Summary
소장이 다양한 크기의 미립자를 처리하는 방법을 연구하기 위해 우리는 소장 통과를 결정하기 위해 확립된 생체 내 방법을 수정했습니다.
Abstract
위장(GI) 운동성은 정상적인 소화 및 흡수에 매우 중요합니다. 영양분을 흡수하는 소장에서 운동성은 소화와 흡수를 최적화합니다. 이러한 이유로, 소장의 운동성 패턴 중 일부는 내강 내용물의 혼합을위한 분할과 추진을위한 연동 운동을 포함한다. 루미 날 내용물의 물리적 특성은 소장 운동성의 패턴을 조절합니다. 내강 내용물과 기본 장 운동성을 전달하여 GI 기계 감각 회로의 기계적 자극은 복잡한 GI 모터 패턴을 시작하고 조절합니다. 그러나이 과정을 주도하는 기계 감각 메커니즘은 제대로 이해되지 않고 있습니다. 이것은 주로 소장이 다른 물리적 특성의 물질을 처리하는 방법을 해부하는 도구가 부족하기 때문입니다. 소장이 다양한 크기의 미립자를 처리하는 방법을 연구하기 위해 우리는 소장 통과를 결정하기 위해 확립된 생체 내 방법을 수정했습니다. 우리는 형광 액체 또는 작은 형광 구슬로 살아있는 쥐를 위축합니다. 30분 후, 우리는 장을 해부하여 위장관 전체에 걸친 형광 내용물의 분포를 이미지화합니다. 기하학적 중심의 고해상도 측정 외에도 가변 크기 비닝 및 스펙트럼 분석을 사용하여 다양한 물질이 소장 이동에 어떤 영향을 미치는지 결정합니다. 우리는 최근에 발견 된 "장 접촉"메커니즘이이 접근법을 사용하여 소장 운동성에 어떻게 영향을 미치는지 탐구했습니다.
Introduction
인간 위장관(GI)은 수 피트 길이의 장기 시스템으로, 다양한 치수와물리적 특성의 튜브로 대략 근사합니다1. 내용물이 길이를 따라 이동함에 따라 위장관의 주요 기능은 생명에 중요한 물질을 흡수하는 것입니다. 소장은 특히 영양소 흡수를 담당합니다. 소장의 통과는 소화 및 흡수 기능에 맞게 엄격하게 조절되어 다양한 운동성 패턴을 생성합니다. Bayliss와 Starling은 1899 년에 "장의 법칙"2을 기술하여 오늘날 연동 반사로 알려진 장의 수축 추진 프로그램을 보여줍니다. 식품 덩어리에 가까운 세그먼트는 그것을 앞으로 추진하기 위해 수축하고 원위 세그먼트는 그것을 받기 위해 이완됩니다. 이론적으로이 패턴만으로도 물질을 낙태 적으로 운반하기에 충분할 수 있지만 한 세기가 넘는 연구를 통해 위장관의 수축 활동에 대한보다 복잡한 그림이 그려졌습니다. 인간에서 세 가지 소장 운동 기간이 인식됩니다 : 이동 운동 복합체 (MMC), 금식 기간 및 식후 기간3. 동일한 패턴이 마우스 4,5에서보고되었습니다. MMC는 대부분의 포유동물에 걸쳐 보존된 순환 운동 패턴이다(6,7). MMC는 기능성GI 장애7에서 유용한 임상 마커로서 작용하는 특징적인 4상 패턴을 갖는다. 발생 순서의 4 단계는 (I) 정지, (II) 불규칙하고 낮은 진폭 수축, (III) 규칙적인 고 진폭 수축 및 (IV) 활동 감소의 램프 다운 기간7입니다. MMC는 금식 기간3의 주요 운동 패턴을 표시합니다. 금식 기간의 MMC는 다음 식사를 준비하기 위해 소장의 내용물을 깨끗이합니다.
식후 기간의 운동 패턴은 소화 및 흡수 기능에 최적화되어 있습니다3. 칼로리 구성에 관계없이 초기 이동은 소장을 따라 빠르며 내용물은 장의 길이를 따라 퍼지고 이후 이동이 느려집니다8. 흡수는 접촉 표면적을 늘리고 속도를 늦추어 체류 시간을 늘림으로써 최적화됩니다. 영양소가 내강 내부에 있으면 지배적 인 패턴은 가까운 (<2cm 간격의) 조정되지 않은 수축 (분할 수축)으로 구성되며, 소장의 전체 길이에 걸쳐 몇 개의 겹쳐진 큰 진폭 수축 (연동 수축)9. 분할 수축은 관강 내 내용물을 제자리에 혼합합니다. 때때로 큰 연동 수축은 내용물을 결장쪽으로 추진합니다.
MMC로 다시 전환하는시기는 음식의 양과 칼로리 조성에 달려 있습니다10. 따라서, 소장 샘플은 운동성 기간 사이의 전환시기를 조절하기 위해 내강 신호를 샘플링합니다. 내강 내용물(11)의 물리적 특성, 내강 부피 및 벽 장력과 같은 기계적 단서는 GI 벽(12,13,14,15,16) 내의 기계수용체 세포에 관여한다. 실제로, 식사의 고체 성분을 증가시키는 것은 소장 통과의 증가로 이어진다17. 우리는 관강 내 내용물의 액체 또는 고체 상태와 같은 물리적 특성이 GI 벽(18)에서 생성하는 다양한 힘으로 인해 다른 기계 수용체와 결합해야한다고 추측합니다.
마우스에서와 같이 인간의 생체 내 GI 통과를 측정하기위한 황금 표준은 신티그라피로 측정 한 방사성 추적자가 위를 빠져 나가거나 결장을 따라 이동할 때 사용하는 것입니다19,20. 포유류에서 소장은 예측할 수 없는 방식으로 순환하여 소장을 생체 내에서 안정적으로 이미지화하기 어렵게 만들지만 진전이 이루어지고 있습니다21. 또한, 현재 소장이 다양한 특성과 크기의 미립자를 처리하는 방법을 정량화하는 도구가 부족합니다. 여기서 출발점은 소장 통과 22,23,24 및 장벽 기능 22에 대한 연구를 표준화하는 금 표준 기술이었습니다. 형광 물질로 마우스를 위영하고, GI 운동성이 물질을 운반 할 때까지 기다리고, 위관을 절제하고, 위에서 결장까지 여러 섹션으로 분할하고, 절편화하고, 형광 정량화를 위해 관강 내 내용물을 균질화하는 것으로 구성됩니다. 두 가지를 개선했습니다. 먼저, 우리는 소장이 물리적 미립자를 어떻게 분포시키는지 결정하기 위해 형광 현미경 비드를 포함하도록 위압 내용물의 구성을 변경했습니다. 둘째, 위와 결장까지 생체 외 전체 위장관을 이미징하여 공간 해상도를 개선하고 다양한 크기의 비닝을 사용하여 동물에 대한 분석을 표준화했습니다. 우리는 이것이 식후 단계에서 추진력과 분할 수축의 균형에 대한 새로운 통찰력을 보여준다고 가정합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 Mayo Clinic의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 설정
- 8-10 주 된 마우스를 4 시간 동안 빠르게 만듭니다. 생쥐에게 물을 제공하십시오.
참고: 여기에 제시된 모든 실험에 야생형 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하지만 모든 균주, 성별 및 유전자형의 마우스에서 수행할 수 있습니다. - 4°C 냉장고의 50mL 원뿔형 튜브에 증류수 15mL를 식힙니다.
- 자석 교반 막대가 있는 핫 플레이트를 사용하여 비커에서 증류수 15mL를 추가로 약 80-90°C로 가열합니다.
- 총 30mL(0.15g)에 대해 0.5% 메틸셀룰로오스를 측정합니다.
- 메틸 셀룰로오스가 뭉치지 않도록 뜨거운 물 15mL에 부드럽게 첨가하십시오. 이 과정에서 메틸 셀룰로오스 용액이 흐려집니다.
- 용해되면 핫 플레이트에서 비커를 제거하고 뜨거운 비커에 냉각수 15mL를 추가합니다.
- 용액이 투명해질 때까지 약 15-20분 동안 4°C 냉장고에 넣습니다.
- 투명해지면 0.5% 메틸셀룰로오스 용액 5mL당 로다민 이소티오시아네이트(RITC)-덱스트란 3mg의 무게를 달고 혼합하여 결합합니다. 대표 결과 섹션의 액체 상태입니다.
- 또는 25mg의 형광 폴리에틸렌 마이크로스피어를 칭량하고 잘 혼입될 때까지 200μL의 메틸셀룰로오스 용액과 혼합합니다. 미세 구체의 철저한 통합은 위관 영양 전에 와류에 의해 보장됩니다. 실험자는 혼합물에서 부유 된 미세 구의 균일 한 분포를 시각화 해야합니다 .
- RITC-덱스트란 용액은 빛에 민감하므로 용액을 냉장 보관하십시오. RITC- 덱스 트란 용액과 마이크로 슈퍼 혼합물을 미리 준비하고 2 개월 이내에 사용하십시오. 사용하기 전에 마이크로스피어 혼합물을 재현탁하십시오.
참고: 다양한 크기의 마이크로스피어는 다양한 물질의 위장 처리를 연구하는 데 사용됩니다. 대표 결과 섹션에서는 작은 (직경 : 75-90 μm) 및 큰 (직경 : 180-212 μm) 마이크로 스피어를 사용한 결과를 보여줍니다.
2. 강내 내용물 위관영양
- 1mL 주사기에 18Ga x 50mm 공급 튜브를 부착하고 200μL의 RITC 용액 또는 마이크로스피어 용액을 채취하여 위관영양을 준비합니다.
- 한 손 구속 기술(25)을 사용하여 금식된 동물을 수동으로 제지한다. 적절한 쥐 구속 기술에 대한 기관의 정보를 참조하십시오.
- 마우스의 입과 식도가 위장에 들어갈 때까지 공급 튜브를 부드럽게 삽입하십시오.
참고: 위관 영양 단계는 성공적인 실험에 매우 중요합니다. 각 마우스에 튜브를 거의 같은 거리로 일관되게 삽입할 수 있는 숙련된 손이 필요합니다. 이 단계는 프로토콜을 수행하는 실험자에 의해 표준화되어야합니다. 동일한 실험자는 서로 비교될 모든 마우스 코호트를 개별해야 한다. - 주사기 내용물을 천천히 위장으로 배출하고 마우스에서 튜브를 조심스럽게 제거하십시오.
- 위관영양 후 마우스를 케이지로 되돌립니다.
- 위관 영양관을 폐기하십시오.
- 원하는 수의 동물에 대해 필요에 따라 이 과정을 반복합니다.
3. 장 해부
- 해부를 시작하기 전에 생체 내 이미징 기기를 켜서 온도에 도달하도록 합니다.
- 위관 영양 후 30 분 동안 마우스를 희생하십시오. 이산화탄소 흡입을 사용하여 마우스를 희생 한 다음 자궁 경부 탈구를 사용하여 성공적인 안락사를 보장하십시오.
- 성공적인 안락사를 확인한 후 마우스를 해부 단계에서 앙와위 자세로 놓고 4 개의 부속기를 무대에 고정하여 복부에 접근 할 수 있도록합니다. 복부 표면을 70 % 에탄올로 적셔 복부 털을 적시십시오.
- 미세 해부 집게를 사용하여 피부를 당기고 날카로운 수술 가위를 사용하여 항문 위 1cm의 가로 절개를합니다. 복강 내 구멍을 노출하려면 흉곽까지 복부 위로 수직으로 절개를 계속하십시오.
- 미세 해부 집게로 맹장을 왼쪽으로 부드럽게 움직여 원위 결장을 노출시킵니다.
- 직장 바로 근위에있는 미세 해부 가위로 원위 결장을 자릅니다.
- 결장, 맹장, 소장을 반대 방향으로 천천히 당겨 부드럽게 풉니 다.
참고: 해부된 장을 하나의 연속 세그먼트로 유지하면 조사자가 가장 쉽게 할 수 있습니다. 세그먼트를 따라 찢어지고 찢어지면 후속 단계가 더 어려워집니다. - 미세 해부 가위를 사용하여 위 근위를 자릅니다.
- 집게를 사용하여 해부 된 장을 측정 시트로 옮깁니다 (그림 1). 위를 0mm에 놓고 통치자를 따라 장을 200mm까지 배열하십시오. 미세 해부 가위를 사용하여 200mm로 자릅니다. 장의 방향이 혼동되지 않는다는 확신을 유지하면서 자를 따라 장을 0mm에서 200mm까지 정렬하는 이 과정을 반복합니다.
- 통치자에 정렬하는 동안 장을 늘리지 않도록주의하십시오.
- 조직이 통치자에 배열되면 맹장이 조직과 평행하지만 직접 접촉하지 않도록 배열하십시오 (해당 영역 내에서 형광이 발견되면 맹장과 장의 명확한 차이가 필요합니다).
- 해부된 조직이 있는 측정 시트를 어두운 영역에 놓아 이미징할 때까지 형광을 보존할 수 있도록 합니다.
4. 생체 외 이미징
- 생체 내 이미징 소프트웨어를 열고 로그인합니다.
- 이미징 기기를 초기화하여 이미지 획득 준비를 합니다.
- '여기' 및 '방출' 필드를 비드 또는 RITC 위관영양에 사용된 해당 색상으로 설정합니다. 빨간색(액체): 여기 535nm/방출 600nm. 녹색(마이크로스피어): 여기 465nm/방출 520nm.
- 노출을 '자동'으로 설정합니다.
- 보기 필드를 선택합니다.
- 측정 시트를 기기에 넣기 전에 운송 중에 장이 움직이지 않았는지 확인하십시오.
- 측정 시트를 시야 내의 기기에 놓습니다.
- 측량기 도어를 단단히 닫고 스냅샷 을 선택하여 시야를 촬영합니다.
- 분석을 위해 수집한 사진을 플래시 드라이브에 저장합니다. 형광등 및 사진 이미지의 개별 캡처를 저장합니다. 사진과 형광의 오버레이는 위장관에서 형광 물질의 위치를 나타냅니다(그림 1).
참고: 다운스트림 처리를 위해 파일을 태그 이미지 파일(.tif) 형식으로 저장하는 것이 좋습니다.
5. 분석
- 사진 편집 소프트웨어에서 형광등 및 사진 이미지 파일을 엽니다.
- 정확히 동일한 크기를 갖도록 두 이미지의 픽셀 크기를 조정합니다(여기서는 두 이미지를 1280픽셀 x 850픽셀[높이 x 너비]로 설정하는 것이 규칙이었습니다).
- 사진 파일을 닫습니다. 다음 단계에는 형광 이미지만 포함됩니다.
- 지우개 도구를 사용하여 배경을 제거하고 투명하게 만듭니다. 나머지 배경의 패치를 제거하려면 지우개가 필요할 수 있습니다.
- 새 레이어를 만듭니다. 형광 신호에 대해 완전히 검은색 배경으로 만듭니다. 이것은 레이어에 검은 색 채우기를 선택하고 레이어를 드래그하여 형광 이미지가있는 레이어 아래에 놓으면 가능합니다.
- 검은색 배경에 형광 신호만 포함된 새 형광 이미지를 새 .tif 파일로 저장합니다.
- ImageJ에서 새 형광등 및 사진 이미지를 엽니다.
- 이미지 > 유형 > 32비트를 선택하여 각 이미지를 32비트 이미지로 변환합니다.
- [이미지] > [ 색상] > [채널 병합]을 선택하여 두 이미지를 모두 병합합니다. 대화 상자가 열리면 회색 채널의 사진 파일을 선택하고 컬러 채널 아래의 형광 파일을 선택합니다.
- [분석> 배율 설정 > 클릭하여 배율 제거]를 선택하여 병합된 이미지의 배율을 끕니다.
- ImageJ에서 "사각형"도구를 선택하십시오.
- 작은 장의 한 부분 주위에 직사각형을 그립니다. 이 관심 영역(ROI)의 너비는 모든 ROI 간에 일정하게 유지되어야 하므로 세심한 주의를 기울이십시오. 공칭 값은 필수적인 것이 아니라 이 이미지에 그려진 모든 ROI에서 일관되게 유지된다는 점뿐입니다[소장이 여러 행을 차지하기 때문에 개별 ROI가 다른 행의 소장의 각 섹션에 그려집니다(그림 1)]. 그림 2 에서는 ImageJ 도구 모음에서 너비 값의 위치를 보여 줍니다.
- 이미지 > 복제를 선택하여 ROI를 복제합니다. 컬러 채널에 해당하는 채널만 선택합니다.
- 사각형 도구를 다시 사용하여 전체 새 이미지에 ROI를 그립니다.
- 분석 > 플롯 프로파일을 선택하여 형광 프로파일을 검색합니다. 결과 그래프는 ROI의 길이에 따라 각 픽셀의 평균 강도를 y축에 표시합니다. 이것은 5.12 단계에서 소장의 분석 된 섹션의 길이로 선택되었습니다.
- 값 목록을 열고 스프레드시트 소프트웨어에 복사합니다.
- 다른 눈금자 행에있는 소장의 각 섹션에 대해 5.12-5.16 단계를 반복하십시오. 동일한 스프레드시트 파일의 값을 각 이전 값 집합 바로 아래에 붙여넣어 해당 열의 모든 연속 행에 소장의 전체 길이에 대한 평균 강도 값이 포함되도록 합니다.
- 스프레드시트 소프트웨어에서 각 평균 강도 값에 5.12단계에서 생성된 ROI 사각형의 상수 너비를 곱합니다. 이렇게 하면 각 지점에서 소장을 따라 실제 강도 값이 생성됩니다.
알림: 동물마다 소장 길이에 약간의 차이가 있습니다. 길이 차이가 다운스트림 데이터 분석의 결과에 영향을 미치지 않도록 하려면 강도 값 문자열을 모든 실험 샘플에서 일관된 수의 빈으로 묶어야 합니다(그림 3, 그림 4 및 그림 5는 세 가지 빈 크기에 대한 결과를 표시합니다). - 강도 값의 수를 원하는 빈 수로 나눕니다. 결과 몫 S 는 각 Bin에 포함되는 강도 값의 수를 결정합니다.
- 라운드업 공식을 사용하여 각 원시 강도 값이 이동할 구간차원을 결정합니다. 이 단계에서는 각 원시 강도 값을 저장소에 넣습니다. 각 원시 강도 값은 정수 N으로 시간순으로 인덱싱됩니다. 몫 N/S 는 각 원시 값에 할당된 빈 번호를 결정합니다. 반올림 공식은 이 몫을 소수 자릿수가 없는 정수로 반올림해야 합니다.
- averageif 수식을 사용하여 각 bin에 대한 값을 생성합니다. 목표는 5.20단계에서 특정 bin에 할당된 원시 값의 평균을 구하는 것입니다. 따라서 수식의 인수는 (1) 5.20단계에서 생성된 할당된 빈, (2) 빈 번호, (3) 원시 강도 값이어야 합니다.
참고: 비닝된 데이터에 대해 수행할 수 있는 첫 번째 분석은 소장을 따라 가장 높은 형광 강도를 얼마나 멀리 관찰하는지 정량화하는 기하학적 중심 분석입니다(그림 4). - 총 형광 강도에 대한 각 강도 값을 정규화합니다. 즉, 각 강도 값을 모든 강도의 합으로 나눕니다.
- 정규화된 각 값에 빈 번호를 곱합니다. 제품은 각 빈의 상대적 중량을 반영하여 총 형광 강도에 기여합니다.
- 5.23단계에서 생성된 모든 값을 더하면 형광 신호의 중심에 빈 번호가 생성됩니다. 빈 수로 나누어 기하학적 중심을 형광 중심이 이동한 소장의 비율로 표현합니다.
참고: 신호의 공간 분포를 반영하기 위해 다음 단계는 비닝된 강도 데이터 세트의 전력 스펙트럼을 생성하는 것입니다(그림 5). - 스프레드시트 소프트웨어에서 FFT(고속 푸리에 변환) 마법사를 엽니다. 입력을 구간차원화된 데이터 세트로 선택하고 출력을 bin과 동일한 행 수의 빈 세트로 선택합니다.
- FFT의 실제 값 성분을 추출합니다.
- FFT의 각 실제 값을 두 번째 거듭제곱으로 올립니다. 이것은 파워 스펙트럼의 데이터 세트를 산출합니다.
- 파워 스펙트럼 데이터 세트의 전반부를 선택하고 후반부 아래에 놓이도록 이동합니다. 이것은 다음 단계에서 플로팅될 때 중심 주파수를 중심으로 파워 스펙트럼을 중심에 두는 효과가 있습니다.
- x-y 그래프의 y-축에 검정력 스펙트럼을 플로팅합니다. 여기서 x-축 값은 -1 x (빈 수/2)에서 (빈 수/2) -1 사이입니다. 1000개의 Bin의 경우 축 값의 범위는 -500에서 499까지입니다.
- 각 동물에 대한 파워 스펙트럼은 0이 아닌 피크의 확산과 이러한 0이 아닌 피크의 높이를 기준으로 비교되어야합니다.
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Representative Results
3단계부터 대표적인 결과를 보여줍니다. 그림 1 은 형광 측정이 겹쳐진 온전한 이식된 장을 보여줍니다. 위 (보라색)는 소장 (주황색)과 같은 축을 따라 놓여 있지만 대장 (주황색)과 겹치지 않도록 맹장 (파란색)을 옆으로 움직이는 것을 선호합니다. 왼쪽 패널에서 알 수 있듯이 장기 크기로 인해 항상 가능한 것은 아닙니다. 우리는 연속 세그먼트의 적용 범위를 최대화하기 위해 소장을 ~200mm로 절단했지만 장간막이 장을 펼치는 능력을 제한하고 형광 알갱이나 맹장과 같은 구조를 절단하지 않는 것을 선호하기 때문에 이것이 항상 가능한 것은 아닙니다. 그림 1 의 왼쪽 패널에 있는 빨간색 강도와 중간 및 오른쪽 패널의 녹색 강도가 서로 다른 크기의 그룹으로 정렬되어 그림 3을 생성합니다. 분석을 위해 주황색 ROI(소장) 내의 강도만 추출됩니다. 소장의 전체 길이 (각 패널의 모든 주황색 ROI)가 분석을 위해 추출됩니다. 주황색 ROI는 ImageJ에 표시된 것과 동일한 너비입니다(그림 2). 비닝 전에 모든 강도를 순서대로 배치하여 함께 스티칭됩니다. 도 3 은 코호트당 평균 형광 추적 ± SEM을 보여주고; 자세한 내용은 그림 범례를 참조하십시오.
마지막 두 그림은 분석 결과를 보여줍니다 : 기하학적 중심 및 전력 스펙트럼. 기하학적 중심은 그림 3에서 형광 신호의 평균 위치를 측정하고 각 빈의 신호 강도로 평균을 측정합니다. 따라서 추적의 피크가 높을수록 평균이 해당 피크의 위치에 더 가깝게 당겨집니다. 기하학적 중심은 강내 내용물의 공간적 분포를 완전히 특성화하지 못합니다. 예를 들어, 단일 지점에 집중된 볼루스와 동일한 지점을 중심으로 한 확산 신호에서 동일한 기하학적 중심을 얻을 수 있습니다. 기하학적 중심 측정의 이러한 한계는 액체와 더 큰 비드 간의 비교에서 분명합니다(그림 3 및 그림 4). 액체 형광 트레이스의 대부분은 두 개의 초기 피크를 중심으로 하는 반면, 더 큰 비드는 소장의 전체 길이를 따라 여러 피크를 보여줍니다(그림 3, 왼쪽 및 오른쪽 패널). 더 큰 비드의 형광 흔적은 더 많이 분포되어 있지만 비닝 입도에 관계없이 액체의 형광 흔적과 유사한 지점까지 평균화되어 기하학적 중심에만 초점을 맞추는 한계를 강조합니다(그림 4). 소장 수축의 분배 특성을 설명하기 위해, 우리는 파워 스펙트럼 분석을 프로토콜에 통합했습니다. 파워 스펙트럼 분석은 공간의 형광 분포를 서로 다른 공간 주파수의 여러 정현파 곡선으로 분해하여 작동합니다. 각 공간 주파수는 형광 추적에서 임의로 선택된 두 점 사이의 거리를 반영합니다. 이러한 거리 중 일부는 다른 거리보다 더 자주 발생하므로 각각은 강도 (힘)에 기인합니다. 검정력은 두 개의 임의 점이 해당 거리만큼 얼마나 자주 분리되는지와 관련이 있습니다. 전력 스펙트럼을 플로팅하여(그림 5), 측정된 신호에 기여하는 공간 주파수의 수(스펙트럼 확산)를 보여주고 이러한 기여도의 상대적 강도(스펙트럼 높이)를 비교할 수 있습니다. 이를 통해 우리는 위장관을 따라 형광의 확산을 정량적으로 설명 할 수 있습니다.
그림 1. 해부된 창자는 이식되어 사진 촬영 및 형광 측정 전에 적층된 자 종이 위에 놓입니다. 형광 강도는 위관영양 물질의 천연 형광과 일치하도록 오버레이되고 유사 착색됩니다. 왼쪽: 적색 스펙트럼의 액체 로다민 이소티오시아네이트(RITC) 형광; 중간: 작은(직경: 75-90 μm) 및 오른쪽: 더 큰(직경: 180-212 μm) 비드는 모두 녹색 스펙트럼에서 형광을 발합니다. 보라색, 주황색, 파란색 및 분홍색 상자는 각각 각 표본의 위, 소장, 맹장 및 결장의 관심 영역(ROI)을 둘러싸고 있습니다. 각 ROI의 너비는 다운스트림 분석 중에 원시 형광 강도를 계산할 때 혼동을 피하기 위해 행 간에 일관되게 유지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. ImageJ 도구 모음에서 관심 영역 너비(픽셀 단위)의 위치(노란색 밑줄)입니다. 다시 말하면, 너비는 스케일이 제거 된 경우에만 픽셀 단위로 표시됩니다 (5.10 단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 형광은 작은 장의 길이를 따라 추적합니다. 선은 주어진 빈에서의 평균 형광을 나타낸다. 음영 영역은 평균(SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 형광 물질의 분포는 관내 내용물 (컬럼)의 재료 특성에 따라 다릅니다. 왼쪽: 위관 영양 후 30분 후에 몇 개의 소장 세그먼트에 걸쳐 액체(n = 7마리의 마우스) 분포. 중간 및 오른쪽 : 작은 (n = 6 마우스) 및 큰 (n = 5 마우스) 비드는 위관 영양 후 30 분 후에 소장을 따라 더 넓게 분포합니다. 동일한 원시 데이터 세트를 정렬하는 데 사용되는 구간차원 수를 늘리면 더 적은 수의 빈(행)으로 해결할 수 없는 세분화된 추적 기능이 나타납니다. 더 작은 빈은 측정 불확실성을 줄이고 공간 분해능을 높이며 소장 수축의 분배 구성 요소를 더 잘 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 액체 RITC로 위관 영양 후 30 분 후에 소장에서 형광 분포의 기하학적 중심, 작은 비드 (75-90 μm) 및 큰 비드 (180-212 μm) (평균 ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, Bonferroni 보정을 갖는 일원 분산 분석). 빈 크기는 작은 비드가 위관 영양 후 30분 후에 액체보다 더 멀리 운반된다는 통과 해석에 영향을 미치지 않지만, 큰 비드는 너무 넓게 분포되어 액체 및 작은 비드와 비교하여 기하학적 중심에 큰 차이가 없습니다(*P < 0.05. ns = 통계적으로 유의하지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 전력 스펙트럼은 재료 속성(열)과 빈 크기(행)로 분류됩니다. 공간 해상도의 개선과 더 작은 비닝이 분명합니다. 맨 윗줄: 넓게 비닝된 스펙트럼에서 몇 가지 차이점을 구별할 수 있습니다. 맨 아래 줄: 빈 크기가 줄어들면 큰 구슬의 스펙트럼에는 존재하지만 작은 구슬의 스펙트럼에는 존재하지 않는 상당한 우성 주파수를 볼 수 있습니다. 이러한 추가 우성 주파수 중 전부는 아니지만 일부는 액체 스펙트럼에 존재합니다. 맨 아래 행 스펙트럼을 사용하여 그림 3의 형광 트레이스와 비교할 수 있습니다. 그림 3에서 액체 형광 트레이스는 두 개의 두드러진 피크를 표시하며, 이는 전력 스펙트럼의 몇 가지 주요 피크와 상관 관계가 있습니다. 그림 3 의 작은 비드 트레이스는 전력 스펙트럼의 단일 우세 피크와 상관 관계가 있는 단일 우세 피크를 표시합니다. 그림 3 의 더 큰 비드 트레이스는 더 많은 주요 피크를 표시합니다. 따라서, 전력 스펙트럼은 더 많은 수의 우세 주파수를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위장관은, 혈관과 같은 다른 관형 기관들처럼, 항상성26,27,28을 유지하기 위해 기계적 센서 및 이펙터를 필요로 한다. 그러나 위장관은 그것을 가로 지르는 물질의 물리적 특성이 식사 전반에 걸쳐 일정하지 않다는 점에서 독특합니다. 다양한 물리적 특성 (고체, 액체 및 기체)의 강내 내용물은 장을 통과하여 GI 기계 수용체에 서로 다른 기계적 입력을 생성합니다. 실제로, 결장의 다른 기계적 자극은 별개의 경로29에 의해 감지되고 전달됩니다.
이 프로토콜은 일상적인 마우스 작업을 수행하는 모든 사람이 기술적으로 액세스할 수 있지만 몇 가지 중요한 단계는 세심한 주의가 필요합니다. 우리는 공복 마우스가 형광 신호를 희석시키는 이전 식사의 기여를 제거하기 때문에 연구를 시작하기 전에 중요하다는 것을 발견했습니다. 더욱이, 표준 사료를 먹인 마우스는 식이 성분, 특히 엽록소 성분30으로부터 강내 형광을 나타낸다. 금식 및 형광단 선택을 통해 차우 형광이 이 프로토콜에 설명된 실험의 제어된 조건을 방해하는 것을 방지합니다. 실험자는 선택한 금식 기간이 균주, 연령 또는 성별에 따라 다를 수 있으므로 소장에서 비특이적 형광을 제거하기에 충분하다는 것을 독립적으로 확인하는 것이 좋습니다. 실험자는 위관 영양 내용물의 균질 한 분포를 시각적으로 평가해야합니다. 그렇지 않으면 전달 및 연구 결과에 불확실성이있을 것입니다. Gavages는 동일한 실험자, 바람직하게는 기술에 대한 경험이 있는 사람이 일관되게 수행해야 합니다. 실험자는 내용물을 위장에 일관되게 전달하는 것을 목표로해야합니다. 식도 또는 위에서만 형광을 발견하는 것은 소장이 위관 영양 내용물에 동일한 접근 권한을 가지고 있는지 확실하지 않기 때문에 분석에서 동물을 제외시키는 근거입니다. 게이 베이징 후, 대기 시간은 초기 또는 늦은 운송 단계가 관심 대상인지 여부에 따라 15 분으로 단축되거나 90 분으로 연장 될 수 있습니다22. 액체 위관영양을 사용한 원래 프로토콜은 대부분의 물질이 30분 후에 소장에 존재한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 해부 단계에서 서둘러 작업하는 것이 중요하지만, 관강 내 내용물의 위치를 방해하지 않고 위장관이 파열되지 않도록주의해야합니다.
이 프로토콜은 형광/방사능 측정22,23,24 이전에 소장을 5-10개의 세그먼트로 절단하고 균질화된 관강 내 내용물을 물리적으로 비닝하는 이전에 발표된 접근 방식에서 발전했습니다. 이전 접근 방식은 소장 통과 측정을 표준화했기 때문에 중요했습니다. 소장은 복강 내에서 복잡하고 예측할 수없는 패턴으로 악명이 높습니다. 이미징 기반 통과 연구는 종31,32에 관계없이 도전적입니다. 우리의 프로토콜은 인간에게 확장 될 수없는 최종 실험으로 남아 있지만, 우리는 공간 해상도를 크게 개선하고 그 개선을 포착하여 지역 통과를 해결하고 소장 내 확산에 대한 편견없는 측정으로 변환합니다 (파워 스펙트럼).
이 프로토콜에서 공간 해상도는 이미징 시스템의 카메라 해상도에 의해 제한됩니다. 비닝은 동물에 걸쳐 소장 길이를 정상화하기 때문에 관강 내 내용물의 평균 위치를 직접 비교할 수 있습니다. 그림 3 은 큰 빈 크기로 인한 급격한 평활화, 불확실성 증가 및 분해능 감소를 명확하게 보여줍니다. 기하학적 중심은 위장관을 따라 형광 중심을 정량화합니다(그림 4). 예상대로 이 측정값은 빈 크기의 영향을 크게 받지 않습니다. 전력 스펙트럼은 그림 3의 형광 트레이스에서 피크 및 확산 분석을 표준화하는 편향되지 않은 보완적인 방법입니다. 분해능을 개선하면 계산된 스펙트럼이 개선되어 형광 트레이스 간의 가시적인 차이를 입증할 수 있습니다(그림 5). 저해상도(10개 빈)에서는 형광 흔적을 보면 우주에서 유사하게 분포되지 않는다는 것이 분명하더라도 기하학적 중심 또는 스펙트럼 평가로 액체와 더 큰 비드를 구별하기 어려울 것입니다. 더 높은 해상도(1000개 빈)에서 기하학적 중심은 여전히 유사하지만(기하학적 중심이 평균 측정값이라는 사실 때문에) 전력 스펙트럼을 사용하여 두 코호트를 구별할 수 있습니다. 형광 흔적은 최첨단 측정과 같은 다른 유형의 분석에 적합합니다. 기하학적 중심의 예상 변화는 실험을 시작하기 전에 표본 크기 계산 중에 사용할 수 있습니다. 액체가 대략 0.4-0.518의 기하학적 중심을 갖는다는 것을 알고, 우리는 최대 45%의 변화를 통계적으로 해결하기 위해 각 그룹에서 적어도 5마리의 마우스를 사용하였다.
우리는 범위를 확장하고이 프로토콜을 사용하여 소장 내 고체의 이동을 연구했습니다. 액체와 마찬가지로, 우리는 고체 미세 구체를 위장에 넣었습니다. 유문 괄약근은 위 - 소장 전이에 있습니다. 이 괄약근은 크기 제외 필터로 작동합니다. 마우스에서 크기 컷오프는 ~300μm이고 미립자 <300μm는 소장으로 들어갈 때 저항이 발생하지 않지만(33), 이 접근법은 최근 연구에서 사용한 약간 더 큰 미립자에서도 작동합니다18. 우리는 최근 연구를 보완하는 다양한 크기를 제공하기 위해 여기에서 마이크로스피어 크기를 선택했습니다. 우리는 직경이 75-90 μm 및 180-212 μm 인 두 가지 상업용 형광 비드 제제를 사용했습니다. 그림 1 은 코호트 전체에서 위장에서 유사한 형광 밀도와 프로파일을 보여 주며, 이는 액체나 미립자가 위장에 의해 차별적으로 유지되지 않음을 시사합니다. 여기에 제시된 원본 데이터는 야생형 마우스의 소장이 액체와 미세한 고체를 어떻게 다르게 처리하는지 보여줍니다. 지금까지 우리는 독립적 인 실험 당 하나의 크기 범위의 비드를 사용했습니다. 향후 연구에서는 다양한 크기의 입자의 혼합물을 처리하는 방법과 다양한 물리적 특성의 형광 유체를 형광 비드와 혼합하여 소장에서 보다 현실적인 chyme 혼합물을 처리하는 방법을 결정하는 데 초점을 맞출 수 있습니다.
여기에 보고된 분포 차이는 서로 다른 특성의 재료에 의해 활성화되는 운동성 패턴의 차이를 시사합니다. 우리는 분할 대 추진 수축의 균형이 물질이 소장을 얼마나 멀리 그리고 얼마나 균질하게 통과하는지 결정한다고 가정합니다. 작은 구슬의 기하학적 중심은 액체에 비해 소장을 따라 더 멀리 있으며, 이는 작은 고체 입자가 추진 수축에 관여함을 시사합니다. 반면에, 더 큰 비드에 대한 기하학적 중심은 액체와 유사하지만, 스펙트럼 분석은 공간 분포에서 상당한 차이를 보여주며, 이는 더 큰 비드 설정에서 더 많은 분할 수축의 결과일 수 있습니다. 우리는 소장이 수축 유형 간의 균형을 결정하는 입력 중 하나로 기계 감각 회로의 일종 인 크기 차별을 활용한다고 가정합니다. 예를 들어, Dogiel 유형 II 뉴런은 추진에서 분할 수축으로의 전환을 지시하는 역할을 하는 것으로 추측되는 기계 감각 뉴런입니다(16,34). 이러한 흥미로운 추측은 위장관이 물리적 특성을 감지하고 수축과 같은 생리적 출력으로 변환하는 메커니즘을 결정하기 위해 추가 연구가 필요합니다.
우리는 이 프로토콜이 분자에서 세포, 장기 기능으로의 격차를 해소하는 추가 도구로 도움이 될 것이라고 믿습니다. 우리는 GI 상피 기계 수용체가 피부 기계 수용체35와 발달 및 구조적 유사성을 공유한다는 것을 인식했습니다. 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 우리는 이러한 GI 상피 기계 수용체가 가벼운 기계적 자극을 감지하고 고유 촉각 감도에 참여하는 "직감 접촉"의 감각적 역할을 입증하는 데 도움을 주었습니다18. 우리는이 프로토콜이 다른 감각 회로가 소장 통과에 어떻게 기여하는지 연구하는 데 유사하게 도움이 될 것으로 기대합니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
행정 지원을 해주신 린지 버스비 여사와 미디어 지원을 해주신 조엘 피노 여사님께 감사드립니다. NIH 보조금은 DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 및 위장병 학 세포 신호 전달을위한 메이요 클리닉 센터 (DK084567)에서이 작업을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | other mice can be used with this protocol |
| Dissection tools | n/a | n/a | |
| Excel software | Microsoft | n/a | used for spreadsheet analysis |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g | "smaller beads" in the manuscript |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g | "larger beads" in the manuscript |
| Gavage needles | Instech | FTP-18-50-50 | |
| ImageJ software | n/a | n/a | used to extract fluorescence profile |
| Laminated ruler paper (prepared in-house) | n/a | n/a | |
| Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) | Sigma | M0262 | |
| Photoshop software | Adobe | n/a | used for image processing |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma | r8881-100mg | "liquid" condition in the manuscript |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
References
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