंशिक विविधता के विभिन्न स्तरों के साथ पुस्तकालयों के समूह बनाने की क्षमता; (iii) एक पूर्ण लंबाई वाले पीसीआर उत्पाद का निर्माण जो सीधे उत्परिवर्ती आरएनए संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में काम कर सकता है; और (iv) आरएनए बनाने की क्षमता जिसे वांछित फेनोटाइप के वायरल उत्परिवर्ती की जांच के लिए गैर-चयनित इनपुट पूल के रूप में मेजबान कोशिकाओं में वितरित किया जा सकता है। हमने रिवर्स जेनेटिक्स दृष्टिकोण का उपयोग करके पाया है कि एफएल-एमआरएस हेपेटाइटिस सी वायरस के जीवन चक्र में सभी चरणों में वायरल-निर्देशित विकास का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण है। यह तकनीक अनुकूलन, प्रतिकृति और सकारात्मक भावना आरएनए वायरस में रोगजनन और एंटीवायरल प्रतिरोध में वायरल जीन की भूमिका को समझने के लिए निर्देशित विकास को नियोजित करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रतीत होती है।

Introduction

फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीनिंग रुचि के वायरल फेनोटाइप से शुरू होती है और फिर, इसके जीनोम को अनुक्रमित करने और मूल तनाव से तुलना करने के माध्यम से, उस फेनोटाइप के कारण उत्परिवर्तन (ओं) की पहचान करने का प्रयास करती है। इसके विपरीत, रिवर्स जेनेटिक स्क्रीन में, एक लक्ष्य जीन में यादृच्छिक उत्परिवर्तन पेश किए जाते हैं, इसके बाद परिणामी फेनोटाइप (एस) 1 की परीक्षा होती है। रिवर्स जेनेटिक्स दृष्टिकोण के लिए, इन विट्रो म्यूटेनेसिस वेरिएंट का एक पूल बनाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है जिसे बाद में रुचि के फेनोटाइप के लिए जांच की जाती है। आरएनए वायरस के जीनोम-वाइड रैंडम म्यूटेनेसिस को प्राप्त करने के लिए विभिन्न आनुवंशिक उपकरणों की सूचना दी गई है, जिसमें त्रुटि-प्रवण पीसीआर (ईपी-पीसीआर) 2,3, सर्कुलर पोलीमरेज़ एक्सटेंशन4, और म्यू-ट्रांसपोसन सम्मिलन म्यूटेनेसिस 5,6,7 शामिल हैं। बाद के दो तरीकों से पुस्तकालयों में सीमित अनुक्रम विविधता होती है और बड़े सम्मिलन और विलोपन की शुरूआत का खतरा होता है, जो वायरस के लिए अत्यधिक घातक होते हैं और संक्रामक वायरल वेरिएंट की वसूली को गंभीर रूप से सीमित करते हैं।

ईपी-पीसीआर एक प्रसिद्ध शक्तिशाली म्यूटेनेसिस तकनीक है जिसका व्यापक रूप से प्रोटीन इंजीनियरिंग में वांछित गुणों के साथ फेनोटाइप के चयन के लिए उत्परिवर्ती एंजाइम उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे कि बढ़ी हुई थर्मल स्थिरता, सब्सट्रेट विशिष्टता और उत्प्रेरक गतिविधि 8,9,10। यह तकनीक प्रदर्शन करना आसान है क्योंकि इसमें सरल उपकरणों की आवश्यकता होती है, इसमें थकाऊ जोड़तोड़ शामिल नहीं है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करता है, और त्वरित है; इसके अलावा, यह उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालय उत्पन्न करता है।

यहां, हमने ईपी-पीसीआर को एकीकृत करके हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) के पूर्ण जीनोम उत्पन्न करने के लिए पूर्ण लंबाई वाले उत्परिवर्ती आरएनए संश्लेषण (एफएल-एमआरएस) के लिए एक नई विधि विकसित की, जो यादृच्छिक जीनोम-वाइड प्रतिस्थापन म्यूटेनेसिस और रिवर्स जेनेटिक्स को प्रेरित करती है। यहां तक कि एक एकल न्यूक्लियोटाइड सम्मिलन या विलोपन सकारात्मक-भावना आरएनए वायरस ([+] एसएसआरएनए) के लिए अत्यधिक हानिकारक है; इसलिए, पीसीआर-आधारित प्रतिस्थापन म्यूटेनेसिस अच्छी व्यवहार्यता के साथ पूर्ण (+) एसएस आरएनए वायरस जीनोम के बड़े, विविध पुस्तकालयों की पुनरावृत्ति पीढ़ी के लिए पसंदीदा तरीका है।

एफएल-एमआरएस एक सीधा दृष्टिकोण है जिसे वायरल सीडीएनए क्लोन को बांधने वाले प्राइमर सेट के सावधानीपूर्वक डिजाइन के माध्यम से ~ 10 केबी जीनोम लंबाई के साथ किसी भी सकारात्मक-भावना आरएनए वायरस पर लागू किया जा सकता है। पीजेएफएच 1 एक संक्रामक सीडीएनए क्लोन है जो एचसीवी जीनोटाइप 2 ए को एन्कोड करता है और वायरस जीवन चक्र के सभी चरणों को पुन: उत्पन्न कर सकता है। एफएल-एमआरएस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हमने प्रतिकृति-सक्षम जेएफएच 1 वेरिएंट का उत्पादन करने के लिए यादृच्छिक रूप से उत्परिवर्तित पूर्ण-जीनोम पुस्तकालयों (उत्परिवर्ती पुस्तकालयों [एमएल]) के संश्लेषण का प्रदर्शन किया, जिसके लिए उत्परिवर्तन से जुड़े गुणों का कोई पूर्व ज्ञान नहीं था। एक एंटीवायरल के संपर्क में आने पर, कुछ वायरल वेरिएंट ने वांछित फेनोटाइपिक परिवर्तन के साथ दवा के दबाव को जल्दी से पार कर लिया। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, वायरल वेरिएंट की अधिकता उत्पन्न की जा सकती है, जिससे (+) एसएसआरएनए वायरस के विकास का अध्ययन करने के अवसर पैदा होते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: यहां इस्तेमाल किया जाने वाला जेएफएच 1 स्ट्रेन (डब्ल्यूटी) ताकाजी वाकिता, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ इन्फेक्शियस डिजीज से एक तरह का उपहार था। मानव हेपेटोमा सेल लाइन, हुह 7.5, चार्ल्स राइस, द रॉकफेलर विश्वविद्यालय से एक तरह का उपहार था। विधि का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है।

1. त्रुटि-प्रवण पीसीआर का उपयोग करके जेएफएच 1 के जीनोम-वाइड प्रतिस्थापन म्यूटेनेसिस।

  1. ईपी-पीसीआर करने के लिए, प्राइमरों जे-फॉर 5'-जीटीटीटीसीसीसीएजीसीएजीसीएजीटीसीजीटीजी-3' और जे-रेव 5'-कैटगैगागासीजीटीएसीजीसीएसीटीसी -3 (चित्रा 1 ए) के साथ प्रयोगों के चार सेटों के लिए मास्टर मिक्स तैयार करें, साथ ही पीजेएफएच 1 टेम्पलेट (जेएफएच 1 स्ट्रेन से अलग प्लाज्मिड) के बिना तालिका 1 में वर्णित प्रतिक्रिया घटकों के साथ।
  2. मास्टर मिश्रण को चार ट्यूबों में विभाजित करें, अलग-अलग ट्यूबों में 100 एनजी, 50 एनजी, 25 एनजी और 10 एनजी टेम्पलेट जोड़ें, और प्रतिक्रिया की कुल मात्रा को 50 μL तक समायोजित करें। तालिका 2 में वर्णित साइक्लिंग स्थितियों को लागू करें ताकि टी 7 प्रमोटर और पूर्ण लंबाई वाले एचसीवी जीनोम (चित्रा 2) वाले 9736 बेस पेयर (बीपी) टुकड़े को बढ़ाया जा सके।
    नोट: वायरल जीनोम के इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन की सुविधा के लिए ईपी-पीसीआर उत्पाद में टी 7 प्रमोटर अनुक्रम होना चाहिए। इसलिए, फॉरवर्ड प्राइमर को वायरल सीडीएनए क्लोन के टी 7 प्रमोटर के अपस्ट्रीम में स्थित होना चाहिए, और रिवर्स प्राइमर अनुक्रम को ट्रांसक्रिप्शन रन-ऑफ की सुविधा के लिए वायरस जीनोम के 3'-अंत में समाप्त होना चाहिए। उच्च उपज प्रवर्धन प्राप्त करने के लिए टैक डीएनए पोलीमरेज़ के निर्माता द्वारा अनुशंसित सीमा के भीतर ईपी-पीसीआर प्रतिक्रिया के प्रत्येक घटक को अनुकूलित करें। विभिन्न टेम्प्लेट मात्राओं के अलावा, असंतुलित डीएनटीपी (विशेष रूप से कम डीएटीपी और / या डीजीटीपी एकाग्रता) का उपयोग वायरल जीनोम की लंबाई में विविधता को 6-8 केबी लंबे3 से बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है।
  3. पीसीआर उत्पादों (5 μL) की समान मात्रा लोड करके और 0.8% ट्रिस-एसीटेट-EDTA (TAE)-आधारित एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन11 चलाकर 1 किलोबेस (केबी) डीएनए सीढ़ी की ज्ञात मात्रा की तुलना करके प्रवर्धित ईपी-पीसीआर उत्पाद का अनुमान लगाएं। निर्माता द्वारा निर्देशित कॉलम शुद्धिकरण किट का उपयोग करके उत्पाद को शुद्ध करें।
  4. माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर12 का उपयोग करके 260 एनएम पर अवशोषण को मापकर शुद्ध उत्पाद की एकाग्रता का अनुमान लगाएं। वैक्यूम ईपी-पीसीआर उत्पाद को केंद्रित करता है यदि उत्पाद एकाग्रता ≥ 100 एनजी / μL प्राप्त करने की आवश्यकता होती है।
    नोट: ईपी-पीसीआर उत्पाद के दो-गुना सीरियल कमजोर पड़ने को लोड करके और 1 केबी डीएनए सीढ़ी की ज्ञात मात्रा में उनकी तीव्रता की तुलना करके अधिक सटीक अनुमान लगाया जा सकता है।

2. वायरल आरएनए संश्लेषण

  1. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक्सबीएआई एंजाइम के 4 यू के साथ क्लोनल-पीजेएफएच 1 के 5 μg को पचाने के लिए 40 μL प्रतिक्रिया सेट करें, इसके बाद कॉलम शुद्धिकरण और माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर12 में 260 एनएम पर अवशोषण को मापना। निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बड़े पैमाने पर आरएनए उत्पादन प्रणाली का उपयोग करके कॉलम-शुद्ध ईपी-पीसीआर उत्पाद या क्लोनल-पीजेएफएच 1 (डब्ल्यूटी) की 20 μL इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया सेट करें।
  2. 200 μL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, शुद्ध ईपी-पीसीआर उत्पाद (उत्परिवर्ती पुस्तकालय) या XBAI पचने वाले क्लोनल-pJFH1 के लगभग 1 μg, राइबोन्यूक्लियोटाइड्स युक्त 2x बफर के 10 μL और T7 एंजाइम मिश्रण के 2 μL को मिलाएं। सभी घटकों को मिलाएं और संक्षेप में घटकों को स्पिन करें। प्रतिक्रिया मिश्रण को 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, इसके बाद 1 यू आरएनएस-मुक्त डीएनएस एंजाइम को जोड़ा जाए और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन जाए (चित्रा 1 सी)।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए क्लीनअप किट का उपयोग करके इन विट्रो संश्लेषित आरएनए को शुद्ध करें, 40 μL RNase- और DNase-मुक्त पानी में विभाजित करें, और माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर12 का उपयोग करके 260 एनएम पर अवशोषण को मापकर शुद्ध आरएनए की एकाग्रता का अनुमान लगाएं। फ्रीज-पिघलने से बचने के लिए आवश्यकतानुसार एलिकोट (5 μg या 2 μg) बनाएं और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एमओपीएस फॉर्मलाडेहाइड 0.8% एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन13 (चित्रा 3) के लिए आरएनए के 2 μg का उपयोग करके वायरल टेप की अखंडता और आकार को सत्यापित करें।

3. ईपी-पीसीआर उत्पादों (उत्परिवर्ती पुस्तकालयों) में उत्परिवर्तन के अनुपात का अनुमान

नोट: इस चरण में, चरण 2 में प्राप्त उत्पाद को उपक्लोन करके न्यूक्लियोटाइड का अनुपात उत्परिवर्तित होता है। दो पूर्ण जीनोम उत्परिवर्ती पुस्तकालयों (एमएल 50 और एमएल 25) और क्लोनल पीजेएफएच 1-व्युत्पन्न वायरल आरएनए का उपयोग करके आनुवंशिक विषमता बनाने के लिए ईपी-पीसीआर को नियोजित करने के लाभ का प्रदर्शन करने का अनुमान लगाया गया था। एचसीवी एनएस 5 ए जीन में उत्परिवर्तन का अनुपात अनुमानित किया गया था, जो इस अध्ययन में फेनोटाइपिक रीडआउट जीन (दवा प्रतिरोध) भी था।

  1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार चरण 2., 5 μM रिवर्स प्राइमर 5'-GTGTACCTAGGTGTGTGCCCTCTA-3', और 200 U रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में संश्लेषित वायरल आरएनए के लगभग 1 μg को जोड़कर 20 μL cDNA संश्लेषण प्रतिक्रिया सेट करें।
  2. सीडीएनए का उपयोग करके, 2571 बीपी टुकड़े को बढ़ाएं जिसमें पूर्ण एनएस 5 ए जीन शामिल है। ऐसा करने के लिए, 5272 एफ और 7848 आर प्राइमरों (अंतिम एकाग्रता) के लिए 0.5 μM युक्त एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। तालिका 3), 1.5 एमएम एमजीसीएल2, 1 एक्स पीसीआर बफर, और 1 यू हाई-फिडेलिटी टैक पोलीमरेज़ 50 μL की कुल मात्रा में और तालिका 4 में वर्णित स्थितियों का उपयोग करके एक प्रवर्धन चक्र चलाते हैं।
  3. 2571 बीपी के उत्पाद आकार की पुष्टि करने के लिए 0.8% टीएई-आधारित एगारोस जेल पर उत्पाद चलाएं और फिर निर्माता द्वारा निर्देशित कॉलम शुद्धिकरण किट का उपयोग करके उत्पाद को शुद्ध करें। 40 μL बाँझ पानी में स्तंभ-शुद्ध उत्पाद का उपयोग करें।
  4. उत्पाद में 3'ए ओवरहैंग जोड़ने के लिए, 0.5 μM dATP और 1U लो-फिडेलिटी टैक डीएनए पोलीमरेज़ जोड़ें और 1x PCR बफर और 1.5 mM MgCl2 (अंतिम एकाग्रता) के साथ 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर पूरे पीसीआर उत्पाद को इनक्यूबेट करें। निर्माता द्वारा निर्देशित कॉलम शुद्धिकरण किट का उपयोग करके मिश्रण को शुद्ध करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, चरण 1.4 से जेल से ~ 9.7 केबी लंबे उत्पाद का उत्पाद शुल्क। और निर्माता के निर्देशों के अनुसार लंबी-पीसीआर उत्पाद की क्लोनिंग के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके क्लोनिंग करें या इलुमिना प्लेटफॉर्म2 का उपयोग करके ईपी-पीसीआर उत्पाद के एनजीएस का प्रदर्शन करें।
  5. चरण 3.4 में संश्लेषित सम्मिलित डीएनए की लगभग 3 गुना अधिकता, T4 DNA लिगेज की 3 वीस इकाइयाँ, और 10 μL की कुल मात्रा में न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़कर एक बंधाव प्रतिक्रिया सेट करें। 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इस प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें और फिर 100 μL के साथ एस्चेरिचिया कोलाई DH5a के 100 μL जोड़ें; 35 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को गर्मी का झटका (चित्रा 1 बी)।
  6. 1 एमएल लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम (एंटीबायोटिक के बिना) जोड़ें और रिकवरी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोमल झटकों के साथ इनक्यूबेट करें। सेल सस्पेंशन को 13,800 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और ताजा एलबी माध्यम के 200 μL में फिर से निलंबित करें।
  7. 50 μg /mL एम्पीसिलिन युक्त एलबी प्लेट पर रूपांतरित E. coli DH5a कोशिकाओं की प्लेट 100 μL और 16 घंटे के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें। 5 एमएल एलबी मध्यम + 50 μg / mL एम्पीसिलिन में 25-30 कॉलोनियों के मिनीप्रेप स्थापित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ें।
  8. अगले दिन, निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लास्मिड शुद्धिकरण किट के साथ प्लास्मिड निकालें और 10 μL मात्रा में पृथक प्लास्मिड के 200 एनजी, इकोआर 1 के 2 यू और सभी कॉलोनियों के लिए 1x प्रतिबंध बफर के साथ प्रतिबंध एंजाइम पाचन करें।
  9. 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पाचन मिश्रण को इंजेक्ट करने के बाद, प्लास्मिड डीएनए सम्मिलन की पुष्टि करने के लिए 0.8% टीएई-आधारित एगारोस जेल पर उत्पादों को हल करें।
  10. पुस्तकालयों और क्लोनल पीजेएफएच 1 (चित्रा 1 बी और चित्रा 4) से प्राप्त वायरल आरएनए में उत्परिवर्तन (उत्परिवर्तित न्यूक्लियोटाइड के अनुपात के रूप में व्यक्त) के अनुपात को निर्धारित करने के लिए एम 13 फॉरवर्ड, एम 13 रिवर्स, 6208-एसपीएफ और 6748-एसपीएफ प्राइमरों (तालिका 3) का उपयोग करके 25 सकारात्मक क्लोनों के प्लास्मिड का सेंगर अनुक्रमण करें।

4. हुह 7.5 सेल लाइन का वायरल आरएनए अभिकर्मक।

नोट: RNase / DNase-मुक्त ऊतक संवर्धन सामग्री का उपयोग करें और बाँझ वर्ग II जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करें। संगठन के जैव सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार अनुशंसित रोकथाम सुविधा में काम करें।

  1. टी 75 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इंजेक्ट करके हुह 7.5 कोशिकाओं को बनाए रखें, जिसमें 15 एमएल पूर्ण डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) के साथ 10% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / एमएल) शामिल हैं; चित्रा 1 डी)।
  2. कोशिकाओं को 1: 3 अनुपात में विभाजित करें जब कंफ्लुएंसी 90% तक पहुंच जाती है। कोशिकाओं को 1x प्रीवार्म्ड फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस; पीएच 7.4) के साथ धोएं। सेल परत को पूरी तरह से कवर करने के लिए 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे से फ्लास्क को घुमाएं, और फिर फ्लास्क को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय भिन्न हो सकता है; कोशिकाओं को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि सेल परत सेल कल्चर फ्लास्क सतह से पूरी तरह से अलग न हो जाए।
  3. 1x प्रीवार्म्ड पूर्ण डीएमईएम के 10 एमएल जोड़ें, बार-बार पाइपिंग करके कोशिकाओं को फैलाएं, और सेल सस्पेंशन को 15 एमएल या 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 252 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, सेल गोली को 6 मिलीलीटर पूर्ण डीएमईएम में पुन: निलंबित करें, और 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. भोले, संक्रमित या वायरस से संक्रमित हुह 7.5 कोशिकाओं के निरंतर रखरखाव के लिए, चरण 4.2 दोहराएं। और चरण 4.3.
  5. अभिकर्मक से 1 दिन पहले, चरण 4.1.-4.3 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को विभाजित करें, हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करें, पूर्ण डीएमईएम के 2 एमएल में 35 मिमी व्यंजनों में 0.6 x 106 के घनत्व पर हुह 7.5 कोशिकाओं को बीज दें, और 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. अगले दिन, प्रतिलेख-लिपिड कॉम्प्लेक्स तैयार करें। ऐसा करने के लिए, न्यूनतम आवश्यक माध्यम के 50 μL में अभिकर्मक अभिकर्मक के 10 μL को पतला करें, और न्यूनतम आवश्यक माध्यम के 50 μL में वायरल टेप के 5 μg को अलग से पतला करें।
  7. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर दोनों मिश्रणों को इनक्यूबेट करें, और फिर उन्हें एक बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाएं और ट्रांसक्रिप्ट-लिपिड कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण को आगे बढ़ाते हैं।
  8. सेल इनक्यूबेशन के 16 घंटे के बाद, कल्चर डिश से कल्चर माध्यम को हटा दें, कोशिकाओं को पहले से गर्म 1x PBS के साथ 2x धो लें, और न्यूनतम आवश्यक माध्यम के 1.5 mL जोड़ें। धीरे-धीरे डिश में ट्रांसक्रिप्ट-लिपिड कॉम्प्लेक्स जोड़ें और कॉम्प्लेक्स के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए हाथों से धीरे से घुमाएं।
  9. 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर, माध्यम को हटा दें, संक्रमित कोशिकाओं को 1 एमएल प्रीवार्म्ड 1 एक्स पीबीएस के साथ 2 x धो लें, और पूर्ण डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें।

5. वायरस का उत्पादन

  1. ट्रांसक्रिप्टेड हुह 7.5 कोशिकाओं को हर 2 दिन या 3 दिन में विभाजित करें जब वे 90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाते हैं। प्रत्येक विभाजन पर वायरस सुपरनैटेंट एकत्र करें और उन्हें आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. प्रत्येक विभाजन में, चरण 6.2 में वर्णित फोकस बनाने वाले परख (एफएफए) का उपयोग करके वायरस के प्रसार की निगरानी करें। वायरस को तब तक काटें जब तक कि वायरस का प्रसार >80% संक्रमित कोशिकाओं तक न पहुंच जाए (चित्रा 1 डी)।
    नोट: वायरल वेरिएंट की अधिकतम संख्या को बचाने के लिए पहले कुछ मार्गों के लिए संक्रमित कोशिकाओं को 1: 1 अनुपात में विभाजित करें। वायरस का प्रसार धीमा हो जाता है और पूर्ण-जीनोम एमएल2 में उत्परिवर्तन के बढ़ते अनुपात के साथ व्यवहार्यता कम हो जाती है।

6. वायरस टिटर्स का परिमाणीकरण

  1. वायरल आरएनए का परिमाणीकरण
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार वायरल आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके 140 μL कल्चर सुपरनैटेंट से वायरल आरएनए को अलग करें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक क्यूआरटी-पीसीआर किट का उपयोग करके 10 μL QRT-PCR प्रतिक्रिया सेट करें। एचसीवी आरएनए परिमाणीकरण के लिए फॉरवर्ड प्राइमर आर 6-130-एस 17, रिवर्स प्राइमर आर 6-290-आर 19 (अंतिम एकाग्रता 0.2 μM प्रत्येक), और जांच R9-148-S21FT (अंतिम एकाग्रता 0.3 μM) का उपयोग करें (तालिका 3)। दौड़ की स्थिति को 20 मिनट के लिए 48 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, और फिर 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 45 चक्र और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के रूप में सेट करें।
      नोट: जांच में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर डाई 6-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन (एफएएम) और बुझाने वाला डाई 6-कार्बोक्सी-टेट्रामिथाइल-रोडामाइन (टीएएमआरए) क्रमशः 5 ' और 3 ' सिरों पर होना चाहिए।
    3. प्रतिक्रियाओं को वास्तविक समय पीसीआर मशीन में चलाएं। क्रॉस-संदूषण की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए एक साथ नकली संक्रमित कोशिकाओं और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के सुपरनैटेंट से निकाले गए आरएनए को नकारात्मक नियंत्रण स्थापित करें।
    4. समानांतर में, वायरल आरएनए की मात्रा का ठहराव के लिए एचसीवी प्रतिलेख (1 x 108 से 0) की 10 गुना क्रमिक रूप से पतला ज्ञात प्रतिलिपि संख्या का उपयोग करके एक मानक वक्र उत्पन्न करें। तीन प्रतियों में परिमाणीकरण करें (चित्रा 1 डी)।
  2. 50% ऊतक संवर्धन संक्रामक खुराक (टीसीआईडी50) का उपयोग करके संक्रामक वायरस टिटर परिमाणीकरण
    1. वायरस को जोड़ने से लगभग 16 घंटे पहले, 96-वेल प्लेट में 6.5 x 103 हुह 7.5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से प्लेट करें और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. एक जैव सुरक्षा वर्ग II कैबिनेट में, काटे गए वायरस के 1 x 10−1 से 1 x 10−6 कमजोर पड़ने (आठ कमजोर पड़ने) को कवर करने वाले 10 गुना सीरियल डाइल्यूशन (1 एमएल प्रत्येक) का प्रदर्शन करें (जब वायरस का प्रसार चरण 5 में वर्णित >80% कोशिकाओं तक पहुंच जाता है)। हुह 7.5 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए पतला वायरस के 100 μL / वेल (आठ प्रतिकृति के साथ) जोड़ें और प्लेट को 3 दिनों के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
    3. 3 दिनों के बाद, संक्रमित कोशिकाओं को हर बार 0.1 एमएल पीबीएस के साथ 3x धोएं, और 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। कुओं को 1x PBS 3x और फिर 1x PBS-T (1x PBS/0.1% [v/v] ट्वीन-20) के साथ धोएं।
    4. पीबीएस-टी को हटाने के बाद, पीबीएसटी में 0.2% स्किम्ड दूध युक्त 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के 0.1 एमएल के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को अवरुद्ध करें। ब्लॉकिंग समाधान को हटा दें और 1x PBS में तैयार 3% H 2 O2के 0.1 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए कोशिकाओं का इलाज करें।
    5. फिर से, कोशिकाओं को 1x PBS और 1x को PBS-T के साथ धोएं, फिर एंटी-NS5A 9E10 mAb (1:10000, स्टॉक 1 mg/mL; चार्ल्स राइस, द रॉकफेलर यूनिवर्सिटी से एक तरह का उपहार) के 50 μL/वेल जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। कुओं को फिर से 1x PBS के साथ 3x और PBS-T के साथ 1x धोएं।
    6. एचआरपी-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस सेकेंडरी आईजीजी (1:4000) के 50 μL / कुएं जोड़ें, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर 1x PBS के 0.1 मिलीलीटर के साथ कुओं को धोकर अनबाउंड एंटीबॉडी को हटा दें।
    7. डीएबी (डायमिनोबेंज़िडीन टेट्राहाइड्रोक्लोराइड) रंग सब्सट्रेट के 30 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कोमल रॉकिंग के साथ प्लेट को इनक्यूबेट करें। सब्सट्रेट अच्छी तरह से सतह पर एक भूरा अवक्षेप विकसित करता है जो एचसीवी एनएस 5 ए एंटीजन को इंगित करता है। डीएबी घोल को निकालें और कुओं को 1x PBS से 2x और आसुत जल से 1x धो लें। 0.03% सोडियम एज़ाइड युक्त पीबीएस के 100 μL जोड़ें।
    8. 10x उद्देश्य का उपयोग करके उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक कुएं की जांच करें। सकारात्मक कुओं की संख्या की गणना करें। यदि कुएं में एक या अधिक एनएस 5 ए-पॉजिटिव कोशिकाएं हैं, तो यह सकारात्मक है; यदि कुआं एनएस 5 ए-पॉजिटिव कोशिकाओं की अनुपस्थिति दिखाता है, तो यह नकारात्मक है। 50% कुओं (टीसीआईडी50)14,15 को संक्रमित करने वाले समापन बिंदु कमजोर पड़ने का अनुमान लगाने के लिए रीड और म्यूंच कैलकुलेटर का उपयोग करें। टीसीआईडी50 प्राप्त करने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने का एक पारस्परिक प्रति यूनिट वॉल्यूम में वायरस संक्रामकता टिटर (फॉसी बनाने वाली इकाइयां) है।
      नोट: वायरस संक्रामकता टिटर्स विभिन्न उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के लिए भिन्न होते हैं।

7. दवा प्रतिरोधी वायरल संस्करण चयन

  1. 100% डीएमएसओ में 1 एमएम की एकाग्रता के लिए एक एनएस 5 ए अवरोधक पिब्रेंटसविर (पीआईबी) को घोलें और इसे 10 एनएम की एकाग्रता तक पूर्ण डीएमईएम में पतला करें।
  2. पीआईबी की 50% प्रभावी सांद्रता निर्धारित करने के लिए, 6-वेल प्लेट में 0.6 x 106/वेल के घनत्व पर हुह 7.5 कोशिकाओं को बीज दें और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। सेल इनक्यूबेशन के 16 घंटे के बाद, 50% कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए एमएल 50 या क्लोनल जेएफएच 1 वायरस की एक वायरस खुराक जोड़ें, और फिर, 12 घंटे के संक्रमण के बाद (एचपी) पर, कोशिकाओं को 0.5-100 पीएम तक पीआईबी की दो गुना कमजोर पड़ने की श्रृंखला के साथ इलाज करें। एफएफए को मापें और चरण 6.2 के रूप में एफएफयू की मात्रा निर्धारित करें। 3 दिन की इनक्यूबेशन के बाद।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एफएफयू-कमी परख मूल्यों का उपयोग करके खुराक-प्रतिक्रिया वक्रों को प्लॉट करें। सिग्मोइडल वक्र से, 50% प्रभावी एकाग्रता प्राप्त करें (ईसी50; चित्रा 5)।
    नोट: प्रभावी एकाग्रता सीमा वर्ग के आधार पर, एक ही वर्ग के एचसीवी एंटीवायरल के बीच और उत्परिवर्ती पुस्तकालय के आधार पर भिन्न हो सकती है।
  4. प्रयोग के लिए, 12 घंटे के लिए 50% कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए एमएल 50 वायरस (एमएल 50 आरएनए से प्राप्त वेरिएंट) खुराक के साथ 70% संगम पर भोले हुह 7.5 कोशिकाओं को संक्रमित करें, और फिर संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमण के 24 घंटे बाद 6-वेल प्लेटों पर स्थानांतरित करें।
  5. सेल विभाजन के 16 घंटे के बाद संक्रमित कोशिकाओं में 1x EC50 PIB (47.3 pM) जोड़ें। प्रत्येक कोशिका को लगातार छह मार्ग (18 दिनों) के लिए विभाजित करने के बाद ऐसा करें, इसके बाद तीन दवा-मुक्त मार्ग चक्र हों, और चरण 6.2 में वर्णित एफएफए का उपयोग करके वायरस प्रसार की निगरानी करें। विकास क्षेत्र के अनुसार स्केल-अप एफएफए अभिकर्मक। प्रत्येक मार्ग पर वायरल सुपरनैटेंट की कटाई करें और उपयोग तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: उपचार अनुवर्ती के दौरान 50% से अधिक कोशिकाओं में वायरल प्रसार को एक सफलता के रूप में परिभाषित किया जा सकता है, और दवा वापसी अवधि के दौरान वायरल प्रसार को वायरल रिलैप्स16 के रूप में परिभाषित किया जा सकता है।
  6. चरण 6.1.1 में वर्णित 18 वें दिन सतह पर तैरनेवाले से वायरल आरएनए निकालें, और फिर सीडीएनए को संश्लेषित करें, जैसा कि चरण 3.1 में दिखाया गया है। 1: 5 पतला सीडीएनए के 5 μL और चरण 3.2 में वर्णित पीसीआर घटकों का उपयोग करके NS5A जीन को बढ़ाएं। उसके बाद, चरण 3.3.-3.5 का पालन करें। एनएस 5 ए अनुक्रमण प्राइमर 6186 एफ, 6862 एफ और 6460 आर (तालिका 3 और तालिका 4) का उपयोग करके 6-8 सकारात्मक जीवाणु प्लास्मिड में एनएस 5 ए दवा प्रतिरोध उत्परिवर्तन निर्धारित करने के लिए।
    नोट: यहां इस अध्ययन में, हमने 1x EC50 पर PIB उपचार के दौरान चयनित वेरिएंट के NS5A में प्रतिस्थापन की सूचना दी। यह पीआईबी के लिए कम संवेदनशीलता में एनएस 5 ए के अलावा अन्य प्रतिस्थापनों के योगदान को खारिज कर देगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद पूर्ण लंबाई वाले एचसीवी वेरिएंट की अधिकता उत्पन्न की जा सकती है और दवा प्रतिरोधी फेनोटाइप के लिए जांच की जा सकती है। पूर्ण जीनोम उत्परिवर्ती पुस्तकालयों को क्लोनल-पीजेएफएच 1 का उपयोग करके घटती मात्रा (100-10 एनजी) में संश्लेषित किया गया था, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। ईपी-पीसीआर उत्पादों (उत्परिवर्ती पुस्तकालयों) की औसत पैदावार 3.8-12.5 एनजी / μL तक थी। चित्रा 3 क्लोनल-pJFH1 और प्रतिनिधि उत्परिवर्ती पुस्तकालय (ML50 को क्लोनल-pJFH1 के 50 ng का उपयोग करके संश्लेषित) से संश्लेषित वायरल प्रतिलेख दिखाता है। क्लोनल-पीजेएफएच 1 को एक्सबीएआई पाचन के माध्यम से रैखिक किया गया था, जबकि एमएल 50 का उपयोग सीधे इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया में किया गया था। उत्परिवर्ती पुस्तकालयों (उत्परिवर्ती वायरल आरएनए) में उत्परिवर्तन का अनुपात ईपी-पीसीआर प्रतिक्रिया में घटते इनपुट पीजेएफएच 1 के साथ बढ़ गया, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। एमएल 50 को टेम्पलेट के 50 एनजी (क्लोनल-पीजेएफएच 1) का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था, जिसमें प्रति 10,000 बीपी कॉपी किए गए 4 प्रतिस्थापन थे, जबकि एमएल 25 को 25 एनजी टेम्पलेट का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। क्लोनल-पीजेएफएच 1 में अनुक्रमित न्यूक्लियोटाइड ्स की संख्या के भीतर कोई प्रतिस्थापन नहीं पाया गया। एमएल 50 वायरल वेरिएंट क्लोनल-जेएफएच 1 वायरस की तुलना में एक एनएस 5 ए अवरोधक पिब्रेंटसविर के लिए कम संवेदनशील (12.7 गुना) थे, जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है। तालिका 5 में एमएल 50 वायरल वेरिएंट में पहचाने गए एनएस 5 ए प्रतिस्थापन हैं, जिन्हें पिब्रेंटसविर उपचार के 1 एक्स ईसी50 के मुकाबले चुना गया है। आठ एनएस 5 ए क्लोनों में से चार में डी 7 वी + एफ 28 सी का संयोजन था, जबकि वी 8 ए + एफ 28 सी और एफ 36 एल एक-एक क्लोन में हुआ था। ये उत्परिवर्तन एनएस 5 ए के एन-टर्मिनस क्षेत्र में थे, जिसे नैदानिक रूप से प्रासंगिक एनएस 5 ए-प्रतिरोध उत्परिवर्तन17 के लिए जाना जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एफएल-एमआरएस रणनीति और दवा प्रतिरोधी फेनोटाइप चयन का योजनाबद्ध। (ए) पीजेएफएच 1 सीडीएनए (जंगली-प्रकार) क्लोन में एक पूर्ण लंबाई जीनोटाइप 2 ए वायरस जीनोम और टी 7 प्रमोटर होता है। प्राइमर जे-फॉर टी 7 प्रमोटर के अपस्ट्रीम है, और प्राइमर जे-रेव एचसीवी जीनोम के 3 'छोर पर स्थित है। (बी) क्लोनल-पीजेएफएच 1 को आनुवंशिक विविधताओं को इंजीनियर करने और पूर्ण जीनोम उत्परिवर्ती पुस्तकालयों को बनाने के लिए त्रुटि-प्रवण पीसीआर का उपयोग करके यादृच्छिक रूप से उत्परिवर्तित किया जाता है। क्लोनल-पीजेएफएच 1 एक्सबीएआई पाचन द्वारा रैखिक है। (सी) पूर्ण-जीनोम ईपी-पीसीआर उत्पाद और रैखिक क्लोनल-पीजेएफएच 1 इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए टेम्पलेट हैं। एमएल और क्लोनल-जेएफएच 1 के वायरल आरएनए में उत्परिवर्तन का अनुपात एनएस 5 ए की टीए सबक्लोनिंग और सकारात्मक टीए क्लोन के सेंगर अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया गया था। (डी) एनएस 5 ए-प्रतिरोधी फेनोटाइप ्स के चयन के लिए हुह 7.5 कोशिकाओं के उत्परिवर्ती वायरल आरएनए अभिकर्मक के बाद उत्पन्न प्रतिकृति-सक्षम वेरिएंट का इलाज पिब्रेंटासविर (एक एनएस 5 ए अवरोधक) के साथ किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ईपी-पीसीआर उत्पादों के एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन। अलग-अलग टेम्प्लेट मात्रा (100 एनजी, 50 एनजी, 25 एनजी, और 10 एनजी पीजेएफएच 1) का उपयोग करके संश्लेषित एचसीवी पूर्ण-जीनोम ईपी-पीसीआर उत्पादों को 0.8% टीएई एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके अलग किया गया था। ईपी-पीसीआर उत्पाद का अपेक्षित आकार 9.7 केबी है। अलग किए गए उत्पादों को एथिडियम ब्रोमाइड धुंधला होने से देखा गया था। लेन 1 एक 1 केबी डीएनए सीढ़ी है; लेन 6 नो-टेम्प्लेट नियंत्रण है (एच2ओ के रूप में लेबल किया गया है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: वायरल टेप के एमओपीएस फॉर्मलाडेहाइड एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन। रैखिक पीजेएफएच 1 (लेन 2) और ईपी-पीसीआर (लेन 3) युक्त पीजेएफएच 1 के 50 एनजी (एमएल 50) के साथ प्राप्त उत्परिवर्ती लाइब्रेरी का उपयोग इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में किया गया था। प्रतिलिपियों की अखंडता का विश्लेषण एथिडियम ब्रोमाइड से सना एमओपीएस फॉर्मलाडेहाइड 0.8% एगारोस जेल का उपयोग करके किया गया था। लेन 1 एक 1 केबी आरएनए सीढ़ी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: उत्परिवर्ती पुस्तकालयों में प्रतिस्थापन का अनुपात। क्लोनल-पीजेएफएच1, एमएल50 और एमएल25 के आरएनए से एनएस5ए जीन को हाई-फिडेलिटी पीसीआर में प्रवर्धित किया गया, इसके बाद 3'ए ओवरहैंग को जोड़ा गया, टी-वेक्टर के साथ उत्पाद का बंधाव किया गया, और लिगेटेड उत्पाद के साथ ई. कोलाई डीएच5ए का रूपांतरण किया गया। लगभग 40,000 न्यूक्लियोटाइड/लाइब्रेरी या क्लोनल-पीजेएफएच 1 सेंगर अनुक्रमित थे। कॉपी किए गए प्रति 10,000 बीपी उत्परिवर्तन का औसत अनुपात दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एमएल 50 वेरिएंट के खिलाफ पिब्रेंटसविर के ईसी50 का अनुमान। हुह 7.5 कोशिकाओं को क्लोनल-जेएफएच 1 वायरस या एमएल 50 वेरिएंट से संक्रमित किया गया था और 100 पीएम पिब्रेंटसविर से शुरू होने वाले सीरियल दो गुना कमजोर पड़ने के साथ इलाज किया गया था, इसके बाद 3 दिनों के बाद एफएफए किया गया था। 50% प्रभावी एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एफएफयू-कमी परख मूल्यों का उपयोग करके सिग्मोइडल खुराक-प्रतिक्रिया वक्र ों को प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

50 μL के लिए घटक आवश्यक स्टॉक मान अंतिम एकाग्रता / प्रतिक्रिया
10x PCR बफर 5.0 μL 1x
MgCl2 (50 mM) 1.5 μL 1.5 mM
KB विस्तारक 2.0 μL -
dNTP (10 mM) 1.0 μL 0.2 mM
फॉरवर्ड प्राइमर (10 μM) 1.0 μL 0.2 μM
रिवर्स प्राइमर (10 μM) 1.0 μL 0.2 μM
टैक डीएनए पोलीमरेज़ (10 यू / 0.5 μL (1:4 पतला) 1 यू
टेम्पलेट (pJFH1, 20 ng/μL) 0.5 से 5.0 μL 10 से 100 एनजी
पानी 32.5 से 37.5 μL 50 μL की अंतिम मात्रा के लिए समायोजित करें

तालिका 1. एचसीवी पूर्ण जीनोम के प्रवर्धन के लिए ईपी-पीसीआर घटक।

तापमान समय चक्र(ओं)
95 °C 3 मिनट 1
95 °C 30 सेकंड 30
60 °C 25 सेकंड
72 °C 8 मिनट
72 °C 10 मिनट 1
4 °C पकड

तालिका 2. एचसीवी पूर्ण जीनोम के ईपी-पीसीआर के लिए साइकिल िंग की स्थिति।

जाँच प्राइमर अनुक्रम (5'-3')
आंशिक NS4B-NS5A-आंशिक NS5B का प्रवर्धन 5272F TGGCCCAAAGTGGAAATTTTGG
7848R GGCCATTTTCTCGCACCGGAC
सीडीएनए संश्लेषण 9464R GTGTACCTGTGTGTGCCGCTA
QRT-PCR R9-148-S21FT (TaqMan probe) CTGCGGAACCGGTGAGTACAC
R6-130-S17 सीजीजीजीएसीटीजी।
R6-290-R19 AGTACCACAAGGCCTTTCG
ईपी-पीसीआर उत्पादों में उत्परिवर्तन के अनुपात को निर्धारित करने के लिए अनुक्रमण प्राइमरों 6208-एसपीएफ CCCAACTTTGGCTCTCTAC
6748-एसपीएफ GACGGTGTGCAGATCCATAG
एनएस 5 ए जीन अनुक्रमण (और ईपी-पीसीआर उत्पादों में उत्परिवर्तन के अनुपात को निर्धारित करने के लिए) 6186F CAACGCAGAACGAGACCtcatccc
6862F GACCTTTTCCTATCAATTGCTACAC
6460R TGGGCGGCCTGACTACAA

तालिका 3. परख में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर और अनुक्रम।

तापमान समय चक्र(ओं)
95 °C 4 मिनट 1
95 °C 30 सेकंड 5
68 °C 30 सेकंड
72 °C 2 मिनट
95 °C 30 सेकंड 5
66 °C 30 सेकंड
72 °C 2 मिनट
95 °C 30 सेकंड 5
64 °C 30 सेकंड
72 °C 2 मिनट
95 °C 30 सेकंड 5
62 °C 30 सेकंड
72 °C 2 मिनट
95 °C 30 सेकंड 10
60 °C 30 सेकंड
72 °C 2 मिनट
72 °C 10 मिनट 1
4 °C पकड

तालिका 4. एनएस 5 ए प्रवर्धन के लिए साइकिल चलाने की स्थिति।

प्रतिस्थापन (ओं) नहीं। क्लोन की संख्या (एन = 6)।
D7V+F28C 4
V8A+F28C 1
F36L 1

तालिका 5. "एनएस 5 ए के पिब्रेंटसविर-प्रतिरोध प्रतिस्थापन"।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस अध्ययन में, हमने एक सरल और तेजी से एफएल-एमआरएस प्रक्रिया का विस्तार किया है जो एचसीवी पूर्ण-जीनोम पुस्तकालयों को संश्लेषित करने के लिए ईपी-पीसीआर18 और रिवर्स जेनेटिक्स को एकीकृत करता है, जिसका उपयोग तब दवा प्रतिरोधी फेनोटाइप की स्क्रीनिंग के लिए प्रतिकृति-सक्षम वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए सेल कल्चर सिस्टम में किया जा सकता है। कम-निष्ठा टैक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग ईपी-पीसीआर की एक शर्त है जो पूर्ण लंबाई वाले वायरल जीनोम के पीसीआर प्रवर्धन के दौरान प्रतिस्थापन को शामिल करने की अनुमति देता है। हमने कई कम-निष्ठा वाले टैक डीएनए पोलीमरेज़ का परीक्षण किया और पाया कि प्लैटिनम टैक डीएनए पोलीमरेज़ ने उच्च उपज (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ ~ 10 केबी आकार का ईपी-पीसीआर उत्पाद प्राप्त किया। हम पूर्ण-जीनोम पुस्तकालयों में उत्परिवर्तन के अनुपात को नियंत्रित करने के लिए थर्मल चक्रों की एक निश्चित संख्या का उपयोग करने और इनपुट टेम्पलेट राशि को बदलने की सलाह देते हैं। चूंकि एफएल-एमआरएस पूर्ण लंबाई वाले वायरल आरएनए के लिए टेम्प्लेट के रूप में गलत पूर्ण जीनोम का उपयोग करता है, इसलिए प्राइमर सेट का सावधानीपूर्वक डिजाइन यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि आरएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया परिभाषित लंबाई के वायरस प्रतिलेख उत्पन्न करती है: (i) आगे प्राइमर को ईपी-पीसीआर उत्पाद के लिए टी 7 पोलीमरेज़ बाइंडिंग की सुविधा के लिए सीडीएनए क्लोन के टी 7 प्रमोटर के अपस्ट्रीम (~ 50 न्यूक्लियोटाइड) स्थित होना चाहिए; और (ii) इन विट्रो आरएनए संश्लेषण के दौरान प्रतिलेखन अपवाह की सुविधा के लिए रिवर्स प्राइमर अनुक्रम वायरस जीनोम के 3 'अंत में समाप्त होना चाहिए।

हालांकि, विधि अपेक्षाकृत कच्ची है, और जीनोम में रुचि के क्षेत्रों में आवश्यक संख्या और प्रतिस्थापन के प्रकार को शामिल करने पर कोई नियंत्रण नहीं है। एफएल-एमआरएस का एक बड़ा लाभ यह है कि संश्लेषित पूर्ण लंबाई वाले प्रतिलेख का उपयोग सीधे कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है, जो वायरल वेरिएंट के एक बड़े पूल को उत्पन्न करने के लिए दृष्टिकोण को सरल और कुशल बनाता है। इसके विपरीत, सर्कुलर पोलीमरेज़ एक्सटेंशन और म्यू-ट्रांसपोसन सम्मिलन म्यूटेनेसिस विधियों के लिए वांछित फेनोटाइप के चयन से पहले पीसीआर उत्पाद की क्लोनिंग और ट्रांसफॉर्मेंट्स की स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है, जो उत्परिवर्ती के पूल की विविधता को गंभीर रूप से सीमित करता है। यद्यपि हमारी विधि कई वांछित फेनोटाइप ्स देने की संभावना को बढ़ाती है, व्यक्तिगत वायरल वेरिएंट का मूल्यांकन आमतौर पर स्क्रीनिंग में आवश्यक होता है।

वायरस रिवर्स जेनेटिक्स के साथ ईपी-पीसीआर के एकीकरण ने हमें एचसीवी उत्परिवर्ती को जल्दी से उत्पन्न करने की अनुमति दी। इस विधि में सैकड़ों आनुवंशिक रूप से संशोधित वायरस उत्पन्न करने की क्षमता है, एक उपलब्धि जो वर्तमान में उपलब्ध इन विट्रो म्यूटेनेसिस तकनीकों के साथ संभव नहीं है। यहां विस्तृत विधि किसी भी (+) एसएसआरएनए वायरस को ले जाने वाले सीडीएनए क्लोन के लिए आसानी से अनुकूलनीय है जिसमें लंबाई में ~ 10 केबी तक जीनोम होते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन के लिए वित्त पोषण सहायता (अनुदान संख्या बीटी/PR10906/एमईडी/29/860/2014) जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb plus DNA ladder  Thermo Fisher 10787018
1.5 ml centrifuge tube Tarsons 500010
15 ml centrifuge tube Tarsons 546021
35 mm cell culture dish  Tarsons 960010
50 ml centrifuge tube Tarsons 546041
Acetic acid Merck A6283
Agarose  HiMedia MB080
Agrose gel electrophoresis unit BioRad 1704406
Biosafety Cabinet, ClassII ESCO AC2 4S
Bovine serum albumin HiMedia MB083
Centrifuge  Eppendorf 5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Cloning plates 90 mm  Tarson 460091
CO2 Incubator  New Brunswick Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer Titertek-Berthold 11050140
DAB Substrate Kit  Abcam ab94665
dATP Solution NEB N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set NEB N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)  SRL chemical 46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO) HiMedia MB058
DMEM high glucose Lonza BE12-604F
EcoR1-HF NEB R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate HiMedia GRM4918
Ethidium Bromide Amresco X328
Fetal bovine serum  Gibco 26140079
Formaldehyde  Fishser Scientific 12755
Gel Documentation System ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo Fisher A16066
Hydrogen peroxide 30% Merck 107209
Inverted microscope Nickon  ECLIPSE Ts2
LB broth  HiMedia M1245
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 116680270 transfection reagent
Mechanical Pipette Set Eppendorf   3120000909
Methanol Merck 106009
Micro Tips 0.2-10 µl  Tarsons 521000
Micro Tips 10 - 100 µl  Tarsons 521010
Micro Tips 200-1000 µl  Tarsons 521020
MOPS buffer  GeNei 3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA) Gibco 11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010 E.coli DH5α
Opti-MEM Gibco 1105-021 minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml Tarsons 510051
Pencillin/streptomycin  Gibco 15070063
pGEM-T Easy Vector System Promega A1360 T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS) HiMedia TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
Pibrentasvir Cayman Chemical 27546
Pipette controller  Gilson  F110120
Platinum Taq DNA Polymerase  Thermo 10966034
Prism GraphPad statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit  Qiagen 52904 viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104 cokum purification kit
RNeasy Mini Kit  QIAGEN 74104 RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml Thermo Fisher 170357N
Serological Pipettes 5 ml Thermo Fisher 170355N
Serological Pipettes10 ml Thermo Fisher 170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb Merck R7020
Skim milk  HiMedia M530
Sodium azide 0.1 M solution Merck 8591
SuperScript III Reverse Transcriptase  Invitrogen 18080044 reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096
T175 cell culture flask  Tarsons 159910
T25 cell culture flask  Tarsons 950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System  Promega P1320  Large Scale RNA Production System 
T75 cell culture flask  Tarsons 950050
Taq DNA Polymerase Genetix Biotech (Puregene) PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit Thermo Fisher 4392653 commercial qRT-PCR kit 
TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit Thermo Fisher K8050-10 kit for cloning of long-PCR product 
Tris base HiMedia TC072
Trypsin-EDTA solution HiMedia TCL007
Tween 20 HiMedia MB067
Vacuum Concentrator  Eppendorf, Concentrator Plus 100248
Water bath  GRANT JBN-18
Xba1 NEB R0145S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
  2. Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
  3. Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
  4. Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
  5. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
  6. Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
  7. Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
  8. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  9. Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
  10. Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
  11. Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
  12. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
  13. Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
  14. Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
  15. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
  16. Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
  17. Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
  18. Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).

Tags

रिवर्स जेनेटिक्स पॉजिटिव-सेंस आरएनए वायरस वेरिएंट डायरेक्टेड इवोल्यूशन आरएनए जीनोम एरर-प्रोन पीसीआर वायरल म्यूटेंट फेनोटाइप्स ऑफ इंटरेस्ट फुल-लेंथ म्यूटेंट आरएनए सिंथेसिस (एफएल-एमआरएस) लाइब्रेरी जेनेटिक डाइवर्सिटी डीएनए पोलीमरेज़ फिडेलिटी टेम्प्लेट म्यूटेंट आरएनए सिंथेसिस होस्ट सेल नॉन-सेलेक्टेड इनपुट पूल वायरल-डायरेक्टेड इवोल्यूशन हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) जेएफएच1 आइसोलेट एडाप्टेशन रेप्लिकेशन वायरल जीन पैथोजेनेसिस एंटीवायरल रेजिस्टेंस।
रिवर्स जेनेटिक्स से मिलेगा पॉजिटिव सेंस आरएनए वायरस वेरिएंट
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soni, S., Agarwal, S., Aggarwal, R., … More

Soni, S., Agarwal, S., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants. J. Vis. Exp. (184), e63685, doi:10.3791/63685 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter