Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Studere Murine Small Bowel Mechanosensing av Luminal partikler

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/63697
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,4
1Enteric NeuroScience Program (ENSP), Division of Gastroenterology & Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Mayo Clinic, 3Easy Learning Labs, 4Department of Physiology & Biomedical Engineering (PBME), Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

For å studere hvordan tynntarmen håndterer partikler av varierende størrelse, har vi modifisert en etablert in vivo-metode for å bestemme tynntarmstransittrasjon.

Abstract

Gastrointestinal (GI) motilitet er kritisk for normal fordøyelse og absorpsjon. I tynntarmen, som absorberer næringsstoffer, optimaliserer motilitet fordøyelsen og absorpsjonen. Av denne grunn inkluderer noen av motilitetsmønstrene i tynntarmen segmentering for blanding av luminalinnhold og peristaltikk for fremdrift. Fysiske egenskaper av luminalinnhold modulerer mønstrene av tynntarmmotilitet. Den mekaniske stimuleringen av GI-mekanosensoriske kretser ved å overføre luminalinnhold og underliggende tarmmotilitet initierer og modulerer komplekse GI-motormønstre. Likevel forblir de mekanosensoriske mekanismene som driver denne prosessen dårlig forstått. Dette skyldes først og fremst mangel på verktøy for å dissekere hvordan tynntarmen håndterer materialer med forskjellige fysiske egenskaper. For å studere hvordan tynntarmen håndterer partikler av varierende størrelse, har vi modifisert en etablert in vivo-metode for å bestemme tynntarmstransittrasjon. Vi gavage levende mus med fluorescerende væske eller små fluorescerende perler. Etter 30 minutter dissekerer vi tarmene for å avbilde fordelingen av fluorescerende innhold over hele GI-kanalen. I tillegg til høyoppløselige målinger av det geometriske senteret, bruker vi binning med variabel størrelse og spektralanalyse for å bestemme hvordan forskjellige materialer påvirker tynntarmstransittrasjonen. Vi har undersøkt hvordan en nylig oppdaget "gut touch" -mekanisme påvirker tynntarmmotilitet ved hjelp av denne tilnærmingen.

Introduction

Den menneskelige gastrointestinale (GI) kanalen er et flere fot langt organsystem, omtrent tilnærmet som et rør av varierende dimensjoner og fysiske egenskaper1. Når innholdet beveger seg gjennom lengden, er GI-kanalens primære funksjon å absorbere stoffer som er kritiske for livet. Tynntarmen er spesielt ansvarlig for næringsopptak. Tynntarmens transitt er tett regulert for å matche fordøyelses- og absorpsjonsfunksjonene, noe som resulterer i forskjellige motilitetsmønstre. Bayliss og Starling beskrev "tarmens lov"2 i 1899, og viste det kontraktile fremdriftsprogrammet i tarmen kjent i dag som den peristaltiske refleksen; segmentet proksimalt for matbolusen trekker seg sammen for å drive den fremover, og det distale segmentet slapper av for å motta det. I teorien kan dette mønsteret alene være tilstrekkelig til å transportere materiale aboralt, men over et århundre med forskning har malt et mer komplekst bilde av kontraktil aktivitet i GI-kanalen. Tre tynntarmmotilitetsperioder er anerkjent hos mennesker: det migrerende motorkomplekset (MMC), fasteperioden og den postprandiale perioden3. De samme mønstrene er rapportert hos mus 4,5. MMC er et syklisk motormønster som er bevart over de fleste pattedyr 6,7. MMC har et karakteristisk firefasemønster som fungerer som en nyttig klinisk markør ved funksjonelle GI-lidelser7. De fire fasene, i rekkefølge av forekomst, er (I) hvile, (II) uregelmessige, lave amplitudekontraksjoner, (III) regelmessige sammentrekninger med høy amplitude og (IV) nedtrappingsperiode med fallende aktivitet7. MMC markerer det viktigste motormønsteret i fasteperioden3. MMC i fasteperioden rydder opp innholdet i tynntarmen som forberedelse til neste måltid.

Motormønstrene i postprandialperioden er optimalisert for fordøyelses- og absorberende funksjoner3. Uavhengig av kalorisammensetning er den første transitten rask langs tynntarmen, innholdet spres langs tarmens lengde, og transitt bremser deretter8. Absorpsjon optimaliseres ved å øke kontaktflaten og bremse den ned for å øke oppholdstiden. Når næringsstoffene er inne i lumen, består det dominerende mønsteret av nære (<2 cm fra hverandre) ukoordinerte sammentrekninger (segmenteringskontraksjoner), med noen få overliggende store amplitudekontraksjoner som spenner over hele tynntarmens lengde (peristaltiske sammentrekninger)9. Segmenteringskontraksjoner blander det intraluminale innholdet på plass. De sporadiske store peristaltiske sammentrekningene driver innholdet mot tykktarmen.

Tidspunktet for denne overgangen tilbake til MMC avhenger av matvolum og kalorisammensetning10. Dermed er tynntarmprøvene luminale signaler for å regulere når man skal overgang mellom motilitetsperioder. Mekaniske signaler, for eksempel fysiske egenskaper til luminalinnhold11, luminalvolum og veggspenning, engasjerer mekanoreceptorceller i GI-veggen 12,13,14,15,16. Å øke den faste komponenten i et måltid fører faktisk til en økning i tynntarmstransitt17. Vi spekulerer i at fysiske egenskaper, som flytende eller fast tilstand av intraluminal innhold, må engasjere forskjellige mekanoreceptorer på grunn av de forskjellige kreftene de genererer på GI-veggen18.

Gullstandarden for måling in vivo GI-transitt hos mennesker, som hos mus, er bruk av radioaktive sporstoffer målt ved scintigrafi når de går ut av magen eller passerer langs tykktarmen19,20. Hos pattedyr sløyfer tynntarmen på uforutsigbare måter som gjør tynntarmen vanskelig å avbilde in vivo pålitelig, men det gjøres fremskritt21. Videre mangler det i dag verktøy for å kvantifisere hvordan tynntarmen håndterer partikler av varierende egenskaper og størrelser. Utgangspunktet her var en gullstandardteknikk som standardiserer studiet av tynntarmstransitt 22,23,24 og barrierefunksjon 22. Den består av gavaging mus med et fluorescerende materiale, venter på GI-motilitet for å transportere materialet, excising GI-kanalen, segmentering i flere seksjoner fra mage til tykktarm, seksjonering og homogenisering av intraluminal innhold for fluorescenskvantifisering. Vi gjorde to forbedringer. Først endret vi sammensetningen av gavaged innholdet for å inkludere fluorescerende mikroskopiske perler for å bestemme hvordan tynntarmen fordeler fysiske partikler. For det andre forbedret vi den romlige oppløsningen ved å avbilde hele GI-kanalen fra mage til kolon ex vivo og brukte binning med variabel størrelse for å standardisere analysen vår på tvers av dyr. Vi postulerer at dette avslører ny innsikt i balansen mellom propulsive versus segmenterende sammentrekninger i postprandialfasen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Mayo Clinic.

1. Oppsett

  1. Raske 8- til 10 uker gamle mus i 4 timer. Gi mus tilgang til vann.
    MERK: Vi bruker villtype mannlige C57BL / 6J-mus for alle eksperimenter som presenteres her, men de kan utføres på mus av hvilken som helst stamme, kjønn og genotype.
  2. Avkjøl 15 ml destillert vann i et 50 ml konisk rør i et 4 °C kjøleskap.
  3. Varm ytterligere 15 ml destillert vann i et beger ved hjelp av en kokeplate med magnetisk rørestang til ca. 80-90 °C.
  4. Mål 0,5% metylcellulose for totalt 30 ml (0,15 g).
  5. Tilsett forsiktig metylcellulose til 15 ml varmt vann slik at det ikke klumper seg. Metylcelluloseoppløsningen vil være uklar under denne prosessen.
  6. Når det er oppløst, fjern begeret fra kokeplaten og tilsett 15 ml kjølt vann til det varme begeret.
  7. Plasser i et 4 °C kjøleskap til oppløsningen er klar, ca. 15-20 min.
  8. Når det er klart, veier du 3 mg rhodaminisotiocyanat (RITC)-dekstran per 5 ml 0,5% metylcelluloseoppløsning og blandes for å kombinere. Dette er væsketilstanden i delen Representative resultater .
    1. Alternativt veier du 25 mg fluorescerende polyetylenmikrosfærer og bland med 200 μL av metylcelluloseoppløsningen til den er godt innarbeidet. Grundig inkorporering av mikrosfærer sikres ved vortex før gavage. Eksperimentøren må visualisere homogen fordeling av suspenderte mikrosfærer i blandingen.
    2. Siden RITC-dextran-oppløsningen er lysfølsom, må oppløsningen oppbevares i kjøleskap. Forbered RITC-dextran-løsningen og microshpere-blandingen på forhånd og bruk innen 2 måneder. Resuspender mikrosfæreblandingen før bruk.
      MERK: Mikrosfærer av varierende størrelse brukes til å studere gastrointestinal håndtering av forskjellige materialer. I delen Representative resultater demonstrerer vi resultatene av å bruke små (diameter: 75-90 μm) og større (diameter: 180-212 μm) mikrosfærer.

2. Intraluminal innhold gavage

  1. Forbered gavage ved å feste et 18 Ga x 50 mm fôringsrør til en 1 ml sprøyte og tegne 200 μL RITC-løsning eller mikrosfæreoppløsning.
  2. Fest det faste dyret manuelt ved hjelp av enhånds fastholdingsteknikk25. Se institusjonens informasjon om riktig murine fastholdelse teknikker.
  3. Sett forsiktig fôringsrøret gjennom musens munn og spiserør til det kommer inn i magen.
    MERK: Gavage-trinnet er avgjørende for et vellykket eksperiment. Det krever erfarne hender som konsekvent kan sette inn røret omtrent samme avstand i hver mus. Dette trinnet må standardiseres av eksperimenter som utfører protokollen. Den samme eksperimentøren bør gavage alle mus kohorter som vil bli sammenlignet med hverandre.
  4. Fjern sprøyteinnholdet sakte i magen og fjern forsiktig røret fra musen.
  5. Etter gavage, returner musen til buret.
  6. Kast gavagerøret.
  7. Gjenta prosessen etter behov for ønsket antall dyr.

3. Tarmdisseksjon

  1. Før du begynner disseksjonene, slå på in vivo bildebehandlingsinstrumentet slik at det kommer til temperatur.
  2. Ofre musen 30 min etter gavage. Bruk karbondioksidinnånding for å ofre musen, etterfulgt av cervikal dislokasjon for å sikre vellykket eutanasi.
  3. Etter å ha bekreftet vellykket eutanasi, plasser musen i liggende stilling på et disseksjonsstadium og fest de fire vedleggene på scenen for å få tilgang til magen. Våt overflaten av magen med 70% etanol for å våte bukhårene.
  4. Bruk mikrodisseksjonstromper til å trekke huden og skaffe skarpe kirurgiske sakser for å lage et tverrgående snitt 1 cm over anus. For å eksponere det intraperitoneale hulrommet, fortsett snittet vertikalt opp i magen til ribbeholderen.
  5. Flytt cecum forsiktig til venstre med mikrodisseksjonstrompene for å eksponere distale kolon.
  6. Klipp distal kolon med mikro-disseksjon saks bare proksimal til endetarmen.
  7. Løs tykktarmen, cecum og tynntarmen forsiktig ved å trekke sakte i motsatt retning.
    MERK: Vedlikehold av dissekerte tarmer i ett kontinuerlig segment vil skape det enkleste for etterforskeren. Rips og tårer langs segmentet vil føre til at påfølgende trinn blir vanskeligere.
  8. Bruk mikrodisseksjonssaks for å kutte proksimalt til magen.
  9. Bruk tang til å overføre de dissekerte tarmene til målearket (figur 1). Plasser magen på 0 mm og ordne tarmene langs linjalen til 200 mm. Bruk mikrodisseksjonssaks til å kutte ved 200 mm. Gjenta denne prosessen med å justere tarmene fra 0 mm til 200 mm langs linjalene mens du er trygg på at tarmens orientering ikke blir forvirret.
    1. Vær forsiktig så du ikke strekker tarmene mens du justerer deg etter linjalene.
  10. Når vevet er ordnet på linjalen, ordne cecum slik at det er parallelt med vevet, men ikke i direkte kontakt med det (hvis det finnes fluorescens i den regionen, vil det være behov for et klart forskjellsskille mellom cecum og tarmen).
  11. Plasser målearket med det dissekerte vevet i et mørkt område slik at fluorescensen kan bevares til det er på tide å avbilde.

4. Ex vivo bildebehandling

  1. Åpne in vivo bildebehandlingsprogramvare og logg inn.
  2. Initialiser bildeinstrumentet slik at det er klart for bildeopptak.
  3. Sett feltene 'Excitation' og 'Emission' til den tilsvarende fargen som brukes for perlen eller RITC gavage. Rød (flytende): eksitasjon 535 nm / utslipp 600 nm. Grønn (mikrosfærer): eksitasjon 465 nm / utslipp 520 nm.
  4. Sett eksponeringen til 'Auto'.
  5. Velg synsfeltet.
  6. Før du legger målearket inn i instrumentet, må du sørge for at tarmene ikke har skiftet under transport.
  7. Plasser målearket i instrumentet innenfor synsfeltet.
  8. Lukk døren til instrumentet på en sikker måte, og velg Øyeblikksbilde for å fotografere synsfeltet.
  9. Lagre innsamlede bilder på en flash-stasjon for analyse. Lagre individuelle opptak av fluorescerende bilder og fotografiske bilder. Et overlegg av fotografiet og fluorescensen indikerer plasseringen av fluorescerende materiale i GI-kanalen (figur 1).
    MERK: Vi anbefaler at du lagrer filene i .tif filformatet (Tag Image File) for nedstrømsbehandling.

5. Analyse

  1. Åpne fluorescerende og fotografiske bildefiler i et bilderedigeringsprogram.
  2. Juster pikselstørrelsen på begge bildene slik at de har nøyaktig samme dimensjoner (vår konvensjon var å sette begge bildene til 1280 piksler med 850 piksler [høyde x bredde]).
  3. Lukk bildefilen. Følgende trinn involverer bare det fluorescerende bildet.
  4. Bruk et viskelærverktøy for å fjerne bakgrunnen og gjøre den gjennomsiktig. Et viskelær kan være nødvendig for å fjerne flekker av gjenværende bakgrunn.
  5. Opprett et nytt lag. Gjør det til en helt svart bakgrunn til fluorescerende signal. Dette kan oppnås ved å velge et svart fyll til laget og dra laget for å ligge under laget med det fluorescerende bildet.
  6. Lagre det nye fluorescerende bildet, som bare inneholder fluorescerende signal på svart bakgrunn, som en ny .tif-fil.
  7. Åpne de nye fluorescerende og fotografiske bildene i ImageJ.
  8. Gjør hvert bilde om til et 32-biters bilde ved å velge Bilde > Type > 32-biters.
  9. Opprett et sammenslått bilde av begge ved å velge Bilde > Farge > Slå sammen kanaler. I dialogboksen som åpnes, velger du fotografifilen for den grå kanalen og den fluoriserende filen under alle fargede kanaler.
  10. Deaktiver skalaen for det sammenslåtte bildet ved å velge Analyser > angi skalering > klikk for å fjerne skala.
  11. Velg "Rektangel" -verktøyet i ImageJ.
  12. Tegn et rektangel rundt en del av tynntarmen. Vær nøye med bredden på dette interesseområdet (ROI), da det skal forbli konstant mellom alle avkastninger. Den nominelle verdien er ikke avgjørende, bare at den holdes konsistent på tvers av alle avkastninger tegnet på dette bildet [siden tynntarmen tar over flere rader, vil individuelle avkastninger bli trukket over hver del av tynntarmen i en annen rad (figur 1)]. Figur 2 viser plasseringen av breddeverdien på ImageJ-verktøylinjen.
  13. Dupliser avkastningen ved å velge Bilde > Dupliser. Velg bare kanalen som tilsvarer den fargede kanalen.
  14. Bruk rektangelverktøyet på nytt for å tegne en avkastning over hele det nye bildet.
  15. Hent en profil for fluorescensen ved å velge Analyser > Plottprofil. Den resulterende grafen plotter på y-aksen den gjennomsnittlige intensiteten for hver piksel langs lengden på avkastningen. Dette ble valgt i trinn 5.12 for å være lengden på den analyserte delen av tynntarmen
  16. Åpne listen over verdier og kopier dem til et regnearkprogram.
  17. Gjenta trinn 5.12-5.16 for hver del av tynntarmen på en annen linjalrad. Fortsett å lime inn verdiene i den samme regnearkfilen umiddelbart under hvert tidligere sett med verdier, slik at alle kontinuerlige rader i kolonnen inneholder gjennomsnittlig intensitetsverdi for hele lengden av tynntarmen.
  18. I regnearkprogramvaren multipliserer du hver gjennomsnittlige intensitetsverdi med den konstante bredden på ROI-rektangelet som ble opprettet i trinn 5.12. Dette vil gi den reelle intensitetsverdien langs tynntarmen på hvert punkt.
    MERK: Ulike dyr vil ha små variasjoner på tynntarmslengden. For å forhindre at lengdeforskjellene påvirker utfallet av nedstrøms dataanalyse, må strengen med intensitetsverdier binned i et konsistent antall intervaller på tvers av alle eksperimentelle prøver (figur 3, figur 4 og figur 5 viser resultater for tre kassestørrelser).
  19. Del antall intensitetsverdier med antall beholdere som ønskes. Den resulterende kvotienten S bestemmer antall intensitetsverdier som inkluderes i hver kasse.
  20. Bestem papirkurven der hver råintensitetsverdi skal gå ved hjelp av en roundup-formel. Dette trinnet plasserer hver rå intensitetsverdi i en søppelbøtte. Hver råintensitetsverdi indekseres kronologisk med heltall N. Kvotienten N/S bestemmer bin-nummeret som er tilordnet hver råverdi. Roundup-formelen skal runde av denne kvotienten til et helt tall uten desimaler.
  21. Generer verdien for hver papirkurv ved hjelp av en averageif-formel. Målet er å beregne gjennomsnittet av råverdiene som er tilordnet en bestemt papirkurv i trinn 5.20. Derfor bør argumentene i formelen være: (1) tilordnede hyller generert i trinn 5.20, (2) intervallnummer, (3) rå intensitetsverdier.
    MERK: Den første analysen vi kan utføre på binned data er en geometrisk senteranalyse, som kvantifiserer hvor langt vi observerer den høyeste fluorescerende intensiteten langs tynntarmen (figur 4).
  22. Normaliser hver intensitetsverdi over den totale fluorescerende intensiteten. Med andre ord, del hver intensitetsverdi med summen av alle intensiteter.
  23. Multipliser hver normaliserte verdi med bin-nummeret. Produktet gjenspeiler den relative vekten av hver kasse, noe som bidrar til den totale fluorescerende intensiteten.
  24. Hvis du legger til alle verdiene som genereres i trinn 5.23, vises intervallnummeret i midten av det fluorescerende signalet. Del med antall binger for å uttrykke det geometriske senteret som brøkdelen av tynntarmen som reises av fluorescerende senter.
    MERK: For å gjenspeile den romlige fordelingen av signalet, er neste trinn å generere effektspekteret til datasettet med binned intensitet (figur 5).
  25. Åpne en rask Fourier-transformeringsveiviser (FFT) i regnearkprogramvaren. Velg inngangen som binned datasett og utdataene som et tomt sett med samme antall rader som hyller.
  26. Trekk ut den virkelige verdikomponenten i FFT.
  27. Øk hver reelle verdi av FFT til den andre kraften. Dette gir et datasett med effektspektra.
  28. Velg første halvdel av datasettet for effektspektra og flytt det slik at det ligger under andre halvdel. Dette har effekten av å sentrere effektspektrene rundt senterfrekvensen når den plottes i neste trinn.
  29. Plott kraftspektrene på y-aksen i en x-y-graf der x-akseverdiene er området fra -1 x (antall binger / 2) til (antall binger / 2) -1. Når det gjelder 1000 binger, vil akseverdiene variere fra -500 til 499.
  30. Kraftspektra for hvert dyr bør sammenlignes på grunnlag av spredningen av ikke-null topper og høydene på disse ikke-null toppene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viser representative resultater fra trinn 3 og utover. Figur 1 viser intakte eksplanterte tarmer, med fluorescerende målinger overlagt. Magesekken (lilla) legges langs samme akse som tynntarmen (oransje), men vi foretrekker å flytte cecum (blå) til siden for å hindre overlapping med tykktarmen (oransje). Som det fremgår av venstre panel, er dette ikke alltid mulig på grunn av organstørrelse. Vi kutter tynntarmen på ~ 200 mm for å maksimere dekningen av kontinuerlige segmenter, men dette er ikke alltid mulig på grunn av mesenteri som begrenser evnen til å utfolde tarmene, og vår preferanse for ikke å kutte gjennom strukturer som fluorescerende pellets eller cecum. Den røde intensiteten i venstre panel i figur 1 og de grønne intensitetene til de midterste og høyre panelene sorteres i beholdere i forskjellige størrelser for å generere figur 3. Bare intensitetene i de oransje ROIene (tynntarmen) ekstraheres for analyse. Den fulle lengden av tynntarmen (hver oransje avkastning i hvert panel) ekstraheres for analyse. Oransje ROIer har samme bredde som vist i ImageJ (figur 2). De sys sammen ved å plassere alle intensiteter i rekkefølge før binning. Figur 3 viser gjennomsnittlig fluorescerende spor ± SEM per kohort; Se figurforklaring for detaljer.

De to siste tallene viser resultatene av analysene: geometrisk senter og effektspekter. Det geometriske senteret måler den gjennomsnittlige plasseringen av fluorescerende signaler i figur 3, og veier gjennomsnittet av signalstyrken til hver søppelkasse. Derfor trekker høyere topper i sporet gjennomsnittet nærmere posisjonen til den toppen. Det geometriske senteret klarer ikke helt å karakterisere den romlige fordeling av intraluminal innhold. For eksempel kan det samme geometriske senteret fås fra en bolus konsentrert på et enkelt punkt og et spredningssignal sentrert rundt samme punkt. Denne begrensningen av måling av geometrisk senter er tydelig i sammenligningen mellom væsker og større perler (figur 3 og figur 4). Størstedelen av det flytende fluorescerende sporet er sentrert rundt to tidlige topper, mens de større perlene viser flere topper langs hele tynntarmens lengde (figur 3, venstre og høyre panel). Det fluorescerende sporet av de større perlene er mer fordelt, men det gjennomsnitt ut til et lignende punkt som væsken, uavhengig av binning granularitet, noe som fremhever begrensningen av bare å fokusere på det geometriske senteret (figur 4). For å redegjøre for den distributive karakteren av tynntarmskontraksjoner, har vi innlemmet en kraftspektralanalyse i protokollen. Effektspektrumanalysen fungerer ved å dekonstruere fluorescensfordelingen i rommet i flere sinusoide kurver med forskjellige romlige frekvenser. Hver romlig frekvens gjenspeiler avstanden mellom to tilfeldig valgte punkter i fluorescenssporet. Noen av disse avstandene forekommer oftere enn andre, så hver tilskrives en styrke (kraft). Kraften korrelerer med hvor ofte to tilfeldige punkter er skilt av den avstanden. Ved å plotte effektspekteret (figur 5) kan vi demonstrere hvor mange romlige frekvenser som bidrar til det målte signalet (spredning av spekteret) og sammenligne den relative styrken til disse bidragene (høyden på spekteret). Dette gjør at vi kvantitativt kan beskrive spredningen av fluorescens langs GI-kanalen.

Figure 1
Figur 1. De dissekerte tarmene blir eksplantert og plassert på laminert linjalpapir før fotografering og fluorescensmåling. Fluorescensintensiteten er overlagret og pseudofarget for å matche den opprinnelige fluorescensen av gavaged materiale. Venstre: flytende rhodaminisotiocyanat (RITC) fluoresces i det røde spekteret; Midt: liten (diameter: 75-90 μm), og Høyre: større (diameter: 180-212 μm) perler begge fluorescerer i det grønne spekteret. Lilla, oransje, blå og rosa bokser omgir interesseområder (ROIs) i henholdsvis mage, tynntarm, cecum og kolon i hvert eksemplar. Bredden på hver ROI holdes konsistent på tvers av rader for å unngå forvirring ved beregning av rå fluorescensintensitet under nedstrømsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Plassering av området med interessebredde (i piksler) på ImageJ-verktøylinjen (gul understreking). For å gjenta, vises bredden i piksler bare hvis skalaen er fjernet (trinn 5.10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Fluorescens spor langs lengden av tynntarmen. Linje angir gjennomsnittlig fluorescens ved en gitt søppelkasse. Det skyggelagte området angir standardfeilen til gjennomsnittet (SEM). Fordelingen av fluorescerende materiale varierer i henhold til materialegenskapene til det intraluminale innholdet (kolonner). Venstre: flytende (n = 7 mus) fordeling over noen få tarmsegmenter 30 min etter gavage. Midt og høyre: små (n = 6 mus) og større (n = 5 mus) perler fordeler seg bredere langs tynntarmen 30 min etter gavage. Ved å øke antall intervaller som brukes til å sortere de samme rådatasettene, avsløres granulære sporingsfunksjoner som ikke kan løses med færre hyller (rader). Mindre beholdere reduserer måleusikkerheten, øker romlig oppløsning og reflekterer bedre fordelingskomponenten i tynntarmskontraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Det geometriske senteret for fluorescensfordelingen i tynntarm 30 min etter gavage med flytende RITC, små perler (75-90 μm) og større perler (180-212 μm) (gjennomsnittlig ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, enveis ANOVA med Bonferroni-korreksjon). Binstørrelsen påvirker ikke transitttolkningen om at små perler transporteres mer distalt enn væsker 30 min etter gavage, men de større perlene fordeler seg så mye at det ikke er signifikante forskjeller i deres geometriske senter sammenlignet med både væsker og små perler (* P < 0,05. ns = ikke statistisk signifikant). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Effektspektra er kategorisert etter materialegenskap (kolonner) og binstørrelse (rader). Forbedringene i romlig oppløsning og mindre binning er tydelige. Øverste rad: få forskjeller kan skilles i de allment binnede spektrene. Nederste rad: når binstørrelsene krymper, kan vi sette pris på betydelige dominerende frekvenser som er tilstede i det større perlespekteret, men ikke i de små perlene. Noen, men ikke alle, av de ekstra dominerende frekvensene, er tilstede i væskespekteret. Ved hjelp av de nederste radspektrene kan vi sammenligne med de fluorescerende sporene i figur 3. I figur 3 viser det flytende fluorescerende sporet to fremtredende topper, som korrelerer med noen få dominerende topper i effektspekteret. Det lille perlesporet i figur 3 viser en enkelt dominerende topp, som korrelerer med en enkelt dominerende topp i kraftspekteret. De større perlesporene i figur 3 viser mer dominerende topper. Følgelig viser effektspekteret et større antall dominerende frekvenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GI-kanalen, som andre rørformede organer, som blodkar, krever mekaniske sensorer og effektorer for å opprettholde homeostase26,27,28. Imidlertid er GI-kanalen unik ved at de fysiske egenskapene til materialene som krysser den ikke er konstante over måltider. Intraluminal innhold av forskjellige fysiske egenskaper (fast, flytende og gass) passerer tarmen, genererer forskjellige mekaniske innganger til GI-mekanoreceptorene. Faktisk blir forskjellige mekaniske stimuli i tykktarmen sanset og videresendt av forskjellige veier29.

Denne protokollen er teknisk tilgjengelig for alle som utfører rutinemessig musearbeid, men noen få kritiske trinn krever nøye oppmerksomhet. Vi finner faste mus er viktig før du starter studien, da det fjerner bidraget fra tidligere måltider som fortynner fluorescerende signal. Videre viser mus matet en standard diett intraluminal fluorescens fra diettkomponenter, spesielt klorofyllkomponenten30. Ved fasting og fluoroforvalg forhindrer vi at chow-fluorescens forstyrrer de kontrollerte forholdene i forsøkene som er skissert i denne protokollen. Vi anbefaler at eksperimenter uavhengig bekrefter at den valgte fasteperioden er tilstrekkelig til å eliminere ikke-spesifikk fluorescens i tynntarmen, da dette kan variere etter belastning, alder eller kjønn. Eksperimentøren bør visuelt vurdere den homogene fordelingen av det gastede innholdet. Ellers vil det være usikkerhet i leveransen og studieresultatene. Gavages bør utføres konsekvent av samme eksperimentør, helst noen som har utviklet erfaring med teknikken. Eksperimentøren bør sikte på konsekvent levering av innhold til magen. Funn av fluorescens i spiserøret eller utelukkende i magesekken er grunn til å utelukke et dyr fra analysen, da det er usikkert om tynntarmen hadde samme tilgang til det avstøpte innholdet. Etter gavaging kan ventetiden forkortes til 15 minutter eller utvides til 90 minutter, avhengig av om tidlige eller sene transittfaser er av interesse22. Den opprinnelige protokollen med flytende gavage viste at mesteparten av materialet ligger i tynntarmen etter 30 minutter. Videre, mens det er kritisk å jobbe med hastverk under disseksjonstrinnet, må det tas hensyn til ikke å forstyrre plasseringen av det intraluminale innholdet og ikke briste GI-kanalen.

Denne protokollen utviklet seg fra tidligere publiserte tilnærminger som fysisk binned tynntarmen ved å kutte den i fem til 10 segmenter og homogenisert intraluminal innhold før fluorescens / radioaktivitetsmåling22,23,24. Den forrige tilnærmingen var signifikant fordi den standardiserte måling av tynntarmstransitt. Tynntarmen løkker notorisk i kompliserte og uforutsigbare mønstre inne i bukhulen. Bildebaserte transittstudier er utfordrende uavhengig av art31,32. Mens protokollen vår forblir et terminalt eksperiment som ikke kan utvides til mennesker, forbedrer vi den romlige oppløsningen betydelig, og griper den forbedringen for å løse regionale passasjer og oversette dem til en objektiv måling av spredning i tynntarmen (kraftspekteret).

I denne protokollen er romlig oppløsning begrenset av kameraets oppløsning i bildesystemet. Siden binning normaliserer tynntarmslengden over dyr, kan vi direkte sammenligne gjennomsnittsposisjonen til det intraluminale innholdet. Figur 3 viser tydelig den drastiske utjevningen, økt usikkerhet og redusert oppløsning som følge av stor kassestørrelse. Det geometriske senteret kvantifiserer fluorescenssenteret langs GI-kanalen (figur 4). Som forventet påvirkes ikke denne målingen signifikant av bin-størrelsen. Effektspekteret er en objektiv og komplementær metode som standardiserer analysen av topper og spredninger i de fluorescerende sporene i figur 3. Forbedring av oppløsningen forbedrer de beregnede spektrene, noe som gjør det mulig å demonstrere synlige forskjeller mellom fluorescerende spor (figur 5). Ved lav oppløsning (10 beholdere) ville det være vanskelig å skille mellom væsker og større perler, enten ved geometriske senter- eller spektrumvurderinger, selv om det er klart fra å se på fluorescerende spor at de ikke fordeles likt i rommet. Ved høyere oppløsning (1000 bins) er de geometriske sentrene fortsatt like (på grunn av at det geometriske senteret er en gjennomsnittlig måling), men effektspekteret kan pålitelig brukes til å skille mellom begge kohorter. Det er verdt å merke seg at fluorescerende spor er mottagelige for andre typer analyser, for eksempel ledende målinger. Forventede endringer i det geometriske senteret kan brukes under prøvestørrelsesberegninger før du begynner på forsøkene. Å vite at væsker har et geometrisk senter på omtrent 0,4-0,518, brukte vi minst fem mus i hver gruppe for å statistisk løse endringer på opptil 45%.

Vi utvidet omfanget og brukte denne protokollen til å studere transitt av faste stoffer i tynntarmen. Som med væsker, ga vi de faste mikrosfærene inn i magen. Den pyloriske sphincteren ligger ved mage-tynntarmovergangen. Denne sphincteren fungerer som et størrelsesekskluderingsfilter. Hos mus er størrelsesgrensen på ~ 300 μm, med partikler <300 μm som ikke møter motstand ved å komme inn i tynntarmen33, men denne tilnærmingen fungerer også med litt større partikler vi brukte i en nylig studie18. Vi valgte våre mikrosfærestørrelser her for å gi en rekke størrelser som utfyller den siste studien. Vi benyttet to kommersielle fluorescerende perlepreparater som har diametre på 75-90 μm og 180-212 μm. Figur 1 viser lik fluorescenstetthet og profiler i magen på tvers av kohorter, noe som tyder på at verken væsker eller partikler beholdes differensielt av magen. De opprinnelige dataene som presenteres her, viser hvordan tynntarmen til villtypemus håndterer væsker og mikroskopiske faste stoffer annerledes. Så langt har vi brukt perler av ett størrelsesområde per uavhengig eksperiment. Fremtidige studier kan fokusere på hvordan blandinger av forskjellige størrelsespartikler håndteres, og blande fluorescerende væsker av forskjellige fysiske egenskaper med fluorescerende perler for å bestemme hvordan mer realistiske kymeblandinger håndteres av tynntarmen.

Fordelingsforskjellene som er rapportert her, antyder en forskjell i motilitetsmønstrene aktivert av materialer med forskjellige egenskaper. Vi postulerer at balansen mellom segmentering versus propulsive kontraksjoner bestemmer hvor langt og hvor homogent materialer passerer tynntarmen. Det geometriske senteret for små perler er lenger langs tynntarmen sammenlignet med væsker, noe som tyder på at små faste partikler engasjerer propulsive sammentrekninger. På den annen side, mens det geometriske senteret for større perler ligner på en væske, viser spektralanalyse betydelige forskjeller i romlig fordeling, noe som kan være et resultat av flere segmenteringskontraksjoner i den større perleinnstillingen. Vi antar at tynntarmen bruker størrelsesdiskriminering, en type mekanosensorisk krets, som en av inngangene som gir næring til å bestemme balansen mellom sammentrekningstyper. For eksempel er Dogiel type II-nevroner mekanosensoriske nevroner spekulert i å spille en rolle i å styre overgangen fra propulsive til segmenterende sammentrekninger16,34. Disse spennende spekulasjonene krever ytterligere forskning for å bestemme mekanismene som GI-kanalen sanser fysiske egenskaper og transduserer dem til fysiologiske utganger som sammentrekninger.

Vi tror denne protokollen vil være nyttig som et ekstra verktøy for å bygge bro over gapet fra molekyler til celler til organfunksjon. Vi anerkjente at GI-epitelmekanoreceptorer deler utviklingsmessige og strukturelle likheter med hudmekanoreceptorer35. Ved hjelp av protokollen som er skissert ovenfor, bidro vi til å demonstrere den sensoriske rollen som "tarmberøring" der disse GI-epitelmekanoreceptorene sanser lette mekaniske stimuli og deltar i egen taktil følsomhet18. Vi forventer at denne protokollen vil vise seg å være like nyttig for å studere hvordan andre sensoriske kretser bidrar til tynntarmstransittrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi takker fru Lyndsay Busby for administrativ hjelp og Mr. Joel Pino for mediestøtte. NIH-tilskudd støttet dette arbeidet: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 og Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664 other mice can be used with this protocol
Dissection tools n/a n/a
Excel software Microsoft n/a used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g "smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g "larger beads" in the manuscript
Gavage needles Instech FTP-18-50-50
ImageJ software n/a n/a used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house) n/a n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) Sigma M0262
Photoshop software Adobe n/a used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma r8881-100mg "liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
  3. Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
  4. Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
  5. Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
  6. Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
  7. Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
  8. Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
  9. Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
  10. Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
  11. Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
  12. Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
  13. Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
  14. Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
  15. Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
  16. Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
  17. McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
  18. Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
  19. Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
  20. Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
  21. Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
  22. Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
  23. Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
  24. Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
  25. Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  26. Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
  27. Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
  28. Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
  29. Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  30. Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
  31. Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
  32. Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
  33. Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
  34. Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
  35. Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).

Tags

Medisin utgave 181
Studere Murine Small Bowel Mechanosensing av Luminal partikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mercado-Perez, A., Wegner, A.,… More

Mercado-Perez, A., Wegner, A., Knutson, K., Zumchak, M., Beyder, A. Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates. J. Vis. Exp. (181), e63697, doi:10.3791/63697 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter