Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Studera murin tunntarmsmekanosens av luminala partiklar

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/63697
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,4
1Enteric NeuroScience Program (ENSP), Division of Gastroenterology & Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Mayo Clinic, 3Easy Learning Labs, 4Department of Physiology & Biomedical Engineering (PBME), Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

För att studera hur tunntarmen hanterar partiklar av varierande storlek har vi modifierat en etablerad in vivo-metod för att bestämma tunntarmstransitering.

Abstract

Gastrointestinal (GI) motilitet är avgörande för normal matsmältning och absorption. I tunntarmen, som absorberar näringsämnen, optimerar rörligheten matsmältningen och absorptionen. Av denna anledning innefattar några av motilitetsmönstren i tunntarmen segmentering för blandning av luminalt innehåll och peristaltik för deras framdrivning. Fysikaliska egenskaper hos luminalt innehåll modulerar mönstren för tunntarmsmotilitet. Den mekaniska stimuleringen av GI-mekanosensoriska kretsar genom att transitera luminalt innehåll och underliggande tarmmotilitet initierar och modulerar komplexa GI-motormönster. Ändå är de mekanosensoriska mekanismerna som driver denna process fortfarande dåligt förstådda. Detta beror främst på brist på verktyg för att dissekera hur tunntarmen hanterar material med olika fysikaliska egenskaper. För att studera hur tunntarmen hanterar partiklar av varierande storlek har vi modifierat en etablerad in vivo-metod för att bestämma tunntarmstransitering. Vi sonderade levande möss med fluorescerande vätska eller små fluorescerande pärlor. Efter 30 minuter dissekerar vi ut tarmarna för att avbilda fördelningen av fluorescerande innehåll över hela mag-tarmkanalen. Förutom högupplösta mätningar av det geometriska centret använder vi binning av variabel storlek och spektralanalys för att bestämma hur olika material påverkar tunntarmstransitering. Vi har undersökt hur en nyligen upptäckt "tarmberöring" -mekanism påverkar tunntarmens rörlighet med hjälp av detta tillvägagångssätt.

Introduction

Den mänskliga gastrointestinala (GI) kanalen är ett flera fot långt organsystem, ungefär approximerat som ett rör med varierande dimensioner och fysikaliska egenskaper1. När innehållet rör sig genom dess längd är mag-tarmkanalens primära funktion att absorbera ämnen som är kritiska för livet. Tunntarmen är specifikt ansvarig för näringsupptag. Tunntarmens transitering är hårt reglerad för att matcha matsmältnings- och absorptionsfunktionerna, vilket resulterar i olika rörlighetsmönster. Bayliss och Starling beskrev "tarmens lag"2 1899 och visade kontraktilframdrivningsprogrammet i tarmen som idag kallas den peristaltiska reflexen; segmentet proximalt till matboluskontrakten för att driva det framåt, och det distala segmentet slappnar av för att ta emot det. I teorin kan detta mönster ensamt vara tillräckligt för att transportera material aboralt, men över ett sekel av forskning har målat en mer komplex bild av kontraktil aktivitet i mag-tarmkanalen. Tre tunntarmsmotilitetsperioder känns igen hos människor: det migrerande motorkomplexet (MMC), fasteperioden och den postprandiala perioden3. Samma mönster har rapporterats hos möss 4,5. MMC är ett cykliskt motormönster bevarat över de flesta däggdjur 6,7. MMC har ett karakteristiskt fyrfasmönster som fungerar som en användbar klinisk markör vid funktionella GI-störningar7. De fyra faserna, i ordning efter förekomst, är (I) quiescence, (II) oregelbundna, låga amplitudkontraktioner, (III) regelbundna sammandragningar med hög amplitud och (IV) nedtrappningsperiod med minskande aktivitet7. MMC markerar det viktigaste motormönstret för fasteperioden3. MMC under fasteperioden rensar upp innehållet i tunntarmen som förberedelse för nästa måltid.

Motormönstren i den postprandiala perioden är optimerade för matsmältnings- och absorptionsfunktionerna3. Oavsett kalorisammansättning är den första transiteringen snabb längs tunntarmen, innehållet sprids längs tarmens längd och transiteringen saktar därefter ner8. Absorptionen optimeras genom att öka kontaktytan och sakta ner den för att öka uppehållstiden. När näringsämnena väl är inne i lumen består det dominerande mönstret av nära (<2 cm från varandra) okoordinerade sammandragningar (segmenterande sammandragningar), med några överlagrade sammandragningar med stor amplitud som sträcker sig över hela tunntarmens längd (peristaltiska sammandragningar)9. Segmentering av sammandragningar blandar det intraluminala innehållet på plats. De enstaka stora peristaltiska sammandragningarna driver innehållet mot tjocktarmen.

Tidpunkten för denna övergång tillbaka till MMC beror på matvolym och kalorisammansättning10. Således tar tunntarmen prov på luminala ledtrådar för att reglera när man ska övergå mellan motilitetsperioder. Mekaniska signaler, såsom fysikaliska egenskaper hos luminalt innehåll11, luminal volym och väggspänning, engagerar mekanoreceptorceller i GI-väggen 12,13,14,15,16. Faktum är att en ökning av den fasta komponenten i en måltid leder till en ökning av tunntarmstransitering17. Vi spekulerar i att fysikaliska egenskaper, såsom flytande eller fast tillstånd av intraluminalt innehåll, måste engagera olika mekanoreceptorer på grund av de olika krafter de genererar på GI-väggen18.

Guldstandarden för mätning av in vivo GI-transitering hos människor, som hos möss, är användningen av radioaktiva spårämnen mätt med scintigrafi när de lämnar magen eller transiterar längs tjocktarmen19,20. Hos däggdjur gör tunntarmen slingor på oförutsägbara sätt tunntarmen svår att avbilda in vivo på ett tillförlitligt sätt, men framsteg görs21. Vidare saknas det idag verktyg för att kvantifiera hur tunntarmen hanterar partiklar av varierande egenskaper och storlek. Utgångspunkten här var en guldstandardteknik som standardiserar studien av tunntarmstransitering 22,23,24 och barriärfunktion 22. Den består av att sondge möss med ett fluorescerande material, vänta på GI-motilitet för att transportera materialet, excitera mag-tarmkanalen, segmentera det i flera sektioner från mage till kolon, sektionering och homogenisering av intraluminalt innehåll för fluorescenskvantifiering. Vi gjorde två förbättringar. Först ändrade vi sammansättningen av det sonderade innehållet för att inkludera fluorescerande mikroskopiska pärlor för att bestämma hur tunntarmen fördelar fysiska partiklar. För det andra förbättrade vi den rumsliga upplösningen genom att avbilda hela mag-tarmkanalen från mage till kolon ex vivo och använde binning av variabel storlek för att standardisera vår analys över djur. Vi postulerar att detta avslöjar nya insikter i balansen mellan framdrivande kontra segmenterande sammandragningar under den postprandiala fasen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Mayo Clinic.

1. Inställning

  1. Snabba 8- till 10-veckors gamla möss i 4 timmar. Ge möss tillgång till vatten.
    OBS: Vi använder vildtyps manliga C57BL / 6J-möss för alla experiment som presenteras här, men de kan utföras på möss av vilken stam, kön och genotyp som helst.
  2. Kyl 15 ml destillerat vatten i ett 50 ml koniskt rör i ett 4 °C kylskåp.
  3. Värm ytterligare 15 ml destillerat vatten i en bägare med en värmeplatta med magnetisk omrörningsstång till cirka 80-90 °C.
  4. Mät 0,5% metylcellulosa för totalt 30 ml (0,15 g).
  5. Tillsätt försiktigt metylcellulosa till 15 ml varmt vatten så att det inte klumpar sig. Metylcellulosalösningen kommer att vara grumlig under denna process.
  6. När den är upplöst, ta bort bägaren från kokplattan och tillsätt 15 ml kylt vatten till den heta bägaren.
  7. Ställ in i ett 4 °C kylskåp tills lösningen är klar, cirka 15-20 min.
  8. När det är klart, väg 3 mg rhodaminisotiocyanat (RITC)-dextran per 5 ml 0,5% metylcellulosalösning och blanda för att kombinera. Detta är det flytande tillståndet i avsnittet Representativa resultat .
    1. Alternativt kan du väga 25 mg fluorescerande polyetenmikrosfärer och blanda med 200 μl av metylcellulosalösningen tills den är väl införlivad. Grundlig införlivande av mikrosfärer säkerställs genom virvel före sondmatning. Experimentören måste visualisera homogen fördelning av suspenderade mikrosfärer i blandningen.
    2. Eftersom RITC-dextran-lösningen är ljuskänslig, kyl lösningen. Förbered RITC-dextran-lösningen och mikroshperblandningen i förväg och använd inom 2 månader. Återsuspendera mikrosfärblandningen före användning.
      OBS: Mikrosfärer av varierande storlek används för att studera gastrointestinal hantering av olika material. I avsnittet Representativa resultat visar vi resultaten av att använda små (diameter: 75-90 μm) och större (diameter: 180-212 μm) mikrosfärer.

