Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Изучение механозондирования просветных частиц мышей тонкой кишки

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/63697
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,4
1Enteric NeuroScience Program (ENSP), Division of Gastroenterology & Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Mayo Clinic, 3Easy Learning Labs, 4Department of Physiology & Biomedical Engineering (PBME), Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

Чтобы изучить, как тонкая кишка обрабатывает частицы различных размеров, мы модифицировали установленный метод in vivo для определения транзита тонкой кишки.

Abstract

Моторика желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) имеет решающее значение для нормального пищеварения и всасывания. В тонкой кишке, которая усваивает питательные вещества, моторика оптимизирует пищеварение и всасывание. По этой причине некоторые из паттернов моторики в тонкой кишке включают сегментацию для смешивания просветного содержимого и перистальтику для их движения. Физические свойства просветного содержимого модулируют паттерны моторики тонкой кишки. Механическая стимуляция механосенсорных цепей ЖКТ путем транзита просветного содержимого и лежащей в основе подвижности кишечника инициирует и модулирует сложные двигательные паттерны ЖКТ. Тем не менее, механосенсорные механизмы, которые управляют этим процессом, остаются плохо изученными. В первую очередь это связано с отсутствием инструментов для вскрытия того, как тонкая кишка обрабатывает материалы различных физических свойств. Чтобы изучить, как тонкая кишка обрабатывает частицы различных размеров, мы модифицировали установленный метод in vivo для определения транзита тонкой кишки. Мы обоживаем живых мышей флуоресцентной жидкостью или крошечными флуоресцентными шариками. Через 30 минут мы рассекаем кишечник, чтобы изобразить распределение флуоресцентного содержимого по всему желудочно-кишечному тракту. В дополнение к измерениям геометрического центра с высоким разрешением мы используем биннинг переменного размера и спектральный анализ, чтобы определить, как различные материалы влияют на транзит тонкой кишки. Мы изучили, как недавно обнаруженный механизм «прикосновения к кишечнику» влияет на моторику тонкой кишки, используя этот подход.

Introduction

Желудочно-кишечный тракт человека (ЖКТ) представляет собой систему органов длиной в несколько футов, примерно аппроксимированную как трубка различных размеров и физических свойств1. По мере того, как содержимое движется по своей длине, основная функция желудочно-кишечного тракта заключается в поглощении веществ, критически важных для жизни. Тонкая кишка специально отвечает за всасывание питательных веществ. Транзит тонкой кишки жестко регулируется, чтобы соответствовать функциям пищеварения и всасывания, что приводит к различным моделям моторики. Бейлисс и Старлинг описали «закон кишечника»2 в 1899 году, показав сократительную двигательную программу в кишечнике, известную сегодня как перистальтический рефлекс; сегмент, близкий к пищевому болюсу, сжимается, чтобы продвинуть его вперед, а дистальный сегмент расслабляется, чтобы получить его. Теоретически одной этой модели может быть достаточно для транспортировки материала аборально, но более века исследований нарисовали более сложную картину сократительной активности в желудочно-кишечном тракте. У человека выделяют три периода моторики тонкой кишки: мигрирующий двигательный комплекс (MMC), период голодания и постпрандиальный период3. Такие же закономерности были зарегистрированы у мышей 4,5. MMC представляет собой циклическую моторную модель, сохраненную у большинства млекопитающих 6,7. MMC имеет характерную четырехфазную картину, которая служит полезным клиническим маркером при функциональных расстройствах ЖКТ7. Четырьмя фазами, в порядке возникновения, являются (I) покое, (II) нерегулярные сокращения с низкой амплитудой, (III) регулярные сокращения с высокой амплитудой и (IV) период снижения активности7. MMC отмечает основную двигательную картину периода голодания3. ММК периода натощак очищают содержимое тонкой кишки при подготовке к следующему приему пищи.

Двигательные паттерны постпрандиального периода оптимизированы для пищеварительной и абсорбционной функций3. Независимо от калорийного состава, начальный транзит происходит быстро по тонкому кишечнику, содержимое распространяется по всей длине кишечника, а транзит впоследствии замедляется8. Абсорбция оптимизируется за счет увеличения площади контактной поверхности и ее замедления для увеличения времени пребывания. Как только питательные вещества находятся внутри просвета, доминирующий рисунок состоит из близких (<2 см друг от друга) нескоординированных сокращений (сегментирующих сокращений), с несколькими наложенными сокращениями с большой амплитудой, охватывающими всю длину тонкой кишки (перистальтические сокращения)9. Сегментирующие сокращения смешивают внутрипросветное содержимое на месте. Случайные большие перистальтические сокращения продвигают содержимое к толстой кишке.

Сроки этого перехода обратно к ММК зависят от объема пищи и калорийности10. Таким образом, тонкая кишка пробует просветные сигналы, чтобы регулировать, когда переходить между периодами моторики. Механические сигналы, такие как физические свойства просветного содержимого11, объем просвета и напряжение стенки, задействуют механорецепторные клетки в стенке ЖКТ 12,13,14,15,16. Действительно, увеличение твердого компонента пищи приводит к увеличению транзита тонкой кишки17. Мы предполагаем, что физические свойства, такие как жидкое или твердое состояние внутрипросветного содержимого, должны задействовать различные механорецепторы из-за различных сил, которые они генерируют на стенке ЖКТ18.

Золотым стандартом для измерения транзита IN vivo GI у людей, как и у мышей, является использование радиоактивных индикаторов, измеренных сцинтиграфией, когда они выходят из желудка или проходят по толстой кишке19,20. У млекопитающих тонкая кишка петляет непредсказуемым образом, что затрудняет надежное изображение тонкой кишки in vivo, но прогресс достигается21. Кроме того, в настоящее время не хватает инструментов для количественной оценки того, как тонкая кишка обрабатывает частицы различных свойств и размеров. Отправной точкой здесь был метод золотого стандарта, который стандартизирует изучение транзита тонкой кишки 22,23,24 и барьерной функции22. Он состоит из обжига мышей флуоресцентным материалом, ожидающих подвижности ЖКТ для транспортировки материала, иссечения желудочно-кишечного тракта, сегментации его на несколько секций от желудка до толстой кишки, секционирования и гомогенизации внутрипросветного содержимого для количественной оценки флуоресценции. Мы сделали два улучшения. Во-первых, мы изменили состав гаваированного содержимого, включив флуоресцентные микроскопические шарики, чтобы определить, как тонкая кишка распределяет физические частицы. Во-вторых, мы улучшили пространственное разрешение, визуализируя весь желудочно-кишечный тракт от желудка до толстой кишки ex vivo и использовали биннинг переменного размера для стандартизации нашего анализа на животных. Мы постулируем, что это раскрывает новое понимание баланса пропульсивных и сегментирующих сокращений во время постпрандиальной фазы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) клиники Майо.

1. Настройка

  1. Быстрые 8-10-недельные мыши в течение 4 ч. Обеспечьте мышам доступ к воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех экспериментов, представленных здесь, мы используем самцов мышей C57BL/6J дикого типа, но они могут быть выполнены на мышах любого штамма, пола и генотипа.
  2. Охладите 15 мл дистиллированной воды в конической трубке объемом 50 мл в холодильнике с температурой 4 °C.
  3. Нагрейте еще 15 мл дистиллированной воды в стакане с помощью конфорки с магнитным перемешивателем примерно до 80-90 °C.
  4. Измерьте 0,5% метилцеллюлозы в общей сложности 30 мл (0,15 г).
  5. Аккуратно добавьте метилцеллюлозу в 15 мл горячей воды, чтобы она не слипалась. Раствор метилцеллюлозы будет мутным во время этого процесса.
  6. После растворения извлеките стакан из конфорки и добавьте 15 мл охлажденной воды в горячий стакан.
  7. Поместите в холодильник с температурой 4 °C до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, примерно 15-20 мин.
  8. При очистке взвесьте 3 мг изотиоцианата родамина (RITC)-декстрана на 5 мл 0,5% раствора метилцеллюлозы и перемешайте для объединения. Это жидкое состояние в разделе Репрезентативные результаты .
    1. Альтернативно, взвесьте 25 мг флуоресцентных полиэтиленовых микросфер и смешайте с 200 мкл раствора метилцеллюлозы до тех пор, пока они не будут хорошо включены. Тщательное включение микросфер обеспечивается вихрем перед гаважем. Экспериментатор должен визуализировать однородное распределение взвешенных микросфер в смеси.
    2. Поскольку раствор RITC-декстран является светочувствительным, охладите раствор. Заранее приготовьте раствор RITC-декстрана и смесь микрошпере и используйте в течение 2 месяцев. Перед использованием повторно суспендируйте смесь микросферы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микросферы различных размеров используются для изучения желудочно-кишечного тракта различных материалов. В разделе Репрезентативные результаты мы демонстрируем результаты использования малых (диаметр: 75-90 мкм) и больших (диаметр: 180-212 мкм) микросфер.

2. Внутрипросветное содержание

  1. Подготовьте стекло, прикрепив питательную трубку размером 18 Ga x 50 мм к шприцу объемом 1 мл и вытянув 200 мкл раствора RITC или раствора микросферы.
  2. Вручную удерживать постящееся животное с помощью техники удержания одной рукой25. Обратитесь к информации учреждения о надлежащих методах сдерживания мышей.
  3. Осторожно вставьте питательную трубку через рот и пищевод мыши, пока она не попадет в желудок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг гаважа имеет решающее значение для успешного эксперимента. Для этого требуются опытные руки, которые могут последовательно вставлять трубку примерно на одинаковое расстояние в каждую мышь. Этот шаг должен быть стандартизирован экспериментаторами, выполняющими протокол. Один и тот же экспериментатор должен оценить все когорты мышей, которые будут сравниваться друг с другом.
  4. Медленно выталкивайте содержимое шприца в желудок и осторожно извлекайте трубку из мыши.
  5. После гаважа верните мышь в клетку.
  6. Утилизируйте трубку.
  7. Повторите процесс по мере необходимости для нужного количества животных.

3. Рассечение кишечника

  1. Перед началом рассечения включите инструмент визуализации in vivo , чтобы он достиг температуры.
  2. Принесите мышь в жертву через 30 минут после захода. Используйте вдыхание углекислого газа, чтобы принести в жертву мышь, с последующим вывихом шейки матки, чтобы обеспечить успешную эвтаназию.
  3. После подтверждения успешной эвтаназии поместите мышь в положение лежа на спине на стадии рассечения и закрепите ее четыре придатка на сцене, чтобы иметь доступ к брюшной полости. Смочите поверхность живота 70% этанолом, чтобы смочить волоски живота.
  4. Используйте микродиссекционные щипцы (No 5), чтобы потянуть кожу и приобрести острые хирургические ножницы, чтобы сделать поперечный разрез на 1 см выше ануса. Чтобы обнажить внутрибрюшинную полость, продолжайте разрез вертикально вверх по брюшной полости до грудной клетки.
  5. Осторожно переместите слепую кишку влево с помощью микродискционных щипцов, чтобы обнажить дистальную толстую кишку.
  6. Вырежьте дистальную кишку с помощью микродисперсных ножниц только проксимально к прямой кишке.
  7. Осторожно распутайте толстую кишку, слепую кишку и тонкую кишку, медленно потянув в противоположном направлении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание рассеченного кишечника в одном непрерывном сегменте создаст наибольшую легкость для исследователя. Разрывы и разрывы вдоль сегмента приведут к тому, что последующие шаги будут более сложными.
  8. Используйте микродиссекционные ножницы, чтобы разрезать проксимально к желудку.
  9. Используйте щипцы для переноса рассеченного кишечника на измерительный лист (рисунок 1). Поместите желудок на 0 мм и расположите кишечник вдоль линейки до 200 мм. Используйте микродиссекционные ножницы для резки на 200 мм. Повторите этот процесс выравнивания кишечника от 0 мм до 200 мм вдоль линеек, оставаясь уверенным в том, что ориентация кишечника не запутается.
    1. Будьте осторожны, чтобы избежать растяжения кишечника при выравнивании к линейкам.
  10. Как только ткань расположена на линейке, расположите слепую кишку так, чтобы она была параллельна ткани, но не находилась в прямом контакте с ней (если в этой области обнаружена какая-либо флуоресценция, то потребуется четкое различие между слепой кишкой и кишечником).
  11. Поместите измерительный лист с рассеченной тканью в темную область, чтобы флуоресценция могла сохраняться до тех пор, пока не придет время для изображения.

4. Визуализация Ex vivo

  1. Откройте программное обеспечение для создания образов in vivo и войдите в систему.
  2. Инициализируйте инструмент обработки изображений, чтобы он был готов к получению изображения.
  3. Установите поля «Возбуждение» и «Излучение» на соответствующий цвет, используемый для бусины или RITC gavage. Красный (жидкий): возбуждение 535 нм /излучение 600 нм. Зеленый (микросферы): возбуждение 465 нм /излучение 520 нм.
  4. Установите экспозицию в положение «Авто».
  5. Выберите поле зрения.
  6. Перед помещением измерительного листа в прибор убедитесь, что кишечник не сместился во время транспортировки.
  7. Поместите измерительный лист в прибор в поле зрения.
  8. Надежно закройте дверцу прибора и выберите Снимок , чтобы сфотографировать поле зрения.
  9. Сохраните собранные снимки на флешку для анализа. Сохраняйте индивидуальные снимки флуоресцентных и фотоизображений. Наложение фотографии и флуоресценция указывают на расположение флуоресцентного материала в желудочно-кишечном тракте (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем сохранить файлы в формате Tag Image File (.tif) для последующей обработки.

5. Анализ

  1. Откройте файлы флуоресцентных и фотоизображений в программном обеспечении для редактирования изображений.
  2. Отрегулируйте размер пикселей обоих изображений таким образом, чтобы они имели одинаковые размеры (наше соглашение заключалось в том, чтобы установить для обоих изображений 1280 пикселей на 850 пикселей [высота х ширина]).
  3. Закройте файл фотографии. Следующие шаги включают только флуоресцентное изображение.
  4. Используйте инструмент ластика, чтобы удалить фон и сделать его прозрачным. Ластик может понадобиться для удаления пятен оставшегося фона.
  5. Создайте новый слой. Сделайте его полностью черным фоном для флуоресцентного сигнала. Этого можно достичь, выбрав черную заливку слоя и перетащив слой, чтобы он лежал под слоем с флуоресцентным изображением.
  6. Сохраните новое флуоресцентное изображение, содержащее только флуоресцентный сигнал на черном фоне, в качестве нового файла .tif.
  7. Откройте новые флуоресцентные и фотоизображения в ImageJ.
  8. Превратите каждое изображение в 32-разрядное, выбрав «Тип изображения > > 32-разрядный».
  9. Создайте объединенное изображение обоих, выбрав «Цвет изображения > > «Объединить каналы». В открывшемся диалоговом окне выберите файл фотографии для серого канала и флуоресцентный файл под любыми цветными каналами.
  10. Отключите масштаб объединенного изображения, выбрав Анализ > Задать масштаб > Щелкните, чтобы удалить масштаб.
  11. Выберите инструмент «Прямоугольник» в ImageJ.
  12. Нарисуйте прямоугольник вокруг участка тонкой кишки. Обратите пристальное внимание на ширину этой интересующей области (ROI), так как она должна оставаться постоянной между всеми ROI. Номинальное значение не является существенным, просто оно остается последовательным для всех ROI, нарисованных на этом изображении [поскольку тонкая кишка занимает несколько рядов, отдельные ROI будут нарисованы над каждым участком тонкой кишки в другом ряду (рисунок 1)]. На рисунке 2 показано расположение значения ширины на панели инструментов ImageJ.
  13. Продублируйте рентабельность инвестиций, выбрав Изображение > Дублировать. Выберите только канал, соответствующий цветному каналу.
  14. Снова используйте инструмент «Прямоугольник», чтобы нарисовать рентабельность инвестиций по всему новому изображению.
  15. Извлеките профиль флуоресценции, выбрав Анализ > Профиль графика. Полученный график отображает на оси Y среднюю интенсивность для каждого пикселя по длине ROI. Это было выбрано на шаге 5.12 для длины анализируемого участка тонкой кишки.
  16. Откройте список значений и скопируйте их в программное обеспечение для работы с электронными таблицами.
  17. Повторите шаги 5.12-5.16 для каждого отдела тонкой кишки на отдельном ряду линейки. Продолжайте вставлять значения в один и тот же файл электронной таблицы непосредственно под каждым предыдущим набором значений, чтобы все непрерывные строки в этом столбце содержали среднее значение интенсивности для всей длины тонкой кишки.
  18. В программном обеспечении для работы с электронными таблицами умножьте каждое среднее значение интенсивности на постоянную ширину прямоугольника ROI, созданного на шаге 5.12. Это даст реальное значение интенсивности вдоль тонкой кишки в каждой точке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разные животные будут иметь небольшие вариации по длине тонкой кишки. Чтобы различия в длине не влияли на результат последующего анализа данных, строка значений интенсивности должна быть объединена в согласованное число контейнеров во всех экспериментальных образцах (на рисунке 3, рисунке 4 и рисунке 5 отображаются результаты для трех размеров бункеров).
  19. Разделите число значений интенсивности на желаемое количество контейнеров. Результирующее частное S определяет количество значений интенсивности, включенных в каждую корзину.
  20. Определите корзину, в которую будет направляться каждое необработанное значение интенсивности, используя формулу округления. На этом шаге каждое необработанное значение интенсивности помещается в корзину. Каждое необработанное значение интенсивности в хронологическом порядке индексируется целым числом N. Коэффициент N/S определяет номер бункера, присвоенный каждому необработанному значению. Формула округления должна округлять это частное до целого числа без десятичных знаков.
  21. Создайте значение для каждой корзины с помощью формулы усреднения. Цель состоит в том, чтобы усреднить необработанные значения, назначенные определенной корзине на шаге 5.20. Следовательно, аргументы в формуле должны быть следующими: (1) назначенные контейнеры, сгенерированные на шаге 5.20, (2) номер bin, (3) необработанные значения интенсивности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первый анализ, который мы можем выполнить на связанных данных, - это геометрический анализ центра, который количественно определяет, насколько мы наблюдаем самую высокую интенсивность флуоресцентной жидкости вдоль тонкой кишки (рисунок 4).
  22. Нормализуйте каждое значение интенсивности по отношению к общей интенсивности флуоресцентности. Другими словами, разделите каждое значение интенсивности на сумму всех интенсивностей.
  23. Умножьте каждое нормализованное значение на номер корзины. Продукт отражает относительный вес каждого бункера, способствуя общей интенсивности флуоресценции.
  24. Сложение всех значений, сгенерированных на шаге 5.23, дает номер бункера в центре флуоресцентного сигнала. Разделите на количество бункеров, чтобы выразить геометрический центр как фракцию тонкой кишки, проходящей мимо флуоресцентного центра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для отражения пространственного распределения сигнала следующим шагом является генерация спектра мощности объединенного набора данных об интенсивности (рисунок 5).
  25. Откройте мастер быстрого преобразования Фурье (FFT) в программном обеспечении для работы с электронными таблицами. Выберите входные данные в виде набора данных binned и выходные данные в виде пустого набора из того же количества строк, что и bins.
  26. Извлеките компонент реальной стоимости БПФ.
  27. Поднимите каждое реальное значение БПФ во вторую степень. Это дает набор данных спектров мощности.
  28. Выберите первую половину набора данных спектров мощности и переместите ее так, чтобы она лежала ниже второй половины. Это приводит к центрированию спектров мощности вокруг центральной частоты, когда она строится на следующем шаге.
  29. Постройте спектры мощности на оси Y графика x-y, где значения оси x представляют собой диапазон от -1 x (количество bins/2) до (количество bins/2) -1. В случае 1000 бункеров значения оси будут варьироваться от -500 до 499.
  30. Спектры мощности для каждого животного следует сравнивать на основе распространения ненулевых пиков и высот этих ненулевых пиков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы показываем репрезентативные результаты, начиная с Шага 3. На рисунке 1 показаны неповрежденные эксплантированные кишечники с флуоресцентными измерениями. Желудок (фиолетовый) укладывается вдоль той же оси, что и тонкая кишка (оранжевый), но мы предпочитаем перемещать слепую кишку (синюю) в сторону, чтобы предотвратить перекрытие с толстой кишкой (оранжевый). Как свидетельствует левая панель, это не всегда возможно из-за размера органа. Мы разрезаем тонкую кишку на ~ 200 мм, чтобы максимизировать покрытие непрерывных сегментов, но это не всегда возможно из-за брыжейки, ограничивающей способность разворачивать кишечник, и нашего предпочтения не разрезать структуры, такие как флуоресцентные гранулы или слепая кишка. Красная интенсивность на левой панели рисунка 1 и зеленая интенсивность средней и правой панелей отсортированы по контейнерам разного размера для создания рисунка 3. Для анализа извлекаются только интенсивности в пределах оранжевых ROI (тонкой кишки). Полная длина тонкой кишки (каждая оранжевая рентабельность инвестиций в каждой панели) извлекается для анализа. Оранжевые ROI имеют ту же ширину, что и в ImageJ (рисунок 2). Они сшиваются вместе путем размещения всех интенсивностей в последовательности перед биннингом. На рисунке 3 показана средняя флуоресцентная следовая ± SEM на когорту; подробности см. в легенде рисунка.

Последние два рисунка демонстрируют результаты анализа: геометрический центр и спектр мощности. Геометрический центр измеряет среднее расположение флуоресцентных сигналов на рисунке 3, взвешивая среднее значение по силе сигнала каждого бункера. Следовательно, более высокие пики в следе притягивают среднее значение ближе к положению этого пика. Геометрический центр не в состоянии полностью охарактеризовать пространственное распределение внутрипросветного содержимого. Например, один и тот же геометрический центр может быть получен из болюса, сконцентрированного в одной точке, и распространяемого сигнала, центрированного вокруг одной и той же точки. Это ограничение измерения геометрического центра очевидно при сравнении жидкостей и более крупных шариков (рисунок 3 и рисунок 4). Большая часть жидкого флуоресцентного следа сосредоточена вокруг двух ранних пиков, тогда как более крупные бусины показывают несколько пиков по всей длине тонкой кишки (рисунок 3, левая и правая панели). Флуоресцентный след более крупных шариков более распределен, но он усредняется до той же точки, что и у жидкости, независимо от гранулярности биннинга, что подчеркивает ограничение сосредоточения исключительно на геометрическом центре (рисунок 4). Чтобы учесть дистрибутивный характер сокращений тонкой кишки, мы включили в протокол спектральный анализ мощности. Анализ энергетического спектра работает путем деконструкции распределения флуоресценции в пространстве в множественные синусоидальные кривые разных пространственных частот. Каждая пространственная частота отражает расстояние между двумя случайно выбранными точками в следе флуоресценции. Некоторые из этих расстояний встречаются чаще, чем другие, поэтому каждому приписывается сила (мощность). Мощность коррелирует с тем, как часто две случайные точки разделяются этим расстоянием. Построив спектр мощности (рисунок 5), мы можем продемонстрировать, сколько пространственных частот вносят вклад в измеряемый сигнал (расширение спектра) и сравнить относительную силу этих вкладов (высоту спектра). Это позволяет количественно описать распространение флуоресценции по желудочно-кишечному тракту.

Figure 1
Рисунок 1. Рассеченный кишечник эксплантируют и помещают на ламинированную бумагу линейки перед фотографированием и измерением флуоресценции. Интенсивность флуоресценции накладывается и псевдоокрашивается в соответствии с нативной флуоресценцией гавамного материала. Слева: флуоресцеты жидкого родамина изотиоцианата (RITC) в красном спектре; Средний: малый (диаметр: 75-90 мкм) и правый: больший (диаметр: 180-212 мкм) шарики оба флуоресцируют в зеленом спектре. Фиолетовые, оранжевые, синие и розовые коробки окружают области интереса (ROI) в желудке, тонкой кишке, слепой кишке и толстой кишке в каждом образце соответственно. Ширина каждого ROI остается согласованной по строкам, чтобы избежать путаницы при расчете интенсивности необработанной флуоресценции во время последующего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Расположение интересующей области ширины (в пикселях) на панели инструментов ImageJ (желтое подчеркивание). Повторюсь, ширина отображается в пикселях только в том случае, если шкала была удалена (шаг 5.10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Следы флуоресценции по всей длине тонкой кишки. Линия обозначает среднюю флуоресценцию в данном бункере. Затененная область обозначает стандартную погрешность среднего значения (SEM). Распределение флуоресцентного материала изменяется в зависимости от свойств материала внутрипросветного содержимого (колонки). Слева: жидкое (n = 7 мышей) распределение по нескольким сегментам тонкой кишки через 30 мин после гаважа. Средние и правые: мелкие (n = 6 мышей) и более крупные (n = 5 мышей) шарики распределяются более широко вдоль тонкой кишки через 30 мин после половой сдачи. Увеличение числа корзин, используемых для сортировки одних и тех же необработанных наборов данных, приводит к тому, что элементарные элементы трассировки неразрешимы с меньшим количеством контейнеров (строк). Меньшие бункеры уменьшают погрешность измерений, увеличивают пространственное разрешение и лучше отражают распределительную составляющую сокращений тонкой кишки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Геометрический центр распределения флуоресценции в тонкой кишке через 30 мин после закапывания жидким RITC, мелкими шариками (75-90 мкм) и более крупными бусинами (180-212 мкм) (среднее ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, одностороннее ANOVA с поправкой Бонферрони). Размер бункера не влияет на транзитную интерпретацию того, что маленькие бусины транспортируются более дистально, чем жидкости через 30 мин после гаважа, но более крупные бусины распределяются настолько широко, что нет существенных различий в их геометрическом центре по сравнению как с жидкостями, так и с мелкими бусинами (*P < 0,05. нс = не статистически значимый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5. Спектры мощности классифицируются по свойствам материала (столбцы) и размеру бункера (строки). Улучшения в пространственном разрешении и меньшем биннинге очевидны. Верхний ряд: мало различий можно различить в широко связанных спектрах. Нижний ряд: по мере того, как размеры бункеров уменьшаются, мы можем оценить значительные доминирующие частоты, присутствующие в спектре более крупных бусин, но не в спектре мелких бусин. Некоторые, но не все, из этих дополнительных доминирующих частот присутствуют в жидком спектре. Используя спектры нижнего ряда, мы можем сравнить с флуоресцентными следами на рисунке 3. На рисунке 3 жидкий флуоресцентный след отображает два заметных пика, которые коррелируют с несколькими доминирующими пиками в спектре мощности. След маленьких шариков на рисунке 3 отображает один доминирующий пик, который коррелирует с одним доминирующим пиком в спектре мощности. Трасса более крупных бусин на рисунке 3 отображает более доминирующие пики. Соответственно, спектр мощности показывает большее количество доминирующих частот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Желудочно-кишечный тракт, как и другие трубчатые органы, такие как кровеносные сосуды, требует механических датчиков и эффекторов для поддержания гомеостаза 26,27,28. Тем не менее, желудочно-кишечный тракт уникален тем, что физические свойства материалов, которые пересекают его, не являются постоянными во время еды. Внутрипросветное содержимое различных физических свойств (твердое, жидкое и газовое) проходит через кишечник, генерируя различные механические входы в механорецепторы ЖКТ. Действительно, различные механические стимулы в толстой кишке ощущаются и передаются различными путями29.

Этот протокол технически доступен для всех, кто выполняет рутинную работу с мышью, но несколько критических шагов требуют пристального внимания. Мы считаем, что голодание мышей важно перед началом исследования, поскольку оно удаляет вклад от предыдущих приемов пищи, разбавляя флуоресцентный сигнал. Кроме того, мыши, получавшие стандартную диету, демонстрируют внутрипросветную флуоресценцию от компонентов диеты, в частности компонентахлорофилла 30. С помощью голодания и отбора флуорофоров мы предотвращаем вмешательство флуоресценции чау в контролируемые условия экспериментов, описанных в этом протоколе. Мы рекомендуем экспериментаторам самостоятельно подтвердить, что выбранный период голодания достаточен для устранения неспецифической флуоресценции в тонкой кишке, так как это может варьироваться в зависимости от штамма, возраста или пола. Экспериментатор должен визуально оценить однородное распределение гаваированного содержимого. В противном случае возникнет неопределенность в их доставке и результатах исследования. Гаважи должны последовательно выполняться одним и тем же экспериментатором, предпочтительно кем-то, кто имеет опыт работы с техникой. Экспериментатор должен стремиться к последовательной доставке содержимого в желудок. Обнаружение флуоресценции в пищеводе или исключительно в желудке является основанием для исключения животного из анализа, так как неясно, имела ли тонкая кишка такой же доступ к парчатому содержимому. После оценки время ожидания может быть сокращено до 15 минут или продлено до 90 минут, в зависимости от того, представляют ли интерес ранние или поздние этапы транзита22. Оригинальный протокол с использованием жидкого гаважа показал, что большая часть материала находится в тонкой кишке через 30 минут. Более того, хотя критически важно работать с поспешностью на этапе рассечения, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не нарушить расположение внутрипросветного содержимого и не разорвать желудочно-кишечный тракт.

Этот протокол развился из ранее опубликованных подходов, которые физически связывали тонкую кишку, разрезая ее на пять-10 сегментов и гомогенизируя внутрипросветное содержимое до измерения флуоресценции / радиоактивности 22,23,24. Предыдущий подход был важен, поскольку он стандартизировал измерение транзита тонкой кишки. Тонкая кишка, как известно, петляет в сложных и непредсказуемых узорах внутри брюшной полости. Исследования транзита на основе визуализации являются сложными независимо от видов31,32. Хотя наш протокол остается терминальным экспериментом, который не может быть распространен на людей, мы значительно улучшаем пространственное разрешение и используем это улучшение для разрешения региональных транзитов и перевода их в непредвзятое измерение распространения в пределах тонкой кишки (спектр мощности).

В этом протоколе пространственное разрешение ограничено разрешением камеры в системе визуализации. Поскольку биннинг нормализует длину тонкой кишки у животных, мы можем напрямую сравнить среднее положение внутрипросветного содержимого. На рисунке 3 наглядно показано резкое сглаживание, повышенная неопределенность и снижение разрешения в результате больших размеров бункера. Геометрический центр количественно определяет центр флуоресценции вдоль желудочно-кишечного тракта (рисунок 4). Как и ожидалось, на это измерение существенно не влияет размер бункера. Спектр мощности представляет собой непредвзятый и взаимодополняющий метод, который стандартизирует анализ пиков и спредов в флуоресцентных следах на рисунке 3. Улучшение разрешения улучшает расчетные спектры, позволяя продемонстрировать видимые различия между флуоресцентными следами (рисунок 5). При низком разрешении (10 бункеров) было бы трудно различить жидкости и более крупные бусины, либо по геометрическому центру, либо по оценкам спектра, хотя глядя на флуоресцентные следы, ясно, что они не распределены аналогичным образом в пространстве. При более высоком разрешении (1000 бункеров) геометрические центры по-прежнему похожи (из-за того, что геометрический центр является средним измерением), но спектр мощности может быть надежно использован для дифференциации между обеими когортами. Стоит отметить, что флуоресцентные следы поддаются другим видам анализов, таким как передовые измерения. Ожидаемые изменения в геометрическом центре могут быть использованы во время расчетов размера выборки до начала экспериментов. Зная, что жидкости имеют геометрический центр примерно 0,4-0,518, мы использовали по крайней мере пять мышей в каждой группе для статистического разрешения изменений до 45%.

Мы расширили сферу применения и использовали этот протокол для изучения транзита твердых веществ в тонкой кишке. Как и в случае с жидкостями, мы впрыскивали твердые микросферы в желудок. Пилорический сфинктер расположен при переходе желудок-тонкая кишка. Этот сфинктер работает как фильтр исключения размера. У мышей отсечение размера составляет ~ 300 мкм, при этом частицы <300 мкм не встречают сопротивления при попадании в тонкую кишку33, но этот подход также работает с немного более крупными частицами, которые мы использовали в недавнем исследовании18. Мы выбрали наши размеры микросферы здесь, чтобы предоставить диапазон размеров, которые дополняют недавнее исследование. Мы использовали два коммерческих флуоресцентных шариковых препарата диаметром 75-90 мкм и 180-212 мкм. На рисунке 1 показана одинаковая плотность флуоресценции и профили в желудке в разных когортах, предполагая, что ни жидкости, ни частицы не удерживаются дифференциально желудком. Оригинальные данные, представленные здесь, демонстрируют, как тонкая кишка мышей дикого типа по-разному обрабатывает жидкости и микроскопические твердые вещества. До сих пор мы использовали бусины одного размера в каждом независимом эксперименте. Будущие исследования могут быть сосредоточены на том, как обрабатываются смеси частиц разного размера, и смешивании флуоресцентных жидкостей различных физических свойств с флуоресцентными шариками, чтобы определить, как более реалистичные смеси химуса обрабатываются тонкой кишкой.

Различия в распределении, о которых сообщается здесь, свидетельствуют о различии в паттернах подвижности, активируемых материалами с различными свойствами. Мы постулируем, что баланс сегментации и двигательных сокращений определяет, как далеко и как однородно материалы проходят через тонкую кишку. Геометрический центр для мелких бусин находится дальше вдоль тонкой кишки по сравнению с жидкостями, предполагая, что мелкие твердые частицы участвуют в пропульсивных сокращениях. С другой стороны, в то время как геометрический центр для более крупных бусин похож на жидкость, спектральный анализ показывает значительные различия в пространственном распределении, что может быть результатом большего сегментирования сокращений в более крупном расположении бусин. Мы предполагаем, что тонкая кишка использует дискриминацию по размеру, тип механосенсорной цепи, в качестве одного из входов, которые влияют на определение баланса между типами сокращения. Например, нейроны типа II Догиэля являются механосенсорными нейронами, которые, как предполагается, играют роль в направлении перехода от пропульсивных к сегментирующим сокращениям16,34. Эти интригующие спекуляции требуют дальнейших исследований, чтобы определить механизмы, с помощью которых желудочно-кишечный тракт ощущает физические свойства и преобразует их в физиологические выходы, такие как сокращения.

Мы считаем, что этот протокол будет полезен в качестве дополнительного инструмента для преодоления разрыва между молекулами и клетками и функцией органов. Мы признали, что эпителиальные механорецепторы ЖКТ имеют сходство развития и структуры с механорецепторами кожи35. Используя протокол, описанный выше, мы помогли продемонстрировать сенсорную роль «прикосновения кишечника», когда эти эпителиальные механорецепторы ЖКТ воспринимают легкие механические стимулы и участвуют во внутренней тактильной чувствительности18. Мы ожидаем, что этот протокол окажется столь же полезным для изучения того, как другие сенсорные цепи способствуют транзиту тонкой кишки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой.

Acknowledgments

Мы благодарим г-жу Линдсей Басби за административную помощь и г-на Джоэла Пино за поддержку со стороны средств массовой информации. Гранты NIH поддержали эту работу: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 и Центр клеточной сигнализации в гастроэнтерологии клиники Майо (DK084567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664 other mice can be used with this protocol
Dissection tools n/a n/a
Excel software Microsoft n/a used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g "smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g "larger beads" in the manuscript
Gavage needles Instech FTP-18-50-50
ImageJ software n/a n/a used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house) n/a n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) Sigma M0262
Photoshop software Adobe n/a used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma r8881-100mg "liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
  3. Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
  4. Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
  5. Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
  6. Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
  7. Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
  8. Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
  9. Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
  10. Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
  11. Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
  12. Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
  13. Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
  14. Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
  15. Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
  16. Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
  17. McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
  18. Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
  19. Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
  20. Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
  21. Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
  22. Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
  23. Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
  24. Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
  25. Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  26. Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
  27. Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
  28. Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
  29. Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  30. Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
  31. Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
  32. Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
  33. Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
  34. Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
  35. Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).

Tags

Медицина выпуск 181
Изучение механозондирования просветных частиц мышей тонкой кишки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mercado-Perez, A., Wegner, A.,… More

Mercado-Perez, A., Wegner, A., Knutson, K., Zumchak, M., Beyder, A. Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates. J. Vis. Exp. (181), e63697, doi:10.3791/63697 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter