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Étude de la mécanodétection de l’intestin grêle murin des particules luminales

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/63697
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,4
1Enteric NeuroScience Program (ENSP), Division of Gastroenterology & Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Mayo Clinic, 3Easy Learning Labs, 4Department of Physiology & Biomedical Engineering (PBME), Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

Pour étudier comment l’intestin grêle traite les particules de différentes tailles, nous avons modifié une méthode in vivo établie pour déterminer le transit de l’intestin grêle.

Abstract

La motilité gastro-intestinale (GI) est essentielle à une digestion et une absorption normales. Dans l’intestin grêle, qui absorbe les nutriments, la motilité optimise la digestion et l’absorption. Pour cette raison, certains des modèles de motilité dans l’intestin grêle comprennent la segmentation pour le mélange du contenu luminal et le péristaltisme pour leur propulsion. Les propriétés physiques du contenu luminal modulent les modèles de motilité de l’intestin grêle. La stimulation mécanique des circuits mécanosensoriels gastro-intestinaux par le transit du contenu luminal et la motilité intestinale sous-jacente initie et module des schémas moteurs gastro-intestinaux complexes. Pourtant, les mécanismes mécanosensoriels qui conduisent ce processus restent mal compris. Cela est principalement dû à un manque d’outils pour disséquer la façon dont l’intestin grêle manipule des matériaux de différentes propriétés physiques. Pour étudier comment l’intestin grêle traite les particules de différentes tailles, nous avons modifié une méthode in vivo établie pour déterminer le transit de l’intestin grêle. Nous gavage des souris vivantes avec un liquide fluorescent ou de minuscules billes fluorescentes. Après 30 minutes, nous disséquons les intestins pour imager la distribution du contenu fluorescent sur l’ensemble du tractus gastro-intestinal. En plus des mesures à haute résolution du centre géométrique, nous utilisons le regroupement de taille variable et l’analyse spectrale pour déterminer comment différents matériaux affectent le transit de l’intestin grêle. Nous avons exploré comment un mécanisme de « toucher intestinal » récemment découvert affecte la motilité de l’intestin grêle en utilisant cette approche.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal (GI) humain est un système organique de plusieurs pieds de long, approximatif comme un tube de dimensions et de propriétés physiquesvariables 1. Au fur et à mesure que le contenu se déplace sur toute sa longueur, la fonction principale du tractus gastro-intestinal est d’absorber les substances essentielles à la vie. L’intestin grêle est spécifiquement responsable de l’absorption des nutriments. Le transit de l’intestin grêle est étroitement régulé pour correspondre aux fonctions de digestion et d’absorption, ce qui entraîne divers modèles de motilité. Bayliss et Starling ont décrit la « loi de l’intestin »2 en 1899, montrant le programme de propulsion contractile dans l’intestin connu aujourd’hui sous le nom de réflexe péristaltique; Le segment proximal au bol alimentaire se contracte pour le propulser vers l’avant, et le segment distal se détend pour le recevoir. En théorie, ce modèle seul pourrait suffire à transporter le matériau par voie aborale, mais plus d’un siècle de recherche a brossé un tableau plus complexe de l’activité contractile dans le tractus gastro-intestinal. Trois périodes de motilité de l’intestin grêle sont reconnues chez l’homme : le complexe moteur migrant (MMC), la période de jeûne et la période postprandiale3. Les mêmes tendances ont été rapportées chez les souris 4,5. La MMC est un moteur cyclique conservé chez la plupart des mammifères 6,7. La MMC a un schéma caractéristique en quatre phases qui sert de marqueur clinique utile dans les troubles gastro-intestinaux fonctionnels7. Les quatre phases, par ordre d’occurrence, sont (I) la quiescence, (II) les contractions irrégulières de faible amplitude, (III) les contractions régulières de haute amplitude, et (IV) la période de ralentissement de l’activitédéclinante 7. Le MMC marque le schéma moteur majeur de la période de jeûne3. Les MMC de la période de jeûne éclaircissent le contenu de l’intestin grêle en préparation du prochain repas.

Les schémas moteurs de la période postprandiale sont optimisés pour les fonctions digestives et absorbantes3. Quelle que soit la composition calorique, le transit initial est rapide le long de l’intestin grêle, le contenu est réparti le long de l’intestin et le transit ralentit ensuite8. L’absorption est optimisée en augmentant la surface de contact et en la ralentissant pour augmenter le temps de séjour. Une fois que les nutriments sont à l’intérieur de la lumière, le schéma dominant consiste en des contractions étroites (<2 cm espacées) non coordonnées (contractions de segmentation), avec quelques contractions superposées de grande amplitude couvrant toute la longueur de l’intestin grêle (contractions péristaltiques)9. Les contractions de segmentation mélangent les contenus intraluminaux en place. Les grandes contractions péristaltiques occasionnelles propulsent le contenu vers le côlon.

Le moment de cette transition vers les CMM dépend du volume alimentaire et de la composition calorique10. Ainsi, l’intestin grêle échantillonne des indices luminaux pour réguler le moment de la transition entre les périodes de motilité. Des indices mécaniques, tels que les propriétés physiques du contenu luminal11, le volume luminal et la tension de la paroi, engagent les cellules mécanoréceptrices dans la paroi gastro-intestinale 12,13,14,15,16. En effet, l’augmentation de la composante solide d’un repas entraîne une augmentation du transit intestinal grêle17. Nous supposons que les propriétés physiques, telles que l’état liquide ou solide du contenu intraluminal, doivent engager différents mécanorécepteurs en raison des diverses forces qu’ils génèrent sur la paroi gastro-intestinale18.

L’étalon-or pour mesurer le transit gastro-intestinal in vivo chez l’homme, comme chez la souris, est l’utilisation de traceurs radioactifs mesurés par scintigraphie lorsqu’ils sortent de l’estomac ou transitent le long du côlon19,20. Chez les mammifères, l’intestin grêle boucle de manière imprévisible, ce qui rend l’intestin grêle difficile à imager in vivo de manière fiable, mais des progrès sont réalisés21. De plus, il y a actuellement un manque d’outils pour quantifier la façon dont l’intestin grêle traite les particules de propriétés et de tailles variables. Le point de départ ici était une technique de référence qui standardise l’étude du transit de l’intestin grêle 22,23,24 et de la fonction barrière 22. Il consiste à gaver des souris avec un matériau fluorescent, à attendre que la motilité gastro-intestinale transporte le matériau, à exciser le tractus gastro-intestinal, à le segmenter en plusieurs sections de l’estomac au côlon, à sectionner et à homogénéiser le contenu intraluminal pour la quantification de la fluorescence. Nous avons apporté deux améliorations. Tout d’abord, nous avons modifié la composition du contenu gavé pour inclure des billes microscopiques fluorescentes afin de déterminer comment l’intestin grêle distribue les particules physiques. Deuxièmement, nous avons amélioré la résolution spatiale en imageant l’ensemble du tractus gastro-intestinal de l’estomac au côlon ex vivo et en utilisant un regroupement de taille variable pour normaliser notre analyse chez les animaux. Nous postulons que cela révèle de nouvelles perspectives sur l’équilibre des contractions propulsives et segmentées pendant la phase postprandiale.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Mayo Clinic.

1. Configuration

  1. Souris rapides de 8 à 10 semaines pendant 4 h. Fournir aux souris un accès à l’eau.
    REMARQUE: Nous utilisons des souris mâles C57BL / 6J de type sauvage pour toutes les expériences présentées ici, mais elles peuvent être effectuées sur des souris de n’importe quelle souche, sexe et génotype.
  2. Refroidir 15 ml d’eau distillée dans un tube conique de 50 ml dans un réfrigérateur à 4 °C.
  3. Chauffer 15 mL supplémentaires d’eau distillée dans un bécher à l’aide d’une plaque chauffante munie d’une barre d’agitation magnétique à environ 80-90 °C.
  4. Mesurer 0,5 % de méthylcellulose pour un total de 30 mL (0,15 g).
  5. Ajouter délicatement la méthylcellulose à 15 mL d’eau chaude pour qu’elle ne s’agglutine pas. La solution de méthylcellulose sera trouble au cours de ce processus.
  6. Une fois dissous, retirez le bécher de la plaque chauffante et ajoutez les 15 ml d’eau glacée dans le bécher chaud.
  7. Placer dans un réfrigérateur à 4 °C jusqu’à ce que la solution soit claire, environ 15-20 min.
  8. Lorsqu’il est clair, peser 3 mg d’isothiocyanate de rhodamine (RITC)-dextrane par 5 mL de solution de méthylcellulose à 0,5 % et mélanger pour combiner. Il s’agit de l’état liquide dans la section Résultats représentatifs .
    1. Sinon, peser 25 mg de microsphères fluorescentes en polyéthylène et mélanger avec 200 μL de la solution de méthylcellulose jusqu’à ce qu’elle soit bien incorporée. L’incorporation complète des microsphères est assurée par vortex avant le gavage. L’expérimentateur doit visualiser la distribution homogène des microsphères en suspension dans le mélange.
    2. Comme la solution de DRÉTANE RITC est sensible à la lumière, réfrigérez la solution. Préparer la solution RITC-dextran et le mélange microshpere à l’avance et utiliser dans les 2 mois. Remettez en suspension le mélange de microsphères avant utilisation.
      NOTE: Des microsphères de différentes tailles sont utilisées pour étudier la manipulation gastro-intestinale de différents matériaux. Dans la section Résultats représentatifs , nous démontrons les résultats de l’utilisation de microsphères de petite taille (diamètre : 75-90 μm) et de plus grande (diamètre : 180-212 μm).

2. Gavage de contenu intraluminal

  1. Préparer le gavage en fixant une sonde d’alimentation de 18 Ga x 50 mm à une seringue de 1 mL et en prélevant 200 μL de solution de RITC ou de solution de microsphère.
  2. Retenir manuellement l’animal à jeun à l’aide de la technique de contention à une main25. Consultez les renseignements de l’établissement sur les techniques appropriées de contention murine.
  3. Insérez doucement la sonde d’alimentation dans la bouche et l’œsophage de la souris jusqu’à ce qu’elle pénètre dans l’estomac.
    REMARQUE: L’étape du gavage est essentielle à la réussite de l’expérience. Il nécessite des mains expérimentées qui peuvent constamment insérer le tube à peu près à la même distance dans chaque souris. Cette étape doit être normalisée par les expérimentateurs qui mettent en œuvre le protocole. Le même expérimentateur devrait gavage de toutes les cohortes de souris qui seront comparées les unes aux autres.
  4. Expulsez lentement le contenu de la seringue dans l’estomac et retirez délicatement le tube de la souris.
  5. Après le gavage, remettez la souris dans la cage.
  6. Jetez le tube de gavage.
  7. Répétez le processus au besoin pour le nombre d’animaux souhaité.

3. Dissection intestinale

  1. Avant de commencer les dissections, allumez l’instrument d’imagerie in vivo pour lui permettre d’atteindre la température.
  2. Sacrifiez la souris 30 min après le gavage. Utilisez l’inhalation de dioxyde de carbone pour sacrifier la souris, suivie d’une luxation cervicale pour assurer une euthanasie réussie.
  3. Après avoir confirmé la réussite de l’euthanasie, placez la souris en décubitus dorsal sur une étape de dissection et épinglez ses quatre appendices sur la scène pour avoir accès à l’abdomen. Mouillez la surface de l’abdomen avec de l’éthanol à 70% pour mouiller les poils abdominaux.
  4. Utilisez des pinces à microdissection #1 pour tirer la peau et acquérir des ciseaux chirurgicaux tranchants pour faire une incision transversale à 1 cm au-dessus de l’anus. Pour exposer la cavité intrapéritonéale, continuez l’incision verticalement jusqu’à la cage thoracique.
  5. Déplacez doucement le caecum vers la gauche avec la pince à micro-dissection pour exposer le côlon distal.
  6. Coupez le côlon distal avec des ciseaux de micro-dissection juste à proximité du rectum.
  7. Démêlez doucement le côlon, le caecum et l’intestin grêle en tirant lentement dans la direction opposée.
    REMARQUE: Le maintien des intestins disséqués dans un segment continu créera le plus de facilité pour l’investigateur. Les déchirures et les déchirures le long du segment rendront les étapes suivantes plus difficiles.
  8. Utilisez des ciseaux de micro-dissection pour couper la proximale à l’estomac.
  9. Utilisez une pince pour transférer les intestins disséqués sur la feuille de mesure (Figure 1). Placez l’estomac à 0 mm et disposez les intestins le long de la règle jusqu’à 200 mm. Utilisez des ciseaux à microdissection pour couper à 200 mm. Répétez ce processus d’alignement des intestins de 0 mm à 200 mm le long des règles tout en restant confiant que l’orientation des intestins ne se confond pas.
    1. Veillez à éviter d’étirer les intestins tout en vous alignant sur les règles.
  10. Une fois que le tissu est disposé sur la règle, disposez le caecum de manière à ce qu’il soit parallèle au tissu mais pas en contact direct avec lui (si une fluorescence est trouvée dans cette région, une distinction claire entre le caecum et les intestins sera nécessaire).
  11. Placez la feuille de mesure avec le tissu disséqué dans une zone sombre afin que la fluorescence puisse être préservée jusqu’à ce qu’il soit temps d’imager.

4. Imagerie ex vivo

  1. Ouvrez le logiciel d’imagerie in vivo et connectez-vous.
  2. Initialisez l’instrument d’imagerie afin qu’il soit prêt pour l’acquisition d’images.
  3. Définissez les champs 'Excitation' et 'Émission' sur la couleur correspondante utilisée pour le gavage perle ou RITT. Rouge (liquide) : excitation 535 nm /émission 600 nm. Vert (microsphères) : excitation 465 nm /émission 520 nm.
  4. Réglez l’exposition sur 'Auto'.
  5. Sélectionnez le champ de vision.
  6. Avant de placer la feuille de mesure dans l’instrument, assurez-vous que les intestins ne se sont pas déplacés pendant le transport.
  7. Placez la feuille de mesure dans l’instrument dans le champ de vision.
  8. Fermez solidement la porte de l’instrument et sélectionnez Instantané pour photographier le champ de vision.
  9. Enregistrez les images collectées sur un lecteur flash pour analyse. Enregistrez les captures individuelles des images fluorescentes et photographiques. Une superposition de la photographie et de la fluorescence indique l’emplacement du matériau fluorescent dans le tractus gastro-intestinal (figure 1).
    REMARQUE : nous vous recommandons d’enregistrer les fichiers au format Tag Image File (.tif) pour le traitement en aval.

5. Analyse

  1. Ouvrez les fichiers d’images fluorescentes et photographiques dans un logiciel de retouche d’image.
  2. Ajustez la taille en pixels des deux images de sorte qu’elles aient exactement les mêmes dimensions (notre convention était de définir les deux images sur 1280 pixels par 850 pixels [hauteur x largeur]).
  3. Fermez le fichier de photographie. Les étapes suivantes impliquent uniquement l’image fluorescente.
  4. Utilisez un outil de gomme pour supprimer l’arrière-plan et le rendre transparent. Une gomme peut être nécessaire pour supprimer les patchs de l’arrière-plan restant.
  5. Créez un calque. Faites-en un fond entièrement noir au signal fluorescent. Cela peut être réalisé en choisissant un remplissage noir sur le calque et en faisant glisser le calque pour qu’il se trouve sous le calque avec l’image fluorescente.
  6. Enregistrez la nouvelle image fluorescente, contenant uniquement le signal fluorescent sur fond noir, en tant que nouveau fichier .tif.
  7. Ouvrez les nouvelles images fluorescentes et photographiques dans ImageJ.
  8. Transformez chaque image en image 32 bits en choisissant Image > Type > 32 bits.
  9. Créez une image fusionnée des deux en choisissant Image > Couleur > Fusionner les canaux. Dans la boîte de dialogue qui s’ouvre, sélectionnez le fichier photo pour la couche grise et le fichier fluorescent sous les couches colorées.
  10. Désactivez l’échelle de l’image fusionnée en sélectionnant Analyser > Définir l’échelle > Cliquez pour supprimer l’échelle.
  11. Sélectionnez l’outil « Rectangle » dans ImageJ.
  12. Dessinez un rectangle autour d’une section de l’intestin grêle. Portez une attention particulière à la largeur de cette région d’intérêt (ROI), car elle doit rester constante entre tous les ROI. La valeur nominale n’est pas essentielle, mais elle est maintenue cohérente pour tous les ROI dessinés sur cette image [puisque l’intestin grêle occupe plusieurs rangées, les ROI individuels seront dessinés sur chaque section de l’intestin grêle dans une rangée différente (Figure 1)]. La figure 2 montre l’emplacement de la valeur de largeur dans la barre d’outils ImageJ.
  13. Dupliquez le retour sur investissement en sélectionnant Image > Dupliquer. Sélectionnez uniquement le canal correspondant au canal coloré.
  14. Utilisez à nouveau l’outil rectangle pour dessiner un retour sur investissement sur l’ensemble de la nouvelle image.
  15. Récupérez un profil de fluorescence en sélectionnant Analyser > Profil de tracé. Le graphique résultant trace sur l’axe des y l’intensité moyenne pour chaque pixel le long de la longueur du retour sur investissement. Cette mesure a été choisie à l’étape 5.12 comme étant la longueur de la section analysée de l’intestin grêle.
  16. Ouvrez la liste des valeurs et copiez-les dans un tableur.
  17. Répétez les étapes 5.12 à 5.16 pour chaque section de l’intestin grêle sur une rangée de règle différente. Continuez à coller les valeurs sur le même fichier de feuille de calcul immédiatement sous chaque ensemble de valeurs précédent, de sorte que toutes les lignes continues de cette colonne contiennent la valeur d’intensité moyenne pour toute la longueur de l’intestin grêle.
  18. Dans le tableur, multipliez chaque valeur d’intensité moyenne par la largeur constante du rectangle ROI créé à l’étape 5.12. Cela donnera la valeur d’intensité réelle le long de l’intestin grêle à chaque point.
    REMARQUE: Différents animaux auront de légères variations sur la longueur de l’intestin grêle. Pour éviter que les différences de longueur n’affectent les résultats de l’analyse des données en aval, la chaîne de valeurs d’intensité doit être regroupée dans un nombre constant de cellules dans tous les échantillons expérimentaux (la figure 3, la figure 4 et la figure 5 présentent les résultats pour trois tailles de cellules).
  19. Divisez le nombre de valeurs d’intensité par le nombre de bacs souhaités. Le quotient S résultant détermine le nombre de valeurs d’intensité incluses dans chaque bac.
  20. Déterminez le bac où chaque valeur d’intensité brute ira à l’aide d’une formule d’arrondi. Cette étape place chaque valeur d’intensité brute dans un bac. Chaque valeur d’intensité brute est indexée chronologiquement avec l’entier N. Le quotient N/S détermine le numéro de bac attribué à chaque valeur brute. La formule d’arrondi doit arrondir ce quotient à un nombre entier sans décimales.
  21. Générez la valeur de chaque bac à l’aide d’une formule averageif. L’objectif est de faire la moyenne des valeurs brutes attribuées à un bac spécifique à l’étape 5.20. Par conséquent, les arguments de la formule doivent être : (1) les bacs assignés générés à l’étape 5.20, (2) le numéro de bac, (3) les valeurs d’intensité brutes.
    REMARQUE: La première analyse que nous pouvons effectuer sur les données regroupées est une analyse géométrique du centre, qui quantifie à quelle distance nous observons l’intensité fluorescente la plus élevée le long de l’intestin grêle (Figure 4).
  22. Normaliser chaque valeur d’intensité sur l’intensité fluorescente totale. En d’autres termes, divisez chaque valeur d’intensité par la somme de toutes les intensités.
  23. Multipliez chaque valeur normalisée par le numéro de la corbeille. Le produit reflète le poids relatif de chaque cellule, ce qui contribue à l’intensité fluorescente totale.
  24. L’addition de toutes les valeurs générées à l’étape 5.23 donne le numéro de bac au centre du signal fluorescent. Divisez par le nombre de bacs pour exprimer le centre géométrique comme la fraction de l’intestin grêle parcourue par le centre fluorescent.
    REMARQUE : Pour refléter la distribution spatiale du signal, l’étape suivante consiste à générer le spectre de puissance de l’ensemble de données d’intensité groupées (Figure 5).
  25. Ouvrez un assistant de transformation de Fourier rapide (FFT) dans le tableur. Sélectionnez l’entrée comme jeu de données groupé et la sortie comme un ensemble vide du même nombre de lignes que les bacs.
  26. Extraire la composante valeur réelle de la FFT.
  27. Élever chaque valeur réelle de la FFT à la deuxième puissance. Cela donne un ensemble de données de spectres de puissance.
  28. Sélectionnez la première moitié de l’ensemble de données des spectres de puissance et déplacez-la de manière à ce qu’elle se trouve en dessous de la seconde moitié. Cela a pour effet de centrer les spectres de puissance autour de la fréquence centrale lorsqu’elle est tracée à l’étape suivante.
  29. Tracez les spectres de puissance sur l’axe des y d’un graphique x-y où les valeurs de l’axe des x sont comprises entre -1 x (nombre de bacs/2) et (nombre de compartiments/2) -1. Dans le cas de 1000 bacs, les valeurs des axes seraient comprises entre -500 et 499.
  30. Les spectres de puissance pour chaque animal doivent être comparés sur la base de l’étendue des pics non nuls et des hauteurs de ces pics non nuls.

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Representative Results

Nous montrons des résultats représentatifs à partir de l’étape 3. La figure 1 montre les intestins explantés intacts, avec des mesures fluorescentes superposées. L’estomac (violet) est posé le long du même axe que l’intestin grêle (orange), mais nous préférons déplacer le caecum (bleu) sur le côté pour éviter le chevauchement avec le gros intestin (orange). Comme en témoigne le panneau de gauche, cela n’est pas toujours possible en raison de la taille de l’organe. Nous coupons l’intestin grêle à ~200 mm pour maximiser la couverture des segments continus, mais ce n’est pas toujours possible en raison du mésentère limitant la capacité de déplier les intestins et de notre préférence de ne pas couper à travers des structures comme les granulés fluorescents ou le caecum. L’intensité rouge dans le panneau gauche de la figure 1 et les intensités vertes des panneaux du milieu et de la droite sont triées dans des bacs de différentes tailles pour générer la figure 3. Seules les intensités dans les ROI orange (intestin grêle) sont extraites pour analyse. La longueur totale de l’intestin grêle (chaque ROI orange dans chaque panneau) est extraite pour analyse. Les ROI orange ont la même largeur, comme illustré dans ImageJ (Figure 2). Ils sont cousus ensemble en plaçant toutes les intensités dans l’ordre avant le rangement. La figure 3 montre la trace fluorescente moyenne ± MEB par cohorte; Voir la légende de la figure pour plus de détails.

Les deux dernières figures montrent les résultats des analyses : centre géométrique et spectre de puissance. Le centre géométrique mesure l’emplacement moyen des signaux fluorescents dans la figure 3, en pesant la moyenne par la force du signal de chaque bac. Par conséquent, des pics plus élevés dans la trace rapprochent la moyenne de la position de ce pic. Le centre géométrique ne parvient pas à caractériser complètement la distribution spatiale des contenus intraluminaux. Par exemple, le même centre géométrique peut être obtenu à partir d’un bolus concentré en un seul point et d’un signal étalé centré autour du même point. Cette limitation de la mesure du centre géométrique est évidente dans la comparaison entre les liquides et les billes plus grandes (Figure 3 et Figure 4). La majeure partie de la trace fluorescente liquide est centrée autour de deux pics précoces, tandis que les plus gros billes montrent plusieurs pics sur toute la longueur de l’intestin grêle (Figure 3, panneaux gauche et droit). La trace fluorescente des plus grosses billes est plus distribuée, mais elle atteint en moyenne un point similaire à celui du liquide, indépendamment de la granularité de binning, ce qui souligne la limitation de la focalisation uniquement sur le centre géométrique (Figure 4). Pour tenir compte de la nature distributive des contractions de l’intestin grêle, nous avons incorporé une analyse spectrale de puissance dans le protocole. L’analyse du spectre de puissance fonctionne en déconstruisant la distribution de fluorescence dans l’espace en plusieurs courbes sinusoïdales de différentes fréquences spatiales. Chaque fréquence spatiale reflète la distance entre deux points choisis au hasard dans la trace de fluorescence. Certaines de ces distances se produisent plus fréquemment que d’autres, de sorte que chacune se voit attribuer une force (puissance). La puissance est en corrélation avec la fréquence à laquelle deux points aléatoires sont séparés par cette distance. En traçant le spectre de puissance (Figure 5), nous pouvons démontrer combien de fréquences spatiales contribuent au signal mesuré (étalement du spectre) et comparer la force relative de ces contributions (hauteur du spectre). Cela nous permet de décrire quantitativement la propagation de la fluorescence le long du tractus gastro-intestinal.

Figure 1
Graphique 1. Les intestins disséqués sont explantés et placés sur du papier de règle laminé avant la photographie et la mesure de fluorescence. L’intensité de fluorescence est superposée et pseudocolorée pour correspondre à la fluorescence native du matériau gavé. À gauche : isothiocyanate de rhodamine liquide (RITC) fluorescent dans le spectre rouge; Milieu : petit (diamètre : 75-90 μm) et Droite : plus grand (diamètre : 180-212 μm) perles toutes deux fluorescentes dans le spectre vert. Des boîtes violettes, oranges, bleues et roses entourent les régions d’intérêt (ROI) de l’estomac, de l’intestin grêle, du caecum et du côlon dans chaque spécimen, respectivement. La largeur de chaque retour sur investissement est maintenue constante sur toutes les lignes afin d’éviter toute confusion lors du calcul de l’intensité de fluorescence brute lors de l’analyse en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Emplacement de la largeur de la région d’intérêt (en pixels) dans la barre d’outils ImageJ (soulignement jaune). Pour rappel, la largeur n’est affichée en pixels que si l’échelle a été supprimée (étape 5.10). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Traces de fluorescence le long de l’intestin grêle. La ligne indique la fluorescence moyenne à un bac donné. La zone ombrée indique l’erreur-type de la moyenne (MEB). La distribution des matériaux fluorescents varie en fonction des propriétés matérielles du contenu intraluminal (colonnes). À gauche : distribution liquide (n = 7 souris) sur quelques segments de l’intestin grêle 30 min après le gavage. Au milieu et à droite : les petites billes (n = 6 souris) et les plus grandes (n = 5 souris) se répartissent plus largement le long de l’intestin grêle 30 min après le gavage. L’augmentation du nombre de bacs utilisés pour trier les mêmes ensembles de données brutes révèle des caractéristiques de trace granulaires insolubles avec moins de bacs (lignes). Des bacs plus petits réduisent l’incertitude de mesure, augmentent la résolution spatiale et reflètent mieux la composante distributive des contractions de l’intestin grêle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Le centre géométrique de la distribution de fluorescence dans l’intestin grêle 30 min après le gavage avec du RITC liquide, des petites billes (75-90 μm) et des billes plus grandes (180-212 μm) (moyenne ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, ANOVA unidirectionnelle avec correction de Bonferroni). La taille des bacs n’affecte pas l’interprétation du transit selon laquelle les petites billes sont transportées plus distalement que les liquides 30 minutes après le gavage, mais les plus grosses billes se répartissent si largement qu’il n’y a pas de différences significatives dans leur centre géométrique par rapport aux liquides et aux petites billes (*P < 0,05. ns = non statistiquement significatif). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Graphique 5. Les spectres de puissance sont classés par propriété de matériau (colonnes) et taille de bac (lignes). Les améliorations de la résolution spatiale et la réduction de la mise en commun sont évidentes. Rangée du haut : peu de différences peuvent être distinguées dans les spectres largement classés. Rangée du bas : à mesure que la taille des bacs diminue, on peut apprécier les fréquences dominantes significatives présentes dans le spectre des plus grandes perles, mais pas dans celui des petites perles. Certaines de ces fréquences dominantes supplémentaires, mais pas toutes, sont présentes dans le spectre liquide. En utilisant les spectres de la rangée inférieure, nous pouvons comparer aux traces fluorescentes de la figure 3. Dans la figure 3, la trace fluorescente liquide affiche deux pics proéminents, ce qui correspond à quelques pics dominants dans le spectre de puissance. La trace de petites billes de la figure 3 affiche un seul pic dominant, qui est en corrélation avec un seul pic dominant dans le spectre de puissance. La trace de plus gros billes de la figure 3 affiche des pics plus dominants. En conséquence, le spectre de puissance montre un plus grand nombre de fréquences dominantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le tractus gastro-intestinal, comme d’autres organes tubulaires, tels que les vaisseaux sanguins, nécessite des capteurs et des effecteurs mécaniques pour maintenir l’homéostasie26,27,28. Cependant, le tractus gastro-intestinal est unique en ce sens que les propriétés physiques des matériaux qui le traversent ne sont pas constantes d’un repas à l’autre. Les contenus intraluminaux de diverses propriétés physiques (solide, liquide et gazeux) transitent par l’intestin, générant différentes entrées mécaniques vers les mécanorécepteurs gastro-intestinaux. En effet, différents stimuli mécaniques dans le côlon sont détectés et relayés par des voies distinctes29.

Ce protocole est techniquement accessible à toute personne qui effectue un travail de routine sur la souris, mais quelques étapes critiques nécessitent une attention particulière. Nous constatons que les souris à jeun sont importantes avant de commencer l’étude, car elles suppriment la contribution des repas précédents diluant le signal fluorescent. De plus, les souris nourries avec un régime standard présentent une fluorescence intraluminale des composants de l’alimentation, en particulier le composant chlorophylle30. Par le jeûne et la sélection des fluorophores, nous empêchons la fluorescence du chow d’interférer avec les conditions contrôlées des expériences décrites dans ce protocole. Nous recommandons aux expérimentateurs de confirmer indépendamment que la période de jeûne choisie est suffisante pour éliminer la fluorescence non spécifique dans l’intestin grêle, car cela peut varier selon la souche, l’âge ou le sexe. L’expérimentateur doit évaluer visuellement la distribution homogène du contenu gavage. Sinon, il y aura de l’incertitude quant à leur livraison et aux résultats de l’étude. Les gavages doivent être effectués de manière cohérente par le même expérimentateur, de préférence quelqu’un qui a développé une expérience avec la technique. L’expérimentateur doit viser une livraison constante du contenu à l’estomac. La découverte de fluorescence dans l’œsophage ou exclusivement dans l’estomac est un motif d’exclure un animal de l’analyse, car il n’est pas certain que l’intestin grêle ait eu le même accès au contenu gavé. Après le gavaging, les temps d’attente peuvent être réduits à 15 minutes ou prolongés à 90 minutes, selon que les phases de transit précoces ou tardives présentent un intérêt22. Le protocole original utilisant le gavage liquide a démontré que la majorité du matériel réside dans l’intestin grêle après 30 minutes. De plus, bien qu’il soit essentiel de travailler avec hâte pendant l’étape de dissection, il faut veiller à ne pas perturber l’emplacement du contenu intraluminal et à ne pas rompre le tractus gastro-intestinal.

Ce protocole a évolué à partir d’approches publiées précédemment qui ont physiquement regroupé l’intestin grêle en le coupant en cinq à 10 segments et en homogénéisant le contenu intraluminal avant la mesure de la fluorescence / radioactivité22,23,24. L’approche précédente était importante parce qu’elle normalisait la mesure du transit de l’intestin grêle. L’intestin grêle tourne notoirement en boucle dans des schémas compliqués et imprévisibles à l’intérieur de la cavité abdominale. Les études de transit basées sur l’imagerie sont difficiles, quelle que soit l’espèce31,32. Bien que notre protocole reste une expérience terminale qui ne peut pas être étendue aux humains, nous améliorons considérablement la résolution spatiale et profitons de cette amélioration pour résoudre les transits régionaux et les traduire en une mesure impartiale de la propagation dans l’intestin grêle (spectre de puissance).

Dans ce protocole, la résolution spatiale est limitée par la résolution de la caméra dans le système d’imagerie. Étant donné que le binning normalise la longueur de l’intestin grêle chez les animaux, nous pouvons directement comparer la position moyenne du contenu intraluminal. La figure 3 illustre clairement le lissage drastique, l’incertitude accrue et la diminution de la résolution résultant de la taille des grands bacs. Le centre géométrique quantifie le centre de fluorescence le long du tractus gastro-intestinal (Figure 4). Comme prévu, cette mesure n’est pas affectée de manière significative par la taille du bac. Le spectre de puissance est une méthode non biaisée et complémentaire qui standardise l’analyse des pics et des écarts dans les traces fluorescentes de la figure 3. L’amélioration de la résolution améliore les spectres calculés, ce qui permet de mettre en évidence les différences visibles entre les traces fluorescentes (Figure 5). À basse résolution (10 bacs), il serait difficile de faire la distinction entre les liquides et les billes plus grosses, que ce soit par le centre géométrique ou les évaluations du spectre, même s’il est clair en regardant les traces fluorescentes qu’elles ne sont pas distribuées de manière similaire dans l’espace. À une résolution plus élevée (1000 bacs), les centres géométriques sont toujours similaires (en raison du fait que le centre géométrique est une mesure moyenne), mais le spectre de puissance peut être utilisé de manière fiable pour différencier les deux cohortes. Il convient de noter que les traces fluorescentes se prêtent à d’autres types d’analyses, telles que les mesures de pointe. Les changements anticipés dans le centre géométrique peuvent être utilisés lors des calculs de taille d’échantillon avant d’entreprendre les expériences. Sachant que les liquides ont un centre géométrique d’environ 0,4-0,518, nous avons utilisé au moins cinq souris dans chaque groupe pour résoudre statistiquement des changements allant jusqu’à 45%.

Nous avons élargi la portée et utilisé ce protocole pour étudier le transit des solides dans l’intestin grêle. Comme pour les liquides, nous avons gavé les microsphères solides dans l’estomac. Le sphincter pylorique est situé à la transition estomac-intestin grêle. Ce sphincter fonctionne comme un filtre d’exclusion de taille. Chez la souris, la limite de taille est à ~300 μm, les particules <300 μm ne rencontrant aucune résistance à pénétrer dans l’intestin grêle33, mais cette approche fonctionne également avec des particules légèrement plus grosses que nous avons utilisées dans une étude récente18. Nous avons choisi ici nos tailles de microsphères pour fournir une gamme de tailles qui complètent l’étude récente. Nous avons utilisé deux préparations commerciales de billes fluorescentes dont le diamètre est de 75 à 90 μm et de 180 à 212 μm. La figure 1 montre une densité de fluorescence et des profils similaires dans l’estomac d’une cohorte à l’autre, ce qui suggère que ni les liquides ni les particules ne sont retenus différemment par l’estomac. Les données originales présentées ici démontrent comment l’intestin grêle des souris de type sauvage traite différemment les liquides et les solides microscopiques. Jusqu’à présent, nous avons utilisé des perles d’une taille unique par expérience indépendante. Les études futures pourront se concentrer sur la façon dont les mélanges de particules de différentes tailles sont manipulés et sur le mélange de fluides fluorescents de diverses propriétés physiques avec des billes fluorescentes afin de déterminer comment des mélanges de chymes plus réalistes sont manipulés par l’intestin grêle.

Les différences de distribution rapportées ici suggèrent une différence dans les modèles de motilité activés par des matériaux de propriétés différentes. Nous postulons que l’équilibre entre la segmentation et les contractions propulsives détermine la distance et l’homogénéité du transit des matériaux dans l’intestin grêle. Le centre géométrique des petites perles est plus éloigné le long de l’intestin grêle par rapport aux liquides, ce qui suggère que les petites particules solides engagent des contractions propulsives. D’autre part, alors que le centre géométrique pour les billes plus grandes est similaire à un liquide, l’analyse spectrale montre des différences significatives dans la distribution spatiale, ce qui pourrait être le résultat de contractions plus segmentées dans le cadre de billes plus grandes. Nous émettons l’hypothèse que l’intestin grêle utilise la discrimination de taille, un type de circuit mécanosensoriel, comme l’un des intrants qui alimentent la décision de l’équilibre entre les types de contraction. Par exemple, les neurones de Dogiel de type II sont des neurones mécanosensoriels supposés jouer un rôle dans la direction du passage des contractions propulsives à la segmentation16,34. Ces spéculations intrigantes nécessitent des recherches supplémentaires pour déterminer les mécanismes par lesquels le tractus gastro-intestinal détecte les propriétés physiques et les transduit en résultats physiologiques tels que les contractions.

Nous pensons que ce protocole sera utile en tant qu’outil supplémentaire pour combler l’écart entre les molécules, les cellules et la fonction des organes. Nous avons reconnu que les mécanorécepteurs épithéliaux gastro-intestinaux partagent des similitudes développementales et structurelles avec les mécanorécepteurs cutanés35. En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons aidé à démontrer le rôle sensoriel du « toucher intestinal » où ces mécanorécepteurs épithéliaux gastro-intestinaux détectent les stimuli mécaniques de la lumière et participent à la sensibilité tactile intrinsèque18. Nous prévoyons que ce protocole s’avérera tout aussi utile pour étudier comment d’autres circuits sensoriels contribuent au transit de l’intestin grêle.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Nous remercions Mme Lyndsay Busby pour son aide administrative et M. Joel Pino pour son soutien aux médias. Les subventions des NIH ont soutenu ce travail: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 et Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664 other mice can be used with this protocol
Dissection tools n/a n/a
Excel software Microsoft n/a used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g "smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g "larger beads" in the manuscript
Gavage needles Instech FTP-18-50-50
ImageJ software n/a n/a used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house) n/a n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) Sigma M0262
Photoshop software Adobe n/a used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma r8881-100mg "liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system

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Médecine numéro 181
Étude de la mécanodétection de l’intestin grêle murin des particules luminales
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Mercado-Perez, A., Wegner, A., Knutson, K., Zumchak, M., Beyder, A. Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates. J. Vis. Exp. (181), e63697, doi:10.3791/63697 (2022).

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