Summary
プロトコルは間違いが傾向があるPCRおよび逆の遺伝学を使用して完全長の突然変異体のRNAの統合の結合によって肝炎のウイルスのゲノムの制御可能な遺伝の多様性をもたらすための方法を記述する。この方法は、表現型選択のモデルを提供し、長さ10 kbのポジティブセンスRNAウイルスゲノムに使用できます。
Abstract
多様な完全長ウイルス変異体を繰り返し生成するための便利な方法の欠如は、RNAウイルスの指向性進化の研究を妨げてきました。フルRNAゲノムエラーを起こしやすいPCRとリバースジェネティクスを統合することで、ランダムなゲノムワイドな置換突然変異誘発を誘導することができます。私たちは、この手法を用いて多様なライブラリを合成し、目的の表現型を持つウイルス変異体を同定する方法を開発しました。完全長変異体RNA合成(FL-MRS)と呼ばれるこの方法は、次の利点を提供します:(i)非常に効率的なワンステップエラーを起こしやすいPCRを介して大規模なライブラリを作成する能力。(ii)DNAポリメラーゼの忠実度を操作することにより、さまざまなレベルの遺伝的多様性を有するライブラリのグループを作成する能力。(iii)変異体RNA合成の鋳型として直接役立つことができる完全長PCR産物の作成。(iv)所望の表現型のウイルス変異体をスクリーニングするための非選択インプットプールとして宿主細胞に送達できるRNAを作製する能力。我々は、逆遺伝学アプローチを用いて、FL-MRSがC型肝炎ウイルスであるJFH1分離株のライフサイクルのすべての段階でウイルス指向性進化を研究するための信頼できるツールであることを発見しました。この手法は、ポジティブセンスRNAウイルスの病因と抗ウイルス耐性における適応、複製、およびウイルス遺伝子の役割を理解するために、指向性進化を採用するための非常に貴重なツールであるように思われます。
Introduction
フォワード遺伝子スクリーニングは、目的のウイルス表現型から始まり、そのゲノム配列を決定し、元の株と比較することで、その表現型の原因となる変異を特定しようとします。対照的に、逆遺伝子スクリーニングでは、標的遺伝子にランダムな変異を導入し、その後、結果として生じる表現型を調べます1。リバースジェネティクスアプローチでは、in vitro突然変異誘発は、その後、関心のある表現型についてスクリーニングされるバリアントのプールを作成するために最も広く使用されている手法です。RNAウイルスのゲノムワイドなランダム突然変異誘発を実現するために、エラーを起こしやすいPCR(ep-PCR)2,3、環状ポリメラーゼ伸長4、ミュートランスポゾン挿入突然変異誘発5,6,7など、さまざまな遺伝的ツールが報告されています。後者の2つの方法では、配列の多様性が限られており、大きな挿入や欠失が発生しやすく、ウイルスにとって致死性が高く、感染性ウイルス変異体の回復を著しく制限します。
ep-PCRは、熱安定性、基質特異性、触媒活性の向上など、所望の特性を持つ表現型を選択するための変異酵素を生成するために、タンパク質工学で広く使用されている有名な強力な突然変異誘発技術です8,9,10。この手法は、簡単な機器を必要とし、面倒な操作を必要とせず、市販の試薬を使用し、迅速であるため、実行が簡単です。さらに、高品質のライブラリを生成します。
本研究では、ゲノムワイドなランダム置換突然変異誘発とリバースジェネティクスを誘導するep-PCRを組み込んで、C型肝炎ウイルス(HCV)の全ゲノムを作製する完全長変異RNA合成法(FL-MRS)を開発しました。単一のヌクレオチドの挿入または欠失でさえ、ポジティブセンスRNAウイルス([+]ssRNA)にとって非常に有害です。したがって、PCRベースの置換突然変異誘発は、生存率の良いフル(+)ssRNAウイルスゲノムの大規模で多様なライブラリを繰り返し生成するための好ましい方法です。
FL-MRSは、ウイルスcDNAクローンに結合するプライマーセットの細心の注意を払った設計により、ゲノム長が~10 kbのポジティブセンスRNAウイルスに適用できる簡単なアプローチです。pJFH1は、HCV遺伝子型2aをコードする感染性cDNAクローンであり、ウイルスライフサイクルのすべてのステップを再現することができます。FL-MRSアプローチを用いて、ランダムに変異原化された全ゲノムライブラリー(変異体ライブラリー[ML])を合成し、変異に関連する特性に関する予備知識がなかった複製能力のあるJFH1変異体を作製することを実証しました。抗ウイルス薬に曝露すると、一部のウイルス変異体は、望ましい表現型の変化により、薬剤圧力を迅速に克服しました。ここで説明するプロトコルを使用すると、多数のウイルス変異体を生成することができ、(+)ssRNAウイルスの進化を研究する機会が生まれます。
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Protocol
(注)ここで使用したJFH1株(WT)は、国立感染症研究所の脇田隆治さんからのご厚意によるものです。ヒト肝細胞腫細胞株Huh7.5は、ロックフェラー大学のチャールズ・ライスからの親切な贈り物でした。この方法の概略図を 図1に示します。
1. エラーを起こしやすいPCRを用いたJFH1のゲノムワイド置換突然変異誘発
- ep-PCRを実施するには、プライマーJ-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3'およびJ-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3'(図1A)と、表 1 に記載の反応成分をpJFH1テンプレート(JFH1株から単離したプラスミド)を含まない状態で、4セットの実験用のマスターミックスを調製します。
- マスターミックスを 4 本のチューブに分注し、100 ng、50 ng、25 ng、10 ng のテンプレートを個々のチューブに加え、反応液の総容量を 50 μL に調整します。 表 2 に記載のサイクリング条件を適用して、T7 プロモーターと完全長 HCV ゲノムからなる 9736 塩基対(bp)フラグメントを増幅します(図 2)。
注:ep-PCR産物には、ウイルスゲノムの in vitro 転写を容易にするために、T7プロモーター配列が含まれている必要があります。したがって、フォワードプライマーはウイルスcDNAクローンのT7プロモーターの上流に位置しなければならず、リバースプライマー配列は転写流出を促進するためにウイルスゲノムの3'末端で終端する必要があります。Taq DNAポリメラーゼのメーカーが推奨する範囲内でep-PCR反応の各成分を最適化し、高収量増幅を実現します。さまざまなテンプレート量に加えて、不均衡なdNTP(特に低いdATPおよび/またはdGTP濃度)を使用して、ウイルスゲノムの長さの多様性を6〜8 kbに増やすこともできます3。 - 等量のPCR産物(5 μL)をロードし、0.8%トリス-アセテート-EDTA(TAE)ベースのアガロースゲル電気泳動を実行して、既知の量の1キロベース(kb)DNAラダーと比較することによって増幅されたep-PCR産物を推定します11。メーカーの指示に従って、カラム精製キットを使用して製品を精製します。
- 微量分光光度計12を用いて260nmでの吸光度を測定することにより、精製物の濃度を推定する。必要に応じてep-PCR産物を真空濃縮し、産物濃度≥100 ng/μLを得ます。
注:ep-PCR産物の2倍段階希釈液をロードし、その強度を既知の量の1 kb DNAラダーと比較することで、より正確な推定を行うことができます。
2. ウイルスRNA合成
- 40 μL の反応液を 5 μg の Clonal-pJFH1 と 4 U の XbaI 酵素で 37 °C で 2 時間消化し、続いてカラム精製を行い、微量分光光度計で 260 nm の吸光度を測定します12。メーカーの指示に従い、市販の大規模RNA産生システムを用いて、カラム精製したep-PCR産物またはクローンpJFH1(WT)の in vitro 転写反応を20 μLセットアップします。
- 200 μLの微量遠心チューブに、精製したep-PCR産物(変異体ライブラリ)または XbaI 消化クローンpJFH1 約1 μg、リボヌクレオチドを含む2xバッファー10 μL、およびT7酵素ミックス2 μLを混合します。すべての成分を混ぜ合わせ、簡単にスピンダウンします。反応混合物を37°Cで45分間インキュベートした後、1 U RNaseフリーDNase酵素を添加し、37°Cで30分間インキュベートします(図1C)。
- メーカーの指示に従ってRNAクリーンアップキットを使用して in vitro 合成RNAを精製し、40μLのRNaseおよびDNaseフリー水で溶出し、微量分光光度計12を使用して260nmでの吸光度を測定することにより、精製されたRNAの濃度を推定する。必要に応じてアリコート(5 μgまたは2 μg)を調製し、凍結融解を避け、-80°Cで保存します。 MOPS ホルムアルデヒド 0.8% アガロースゲル電気泳動に 2 μg の RNA を使用して、ウイルス転写産物の完全性とサイズを検証します13 (図 3)。
3. ep-PCR産物(変異体ライブラリー)における変異割合の推定
注:このステップでは、ステップ2で得られた産物をサブクローニングすることによって変異したヌクレオチドの割合。は、2つの全ゲノム変異体ライブラリ(ML50およびML25)およびクローンpJFH1由来ウイルスRNAを使用して遺伝的不均一性を作成するためにep-PCRを採用することの利点を実証すると推定されました。変異の割合は、本研究の表現型読み出し遺伝子(薬剤耐性)でもあるHCV NS5A遺伝子で推定された。
- ステップ2で合成したウイルスRNA約1 μg、5 μMリバースプライマー5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3'、および200 U逆転写酵素をメーカーの推奨に従って添加して、20 μLのcDNA合成反応をセットアップします。
- cDNAを使用して、完全なNS5A遺伝子を構成する2571 bpフラグメントを増幅します。これを行うには、5272Fおよび7848Rプライマー(最終濃度; 表3)、1.5 mM MgCl2、1x PCR バッファー、および 1 U ハイフィデリティ Taq ポリメラーゼを総容量 50 μL で、 表 4 に記載の条件を使用して増幅サイクルを実行します。
- 0.8% TAE ベースのアガロースゲルで分析して 2571 bp の製品サイズを確認し、メーカーの指示に従ってカラム精製キットを使用して製品を精製します。カラム精製物を40μLの滅菌水に溶出します。
- 産物に 3' A オーバーハングを追加するには、0.5 μM の dATP と 1 U の低忠実度の Taq DNA ポリメラーゼを添加し、1 x PCR バッファーおよび 1.5 mM MgCl2 (最終濃度) とともに、PCR 産物全体を 70 °C で 30 分間インキュベートします。メーカーの指示に従って、カラム精製キットを使用して混合物を精製します
注:または、ステップ1.4のゲルから~9.7 kbの長さの製品を切除します。メーカーの指示に従って、ロングPCR産物のクローニング用の市販のキットを使用してクローニングを行うか、Illuminaプラットフォームを使用してep-PCR産物のNGSを実行します2。 - 5 μL の 2x ライゲーションバッファー、50 ng の T ベクター DNA、ステップ 3.4 で合成したインサート DNA の約 3 倍モル過剰、3 Weiss 単位の T4 DNA リガーゼ、およびヌクレアーゼフリー水を総容量 10 μL まで添加して、ライゲーション反応を開始します。 この反応液を室温で3時間インキュベートし、ライゲーションしたDNAに大 腸菌 DH5αを100 μL添加します。セルを42°Cで35秒間ヒートショックします(図1B)。
- 1 mLのLuria-Bertani(LB)培地(抗生物質なし)を加え、37°Cで1時間穏やかに振とうしながらインキュベートして回収します。細胞懸濁液を13,800 x gで遠心分離し、上清を廃棄し、200 μLの新鮮なLB培地に再懸濁します。
- 形質転換した 大腸菌 DH5α細胞100 μLを50 μg/mLのアンピシリンを含むLBプレートに播種し、37°Cで16時間インキュベートします。5 mLのLB培地+ 50 μg/mLのアンピシリンに25〜30コロニーのミニプレップを設置し、37°Cで一晩増殖させます。
- 翌日、メーカーの指示に従ってプラスミド精製キットでプラスミドを抽出し、すべてのコロニーについて、単離したプラスミド200 ng、 EcoR1 2 U、および制限バッファー1xを含む10 μLの容量で制限酵素消化を行います。
- 消化混合物を37°Cで3時間インキュベートした後、0.8%TAEベースのアガロースゲルで生成物を分離し、プラスミドDNAの挿入を確認します。
- M13 Forward、M13 reverse、6208-SPF、および 6748-SPF プライマー(表 3)を使用して、25 個の陽性クローンのプラスミドのサンガーシーケンシングを行い、ライブラリおよびクローン pJFH1 に由来するウイルス RNA の変異の割合(変異したヌクレオチドの割合として表される)を決定します(図 1B および 図 4)。
4. Huh7.5細胞株のウイルスRNAトランスフェクション
注:RNase/DNaseフリーの組織培養材料を使用し、滅菌クラスIIのバイオセーフティキャビネットで作業してください。組織のバイオセーフティガイドラインに従って、推奨される封じ込め施設で作業します。
- 10%(vol/vol)ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(100 μg/mL;図1D)。
- コンフルエントが90%に達したら、セルを1:3の比率で分割します。1x予熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH 7.4)で細胞を洗浄します。5 mLの1x trypsin-EDTA溶液を添加して細胞層を完全に覆い、フラスコを静かに渦巻きさせた後、フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。
注:インキュベーション時間は異なる場合があります。細胞層が細胞培養フラスコ表面から完全に剥離するまで、細胞をインキュベートします。 - 10 mLの予熱済み完全DMEMを添加し、ピペッティングを繰り返して細胞を分散させ、細胞懸濁液を15 mLまたは50 mLの滅菌遠心チューブに回収します。細胞懸濁液を室温で252 x gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを6 mLの完全DMEMに再懸濁し、5%CO2を含む加湿インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。
- ナイーブ細胞、トランスフェクション細胞、またはウイルス感染したHuh7.5細胞を継続的に維持するには、手順4.2を繰り返します。ステップ4.3。
- トランスフェクションの1日前に、ステップ4.1〜4.3.に記載のとおりに細胞を分割し、血球計算盤を用いて生細胞の数をカウントし、Huh7.5細胞を2mLの完全DMEM中に35mmディッシュに0.6×106 の密度で播種し、5%CO2を含む加湿インキュベーター中で37°Cで細胞をインキュベートする。
- 翌日、転写産物-脂質複合体を調製します。これを行うには、トランスフェクション試薬10 μLを50 μLのミニマルエッセンシャル培地で希釈し、5 μgのウイルス転写産物を50 μLのミニマルエッセンシャル培地で別々に希釈します。
- 両方の混合物を室温で10分間インキュベートし、次にそれらを単一の滅菌微量遠心チューブで混合し、さらに室温で30分間インキュベートして転写産物-脂質複合体を形成します。
- 細胞インキュベーションの16時間後、培養皿から培地を取り出し、予熱した1x PBSで細胞を2回洗浄し、1.5 mLの最小限の必須培地を加えます。転写産物-脂質複合体を皿にゆっくりと加え、手で静かに渦巻かせて、複合体が均一に分布するようにします。
- 細胞を5%CO2 インキュベーターで37°Cで10時間インキュベートします。次に、培地を除去し、トランスフェクションした細胞を予熱した1x PBS1 mLで2回洗浄し、2 mLの完全DMEMを加えます。
5.ウイルス産生
- トランスフェクションしたHuh7.5細胞を2日ごとまたは3日ごとに90%のコンフルエントに達したら分割します。スプリットごとにウイルス上清を回収し、-80°Cで保存してさらに分析します。
- 分割ごとに、ステップ6.2で説明したように、焦点形成アッセイ(FFA)を使用してウイルスの拡散を監視します。ウイルスの拡散がトランスフェクションされた細胞の>80%に達するまでウイルスを回収します(図1D)。
注:トランスフェクションした細胞を最初の数継代の比率で1:1の比率で分割し、最大数のウイルス変異体を救出します。ウイルスの拡散は遅くなり、生存率は、全ゲノムMLの突然変異の割合が増加すると低下します2。
6. ウイルス力価の定量化
- ウイルスRNAの定量
- メーカーの指示に従って、ウイルス RNA 分離キットを使用して、140 μL の培養上清からウイルス RNA を単離します。
- メーカーの指示に従って、市販のqRT-PCRキットを使用して10 μLのqRT-PCR反応をセットアップします。HCV RNAの定量には、フォワードプライマーR6-130-S17、リバースプライマーR6-290-R19(各最終濃度0.2 μM)、プローブR9-148-S21FT(最終濃度0.3 μM)を使用します(表3)。運転条件を48°Cで20分、95°Cで10分、95°Cで15秒、60°Cで1分を45サイクルします。
注:プローブには、蛍光レポーター色素である6-カルボキシフルオレセイン(FAM)とクエンチャー色素である6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン(TAMRA)がそれぞれ5'末端と3'末端に含まれている必要があります。 - リアルタイムPCRマシンで反応を実行します。ネガティブコントロール、すなわち、模擬感染細胞の上清から抽出したRNAとヌクレアーゼフリーの水を同時にセットアップして、クロスコンタミネーションが起こらないようにします。
- 並行して、ウイルス RNA の定量のために、10 倍段階希釈した既知のコピー数の HCV 転写産物(1 x 108 から 0)を使用して検量線を作成します。定量を 3 回に分けて行います(図 1D)。
- 50%組織培養感染線量(TCID50)を用いた感染性ウイルス力価の定量化
- ウイルスを添加する約16時間前に、6.5 x 103 Huh7.5細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種し、5%CO2 インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。
- バイオセーフティークラスIIキャビネットで、採取したウイルス(ステップ5で説明したように、ウイルスの拡散が細胞の>80%に達したときに得られる)の1 x 10-1〜1 x 10-6希釈(8希釈)をカバーする10倍連続希釈(各1 mL)を実行します。希釈したウイルスを100 μL/ウェル(8回繰り返し)添加してHuh7.5細胞に感染させ、プレートを5%CO2を含む37°Cのインキュベーターで3日間保持します。
- 3日後、感染細胞を毎回0.1 mLのPBSで3回洗浄し、0.1 mLの氷冷メタノールで-20°Cで20分間細胞を固定および透過処理します。ウェルを1x PBS 3xで洗浄し、次にPBS-T(1x PBS/0.1% [v/v] Tween-20)で1x洗浄します。
- PBS-Tを除去した後、PBSTに0.2%脱脂乳を含む0.1 mLの1%ウシ血清アルブミン(BSA)で細胞を室温で30分間ブロックします。ブロッキング溶液を除去し、1x PBSで調製した0.1mLの3%H 2O2で細胞を5分間処理します。
- 再度、細胞を1x PBSで2回、PBS-Tで1回洗浄し、50 μL/ウェルの抗NS5A 9E10 mAb(1:10000、ストック1 mg/mL、ロックフェラー大学のCharles Riceからの親切な贈り物)を加え、室温で1時間インキュベートします。ウェルを1x PBSで3回、PBS-Tで1回洗浄します。
- 50 μL/ウェルのHRP標識ヤギ抗マウス二次IgG(1:4000)を添加し、室温で30分間インキュベートした後、0.1 mLの1x PBSでウェルを洗浄して未結合抗体を除去します。
- 30 μLのDAB(ジアミノベンジジン四塩酸塩)カラー基質を加え、室温で10分間穏やかに揺動しながらプレートをインキュベートします。基質は、HCV NS5A抗原を示すウェル表面に茶色の沈殿物を発生させます。DAB溶液を取り除き、ウェルを1x PBSで2回、蒸留水で1回洗浄します。0.03%アジ化ナトリウムを含むPBSを100 μL添加します。
- 10倍の対物レンズを使用して、倒立光学顕微鏡で各ウェルを調べます。正の井戸の数を数えます。ウェルに1つ以上のNS5A陽性細胞が含まれている場合、それは陽性です。ウェルにNS5A陽性細胞が存在しないことが示されている場合、それは陰性です。リードとミュンチの計算機を使用して、ウェルの50%(TCID50)に感染するエンドポイントの希釈率を推定します14,15。TCID50を生成するのに必要な希釈液の逆数は、単位体積あたりのウイルス感染力価(病巣形成単位)です。
注:ウイルス感染力価は、変異体ライブラリによって異なります。
7. 薬剤耐性ウイルス変異株の選抜
- NS5A阻害剤であるピブレンタスビル(PIB)を100%DMSOに1 mMの濃度に溶解し、さらに完全DMEMで10 nMの濃度に希釈します。
- PIBの50%有効濃度を決定するには、Huh7.5細胞を0.6 x 10 6/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種し、5%CO2 インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。16時間の細胞インキュベーション後、ML50またはクローンJFH1ウイルスのいずれかのウイルス用量を追加して細胞の50%に感染させ、感染後12時間(h p.i.)に、0.5〜100pMの範囲のPIBの2倍希釈シリーズで細胞を処理します。ステップ6.2のようにFFAを測定し、FFUを定量化します。3日間の潜伏後。
- 統計解析ソフトウェアでFFU削減アッセイ値を使用して用量反応曲線をプロットします。シグモイド曲線から、50%有効濃度(EC50; 図5)。
注:有効濃度範囲は、クラス、同じクラスのHCV抗ウイルス薬間、および変異体ライブラリによって異なる場合があります。 - 実験では、ナイーブHuh7.5細胞をML50ウイルス(ML50 RNA由来の変異体)の用量で70%のコンフルエンスで感染させ、細胞の50%に12時間感染させ、感染後24時間で感染した細胞を6ウェルプレートに移します。
- 16時間の細胞分裂後、感染細胞に1x EC50 PIB(47.3 pM)を加えます。これを、6回連続して継代(18日間)すべての細胞が分裂した後、その後3回の薬物フリー継代サイクルを行い、ステップ6.2で説明したようにFFAを使用してウイルスの拡散をモニターします。成長分野に応じてFFA試薬をスケールアップします。各継代でウイルス上清を回収し、使用するまで-80°Cで保存します。
注:治療フォローアップ中の細胞の50%を超えるウイルスの拡散はブレークスルーとして定義され、薬物離脱期間中のウイルスの拡散はウイルスの再発として定義される場合があります16。 - ステップ6.1.1で説明したように、18日目に上清からウイルスRNAを抽出し、ステップ3.1に示すようにcDNAを合成します。5 μL の 1:5 希釈 cDNA とステップ 3.2 で説明した PCR 成分を使用して NS5A 遺伝子を増幅します。次に、手順3.3.-3.5に従います。NS5Aシーケンシングプライマー6186F、6862F、および6460Rを用いて、6〜8個の陽性細菌プラスミドにおけるNS5A薬剤耐性変異を決定する(表3 および 表4)。
注:この研究では、1x EC50でのPIB治療中に選択されたバリアントのNS5Aの置換を報告しました。これにより、PIBに対する感受性の低下におけるNS5A以外の置換の寄与が除外されます。
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Representative Results
多数の完全長HCV多様体を作製し、 図1に記載の手順に従って目的の薬剤耐性表現型をスクリーニングすることができる。全ゲノム変異体ライブラリーは、 図2に示すように、Clonnal-pJFH1を用いて量を減らして(100-10 ng)合成しました。ep-PCR産物(変異体ライブラリ)の平均収量は3.8-12.5 ng/μLの範囲でした。 図3 に、クローンpJFH1と代表的な変異体ライブラリ(50 ngのクローンpJFH1を用いて合成したML50)から合成したウイルス転写産物を示します。クローンpJFH1は XbaI 消化によって直鎖化され、ML50は in vitro 転写反応で直接使用されました。 図4に示すように、ep-PCR反応におけるインプットpJFH1の減少に伴い、変異体ライブラリー(変異ウイルスRNA)の変異の割合が増加しました。50 ng のテンプレート(クローン pJFH1)を使用して合成された ML50 では、コピーされた 10,000 bp あたり 4 つの置換がありましたが、25 ng のテンプレートを使用して合成された ML25 では 9 つの置換が含まれていました。配列決定されたヌクレオチド数に置換は、クローンpJFH1では見つからなかった。ML50ウイルス変異体は、 図5に示すように、クローンJFH1ウイルスと比較して、NS5A阻害剤であるピブレンタスビルに対する感受性が低かった(12.7倍)。 表5 は、ピブレンタスビル治療の1x EC50 に対して選択されたML50ウイルス変異体で同定されたNS5A置換を有する。8つのNS5Aクローンのうち、4つはD7V+F28Cの組み合わせを持ち、V8A+F28CとF36Lはそれぞれ1つのクローンで発生しました。これらの変異はNS5AのN末端領域にあり、臨床的に重要なNS5A耐性変異を有することが知られている17。
図1:FL-MRS戦略と薬剤耐性表現型選択の概略図。 (A)pJFH1 cDNA(野生型)クローンは、完全長遺伝子型2aウイルスゲノムとT7プロモーターを持っています。プライマーJ-ForはT7プロモーターの上流にあり、プライマーJ-RevはHCVゲノムの3'末端に位置しています。(B)クローンpJFH1は、エラーが発生しやすいPCRを用いてランダムに変異させ、遺伝的変異を操作し、全ゲノム変異体ライブラリーを作成します。Clonnal-pJFH1はXbaI消化によって直鎖化されます。(C)フルゲノムep-PCR産物および直鎖化クローナル-pJFH1は、in vitro転写のテンプレートです。MLおよびクローン-JFH1のウイルスRNAにおける変異の割合は、NS5AのTAサブクローニングおよび陽性TAクローンのサンガーシーケンシングによって決定された。(D)Huh7.5細胞の変異ウイルスRNAトランスフェクション後に生成された複製能力のある変異体を、NS5A耐性表現型の選択のためにピブレンタスビル(NS5A阻害剤)で処理しました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ep-PCR産物のアガロースゲル電気泳動。 さまざまなテンプレート量(100 ng、50 ng、25 ng、および 10 ng の pJFH1)を使用して合成された HCV 全ゲノム ep-PCR 産物を、0.8% TAE アガロースゲル電気泳動を使用して分離しました。ep-PCR産物の予想サイズは9.7 kbです。分離された生成物は、エチジウムブロマイド染色によって可視化されました。レーン 1 は 1 kb の DNA ラダーです。レーン 6 はテンプレートなしのコントロールです (H2O とラベル付けされています)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:ウイルス転写産物のMOPSホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動。 直鎖状のpJFH1(Lane 2)と、ep-PCRを含む50 ng(ML50)のpJFH1(Lane 3)で得られた変異体ライブラリーを、 in vitro 転写反応のテンプレートとして使用しました。転写産物の完全性は、エチジウムブロマイドで染色したMOPSホルムアルデヒド0.8%アガロースゲルを使用して分析しました。レーン 1 は 1 kb の RNA ラダーです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:変異体ライブラリーにおける置換の割合。 クローンpJFH1、ML50、およびML25のRNA由来のNS5A遺伝子をハイフィデリティPCRで増幅し、続いて3'Aオーバーハングを添加し、Tベクターで産物をライゲーションし、ライゲーションした産物で 大腸菌 DH5αを形質転換しました。約 40,000 のヌクレオチド/ライブラリーまたはクローン pJFH1 をサンガー配列決定しました。コピーされた10,000 bpあたりの変異の平均割合が示されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:ML50変異体に対するピブレンタスビルのEC50 の推定値。 Huh7.5細胞をクローンJFH1ウイルスまたはML50変異体に感染させ、100 pMのピブレンタスビルから開始し、3日後にFFAで連続的に2倍希釈して処理しました。FFU還元アッセイ値を用いたシグモイド線量反応曲線を統計解析ソフトウェアでプロットし、50%有効濃度を推定した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 50 μLの成分 | 必要株式価値 | 最終濃縮・反応 |
| 10x PCRバッファー | 5.0μL | 1倍速 |
| MgCl2 (50 mM) | 1.5μL | 1.5ミリメートル |
| KBエクステンダー | 2.0μL | - |
| dNTP(10 mM) | 1.0 μL | 0.2ミリメートル |
| フォワードプライマー(10 μM) | 1.0 μL | 0.2μM |
| リバースプライマー(10μM) | 1.0 μL | 0.2μM |
| Taq DNA ポリメラーゼ (10 U/μL) | 0.5 μL (1:4 希釈) | 1 U |
| テンプレート(pJFH1、20 ng/μL) | 0.5から5.0 μL | 10から100のng |
| 水 | 32.5から37.5 μL | 最終容量が 50 μL になるように調整します |
表 1.HCV全ゲノムの増幅のためのEp-PCRコンポーネント。
| 温度 | 時間 | サイクル |
| 95 °C | 3分 | 1 |
| 95 °C | 30秒 | 30 |
| 60 °C | 25秒 | |
| 72 °C | 8分 | |
| 72 °C | 10分 | 1 |
| 4 °C | 持つ |
表 2.HCV全ゲノムのep-PCRのサイクル条件。
| 試験 | 入門 | シーケンス (5'-3') |
| NS4B-NS5A-NS5B部分の増幅 | 5272Fシリーズ | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| cDNA合成 | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCRの | R9-148-S21FT(TaqMan プローブ) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6の- 130 - S17 | CGGGガ | |
| R6の- 290 - R19の | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| ep-PCR産物中の変異の割合を決定するためのプライマーのシーケンシング | 6208-SPFの | CCCAACTACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-SPFの | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| NS5A遺伝子シーケンシング(およびep-PCR産物における変異の割合の決定) | 6186Fさん | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862Fシリーズ | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
表 3.アッセイで使用されるプライマーおよび配列。
| 温度 | 時間 | サイクル |
| 95 °C | 4分 | 1 |
| 95 °C | 30秒 | 5 |
| 68 °C | 30秒 | |
| 72 °C | 2分 | |
| 95 °C | 30秒 | 5 |
| 66 °C | 30秒 | |
| 72 °C | 2分 | |
| 95 °C | 30秒 | 5 |
| 64 °C | 30秒 | |
| 72 °C | 2分 | |
| 95 °C | 30秒 | 5 |
| 62 °C | 30秒 | |
| 72 °C | 2分 | |
| 95 °C | 30秒 | 10 |
| 60 °C | 30秒 | |
| 72 °C | 2分 | |
| 72 °C | 10分 | 1 |
| 4 °C | 持つ |
表 4.NS5A増幅のサイクル条件
| 置換 | いいえ。クローン数(n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C型 | 1 |
| F36Lの | 1 |
表 5.NS5Aのピブレンタスビル耐性置換。
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Discussion
この研究では、HCV全ゲノムライブラリを合成するためにep-PCR18 とリバースジェネティクスを統合し、細胞培養システムで使用して、薬剤耐性表現型のスクリーニングのための複製可能なバリアントを生成できる、シンプルで迅速なFL-MRS手順を詳しく説明しました。低忠実度のTaq DNAポリメラーゼの使用は、完全長ウイルスゲノムのPCR増幅中に置換の取り込みを可能にするep-PCRの前提条件です。いくつかの低忠実度のTaq DNAポリメラーゼを試験したところ、Platinum Taq DNAポリメラーゼは~10 kbサイズのep-PCR産物を高収率で得られることがわかりました(データは示していません)。固定数の熱サイクルを使用し、インプットテンプレートの量を変化させて、全ゲノムライブラリの変異の割合を制御することをお勧めします。FL-MRSが完全長のウイルスRNAのテンプレートとして誤った全ゲノムを利用するので、プライマーセットの慎重な設計はRNAの統合の反作用が定義された長さのウイルスの転写物を作り出すことを保証するために重大である: (i)前方プライマーはep-PCRのプロダクトに結合するT7ポリメラーゼを促進するためにcDNAのクローンのT7促進者の上流(~50ヌクレオチド)に見つけなければならない;(ii)リバースプライマー配列は、 in vitro RNA合成中の転写流出を促進するために、ウイルスゲノムの3'末端で終端する必要があります。
しかし、この方法は比較的粗雑であり、ゲノムの関心領域に必要な数と種類の置換を組み込むことを制御することはできません。FL-MRSの主な利点は、合成された完全長転写産物を直接細胞にトランスフェクションできるため、ウイルス変異体の大規模なプールを生成するためのアプローチが簡単かつ効率的になることです。対照的に、環状ポリメラーゼ伸長法およびミュートランスポゾン挿入突然変異誘発法では、目的の表現型を選択する前に、PCR産物のクローニングと形質転換体のスクリーニングが必要であり、変異体のプールの多様性が厳しく制限されます。私たちの方法は、いくつかの望ましい表現型をもたらす可能性を大幅に高めますが、通常、スクリーニングでは個々のウイルス変異の評価が必要です。
ep-PCRとウイルスリバースジェネティクスを統合することで、HCV変異体を迅速に作製することができました。この方法は、何百もの遺伝子組み換えウイルスを生成する可能性を秘めていますが、これは現在利用可能な in vitro 突然変異誘発技術では不可能であるように思われます。ここで詳述する方法は、~10 kbの長さまでのゲノムを含む(+)ssRNAウイルスを運ぶcDNAクローンに容易に適応できます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究の資金援助(助成金番号BT/PR10906/MED/29/860/2014)は、インド政府バイオテクノロジー局によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U.
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R.
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