2. Intraluminal innehållssond

  1. Förbered sondmatningen genom att fästa ett 18 Ga x 50 mm matningsrör på en 1 ml spruta och dra 200 μl RITC-lösning eller mikrosfärlösning.
  2. Håll fast det fastande djuret manuellt med hjälp av enhandsfasthållningstekniken25. Se institutionens information om lämpliga murina fasthållningstekniker.
  3. För försiktigt in matningsröret genom musens mun och matstrupe tills det kommer in i magen.
    Steget med sondmatning är avgörande för ett lyckat experiment. Det kräver erfarna händer som konsekvent kan föra in röret ungefär samma avstånd i varje mus. Detta steg måste standardiseras av experimenter som utför protokollet. Samma experimenter bör sondas alla mösskohorter som kommer att jämföras med varandra.
  4. Släpp långsamt sprutinnehållet i magen och ta försiktigt bort röret från musen.
  5. Efter sondmatningen, sätt tillbaka musen till buret.
  6. Kassera sondröret.
  7. Upprepa processen efter behov för önskat antal djur.

3. Tarmdissektion

  1. Innan du börjar dissektionerna, slå på in vivo-bildinstrumentet så att det kan komma till temperatur.
  2. Offra musen 30 min efter sondmatningen. Använd koldioxidinandning för att offra musen, följt av livmoderhalsförskjutning för att säkerställa framgångsrik dödshjälp.
  3. Efter att ha bekräftat framgångsrik eutanasi, placera musen i liggande läge på ett dissektionsstadium och fäst sina fyra bilagor på scenen för att få tillgång till buken. Våt ytan på buken med 70% etanol för att blöta bukhåren.
  4. Använd mikrodissektionstång för att dra huden och skaffa skarpa kirurgiska saxar för att göra ett tvärgående snitt 1 cm över anusen. För att exponera intraperitonealhålan, fortsätt snittet vertikalt upp i buken tills ribbburet.
  5. Flytta försiktigt cecum till vänster med mikrodissektionstångarna för att exponera den distala tjocktarmen.
  6. Skär den distala tjocktarmen med mikrodissektionssax bara proximal till ändtarmen.
  7. Lossa försiktigt tjocktarmen, cecum och tunntarmen genom att dra långsamt i motsatt riktning.
    OBS: Att upprätthålla de dissekerade tarmarna i ett kontinuerligt segment kommer att skapa mest lätthet för utredaren. Rips och tårar längs segmentet kommer att göra efterföljande steg svårare.
  8. Använd mikrodissektionssax för att skära proximalt i magen.
  9. Använd tång för att överföra de dissekerade tarmarna till mätarket (figur 1). Placera magen på 0 mm och ordna tarmarna längs linjalen till 200 mm. Använd mikrodissektionssax för att klippa vid 200 mm. Upprepa denna process för att justera tarmarna från 0 mm till 200 mm längs linjalerna medan du är säker på att tarmens orientering inte blir förvirrad.
    1. Var noga med att undvika att sträcka tarmarna medan du anpassar dig till linjalerna.
  10. När vävnaden är anordnad på linjalen, ordna cecum så att den är parallell med vävnaden men inte i direkt kontakt med den (om någon fluorescens finns inom den regionen, kommer en tydlig skillnad mellan cecum och tarmarna att behövas).
  11. Placera mätarket med den dissekerade vävnaden i ett mörkt område så att fluorescensen kan bevaras tills det är dags att avbilda.

4. Ex vivo-avbildning

  1. Öppna in vivo-bildprogramvaran och logga in.
  2. Initiera bildinstrumentet så att det är klart för bildförvärv.
  3. Ställ in fälten "Excitation" och "Emission" till motsvarande färg som används för pärlan eller RITC-sondmatningen. Röd (flytande): excitation 535 nm /emission 600 nm. Grön (mikrosfärer): excitation 465 nm /emission 520 nm.
  4. Ställ in exponeringen på "Auto".
  5. Välj synfält.
  6. Innan du placerar mätbladet i instrumentet, se till att tarmarna inte har förskjutits under transporten.
  7. Placera mätbladet i instrumentet inom synfältet.
  8. Stäng dörren till instrumentet ordentligt och välj Ögonblicksbild för att fotografera synfältet.
  9. Spara insamlade bilder på en flash-enhet för analys. Spara enskilda bilder av lysrörs- och fotobilderna. En överlagring av fotografiet och fluorescensen indikerar placeringen av fluorescerande material i mag-tarmkanalen (figur 1).
    Vi rekommenderar att du sparar filerna i formatet Tag Image File (.tif) för underordnad bearbetning.

5. Analys

  1. Öppna fluorescerande och fotografera bildfiler i ett bildredigeringsprogram.
  2. Justera pixelstorleken på båda bilderna så att de har exakt samma dimensioner (vår konvention var att ställa in båda bilderna till 1280 pixlar med 850 pixlar [höjd x bredd]).
  3. Stäng fotofilen. Följande steg omfattar endast den fluorescerande bilden.
  4. Använd ett suddgummiverktyg för att ta bort bakgrunden och göra den transparent. Ett radergummi kan behövas för att ta bort fläckar av den återstående bakgrunden.
  5. Skapa ett nytt lager. Gör det till en helt svart bakgrund till den fluorescerande signalen. Detta kan uppnås genom att välja en svart fyllning till lagret och dra lagret för att ligga under lagret med den fluorescerande bilden.
  6. Spara den nya fluorescerande bilden, som bara innehåller den fluorescerande signalen på en svart bakgrund, som en ny .tif fil.
  7. Öppna de nya fluorescerande och fotografera bilderna i ImageJ.
  8. Förvandla varje bild till en 32-bitarsbild genom att välja Bild > Typ > 32-bitars.
  9. Skapa en sammanfogad bild av båda genom att välja Bild > Färg > Sammanfoga kanaler. I dialogrutan som öppnas väljer du fotofilen för den grå kanalen och den fluorescerande filen under alla färgade kanaler.
  10. Inaktivera skalan för den sammanfogade bilden genom att välja Analysera > Ange skala > Klicka för att ta bort skala.
  11. Välj verktyget "Rektangel" i ImageJ.
  12. Rita en rektangel runt en del av tunntarmen. Var noga med bredden på denna region av intresse (ROI), eftersom den bör förbli konstant mellan alla ROI. Det nominella värdet är inte nödvändigt, bara att det hålls konsekvent över alla ROI som ritas på den här bilden [eftersom tunntarmen tar över flera rader kommer enskilda ROI att dras över varje del av tunntarmen i en annan rad (figur 1)]. Bild 2 visar placeringen av breddvärdet i verktygsfältet ImageJ.
  13. Duplicera avkastningen genom att välja Bild > dubblett. Välj bara den kanal som motsvarar den färgade kanalen.
  14. Använd rektangelverktyget igen för att rita en ROI över hela den nya bilden.
  15. Hämta en profil för fluorescensen genom att välja Analysera > diagramprofil. Det resulterande diagrammet visar på y-axeln den genomsnittliga intensiteten för varje pixel längs roi-längden. Detta valdes i steg 5.12 för att vara längden på den analyserade delen av tunntarmen
  16. Öppna listan med värden och kopiera dem till ett kalkylprogram.
  17. Upprepa steg 5.12-5.16 för varje del av tunntarmen på en annan linjalrad. Fortsätt klistra in värdena i samma kalkylbladsfil omedelbart under varje föregående uppsättning värden, så att alla kontinuerliga rader i den kolumnen innehåller medelvärdet för intensiteten för hela tunntarmens längd.
  18. I kalkylprogrammet multiplicerar du varje genomsnittligt intensitetsvärde med den konstanta bredden på ROI-rektangeln som skapades i steg 5.12. Detta ger det verkliga intensitetsvärdet längs tunntarmen vid varje punkt.
    OBS: Olika djur kommer att ha små variationer på tunntarmens längd. För att förhindra att längdskillnaderna påverkar resultatet av nedströmsdataanalys måste strängen med intensitetsvärden binderas i ett konsekvent antal lagerplatser i alla experimentella prover (figur 3, figur 4 och figur 5 visar resultat för tre lagerplatsstorlekar).
  19. Dela antalet intensitetsvärden med antalet lagerplatser som önskas. Den resulterande kvoten S bestämmer antalet intensitetsvärden som ingår i varje fack.
  20. Bestäm papperskorgen där varje råintensitetsvärde ska gå med hjälp av en roundup-formel. Det här steget placerar varje råintensitetsvärde i en papperskorg. Varje råintensitetsvärde indexeras kronologiskt med heltal N. Kvoten N/S bestämmer det lagerplatsnummer som tilldelats varje råvärde. Roundup-formeln ska avrunda denna kvot till ett heltal utan decimaler.
  21. Generera värdet för varje papperskorg med hjälp av en averageif-formel. Målet är att medelvärdet av de råvärden som tilldelats en specifik behållare i steg 5.20. Därför bör argumenten i formeln vara: (1) tilldelade fack som genereras i steg 5.20, (2) bin-nummer, (3) råintensitetsvärden.
    OBS: Den första analysen vi kan utföra på binned data är en geometrisk centrumanalys, som kvantifierar hur långt vi observerar den högsta fluorescerande intensiteten längs tunntarmen (figur 4).
  22. Normalisera varje intensitetsvärde över den totala fluorescerande intensiteten. Med andra ord, dela varje intensitetsvärde med summan av alla intensiteter.
  23. Multiplicera varje normaliserat värde med facknumret. Produkten återspeglar den relativa vikten av varje behållare, vilket bidrar till den totala fluorescerande intensiteten.
  24. Om du lägger till alla värden som genereras i steg 5.23 får du fackets nummer i mitten av den fluorescerande signalen. Dela med antalet behållare för att uttrycka det geometriska centrumet som fraktionen av tunntarmen som reste av det fluorescerande centret.
    OBS: För att återspegla den rumsliga fördelningen av signalen är nästa steg att generera effektspektrumet för binned intensitetsdatauppsättningen (figur 5).
  25. Öppna en FFT-guide (Fast Fourier Transform) i kalkylprogrammet. Välj indata som binned datauppsättning och utdata som en tom uppsättning med samma antal rader som lagerplatser.
  26. Extrahera den verkliga värdekomponenten i FFT.
  27. Höj varje verkligt värde på FFT till den andra effekten. Detta ger en datauppsättning med effektspektra.
  28. Välj den första halvan av power spectra-datauppsättningen och flytta den så att den ligger under den andra halvan. Detta har effekten att centrera effektspektra runt mittfrekvensen när den ritas i nästa steg.
  29. Rita effektspektra på y-axeln i ett x-y-diagram där x-axelvärdena är intervallet från -1 x (antal fack/2) till (antal fack/2) -1. När det gäller 1000 fack skulle axelvärdena sträcka sig från -500 till 499.
  30. Effektspektra för varje djur bör jämföras på grundval av spridningen av icke-nolltoppar och höjderna på dessa icke-nolltoppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi visar representativa resultat från steg 3 och framåt. Figur 1 visar de intakta explanterade tarmarna, med fluorescerande mätningar överlagrade. Magen (lila) läggs längs samma axel som tunntarmen (orange), men vi föredrar att flytta cecum (blå) åt sidan för att förhindra överlappning med tjocktarmen (orange). Som framgår av den vänstra panelen är detta inte alltid möjligt på grund av orgelstorlek. Vi skär tunntarmen vid ~ 200 mm för att maximera täckningen av kontinuerliga segment, men detta är inte alltid möjligt på grund av mesenteri som begränsar förmågan att utveckla tarmarna och vår preferens att inte skära igenom strukturer som fluorescerande pellets eller cecum. Den röda intensiteten i den vänstra panelen i figur 1 och de gröna intensiteterna i de mellersta och högra panelerna sorteras i fack i olika storlekar för att generera figur 3. Endast intensiteterna inom de orange ROI: erna (tunntarmen) extraheras för analys. Tunntarmens fulla längd (varje orange ROI i varje panel) extraheras för analys. Orange ROI har samma bredd som visas i ImageJ (bild 2). De sys ihop genom att placera alla intensiteter i följd före binning. Figur 3 visar det genomsnittliga fluorescerande spåret ± SEM per kohort; Se figurförklaring för detaljer.

De två sista figurerna visar resultaten av analyserna: geometriskt centrum och effektspektrum. Det geometriska centrumet mäter den genomsnittliga placeringen av de fluorescerande signalerna i figur 3 och väger medelvärdet med signalstyrkan för varje fack. Därför drar högre toppar i spåret medelvärdet närmare positionen för den toppen. Det geometriska centrumet misslyckas med att helt karakterisera den rumsliga fördelningen av intraluminalt innehåll. Till exempel kan samma geometriska centrum erhållas från en bolus koncentrerad vid en enda punkt och en utspridd signal centrerad kring samma punkt. Denna begränsning av den geometriska centrummätningen framgår av jämförelsen mellan vätskor och större pärlor (figur 3 och figur 4). Majoriteten av det flytande fluorescerande spåret är centrerat kring två tidiga toppar, medan de större pärlorna visar flera toppar längs tunntarmens fulla längd (figur 3, vänster och höger panel). Det fluorescerande spåret av de större pärlorna är mer fördelat, men det är i genomsnitt till en liknande punkt som vätskans, oavsett binninggranularitet, vilket belyser begränsningen att enbart fokusera på det geometriska centrumet (Figur 4). För att ta hänsyn till den fördelningsmässiga karaktären hos tunntarmskontraktioner har vi införlivat en effektspektralanalys i protokollet. Effektspektrumanalysen fungerar genom att dekonstruera fluorescensfördelningen i rymden i flera sinusformade kurvor med olika rumsliga frekvenser. Varje rumslig frekvens återspeglar avståndet mellan två slumpmässigt utvalda punkter i fluorescensspåret. Några av dessa avstånd förekommer oftare än andra, så var och en tillskrivs en styrka (kraft). Effekten korrelerar med hur ofta två slumpmässiga punkter separeras av det avståndet. Genom att plotta effektspektrumet (figur 5) kan vi visa hur många rumsliga frekvenser som bidrar till den uppmätta signalen (spektrumets spridning) och jämföra den relativa styrkan hos dessa bidrag (spektrumets höjd). Detta gör att vi kvantitativt kan beskriva spridningen av fluorescens längs mag-tarmkanalen.

Figure 1
Figur 1. De dissekerade tarmarna explanteras och placeras på laminerat linjalpapper före fotografering och fluorescensmätning. Fluorescensintensiteten är överlagrad och pseudofärgad för att matcha den ursprungliga fluorescensen hos sonderat material. Vänster: flytande rhodaminisotiocyanat (RITC) fluorescerar i det röda spektrumet; Mitten: liten (diameter: 75-90 μm) och höger: större (diameter: 180-212 μm) pärlor båda fluorescerar i det gröna spektrumet. Lila, orange, blå och rosa lådor omger regioner av intresse (ROI) i magen, tunntarmen, cecum respektive tjocktarmen i varje prov. Bredden på varje ROI hålls konsekvent över rader för att undvika förvirring vid beräkning av rå fluorescensintensitet under nedströmsanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Plats för området för intressebredden (i pixlar) i verktygsfältet ImageJ (gul understrykning). För att upprepa visas bredden i pixlar endast om skalan har tagits bort (steg 5.10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Fluorescensspår längs tunntarmen. Linje betecknar den genomsnittliga fluorescensen vid en given behållare. Det skuggade området betecknar medelmåttets (SEM) standardfel. Fördelningen av fluorescerande material varierar beroende på materialegenskaperna hos det intraluminala innehållet (kolumner). Vänster: flytande (n = 7 möss) fördelning över några tunntarmssegment 30 min efter sondmatning. Mitten och höger: små (n = 6 möss) och större (n = 5 möss) pärlor fördelar sig bredare längs tunntarmen 30 min efter sondmatning. Om du ökar antalet lagerplatser som används för att sortera samma rådatauppsättningar visas detaljerade spårningsfunktioner som inte kan lösas med färre lagerplatser (rader). Mindre behållare minskar mätosäkerheten, ökar den rumsliga upplösningen och återspeglar bättre den fördelningskomponent i tunntarmskontraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Det geometriska centrumet för fluorescensfördelningen i tunntarmen 30 min efter sondmatning med flytande RITC, små pärlor (75-90 μm) och större pärlor (180-212 μm) (medelvärde ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, enkelriktad ANOVA med Bonferroni-korrigering). Binstorlek påverkar inte transittolkningen att små pärlor transporteras mer distalt än vätskor 30 min efter sondmatning, men de större pärlorna fördelar sig så mycket att det inte finns några signifikanta skillnader i deras geometriska centrum jämfört med både vätskor och små pärlor (* P < 0,05. ns = inte statistiskt signifikant). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Effektspektra kategoriseras efter materialegenskap (kolumner) och fackstorlek (rader). Förbättringarna i rumslig upplösning och mindre binning är uppenbara. Översta raden: få skillnader kan urskiljas i de allmänt binned spektra. Nedre raden: när fackstorlekarna krymper kan vi uppskatta betydande dominerande frekvenser som finns i de större pärlornas spektrum men inte i de små pärlorna. Vissa, men inte alla, av dessa ytterligare dominerande frekvenser är närvarande i vätskespektret. Med hjälp av de nedre radspektra kan vi jämföra med de fluorescerande spåren i figur 3. I figur 3 visar det flytande fluorescerande spåret två framträdande toppar, som korrelerar med några dominerande toppar i effektspektrumet. De små pärlorna i figur 3 visar en enda dominerande topp, som korrelerar med en enda dominerande topp i effektspektrumet. Det större pärlspåret i figur 3 visar mer dominerande toppar. Följaktligen visar effektspektrumet ett större antal dominerande frekvenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mag-tarmkanalen, liksom andra rörformiga organ, såsom blodkärl, kräver mekaniska sensorer och effektorer för att upprätthålla homeostas26,27,28. Mag-tarmkanalen är dock unik genom att de fysiska egenskaperna hos de material som passerar den inte är konstanta över måltiderna. Intraluminalt innehåll av olika fysikaliska egenskaper (fast, flytande och gas) passerar tarmen och genererar olika mekaniska ingångar till GI-mekanoreceptorerna. Faktum är att olika mekaniska stimuli i tjocktarmen känns och vidarebefordras av distinkta vägar29.

Detta protokoll är tekniskt tillgängligt för alla som utför rutinmässigt musarbete, men några kritiska steg kräver noggrann uppmärksamhet. Vi tycker att fasta möss är viktiga innan vi börjar studien, eftersom det tar bort bidraget från tidigare måltider som späder ut den fluorescerande signalen. Dessutom uppvisar möss som matas med en standarddiet intraluminal fluorescens från dietkomponenter, särskilt klorofyllkomponenten30. Genom fasta och fluoroforval förhindrar vi att chow-fluorescens stör de kontrollerade förhållandena för experimenten som beskrivs i detta protokoll. Vi rekommenderar att experimenterare oberoende bekräftar att den valda fasteperioden är tillräcklig för att eliminera ospecifik fluorescens i tunntarmen, eftersom detta kan variera beroende på stam, ålder eller kön. Experimentören bör visuellt bedöma den homogena fördelningen av gavaged innehållet. Annars kommer det att finnas osäkerhet i deras leverans och studieresultaten. Gavages bör konsekvent utföras av samma experimenterare, helst någon som har utvecklat erfarenhet av tekniken. Experimentören bör sträva efter konsekvent leverans av innehåll till magen. Att hitta fluorescens i matstrupen eller uteslutande i magen är skäl att utesluta ett djur från analysen, eftersom det är osäkert om tunntarmen hade samma tillgång till sondinnehållet. Efter sondering kan väntetiderna förkortas till 15 minuter eller förlängas till 90 minuter, beroende på om tidiga eller sena transitfaser är av intresse22. Det ursprungliga protokollet med flytande sondmatning visade att majoriteten av materialet finns i tunntarmen efter 30 minuter. Dessutom, även om det är viktigt att arbeta med brådska under dissektionssteget, måste man se till att inte störa placeringen av det intraluminala innehållet och inte brista mag-tarmkanalen.

Detta protokoll utvecklades från tidigare publicerade tillvägagångssätt som fysiskt binned tunntarmen genom att skära den i fem till 10 segment och homogeniserade intraluminalt innehåll före fluorescens / radioaktivitetsmätning22,23,24. Det tidigare tillvägagångssättet var betydelsefullt eftersom det standardiserade mätningen av tunntarmstransitering. Tunntarmen slingrar sig notoriskt i komplicerade och oförutsägbara mönster inuti bukhålan. Avbildningsbaserade transitstudier är utmanande oavsett art31,32. Medan vårt protokoll förblir ett terminalt experiment som inte kan utvidgas till människor, förbättrar vi den rumsliga upplösningen avsevärt och tar tag i den förbättringen för att lösa regionala transiter och översätta dem till en opartisk mätning av spridning inom tunntarmen (kraftspektrum).

I detta protokoll begränsas den rumsliga upplösningen av kamerans upplösning i bildsystemet. Eftersom binning normaliserar tunntarmslängden över djur kan vi direkt jämföra den genomsnittliga positionen för det intraluminala innehållet. Figur 3 visar tydligt den drastiska utjämningen, ökad osäkerhet och minskad upplösning till följd av storlek på stora fack. Det geometriska centrumet kvantifierar fluorescenscentret längs mag-tarmkanalen (figur 4). Som förväntat påverkas denna mätning inte signifikant av soptunnans storlek. Effektspektrumet är en opartisk och komplementär metod som standardiserar analysen av toppar och spridningar i de fluorescerande spåren i figur 3. Genom att förbättra upplösningen förbättras de beräknade spektra, vilket gör det möjligt att visa synliga skillnader mellan fluorescerande spår (figur 5). Vid låg upplösning (10 fack) skulle det vara svårt att skilja mellan vätskor och större pärlor, antingen genom det geometriska centrumet eller spektrumbedömningar, även om det är tydligt när man tittar på de fluorescerande spåren att de inte fördelas på samma sätt i rymden. Vid högre upplösning (1000 fack) är de geometriska centra fortfarande lika (på grund av att det geometriska centrumet är en genomsnittlig mätning), men effektspektrumet kan på ett tillförlitligt sätt användas för att skilja mellan båda kohorterna. Det är värt att notera att de fluorescerande spåren är mottagliga för andra typer av analyser, såsom ledande mätningar. Förväntade förändringar i det geometriska centrumet kan användas under beräkningar av provstorlek innan experimenten påbörjas. Att veta att vätskor har ett geometriskt centrum på cirka 0,4-0,518, använde vi minst fem möss i varje grupp för att statistiskt lösa förändringar på upp till 45%.

Vi utvidgade omfattningen och använde detta protokoll för att studera transitering av fasta ämnen i tunntarmen. Som med vätskor gav vi de fasta mikrosfärerna i magen. Den pyloriska sfinkteren ligger vid mag-tunntarmsövergången. Denna sfinkter fungerar som ett storleksuteslutningsfilter. Hos möss är storleksavgränsningen vid ~ 300 μm, med partiklar < 300 μm som inte stöter på något motstånd när de kommer in i tunntarmen33, men detta tillvägagångssätt fungerar också med något större partiklar som vi använde i en ny studie18. Vi valde våra mikrosfärstorlekar här för att ge en rad storlekar som kompletterar den senaste studien. Vi använde två kommersiella fluorescerande pärlpreparat som har diametrar på 75-90 μm och 180-212 μm. Figur 1 visar liknande fluorescenstäthet och profiler i magen över kohorter, vilket tyder på att varken vätskor eller partiklar hålls differentiellt kvar av magen. De ursprungliga data som presenteras här visar hur tunntarmen hos vildtypsmöss hanterar vätskor och mikroskopiska fasta ämnen annorlunda. Hittills har vi använt pärlor av ett storleksintervall per oberoende experiment. Framtida studier kan fokusera på hur blandningar av partiklar av olika storlek hanteras, och blanda fluorescerande vätskor av olika fysikaliska egenskaper med fluorescerande pärlor för att bestämma hur mer realistiska chymblandningar hanteras av tunntarmen.

De fördelningsskillnader som redovisas här tyder på en skillnad i de rörlighetsmönster som aktiveras av material med olika egenskaper. Vi postulerar att balansen mellan segmentering kontra framdrivande sammandragningar avgör hur långt och hur homogent material passerar tunntarmen. Det geometriska centrumet för små pärlor ligger längre längs tunntarmen jämfört med vätskor, vilket tyder på att små fasta partiklar engagerar framdrivningssammandragningar. Å andra sidan, medan det geometriska centrumet för större pärlor liknar en vätska, visar spektralanalys signifikanta skillnader i rumslig fördelning, vilket kan vara ett resultat av mer segmenterande sammandragningar i den större pärlinställningen. Vi antar att tunntarmen använder storleksdiskriminering, en typ av mekanosensorisk krets, som en av de ingångar som matas in för att bestämma balansen mellan sammandragningstyper. Till exempel är Dogiel typ II-neuroner mekanosensoriska neuroner som spekuleras spela en roll för att styra omkopplaren från framdrivning till segmenterande sammandragningar16,34. Dessa spännande spekulationer kräver ytterligare forskning för att bestämma de mekanismer genom vilka mag-tarmkanalen känner av fysiska egenskaper och omvandlar dem till fysiologiska utgångar såsom sammandragningar.

Vi tror att detta protokoll kommer att vara till hjälp som ett extra verktyg för att överbrygga klyftan från molekyler till celler till organfunktion. Vi insåg att GI-epitelmekanoreceptorer delar utvecklings- och strukturella likheter med hudmekanoreceptorer35. Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan hjälpte vi till att demonstrera den sensoriska rollen av "tarmberöring" där dessa GI-epitelmekanoreceptorer känner av lätta mekaniska stimuli och deltar i inneboende taktil känslighet18. Vi förväntar oss att detta protokoll kommer att visa sig vara till lika stor hjälp för att studera hur andra sensoriska kretsar bidrar till tunntarmstransitering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi tackar fru Lyndsay Busby för administrativ hjälp och Joel Pino för mediestöd. NIH-bidrag stödde detta arbete: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 och Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664 other mice can be used with this protocol
Dissection tools n/a n/a
Excel software Microsoft n/a used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g "smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g "larger beads" in the manuscript
Gavage needles Instech FTP-18-50-50
ImageJ software n/a n/a used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house) n/a n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) Sigma M0262
Photoshop software Adobe n/a used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma r8881-100mg "liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
  3. Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
  4. Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
  5. Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
  6. Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
  7. Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
  8. Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
  9. Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
  10. Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
  11. Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
  12. Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
  13. Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
  14. Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
  15. Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
  16. Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
  17. McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
  18. Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
  19. Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
  20. Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
  21. Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
  22. Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
  23. Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
  24. Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
  25. Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  26. Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
  27. Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
  28. Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
  29. Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  30. Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
  31. Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
  32. Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
  33. Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
  34. Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
  35. Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).

Tags

Medicin utgåva 181
Studera murin tunntarmsmekanosens av luminala partiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mercado-Perez, A., Wegner, A.,… More

Mercado-Perez, A., Wegner, A., Knutson, K., Zumchak, M., Beyder, A. Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates. J. Vis. Exp. (181), e63697, doi:10.3791/63697 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter